一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于诊疗一体化纳米材料的制备领域，特别涉及一种RGD修饰树状大分子 稳定的功能化金纳米星/s iRNA复合物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，纳米材料由于其在基因/药物传递、分子影像和靶向治疗方面的潜在应 用，受到越来越广泛的关注。尤其是特殊形貌的金纳米颗粒，因为具有良好的化学稳定性、 生物相容性、催化活性以及独特的光学性质，广泛应用在生物传感器、光热治疗和分子影像 等领域。鉴于金纳米材料表面易被化疗药物和其他功能性基团修饰，所以常被作为多模态 治疗和诊疗一体化的明星纳米平台。
[0003] 金纳米星作为特殊形貌的金纳米颗粒的一种，已被验证可以成功应用于光热治 疗、化学催化和分子影像等方面。前期的工作中，在CTAB存在的条件下，合成了金包覆氧化 铁星形核壳结构的复合纳米颗粒，并成功应用于MR/CT双模态成像和肿瘤的光热治疗。（沈 明武，李静超，胡勇，韦平，史向阳。一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备及其成 像和热疗的应用。申请号:CN201410333885.7，申请日期：2014-07-14)。但由于CTAB的存在， 使得后期纯化过程较为繁琐。
[0004] 前期工作已经证明，R⑶对ανβ3整合素高表达的U87MG细胞具有很好的靶向作用(沈 明武，胡勇，李静超，韦平，史向阳。一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方 法。【申请号】CN201410604468.1，申请日期：2014-10-31)。且功能化的树状大分子既作为金 纳米星的稳定剂又可作为基因传递的载体，可以显著提高基因传递效率(史向阳，孔令丹。 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法。中国发明专利，申 请号：CN201310291576.3,申请日期：2013-07-11)。
[0005] 检索国内外文献，尚没有发现关于RGD靶向树状大分子稳定的功能化金纳米星的 制备及其用于CT成像和光热与基因联合治疗的相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米 星/si RNA复合物的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作；制备得到的多功 能化的金纳米星具有良好的单分散性、胶体稳定性和生物相容性，且所用的合成原料均为 环境友好型材料，具有产业化实施的前景。
[0007] 本发明的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方 法，包括：
[0008] (1)将柠檬酸三钠溶于超纯水中，然后加入到煮沸的氯金酸溶液中，煮沸至溶液颜 色由无色变为酒红色，终止反应，冷却至室温，得到柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒;其中，柠檬 酸三钠与氯金酸溶液的体积比为1.5:10;
[0009] (2)将步骤（1)中的柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒加入到氯金酸溶液中，避光搅拌， 加入AgN〇3和抗坏血酸AA，搅拌反应2~4h，纯化，冷冻干燥，得到金纳米星AuNSs ;其中， HAuCl4、AA、AgN03 的摩尔比为 500:1:40 ~60;
[0010] ⑶将巯基乙酸甲酯MTG逐滴加入到第三代聚酰胺-胺树状大分子G3. NH2的超纯水 溶液中，60°C~80°C恒温反应12~48h，透析，冷冻干燥，得到部分巯基封端的聚酰胺-胺三 代树状大分子G3. NH2-SH;其中，MTG与G3.NH2的摩尔比为18~20:1;
[0011] (4)将步骤(3)中的G3 · NH2-SH溶于超纯水中，逐滴加入到步骤(2)中的AuNSs的水 溶液中，搅拌12~24h，离心，洗涤，冷冻干燥，得到树状大分子稳定的金纳米星G3-AuNSs;其 中，G3. NH2-SH与AuNSs的质量比为5~10:1;
[0012] (5)将6-(马来酰亚胺基）己酸琥珀酰亚胺酯6-M与⑶OH-PEG-NH2混合于DMSO溶液 中，搅拌反应8-10小时，得到C00H-PEG-MAL;然后再将充分溶解于DMSO中的巯基封端的RGD 艮P SH-R⑶逐滴加入到⑶OH-PEG-MAL的DMSO溶液中，搅拌反应1~2天，透析，冷冻干燥，即得 至Ij C00H-PEG-RGD;其中，SH-RGD: 6-M: C00H-PEG-NH2 的摩尔比为 1:1 ~1.2:1 ~1.2;
[0013] (6)将步骤(5)中的⑶OH-PEG-RGD经过EDC和NHS活化，然后加入到步骤(4)中G3- AuNSs的DMSO分散液中，搅拌反应2~4天，离心，洗涤，冷冻干燥，得到Au-G3-PEG-RGD NSs， 简称Au DSNSs;其中，C00H-PEG-RGD与Au DSNSs中树状大分子的摩尔比为4~6:1;
[0014] (7)将步骤（6)中的Au DSNSs与VEGF siRNA共同孵育15-20分钟，得到复合物Au DSNSs/siRNA〇
[0015] 所述步骤(1)中煮沸的时间为15~20分钟。
[0016]所述步骤(1)和步骤(2)中加入为快速加入。
[0017]所述步骤⑴中的柠檬酸三钠 Na3C6H5O7溶于超纯水后的质量分数为1 %，体积为 1.5mL，氯金酸溶液的浓度为ImM，体积为10mL。
[0018] 所述步骤（2)中柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒与氯金酸溶液的体积比为1:100~ 125〇
[0019] 所述步骤（2)中HAuCl4、AA、AgN03的配比为：10mL(0.25mM) :50yL(0.1M): IOOyL (2mM)〇
[0020] 所述步骤(3)中巯基乙酸甲酯MTG的含量为95%。
[0021] 所述步骤(3)中恒温反应为将应装置置于恒温水浴锅中恒温反应。
[0022]所述步骤(3)和步骤(5)中透析为用截留分子量1000的透析袋透析3天。
[0023] 所述步骤(5)中COOH-PEg-NH2的分子量为2000。
[0024]所述步骤(4)和步骤(6)中洗涤为水洗三次。
[0025] 所述步骤(6)中C00H-PEG-RGD、EDC和NHS的摩尔比为1:8~10:8~10。
[0026] 所述步骤(6)中活化时间为2~4h。
[0027] 所述步骤(6)中离心的转速为7000-8000rpm，时间为20min。
[0028] 所述步骤(7)中VEGF siRNA规格为100D。
[0029] 所述步骤(7)中Au DSNSs与VEGF siRNA的N/P为 10:1 ~25:1。
[0030] 为了提高金纳米星的稳定性和生物相容性，先后在其表面修饰第三代聚酰胺-胺 树状大分子和聚乙二醇-RGD(Polyethylene glycol-RGD，C00H-PEG-RGD)。
[0031] 本发明首先合成柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒作为种子，采用种子生长法合成金纳 米星，然后在其表面修饰第三代树状大分子和聚乙二醇-RGD复合物（Polyethylene glycol-RGD，⑶0H-PEG-RGD)，最后与VEGF siRNA复合，形成复合物。实验结果表明，Au DSNSs/siRNA不仅可以作为体外CT成像造影剂，而且兼具肿瘤的光热治疗和基因治疗两种 治疗模式，实现了诊疗一体化的创新理念。
[0032]本发明采用柠檬酸钠还原法制备出金种子，种子生长法得到金纳米星，用巯基化 的第三代聚酰胺-胺树状大分子（G3. NH2-SH)稳定后，表面修饰TOG化的RGD(C00H-PEG-RGD)，最终和VEGF siRNA共孵育形成复合物。本发明反应条件温和，工艺简单，易于操作；制 备出的功能化金纳米星具有良好的单分散性，胶体稳定性，生物相容性，加之与VEGF siRNA 复合，可以实现光热治疗和基因治疗的协同治疗，辅以CT成像，在诊疗一体化领域具有潜在 的应用价值。
[0033]本发明操作简单易行，原材料成本较低，对环境无污染，在没有表面活性剂存在的 情况下，成功合成了较小尺寸的金纳米星，而且这种独特的星状结构使得该纳米颗粒在近 红外区有较强的吸收峰，从而有望将光能转化为热能，达到杀死肿瘤细胞的目的。且后期经 由靶向环肽RGD修饰，对U87MG细胞具有较高的靶向能力，可携带更多的VEGF siRNA入胞，实 现较高的细胞吞噬效率