一种防治马铃薯疮痂病的微生物菌肥及其制备方法与流程

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本发明属于微生物肥料技术领域,具体涉及一种防治马铃薯疮痂病的微生物菌肥及其制备方法。



背景技术:

马铃薯,双子叶植物,茄科,茄属草本植物,是除小麦、水稻、玉米外的世界第四大作物。我国是世界上马铃薯第一生产大国,种植面积是世界马铃薯种植面积的 1/4,产量占世界的 1/5。2012 年我国马铃薯种植面积达 55.3 万公顷,产量达 1855.25 万吨。2015 年 1 月 6 日,中国农业科学院、中国种子协会、国家食物与营养咨询委员会在北京举办马铃薯主粮化发展战略研讨会,以马铃薯主粮化与国家粮食安全为主题,深入研讨马铃薯主粮化的战略意义、发展思路、目标任务和推进途径。我国于今年将启动马铃薯主粮化战略,推进把马铃薯加工成米粉、面条、馒头等主食,马铃薯将成为我国继水稻、小麦、玉米外又一主粮。预计 2020 年 50%以上的马铃薯将作为主粮消费。与传统 3 大作物相比,马铃薯耐瘠薄,单产增产潜力大,因此发展马铃薯产业对缓解我国粮食安全压力起到重要作用。近年来随着马铃薯种植经济效益的提高,全国马铃薯的种植面积不断扩大,预计至2018年全国马铃薯种植面积达 1亿亩。近几年因重迎茬种植严重,致使马铃薯的一些次生病害逐渐凸显,马铃薯疮痂病就是其中之一。各产区均有疮痂病的发生,其发生率和严重程度呈逐年上升的趋势。马铃薯疮痂病是由土壤中习居的链霉菌引起的,因其对马铃薯的外观、等级和品质有影响,对全世界的马铃薯种植地区来说都是一种严重的病害。在美国,疮痂病被认为是马铃薯生产上的第四大病害。

马铃薯疮痂病的防治方法国外已报道多种,如选育抗病品种、化学防治、灌溉、轮作并施用绿肥和生物防治等方法。

因为马铃薯疮痂病病原菌存在多样性,并且会在土壤中存活多年,所以防治工作很难进行。据报道,在没有种植马铃薯作物之前,疮痂链霉菌就已经存在于土壤中。国外研究还表明,国外学者采用生物防治手段来防治马铃薯疮痂病取得了良好的防效。Schottel等报道选用非致病性链霉菌菌株对 S. scabies 菌株进行生物防治,防治效果显著。Eckwall 等在大田试验中使用 S.diastatochromogenes PonSSII 来防治疮痂病,结果发现疮痂症状明显的减轻。Hiltunen等的研究也表明利用非致病性链霉菌也可以有效防治疮痂病链霉菌。另外,Han等报道利用芽孢杆菌产生的代谢物 macrolactin A 可以有效地使疮痂病的发病率降低 40%。上述研究表明,国外学者采取生物防治的手段来防治马铃薯疮痂病确实取得了良好的防治效果。

此外,国内刘大群等采用生物防治法对马铃薯疮痂病进行防治,发现不同菌系的防效差异明显。拮抗菌株 ZWQ-1 对马铃薯疮痂病具有较好的防治作用。李勇等也发现马铃薯疮痂病菌拮抗菌株 ZWQ-1(根据拮抗菌株 ZWQ-1 的形态和生理生化特征与枯草芽孢杆菌一致,因此将其鉴定为枯草芽孢杆菌)通过盆栽接种防病测试,结果表明拮抗菌株 ZWQ-1 对马铃薯疮痂病具有较好的防治作用,但该菌株目前并未见开发应用到生产中。

崔国臣等在专利号:2013106658443,2013106658439,2013106658246中公开了一种微生物菌剂在拮抗马铃薯疮痂病中的应用研究,所述的微生物菌剂采用枯草芽孢杆菌,放线菌,玫瑰黄链霉菌作为菌种,制备成发酵液,能够高效拮抗马铃薯疮痂病原菌,刺激植物生长,改善作物品质,从而达到增产的目的;乔长晟等在专利号2015109095764中公开了一种防治马铃薯疮痂病的微生物肥料及其制备,使用方法中,按微生物发酵菌剂,复合营养素的质量比为0.5-2:1,且其中解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和荧光假单胞菌各自对应的发酵液以1:1:1的质量比混合,所得微生物肥料稀释施浇于马铃薯块茎,但发酵菌液一般难以保存持久;赵兴民在专利号200810158030X中公开了一种预防马铃薯疮痂病的有机肥料,由堆肥化物料,家用过磷酸钙,硫磺粉,五氯硝基苯粉剂组成,主要是靠化学原料起到预防的效果。周波等在专利号2014102728901中公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治马铃薯疮痂病中的应用,还保护一种生物菌肥,包括所述解淀粉芽孢杆菌和有机肥;由于病原菌的多样性和同步进化特性,单一拮抗菌株也无法达到很理想的防治效果,因此,生防菌的很多生物功能需要依靠两株或两株以上的细菌间的协同作用,才能发挥出更好的作用。



技术实现要素:

本发明所要解决的问题是研制出一种能够高效防治马铃薯疮痴病的微生物菌肥,制备该微生物菌肥的原料按重量份为:阿氏芽孢杆菌菌粉10-30份,沙福芽孢杆菌菌粉10-30份,加德那链霉菌菌粉(Streptomyces gardneri10-30份,焦土链霉菌菌粉10-30份,黄腐酸钾20-60份,棉粕粉10-30份;该菌肥复配的菌种特点主要是适应性强,稳定性好,能共生共存,都分离自土壤,对病原菌抑菌性强等特点,并合理利用微生物间的相互作用,配备高技术的生产发酵技术生产出优质的产品。该微生物菌肥能高效拮抗马铃薯疮痴病的病原菌,具有固氮,刺激植物生长、改善作物品质等作用,从而达到增产、高产的目的。

另一个目的,提供了一种防治马铃薯疮痂病的微生物菌肥的制备方法,其具体制备方法,包括以下步骤:

步骤一、阿氏芽孢杆菌菌粉的制备

取出阿氏芽孢杆菌保藏管,用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基,在30℃培养箱中培养48小时,用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L阿氏液体种子培养基的500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前10小时通气量为200L/min,10小时后通气量为320L/min ,30℃培养16-24小时,待总菌含量不低于20亿cfu/ml,即可作为阿氏芽孢杆菌液体种子;

发酵:将上述制备的阿氏芽孢杆菌液体种子加至阿氏芽孢固体发酵培养基中,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,翻料控制发酵温度为30-40℃,发酵36-48小时,待芽孢含量不低于100亿cfu/g,即可晒干,待水分含量低于10%,粉碎过40目筛,即得到阿氏芽孢杆菌菌粉;

其中,所述营养肉汁固体培养基:蛋白胨5g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂20 g,水1000mL,pH7.2;

其中,所述阿氏液体种子培养基:玉米淀粉20 g/L, 豆粉10 g/L,硫酸镁0.2 g/L,硫酸锰0.1 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,磷酸氢二钠1.0 g/L,pH7.0。各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

其中,阿氏芽孢固体发酵培养基:甘蔗渣60%,麸皮35%,菜粕2%,石粉1%,粗玉米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%。各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

步骤二、沙福芽孢杆菌菌粉的制备

取出沙福芽孢杆菌保藏管,用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基,在30℃培养箱中培养48小时,用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L沙福液体种子培养基的500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前12小时通气量为200L/min,12小时后通气量为320L/min ,30℃培养16-24小时,待总菌含量不低于10亿cfu/ml,即可作为沙福芽孢杆菌液体种子;

发酵:将上述制备的沙福芽孢杆菌液体种子加至沙福芽孢固体发酵培养基中,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为30-40℃,发酵36-48小时,待芽孢含量不低于50亿cfu/g,即可晒干,待水分含量低于10%,粉碎过40目筛,即得到沙福芽孢杆菌菌粉;

其中,所述营养肉汁固体培养基:蛋白胨5g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂20 g,水1000mL,pH7.2;

其中,所述沙福液体种子培养基:葡萄糖8g/L,玉米粉10 g/L, 豆粉10 g/L,硫酸镁0.2 g/L,硫酸锰0.1 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,磷酸氢二钠1.0 g/L,pH7.0。各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

其中,沙福芽孢固体发酵培养基:麸皮60%, 玉米皮35%,棉粕2%,石粉3%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,硫酸锰0.01%,培养基含水量50%-60%。各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

步骤三,加德那链霉菌菌粉的制备

取出加德那链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养箱中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为加德那链霉菌种子液;

发酵:将上述制备的加德那链霉菌种子液以3%的接种量接种至灭菌的加德那链霉菌固体发酵培养基上,菌种与加德那链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的加德那链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为3-6cm,控温28-32℃,第一天空气湿度保持为60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵3-4天,检测其孢子含量不低于20亿CFU/g,即可低温风干至水分低于8%,粉碎过40目筛,即得到加德那链霉菌菌粉;

其中,所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾:1克,可溶性淀粉:20克,磷酸氢二钾:0﹒5克,硫酸镁:0﹒5克,氯化钠:0﹒5克,硫酸亚铁:0﹒01克,琼脂:20克,蒸馏水补足1000ml ,PH7﹒2~7﹒4;

其中,所述的加德那链霉菌固体发酵培养基:甘蔗渣80%,豆粕2%,玉米芯粉1%,石粉10%,麸皮7%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%。各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

步骤四,焦土链霉菌菌粉的制备

取出焦土链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养箱中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为焦土链霉菌种子液;

发酵:将上述制备的焦土链霉菌种子液以5%的接种量接种至灭菌的焦土链霉菌固体发酵培养基上,菌种与焦土链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的焦土链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-8cm,控温28-32℃,前两天空气湿度保持为60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵4-6天,检测其孢子含量不低于10亿CFU/g,即可低温风干水分低于8%,粉碎过40目筛,即得到焦土链霉菌菌粉;

其中,所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾:1克,可溶性淀粉:20克,磷酸氢二钾:0﹒5克,硫酸镁:0﹒5克,氯化钠:0﹒5克,硫酸亚铁:0﹒01克,琼脂:20克,蒸馏水补足1000ml ,PH7﹒2~7﹒4;

其中,所述的焦土链霉菌固体发酵培养基:米糠80%,棉粕2%,玉米粉1%,石粉2%,麸皮15%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%。各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

步骤五,将上面制成的各种菌粉按阿氏芽孢杆菌菌粉10-30份,沙福芽孢杆菌菌粉10-30份,加德那链霉菌菌粉(Streptomyces gardneri10-30份,焦土链霉菌菌粉10-30份,黄腐酸钾20-60份,棉粕粉10-30份混合均匀,即为防治马铃薯疮痂病的微生物菌肥。

其中,防治马铃薯疮痂病的微生物菌肥的施用方法为拌种,拌种的用量为马铃薯种薯重量的1/10-1/20。

链霉菌作为微生物源农药之一,在生物防治中具有很多优势。链霉菌分布范围广、种类多,自从Cohn(1872)发现链霉菌至今,很多链霉菌可产生多种抗生素和酶,在微生物产生的新生物活性物质中,链霉菌产生的就占到了74%;有些链霉菌还可寄生于植物病原菌中;此外,在自然环境中放线菌可通过产生植物激素和植物生长抑制剂,调整土壤的微生态环境,对提高植物抗性和抑制土传植物病菌具有重要作用。本发明中含有加德那链霉菌与焦土链霉菌,能产生原放线菌素A,B,C,焦土霉素,和一种大环内酯菌素,经过平板对峙试验其能很好的抑制马铃薯疮痂病原链霉菌的微生物,而且能产生磷酸酶,增溶土壤中的P元素,更好地促进植物吸收。我们发现这两株链霉菌接种在含磷酸岩的培养基上,能显著增加马铃薯植株N、P含量。

本发明中含有阿氏芽孢杆菌与沙福芽孢杆菌,这两株芽孢杆菌都是从土壤和植株中分离得到,能产生耐热、抗逆性的芽孢,具有显著的生防潜力,对马铃薯的早疫病与晚疫病菌的抑制有明显的效果;阿氏芽孢杆菌与沙福芽孢杆菌作为根迹促生微生物,它们能寄生根,叶,和其他植物表面。能迅速拓殖植物根毛,树叶,和其他表面,能防止致病真菌和细菌的建立。另外,阿氏芽孢杆菌具有较强的固氮的能力,在土壤中能较好的起到固氮的效果。

本发明的有益效果:本发明的微生物菌肥与马铃薯拌种后,可以在马铃薯周边快速生长,产生大量的放线菌素A,B,C,焦土霉素,和大环内酯菌素,可以有效的抑制疮痂病原菌的生长;同时产生磷酸酶与固氮酶活,起到固氮,解磷的作用,并产生一系列的植物激素促进马铃薯的快速生长;通过将本发明的微生物菌肥拌种马铃薯,改善了马铃薯周边的微环境,使得土壤疏松透气,起到保水保肥作用,利于马铃薯的膨大,经过大田试验,能明显减轻马铃薯的疮痂病害,其防效达到了78.6%以上,增产率也达到了15.56%,起到明显的增产增收效果。

选用了四个菌种组合,其中有的可以促进作物生长的菌株,也有分泌抗生素物质来抑制土壤中病原菌生长的菌株。与普通的化学肥料和化学农药不同,微生物菌肥并不是直接给作物提供营养,而是利用微生物菌肥里含有的活微生物的生命活动来改善作物根际生态环境,转化土壤中作物不可直接利用的营养元素为作物可利用的速效营养,菌株还可以分泌促生物质来刺激作物生长。在治病方面,微生物菌肥采用以菌治菌的原理,利用拮抗菌株分泌的抗生物质来抑制土壤中病原菌的生长,使病原菌在土壤中无法达到致病数量,从而无法侵染作物,使作物发病。

实施例2:拮抗马铃薯疮痴病的微生物菌剂田间应用效果

拮抗马铃薯疮痴病的微生物菌剂田间应用试验如下。

①试验方案及设计:在同一个喷灌圈试验,总约500亩;分10块面积,间隔做试验,即试验组与对照组相互间隔。前一年疮痂病发病较晋重,病情指标达到了34%;

试验组:250亩,在马铃薯疮痴病严重的试验田中施用本发明产品;拌种,用量为种子质量的1/10;

对照组:以不施用本产品,常规用消毒药包衣

试验地点:河北张家口沽源县某种植公司,露地直播。

②马铃薯疮痴病分级标准:

戴线手套去土,不损坏薯块表皮。目测。0级:薯块无病斑;1级:有1-3个明显病

斑,或有多个小病斑斑点,但总体危害很轻;2级:有4个以上明显病斑。

③检测结果与分析:从表1中可以看出,试验组的马铃薯薯块皮色光亮、光泽好;对照组生产的马铃薯薯块皮色暗。试验说明,本发明产品预防马铃薯疮痴的防病效果为78. 6%以上。且使马铃薯薯块皮色光亮、光泽好、明显增长。该试验土壤地块系春马铃薯连作5年,马铃薯疮痴病发病已经较为严重。试验组平均产量为4894kg,对照组平均产量只有4235kg,增产率也达到了15.56%,具有明显的增产效果。

表1拮抗马铃薯疮痴病的微生物菌肥对病薯防效

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