技术领域
本发明涉及农业科学和环境生物学的技术领域，尤其涉及一种综合利用玉米秸秆和牛粪生产高含菌量生物有机肥及其生产工艺。
技术背景
我国是农业大国，在北方地区玉米种植面积广，玉米秸秆是主要农作物秸秆之一，具有来源广、数量大、价格低、竞争用途少和开发利用潜力大等特点。我国玉米秸秆年产量约7亿吨，占全国秸秆年产量的56.6 %。玉米秸秆作为一种非竞争性、潜在性和战略性后备可再生资源，倍受重视。农作物秸杆在能源、家畜饲料、还田肥料和工业原料等方面逐渐被应用。
与发达国家相比，我国玉米秸秆的规模化技术和程度发展至今已落后于现代农业发展的需要，一直处于高消耗、高污染和低产出的现状。我国每年用于工业及造纸的秸秆仅占4 %，用于家畜饲料约占20 %，造肥还田约占14 %，剩余可作为能源利用的秸杆总量约占43 %，但秸秆作为燃料使用，产生的热值低，营养利用率为零，同时又会产生大量的烟雾粉尘，对环境造成一定程度的污染。目前，我国农村约2亿吨的秸秆被直接用作生活燃料，被低效率地燃烧掉，其余的秸秆随意堆放，既存在安全隐患，又影响村容村貌；有些农户则就地焚烧秸秆，既浪费资源，又污染环境。
玉米秸秆中含粗纤维(CF) 31-41 %，中性洗涤纤维(NDF)约80 %，酸性洗涤纤维(ADF)约53 %，粗蛋白(CP) 3-5 %，无氮浸出物约42 %，营养物质很丰富，可用为多种微生物提供培养物质，用以作为有机肥生产的原料，解决玉米秸秆的浪费问题，提升其经济价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高含菌量生物有机肥生产工艺，解决了传统利用玉米秸秆生产生物有机肥有效活菌数含量低，施用效果差的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种高含菌量生物有机肥生产工艺，通过以下方法制备：
(a) 分别活化绿色木霉和拟康氏木霉菌株，逐级扩大培养，按常规固态发酵方法制备绿色木霉和拟康氏木霉种曲，备用；
(b) 分别活化解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌菌株，逐级扩大培养，按常规液态发酵方法制备解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母发酵液，备用；
(c) 将上述制备的绿色木霉和拟康氏木霉种曲及解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌发酵液按重量比5:4:5:6:5混合均匀，制成玉米秸秆一次发酵中所使用秸秆的腐熟剂；
(d) 粉碎玉米秸秆，将粉碎的玉米秸秆与牛粪按质量比1:1混合，并向其中加入无机氮源，调节玉米秸秆和牛粪混合物的C/N至20-30。再加入所述玉米秸秆和牛粪混合物总质量1.0-1.5倍的水，搅拌混匀，得发酵料；
(e) 在所述发酵料中按发酵料质量3-5%的接种量接种所述玉米秸秆腐熟剂，搅拌混匀，堆料发酵10-15 d，得玉米秸秆、牛粪有机肥；
(f) 分别活化胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和圆褐固氮菌菌株，逐级扩大培养，按常规液态发酵方法制备胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和圆褐固氮菌发酵液。将三种发酵液等体积混合，制成二次发酵所需的功能菌剂，备用；
(g) 向所述玉米秸秆、牛粪有机肥中加水调节其含水量至50-60 %，然后向其中接种用于二次发酵的有机肥质量约10 %所述的功能菌剂，混合均匀后堆置发酵3-5小时，即制成高含菌量生物有机肥生产工艺；
(h) 将所述的高含菌量生物有机肥生产工艺造粒、干燥，制成高含菌量生物有机肥生产工艺成品。
本发明步骤(a)所述的木霉菌种的活化是指将绿色木霉和拟康氏木霉菌种分别接种于PDA斜面培养基上，使其在温度为28-30 ℃下恒温培养3-4 d，斜面长满孢子即可。所述的扩大培养均是指将活化后的菌株接种到克氏瓶中制备霉菌孢子；然后将霉菌孢子用无菌水洗下来，接种于固态发酵种子罐进行扩大培养。
其中绿色木霉和拟康氏木霉菌固态发酵培养基均按以下组分比例及工艺条件配置：麸皮40 Kg、稻壳60 Kg，(NH4)2SO4 0.5 Kg、水150-200 Kg，搅拌混匀，采用0.10 MPa灭菌20 min，将克氏瓶中的霉菌孢子用无菌水洗下，接种于固态发酵培养基中，搅拌均匀后于固态发酵罐中30 ℃通风培养3-4 d，即得木霉种曲。
本发明步骤(b)所述的解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌种的活化是指将解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌接种于LB斜面培养基上，使其在温度为37 ℃下恒温培养2 d，斜面长满孢子即可；产朊假丝酵母菌菌种的活化是指将产朊假丝酵母菌接种于YPD斜面培养基上，使其在温度为28-30 ℃下恒温培养3-4 d，所述的扩大培养均是指将活化后的菌株接种到克氏瓶中制备种子；然后将克氏瓶中的菌体用无菌水洗下来，接种于液体发酵罐进行扩大培养。
本发明中PDA斜面培养基为马铃薯葡萄糖培养基，其按以下组分比例及工艺条件配置：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15-20 g、水1000 mL，pH值自然，马铃薯洗净去皮，切成小块煮沸30 min，采用0.10 MPa灭菌20 min，晾斜面。
本发明中LB斜面培养基按以下组分比例及工艺条件配置：蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、琼脂15-20 g、水1000 mL，pH调整为7.0。然后加入MgSO4 .7H2O 5g，以利于产生芽孢。
本发明中YPD斜面培养基按以下组分比例及工艺条件配置：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、琼脂15-20 g、水1000 mL，pH值自然，采用0.10 MPa灭菌20 min，晾斜面。
本发明步骤(d)所述的玉米秸秆为玉米的茎叶，所述粉碎玉米秸秆是指将玉米的茎叶粉碎至约3-5 cm。
本发明步骤(d)所述的无机氮为硫酸铵、磷酸铵、氯化铵、尿素或硝酸铵中的一种或两种任意比例的混合物。
本发明步骤(e)所述的发酵料堆为梯形条垛，其长约6.0 m，下宽约2.0 m，上宽约1.5 m，高约1.8 m。
本发明中多糖斜面培养基按以下组分比例及工艺条件配置：蔗糖10 g、K2HPO4 .7H2O 0.5 g、MgSO4 .7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO3 1.0 g、CaSO4 .7H2O 0.1 g、酵母汁0.4 g、水1000 mL，pH 7.2，采用0.10 MPa灭菌20 min，晾斜面。
本发明中无氮斜面培养基按以下组分比例及工艺条件配置：葡萄糖10 g、 KH2PO4.7H2O 0.2 g、MgSO4.7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO4.7H2O 0.2 g、CaCO3 5.0 g、琼脂15-20 g、水1000 mL，pH 7.0-7.2，采用113 ℃灭菌30 min，晾斜面。
本发明步骤(g)所述的补加3次碳源和氮源，所述补加的碳源为葡萄糖，氮源为尿素或磷酸铵中的一种或两种氮源的任意比例混合物，其中碳源和氮源的补加量分别为所述发酵料质量的4 %和6 %，试验证明，在本发明权利要求1的制备工艺的基础上增加补料工艺，可以显著延长菌体生长的对数期，增加发酵料中有效活菌的数量。
本发明以玉米茎叶和牛粪为原料，采用特定的玉米秸秆腐熟菌剂进行一次发酵，再采用具有解磷、解钾和固氮功能的菌剂进行二次发酵，最终制备出含有有机质、多种微量元素和功能微生物含量高的生物有机肥，本发明一次发酵所用菌剂中含有产朊假丝酵母菌，可以利用发酵料中的还原糖、铵盐等小分子物质进行生长，减少了牛粪发酵过程中氮素的损失，提高了生物肥料中氮的含量，通过采用固态发酵的生产方式，发酵工艺简单可行，无废水废渣排放，能耗低，成本少，环境污染小；二次发酵中所采用工艺提高了有效活菌的数量，制备出的生物有机肥有效活菌数量多，提升了产品的品质。
本发明有益效果为：本发明为适合于制备有效活菌数量高的生物有机肥的工艺，首先采用纤维素酶、半纤维素酶分泌丰富的木霉菌和芽孢菌发酵玉米秸秆和牛粪，积累大量的纤维素酶，将玉米秸秆和牛粪中的纤维素降解为还原糖；产朊假丝酵母菌可以利用发酵料中的还原糖、小分子和无机盐等进行生长，降低原料中氮素的损失，提高氮的含量，制备出高品质的有机肥。然后采用具有解磷、解钾、固氮功能的菌株对一次发酵有机肥进行二次发酵，特别在二次发酵期间增加了补料工艺，通过试验发现，该工艺延长了功能菌株生长的对数期，制备的生物有机肥中每克肥料中有效活菌数达到10亿，提升了肥效，为作物生长提供更多的营养。
本发明提供的制备方法成本低，工艺简单，可操作性强，便于推广应用，得到的生物有机肥有效活菌数量高，不仅能够真正将大量玉米秸秆资源实现高效转化，修复土壤，提高土壤肥力，变废为宝，而且还可以一定程度上缓解因秸秆焚烧而引起的环境污染问题。
申请人经过对两次发酵所用秸秆腐熟菌剂和功能菌剂中各菌株复配比例及两次发酵工艺进行科学的研究，所制备的高含菌量生物有机肥在各指标均达到国家标准，同时有效活菌数达到10亿/g，且各菌株含量均在1亿/g以上，满足生物有机肥国家标准NY884-2012中各指标的要求，比市售生物有机肥含菌量高出许多。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
本发明是一种利用微生物发酵玉米秸秆和牛粪生产有效活菌数含量高的生物有机肥的方法。将玉米秸秆粉碎成3 cm小段，与牛粪以质量比1:1混合，加入秸秆和牛粪总质量1-1.5倍的水，在加水的同时将活菌含量为38.9亿/g、用量为秸秆和牛粪总质量的3-5 %的腐熟剂一起加入其中，混合搅拌均匀进行堆料发酵10 d。待发酵完毕后向发酵料中加水调节含水量至50-60 %，再向其中接种发酵料质量10 %的功能菌剂，继续堆料进行二次发酵，发酵4 d，得到生物有机肥。
实施例2
本发明是一种利用微生物发酵玉米秸秆和牛粪生产有效活菌数含量高的生物有机肥的方法。将玉米秸秆粉碎成5 cm小段，与牛粪以质量比1:1混合，加入秸秆和牛粪总质量1-1.5倍的水，在加水的同时将活菌含量为38.9亿/g、用量为秸秆和牛粪总质量的3-5 %的腐熟剂一起加入其中，混合搅拌均匀进行堆料发酵10 d。待发酵完毕后向发酵料中加水调节含水量至50-60 %，再向其中接种发酵料质量10 %的功能菌剂，继续堆料进行二次发酵，发酵4 d，得到生物有机肥。
实施例3
本发明是一种利用微生物发酵玉米秸秆和牛粪生产有效活菌数含量高的生物有机肥的方法。将玉米秸秆粉碎成3 cm小段，与牛粪以质量比1:1混合，加入秸秆和牛粪总质量1-1.5倍的水，在加水的同时将活菌含量为38.9亿/g、用量为秸秆和牛粪总质量的3-5 %的腐熟剂一起加入其中，混合搅拌均匀进行堆料发酵15 d。待发酵完毕后向发酵料中加水调节含水量至50-60 %，再向其中接种发酵料质量10 %的功能菌剂，继续堆料进行二次发酵，发酵4 d，得到生物有机肥。
实施例4
本发明是一种利用微生物发酵玉米秸秆和牛粪生产有效活菌数含量高的生物有机肥的方法。将玉米秸秆粉碎成3 cm小段，与牛粪以质量比1:1混合，加入秸秆和牛粪总质量1-1.5倍的水，在加水的同时将活菌含量为38.9亿/g、用量为秸秆和牛粪总质量的3-5 %的腐熟剂一起加入其中，混合搅拌均匀进行堆料发酵15 d。待发酵完毕后向发酵料中加水调节含水量至50-60 %，再向其中接种发酵料质量10 %的功能菌剂，继续堆料进行二次发酵。在发酵进行到36 h时向发酵料中补加4 %碳源和6 %的氮源，共发酵4 d，得到生物有机肥。
实施例5
本发明是一种利用微生物发酵玉米秸秆和牛粪生产有效活菌数含量高的生物有机肥的方法。将玉米秸秆粉碎成3 cm小段，与牛粪以质量比1:1混合，加入秸秆和牛粪总质量1-1.5倍的水，在加水的同时将活菌含量为38.9亿/g、用量为秸秆和牛粪总质量的3-5 %的腐熟剂一起加入其中，混合搅拌均匀进行堆料发酵15 d。待发酵完毕后向发酵料中加水调节含水量至50-60 %，再向其中接种发酵料质量10 %的功能菌剂，继续堆料进行二次发酵。在发酵进行到36 h和48 h时分别向发酵料中补加4 %碳源和6 %的氮源，共发酵4 d，得到生物有机肥。
实施例6
本发明是一种利用微生物发酵玉米秸秆和牛粪生产有效活菌数含量高的生物有机肥的方法。将玉米秸秆粉碎成3 cm小段，与牛粪以质量比1:1混合，加入秸秆和牛粪总质量1-1.5倍的水，在加水的同时将活菌含量为38.9亿/g、用量为秸秆和牛粪总质量的3-5 %的腐熟剂一起加入其中，混合搅拌均匀进行堆料发酵15 d。待发酵完毕后向发酵料中加水调节含水量至50-60 %，再向其中接种发酵料质量10 %的功能菌剂，继续堆料进行二次发酵。在发酵进行到36 h、48 h和60 h时分别向发酵料中补加4 %碳源和6 %的氮源，共发酵4 d，得到高含菌量生物有机肥。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。