本发明涉及一种含有复合菌剂的脲醛缓释肥料的制备方法。
背景技术：
海藻肥料以天然海藻为原料，经过特殊生化工艺处理，提取并保留海藻天然活性成分，精炼浓缩而形成的一种新型有机肥料。海藻肥料具有提高作物产量和品质，抵抗病虫害及不良环境以及改良土壤保持水土的功效，其应用于农业生产有巨大的市场需求和良好的发展前景。但是，要保障海藻肥料的质量，就必须把握好海藻原料和提取工艺两个关键环节。
首先，海藻肥料质量的优劣取决于所用的原料。目前，海藻肥生产企业所用的原料主要以褐藻为主，包括泡叶藻、昆布、海带、马尾藻等。其他藻类如墨角藻、浒苔、石莼、卡帕藻等也有少数企业在用。国外海藻肥企业绝大多数使用褐藻为原料，其中尤以泡叶藻应用最为广泛如Seasol、Maxicrop等知名品牌，实际作用效果也表明泡叶藻是优质的海藻原料。但是，我国沿海没有泡叶藻分布，国内企业采用的原料种类繁杂，品质参差不一，造成海藻肥产品质量良莠不齐，甚至有些厂家打着“海藻肥”的幌子，直接勾兑褐藻酸，黄腐酸、氮磷钾等冒充海藻肥，影响了海藻肥质量，扰乱了海藻肥市场。
其次，决定海藻肥质量的第二个因素是提取工艺。不同的提取工艺对海藻肥活性成分的种类和含量影响巨大。目前，海藻活性成分的提取方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，化学试剂对海藻细胞内的活性物质成分的破坏是相当大的，并且残留的有机试剂对环境也是潜在的危害。物理法的原理是控制压力，温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放。该方法虽然工艺清洁、环境友好，但是对于仪器设备的要求严苛，反应条件变化剧烈，成本较高，难以实现大规模生产。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法反应温和，产物多元化，整个生产过程安全环保无污染，是理想的海藻肥生产方法。
利用微生物发酵法生产海藻肥料的研究相对较少，仅有的几例研究是选用多种微生物对海藻原料进行类似堆肥发酵或好氧发酵处理，存在发酵过程可控性差，发酵周期长，目标产物不明确等问题，难以满足工业化生产要求的统一，稳定，可控的标准，产品的质量难以保障。
针对农业用微生物的评价指标主要包括菌剂的纯度和单位质量中的菌剂数量。因此，作为现有技术的菌剂制备方法一般是：在微生物适宜生存的温度和pH条件下进行一次发酵工艺，相当于温室培养。
由于目前土壤板结酸化严重，外界气温变化无常，温室培养的微生物菌剂直接投放到土壤中，因不能适应恶劣的土壤环境造成大量死亡，即使有少量存活因无法形成种群效应，也无法发挥微生物菌剂的效果。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种含有复合菌剂的脲醛缓释肥料的制备方法，第一、采用性能优良的用于降解褐藻酸的巨大芽孢杆菌和噬糖芽孢杆菌降解海藻，并模拟土壤自然生态环境，使发酵后的巨大芽孢杆菌和噬糖芽孢杆菌在投入土壤后，能很快适应环境，确保存活率；第二、提供利用巨大芽孢杆菌和噬糖芽孢杆菌的复合菌剂制备脲醛缓释肥料的方法，该方法发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种含有复合菌剂的脲醛缓释肥料的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：
将氮肥、磷肥、钾肥、脲醛粉和辅料按照质量比10～90∶10～90∶10～90∶5～15∶5～20加入到造粒滚筒中造粒，经烘干、冷却和筛分后，得到脲醛缓释肥料；在包裹滚筒中，将包裹油和复合菌剂喷入到脲醛缓释肥料表面，得到含有复合菌剂的脲醛缓释肥料，脲醛缓释肥料、包裹油和复合菌剂的质量比是50～99.8∶0.1～10∶0.1～40；
所述辅料为膨润土、高岭土和滑石粉中的一种或任意比例的两种以上；
所述脲醛粉是尿素和甲醛按照摩尔比1∶1.2聚合，然后压滤烘干后得到的粉剂；
其中复合菌剂按照以下步骤制备而成：
1)、制备海藻粉末：将烘干后的海藻磨成粉末；
2)、制备产品A：海藻粉末与水按照质量比1～10∶100装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；
并制备种子液：将巨大芽孢杆菌和噬糖芽孢杆菌按照1～5∶1～5的体积比例混合接种至液体培养基，在25℃～40℃培养20～30小时；复合菌种与培养基之间的体积比为1～10∶100；
3)、制备产品B：将种子液加入到产品A中得到产品B，其中种子液与产品A的质量比为1～10∶100；
4)、制备产品C：在温度为25℃～40℃，pH5～9的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为6～10天，得到产品C；
5)、制备产品D：调整产品C的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品D；
6)、制备产品E：调整产品D的温度至25℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为1～10∶100，保存3h～72h，得到产品E；
7)、制备产品F：调整产品E的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品F；
8)、制备产品G：调整产品F的温度至25℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为1～10：100，保存3h～72h，得到产品G；
9)、制备复合菌剂：将产品G风干后得到复合菌剂。
所述液体培养基按照以下质量比配成：海藻酸钠5份、硫酸铵5份、硫酸镁1份、磷酸氢二钾2份、硫酸亚铁0.01份和蒸馏水1000份。
步骤2)所述海藻粉末和水的质量比为4∶100；灭菌温度115℃，灭菌时间25min；制备种子液时，复合菌种接种至液体培养基中，培养22小时，得到种子液，复合菌种和培养基的体积比例为5∶100；步骤5)和步骤7)中，温度为5℃，保存时间为12h。
步骤4)、步骤6)和步骤8)中，温度为25℃，pH为6.5～7.0；步骤4)发酵时间为8天；步骤6)和步骤8)保存时间为12h；步骤6)中发酵种子液与产品D的质量比以及步骤8)中发酵种子液与产品F的质量比均为5∶100。
步骤5)、步骤6)步骤7)和步骤8)中，调整温度均为每小时调整3℃。
所述海藻是指鼠尾藻，海带，裙带，铜藻和马尾藻中的一种或任意比例的两种以上。
所述的巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌YIC～BM1，保藏号为CGMCC No.12156；所述的噬糖芽孢杆菌为嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，保藏号为CGMCC No.12155。
发明具有以下有益技术效果：
本发明通过筛选得到两株海洋来源的菌株：巨大芽孢杆菌和噬糖芽孢杆菌，两株菌均具有降解褐藻酸的能力，一方面能够降解褐藻酸生成小分子量的褐藻寡糖等易于植物吸收利用的营养成分；另一方面破坏海藻细胞壁结构促使海藻体内更多营养物质得以释放。利用此混合菌株发酵处理铜藻、鼠尾藻等马尾藻属海藻原料，发酵一定天数后在发酵液中可检测到分子量在4000Da以下、聚合度为2-20的褐藻寡糖，以此发酵液作为海藻肥母液，直接或者复配N、P、K，微量元素，氨基酸，有机质等有效成分用于农作物生长。肥效实验表明，利用该方法获得发酵液能够明显促进植物根系生长，改良土壤微环境，提高作物产量。
本发明还具有以下特点：
1、采用本发明得到的海洋来源的巨大芽孢杆菌YIC～BM1和嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3对海藻发酵，发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。
2、本发明得到的复合菌剂具有水溶性好，易于植物吸收利用，同时作为一种重要的信号分子，能够参与植物的生长调节和诱导抗病过程促进植物的生长，提高植物对不良环境及病虫害的抵抗力。
3、本发明通过缓慢的温度调节，使复合菌剂适应温度的变化，避免温度变化过快，复合菌剂不能适应而大量死亡。
4、本发明得到的巨大芽孢杆菌和噬糖芽孢杆菌的复合菌株在具有海藻提取物特征外，还具有较强的环境适应性，在投入到酸化的土壤中及温度变化无常的环境中，能很快适应环境存活，发挥微生物菌剂的作用。
5、本发明通过包裹油将复合菌剂和脲醛缓释肥料阻隔，并且利用包裹油的粘性将复合菌剂均匀的粘结在肥料的表面，可以有效避免复合菌剂与高盐分的脲醛缓释肥直接接触，防止因有机无机肥盐分过高导致复合菌剂细胞失水，造成复合菌剂大量死亡。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实施例1
将洗净烘干后的新鲜鼠尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比2∶100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌30min，得到产品A；并制备种子液：将巨大芽孢杆菌YIC～BM1和噬糖芽孢杆菌YIC～Alg3按照体积比1∶1的比例混合接种至液体培养基培养20小时；所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156，所述的嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3保藏号为CGMCC No.12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为2∶100，嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为1∶100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为1∶100，得到产品B；在温度为20℃，pH5.5～6.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为7天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时20℃的温度变化调整温度至5℃，保存24h，得到产品D；以每小时20℃的温度变化调整产品D的温度至20℃，pH至5.5～6.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为1∶100，保存24h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时20℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存24h，得到产品F；以每小时20℃的温度变化调整产品F的温度至20℃，pH至5.5～6.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为1∶100，保存24h，得到产品G；将产品G风干后得到复合菌剂；将氮肥、磷肥、钾肥、脲醛粉和辅料按照质量比25∶30∶30∶10∶5加入到造粒滚筒中造粒，产品经烘干、冷却和筛分后，进入到包裹滚筒，得脲醛缓释肥料在包裹滚筒中，将包裹油和复合菌剂喷入到脲醛缓释肥料表面，脲醛缓释肥料、包裹油和复合菌剂的质量比为99∶0.5∶0.5，得到含有复合菌剂的脲醛缓释肥。
实施例2
将洗净烘干后的新鲜铜藻和新鲜马尾藻按照质量比1∶1复配，磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比4∶100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A；并制备种子液：将巨大芽孢杆菌YIC～BM1和嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3按照体积比1∶2的比例混合接种至液体培养基培养20小时；所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156，所述的嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3保藏号为CGMCCNo.12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5∶100，嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3和培养基比例为2∶100，将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为5∶100，得到产品B；在温度为25℃，pH6.5～7.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为8天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品D；以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为5∶100，保存12h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存12h，得到产品F；
以每小时3℃的温度变化调整产品F的温度至25℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为5∶100，保存12h，得到产品G；将产品G风干后得到复合菌剂；将氮肥、磷肥、钾肥、脲醛粉和辅料按照质量比30∶25∶30∶10∶5加入到造粒滚筒中造粒，产品经烘干、冷却和筛分后，进入到包裹滚筒，得脲醛缓释肥料；在包裹滚筒中，将包裹油和复合菌剂喷入到脲醛缓释肥表面，脲醛缓释肥料、包裹油和复合菌剂的质量比为99∶0.5∶0.5，得到含有复合菌剂的脲醛缓释肥。
实施例3
将洗净烘干后的新鲜马尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比6∶100装入发酵罐中，在125℃条件下灭菌35min，得到产品A；并制备种子液：将巨大芽孢杆菌YIC～BM1和嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3按照体积比1∶1的比例混合接种至液体培养基，分别接种至液体培养基培养20小时；所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156，所述的嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3保藏号为CGMCC No.12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为1∶100，嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3和培养基比例为5∶100，将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为4∶100，得到产品B；在温度为30℃，pH7～7.5的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为9天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时1℃的温度变化调整温度至5℃，保存18h，得到产品D；以每小时8℃的温度变化调整产品D的温度至30℃，pH至7～7.5，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为4∶100，保存18h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时1℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存18h，得到产品F；
以每小时8℃的温度变化调整产品F的温度至30℃，pH至7.0～7.5，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为4∶100，保存18h，得到产品G；将产品G风干后得到复合菌剂；将氮肥、磷肥、钾肥脲醛粉和辅料按照质量比30∶30∶25∶8∶7加入到造粒滚筒中造粒，产品经烘干、冷却和筛分后，进入到包裹滚筒，得脲醛缓释肥料；在包裹滚筒中，将包裹油和复合菌剂喷入到脲醛缓释肥表面，脲醛缓释肥料、包裹油和巨大芽孢杆菌菌剂的质量比为99∶0.5∶0.5，得到含复合菌剂的脲醛缓释肥。
实施例4
将洗净烘干后的新鲜马尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比9∶100装入发酵罐中，在140℃条件下灭菌15min，得到产品A；并制备种子液：将巨大芽孢杆菌YIC～BM1和嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3分别接种至液体培养基培养20小时；所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156，所述的嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3保藏号为CGMCC No.12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为1∶100，嗜糖芽胞杆菌YIC～Alg3和培养基比例为1∶100，将两种种子液按照1∶2的比例加入到产品A种，其中种子液与产品A的质量比为8∶100，得到产品B；在温度为35℃，pH6.5～7.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为9天得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品D；以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至35℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为8∶100，保存12h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存12h，得到产品F；
以每小时3℃的温度变化调整产品F的温度至35℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为8∶100，保存12h，得到产品G；将产品G风干后得到复合菌剂；将氮肥、磷肥、钾肥、脲醛粉和辅料按照质量比25∶30∶30∶7∶8加入到造粒滚筒中造粒，产品经烘干、冷却和筛分后，进入到包裹滚筒，得脲醛缓释肥料；在包裹滚筒中，将包裹油和复合菌剂喷入到脲醛缓释肥料表面，脲醛缓释肥料、包裹油和复合菌剂的质量比为99∶0.5∶0.5，得到含有复合菌剂的脲醛缓释肥。
实施例1至4中，所述氮肥是硫酸铵，磷肥是磷酸一铵，脲醛粉为尿素和甲醛摩尔比1∶1.2缩合而成的经压滤后得到的粉剂，钾肥是硫酸钾，所述辅料为膨润土。
1试验时间和地点
1.1试验时间
2014年10月5日(播种)-2015年6月2日(收获)
1.2试验地点
山东省费县上冶镇宁国庄村。
2试验材料
2.1供试土壤
供试土壤为褐土，质地为轻壤壤土，土壤肥力中下等，灌排条件较好。基础肥力见表1。
表1供试土壤基础肥力
2.2供试肥料
含复合菌剂的脲醛缓释肥：复合菌≥0.2亿/克，N≥15％，P2O5≥15％，K2O≥15％，其中缓释有效氮≥2，由五洲丰农业科技有限公司提供；普通复混肥：N≥15％，P2O5≥15％，K2O≥15％，由五洲丰农业科技有限公司提供；尿素，N≥46％，山东新泰市楼德化肥厂生产。
2.3供试作物及栽培方式
小麦，山农15，于2014年10月5日播种，播种量为120kg/hm2。
2.4试验方法
2.4.1试验设计试验设6个处理：
处理1(CK1)：普通有机无机复混肥；
处理2(CK2)：加入未调整温度和pH的复合菌的海藻脲醛缓释肥；
处理3(T1)：实施例1所述海藻脲醛缓释肥；
处理4(T2)：实施例2所述海藻脲醛缓释肥；
处理5(T3)：实施例3所述海藻脲醛缓释肥；
处理6(T4)：实施例4所述海藻脲醛缓释肥。
每个处理3次重复，随机区组排列，小区长12m，宽5m，面积60m2，设保护行。
2.4.2施肥方法
各施肥处理均施复混肥60kg/666.7m2作基肥，于起垄时一次施入，并于小麦返青期追施尿素15kg/666.7m2。
2.4.3收获
各试验小区于2014年6月2日进行测产验收，分别称量计产；在小麦收获时，以小区为单位，在小区中间部位量取1m2面积区域收获1m2籽粒，经自然风干，测定籽粒含水量后，进行计产和统计分析。于小麦收割后采用五点取样法取耕层混合土样，涂布平板法测定土壤中复合菌数量。
3试验结果与分析
3.1小麦不同施肥处理肥料效应分析
如表2所示，与普通施肥处理(CK)相比，加入复合菌的海藻脲醛缓释肥处理均有不同程度的增产。其中实施例2和实施例3产量显著高于其他几个处理，达极显著水平，分别比CK1增产50.2kg/666.7m2，增幅9.6％和增产51.9kg/666.7m2，增幅9.8％；实施例4和实施例1比对照1和对照2明显增产达极显著水平，分别比CK1增产39.2kg/666.7m2，增幅7.5％和增产32.6kg/666.7m2，增幅6.3％；加入未调整温度和pH的复合菌的海藻脲醛缓释肥也有明显的增产效果，增产13.0kg/666.7m2和2.5％。总体来说，几个处理的产量顺序为T3＞T2＞T4＞T1＞CK2＞CK1。
表2供试肥料对小麦产量的影响
3.2不同施肥处理土壤中复合菌的活性分析
表3不同处理土壤中复合菌数量
104CFU/g
如表3所示，施入添加复合菌的海藻脲醛缓释混肥后，小麦收割时耕层土壤中都有不同数量的巨大芽孢杆菌和噬糖芽孢杆菌存活，并且存活数量与小麦产量呈正相关关系。其中实施例3处理土壤中两种复合菌数量最多，达到34.2*104CFU/g，其后T2、T4、T1、CK2依次递减。
本发明所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillus megaterium。
所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的生物特性如下：
YIC～BM1菌株在纤维素培养基平板上生长48h后，菌落圆形，白色，表面平整。显微镜观察菌株为革兰氏阳性，杆状，能运动，产芽孢。生长温度范围20～40℃，PH范围6-10，NaCl浓度范围0～20％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，半乳糖苷酶阳性，吲哚，VP实验阴性，不还原硝酸；能够利用葡萄糖，甘露糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇，山梨醇。根据其生理生化特征，基因序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。
本发明所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No.12155；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillus halosaccharovorans。
所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的生物特性如下：
YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生长48h后，菌落不规则，淡黄色，中间不透明，边缘半透明，表面褶皱。显微镜观察菌株为杆状，在末端或近末端可产生芽孢，革兰氏阳性，能运动，生长后期菌体易聚集成团。生长温度范围20～45℃，PH范围6～9，NaCl浓度范围0～15％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，VP试验阳性，能够利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纤维素。根据其生理生化特征，基因序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为嗜糖芽孢杆菌Bacillus halosaccharovorans。
注：+表示可以利用，～表示不能利用。