一种基于蛋白还原法的合金纳米颗粒制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于金属纳米颗粒材料的制备领域，是一种基于蛋白还原法的合金纳米颗粒制备方法。
【背景技术】
[0002]二元或多元合金纳米颗粒以其优异的理化性质在催化、光学、生物传感、药物递送等方面具有广泛的应用前景。合金不但可以具有单一金属所特有的性质，还可能产生协同效果，故而近年来各种新型纳米合金颗粒组合层出不穷。
[0003]纳米颗粒的合成需要还原剂和稳定剂。由于添加化学还原剂可能对环境带来负面影响，不符合绿色化学的发展方向，因此越来越多的绿色合成法应运而生。这包括利用各种生物资源，如:蛋白质、DNA、植物提取液、微生物等。其中，蛋白质凭借自身的还原性氨基酸残基可直接用于纳米颗粒的还原，是一种绿色温和的还原手段。但是，其耗费时间较长，故而仍需要开拓新思路以提升蛋白直接还原纳米颗粒的反应速率和产率。关于一些新型制备手段也有报道，如利用微波法促进纳米粒子生成；将气泡鼓入溶液中形成气液界面用以合成纳米合金等。然而，利用铜、镍、亚铁、铝等易被蛋白还原的离子形成零价纳米簇，加速还原银、金、铂、钯等贵金属并合成合金甚至三元合金的方法鲜有报道。所形成的合金不仅具有原目标金属纳米颗粒的光谱性质和还原性质，同时也有机会获得两种纳米金属的协同性质，应用前景十分广阔。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对上述问题，研制出一种基于蛋白质快速还原制备合金纳米颗粒的方法，在碱性水相环境下，制备出直径为5-13nm的合金纳米颗粒。
[0005]本发明的原理是:基于铜、镍、亚铁、铝离子的标准电极电势小于银、金、铂、钯离子，为了提高蛋白质较难还原的贵金属银、金、铂、钯纳米粒子的生成速率和产率，利用铜、镍、亚铁、铝盐溶液，使用蛋白质将它们还原成铜、镍、铁、铝纳米团簇作为成核物质，以增加的银、金、铂、钯离子的还原速率和产率，所合成的合金纳米颗粒具备目标贵金属纳米颗粒的性质，实现了蛋白直接还原合金纳米颗粒的快速制备。
[0006]本发明的一种蛋白直接还原的合金制备方法包括如下具体步骤:
[0007](I)制备纯化蛋白溶液3_50mg mL—1;
[0008](2)配制银、金、铂或钯中一种或其中任意两种混合的贵金属盐溶液10_30mM ;
[0009](3)配制铜、镍、亚铁或铝的金属盐溶液20-30mM，这些金属需比步骤(2)中贵金属的标准氧化还原电势低；
[0010](4)将(I) (2) (3)溶液混合制成纳米合金前驱体溶液，用氢氧化钠溶液调节pH至碱性范围，将前驱体溶液均匀混合后通高纯氮气除氧，继而放入水浴中加热即可得到由蛋白快速还原的纳米合金。
[0011]通过紫外分光光度计测得溶液的表面等离子共振谱峰或通过透射电子显微镜可监测产物合成情况，所形成的单一峰可证明合成纳米颗粒为均质合金。
[0012]在步骤(I)中，所述蛋白溶液为含有pH在8.0-13.0范围内具备还原能力的氨基酸残基的蛋白和多肽，在合成中并不限制其保持空间结构，甚至这些蛋白的淀粉样纤维体也均适用。其中具有还原性的氨基酸为色氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺，选取优质牛乳球蛋白、溶菌酶、胰岛素、牛血清白蛋白，以及这些蛋白所成的淀粉样纤维。其中一分子牛乳球蛋白中主要起还原作用的为2个色氨酸残基，4个酪氨酸残基，15个赖氨酸残基；一分子溶菌酶中主要起还原作用的为6个色氨酸残基，3个酪氨酸残基，6个赖氨酸残基，11个精氨酸残基；一分子胰岛素中主要起还原作用的为8个酪氨酸残基，2个赖氨酸残基，5个半胱氨酸残基，4个组氨酸残基；一分子牛血清白蛋白中主要起还原作用的为20个酪氨酸残基，6个赖氨酸残基，6个谷氨酰胺残基。
[0013]在步骤(I)中，所述蛋白溶液配制方法为:用超纯水配制3-50mg mL—1蛋白溶液，调节pH至8.0-13.0，稳定一小时后将其离心取上层清液，并通过超速离心或透析除去原蛋白中杂质离子。最终蛋白浓度由紫外分光光度计确定。
[0014]步骤(2)中，所述贵金属盐溶液为水溶性一价银盐、三价金盐、四价铂盐、二价钯盐或它们之中任意两者混合；优选硝酸银、氯金酸、氯铂酸、氯化钯。
[0015]步骤(3)中，所述金属盐溶液为水溶性铜盐、镍盐、亚铁盐和铝盐；优选氯化铜、硝酸铜、硫酸铜、氯化镍、氯化亚铁、氯化铝。
[0016]步骤(I)中所述蛋白溶液与目标合金产物并无特殊对应关系。
[0017]在步骤(4)所述前驱体溶液中，所述的前驱体溶液混合体积比例为纯化蛋白溶液:贵金属盐溶液:金属盐溶液为I: (0.2-18): (8-80) O
[0018]蛋白的最终浓度优选为0.3-lmg mL—1，金属最终浓度优选为500-1800 μ M。
[0019]在步骤⑷中，所述反应的反应温度优选为60-90°C，pH优选为8.0-13.0，超出此PH范围，蛋白中起还原作用的氨基酸残基会受影响，从而降低纳米颗粒产率，而所述混合顺序并无特殊要求。
[0020]与现有合成方法相比，本发明的优点在于:
[0021](I)本发明将蛋白直接还原贵金属纳米颗粒的制备时间由l_5h降低为5-30min，能够快速有效地合成具备目标纳米颗粒性质的纳米合金，大大提高了合成速率；
[0022](2)本发明提供了一种利用低电极电势的金属铜、镍、铁、铝促进贵金属银、金、铂、钯纳米颗粒的合成并最终形成合金的新思路，其中蛋白质既是还原剂又是纳米颗粒的稳定剂；
[0023](3)本发明所用蛋白质并不要求空间结构的保持，去折叠的蛋白质甚至淀粉样蛋白纤维亦适用于此合成方法。
[0024](4)本方法制备过程均为水相溶液，无有机溶剂，利用蛋白质为还原剂，绿色环保，操作简便，并降低了合成贵金属纳米颗粒的成本；
[0025](5)本方法除步骤4需要在60_90°C的条件下进行外，其它均在室温下进行，实验条件温和；
[0026](6)本方法所制备的合金纳米颗粒重复性好，便于工业生产。
【附图说明】
[0027]图1为本发明实施例1所述加入硫酸铜在90°C水浴中加热5min后所合成的铜银合金纳米颗粒与未加入铜离子情况下在90°C水浴中加热5min的银纳米颗粒消光谱对比。证明加入硫酸铜后反应速率和产率显著提高。
[0028]图2为本发明实施例1所述铜银纳米合金颗粒@牛乳球蛋白复合物高倍透射电子显微镜图像，其中晶面间距对应银铜合金的(111)晶面，证明了银铜合金的合成。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体的实施例对本发明作进一步详细说明。应理解，这仅是为了举例说明本发明，并非以任何方式限制本发明的范围。
[0030]实施例1:牛乳球蛋白还原铜-银合金纳米颗粒的制备，具体操作步骤如下:
[0031](I)制备纯化的牛乳球蛋白溶液:称取一定量牛乳球蛋白粉末溶于超纯水中，调节pH至11.0，稳定一小时后将其离心取上层清液，并通过超速离心或透析除去原蛋白中杂质离子。最后，通过紫外分光光度计将纯化后的牛乳球蛋白溶液浓度确定为4mg HiL-1O
[0032](2)贵金属纳米银选用硝酸银作为前驱体，制备1mM硝酸银溶液。
[0033](3)比银氧化还原电极电势低的金属盐选用硫酸铜作为前驱体，制备20mM硫酸铜溶液。
[0034](4)制备合金纳米铜-银O牛乳球蛋白复合物:将500 yL牛乳球蛋白溶液，180 yL硫酸铜溶液，300 μ L硝酸银溶液以及4mL去离子水一同置于小玻璃瓶中。调节溶液pH为12.0，经磁力搅拌混匀后，向前驱体溶液通高纯氮气除氧。混合后，前驱体溶液中牛乳球蛋白的浓度为0.4mg mL'继而将小瓶放入90°C水浴中加热，15min即可得到由牛乳球蛋白还原的铜-银合金纳米颗粒。
[0035]相比于同条件下未加入铜离子，加热5min铜银合金纳米与银纳米颗粒合成情况对比如图1所示，表明加入硫酸铜短时间内即可达很高产率。其单一表面等离子共振谱峰位置在410nm，同时如图2所示铜银纳米颗粒高倍透射电子显微镜图像，其中晶面间距对应银铜合金的(111)晶面，证明合成了均质银铜合金纳米颗粒。
[0036]实施例2:牛乳球蛋白还原铜-银-金三元合金纳米颗粒的制备，具体操作步骤如下:
[0037](I)制备纯化的牛乳球蛋白溶液:如实施例1中步骤⑴所述，将纯化后的牛乳球蛋白确定为4mg mL'
[0038](2)贵金属纳米金银选用氯金酸和硝酸银作为前驱体，制备1mM硝酸银溶液，20mM氯金酸溶液。
[0039](3)比金、银的氧化还原电极电势低的金属盐选用氯化铜作为前驱体，制备20mM硫酸铜溶液。
[0040](4)制备合金纳米铜-银-金O牛乳球蛋白复合物:将500 μ L牛乳球蛋白溶液，180 μ L硫酸铜溶液，240 μ L硝酸银溶液，100 μ L氯金酸溶液，以及4mL去离子水一