本发明涉及抗寒剂与及其制备方法与应用，尤其涉及一种外源硒抗寒剂及其制备方法与应用。
背景技术：
铁皮石斛是我国传统的名贵中药材，具有益胃生津，滋阴清热，免疫调节，延缓衰老等功效。低温抑制铁皮石斛幼苗的成活和生长，是影响其生存与分布的主要因素。在长江三角洲地区铁皮石斛冬季很难在露地栽培成活，均是在温室内保护栽培。一旦大棚供暖条件欠缺，铁皮石斛就易收到低温伤害。寻找缓解低温胁迫的有效途径，是目前铁皮石斛栽培生产中亟待解决的问题之一。关于铁皮石斛方面的研究较多，多集中于组培、栽培、药用等方面；对于添加外源硒抗寒剂提高铁皮石斛抗寒性的报道甚少。本研究喷施外源硒抗寒剂于低温胁迫后的铁皮石斛幼苗，探讨外源硒抗寒剂能否缓解铁皮石斛的低温伤害、能否提高其抗寒性，以期为铁皮石斛在我国大范围推广应用及室外越冬栽培提供参考依据。技术实现要素：发明目的：本发明的第一目的是提供一种有效提高铁皮石斛存活率及生长质量的外源硒抗寒剂；本发明的第二目的是提供该抗寒剂的制备方法；本发明的第三目的是提供该抗寒剂的应用。技术方案：本发明提供一种外源硒抗寒剂，包括如下浓度的原料组分：外源硒的浓度0.4～0.6mg/l、6-ba15～20mg/l、3-吲哚乙酸100～150mg/l、果糖浓度2～6g/l。优选地，上述外源硒抗寒剂，还包括如下浓度的原料组分：200～400mg/l的磷酸二氢钾和质量百分比浓度为4～10％的硫酸镁。上述外源硒抗寒剂的制备方法，包括如下步骤：将溶解的6-ba、3-吲哚乙酸和外源硒加入果酸溶液中搅拌得到初混物；将初混物与辅助成分混合液混合搅拌并调节ph值，即得到外源硒抗寒剂。优选地，所述加入果酸溶液中搅拌温度为30～40℃，搅拌时间为1～2小时。进一步地，所述将初混物与辅助成分混合液混合搅拌温度为25～30℃，搅拌时间为1～3小时。进一步地，所述初混物与辅助成分混合液混合调节ph值为5.7～6.7。所述外源硒抗寒剂在铁皮石斛抗寒中的应用，其中，施用外源硒抗寒剂的浓度为0.4～1.6mg/l。进一步地，上述施用外源硒抗寒剂的浓度为0.8～1.6mg/l。优选地，施用外源硒抗寒剂时控制透光率为60～80％；控制温度在15～20℃；保持湿度在65～85％。有益效果：本发明提供的外源硒抗寒剂，对铁皮石斛具有良好的抗寒效果，尤其的，当组分中外源硒浓度为0.4～0.6mg/l、6-ba15～20mg/l、3-吲哚乙酸100～150mg/l时，抗寒效果优异。同时，该抗寒剂的制备方法简单有效，不需添加任何化工原料，施用于铁皮石斛不会对其造成损害。尤其的，施用时采用0.8～1.6mg/l的剂量，抗寒效果最好，且不会对植被造成伤害。具体实施方式下面针对本发明的技术方案作进一步说明。下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例1外源硒抗寒剂的制备称取一定量的磷酸二氢钾和硫酸镁溶于蒸馏水中，定容至500ml，30℃下充分搅拌1小时至均匀配比制成辅助成分的溶液，该溶液中磷酸二氢钾的浓度为400mg/l，硫酸镁质量百分比浓度为8％。将6-ba和3-吲哚乙酸分别溶于少量的95％乙醇中使其完全溶解；称取一定量的外源硒溶于蒸馏水中至完全溶解，外源硒是分析纯的亚硒酸钠na2seo3。将上述完全溶解的6-ba、3-吲哚乙酸和外源硒加入果酸溶液中，定容至500ml，充分搅拌均匀得到初混物。该初混物中外源硒浓度为0.2mg/l、6-ba浓度为30mg/l、3-吲哚乙酸浓度为200mg/l、果糖浓度为4g/l。将初混物与辅助成分混合液按照1:1的体积比混合，25℃下充分搅拌1小时至均匀配比，将ph值调为5.7，此溶液即为外源硒抗寒剂。实施例2外源硒抗寒剂的制备称取一定量的磷酸二氢钾和硫酸镁溶于蒸馏水中，定容至500ml，40℃下充分搅拌2小时至均匀配比制成辅助成分的溶液，该溶液中磷酸二氢钾的浓度为800mg/l，硫酸镁质量百分比浓度为20％。将6-ba和3-吲哚乙酸分别溶于少量的95％乙醇中使其完全溶解；称取一定量的外源硒溶于蒸馏水中至完全溶解，这里的外源硒是分析纯的亚硒酸钠na2seo3。将上述完全溶解的6-ba、3-吲哚乙酸和外源硒加入果酸溶液中，定容至500ml，充分搅拌均匀得到初混物。该初混物中外源硒浓度为0.4mg/l、6-ba浓度为80mg/l、3-吲哚乙酸浓度为300mg/l、果糖浓度为12g/l。将初混物与辅助成分混合液按照1:1的体积比混合，30℃下充分搅拌3小时至均匀配比，将ph值调为6.7，此溶液即为外源硒抗寒剂。实施例3外源硒抗寒剂的制备称取一定量的磷酸二氢钾和硫酸镁溶于蒸馏水中，定容至500ml，35℃下充分搅拌1.5小时至均匀配比制成辅助成分的溶液，该溶液中磷酸二氢钾的浓度为600mg/l，硫酸镁质量百分比浓度为15％。将6-ba和3-吲哚乙酸分别溶于少量的95％乙醇中使其完全溶解；称取一定量的外源硒溶于蒸馏水中至完全溶解，这里的外源硒是分析纯的亚硒酸钠na2seo3。将上述完全溶解的6-ba、3-吲哚乙酸和外源硒加入果酸溶液中，定容至500ml，充分搅拌均匀得到初混物。该初混物中外源硒浓度为0.6mg/l、6-ba浓度为50mg/l、3-吲哚乙酸浓度为250mg/l、果糖浓度为10g/l。将初混物与辅助成分混合液按照1:1的体积比混合，28℃下充分搅拌2小时至均匀配比，将ph值调为6.0，此溶液即为外源硒抗寒剂。实施例4不同浓度组分对外源硒抗寒剂抗寒效果的影响实施例4外源硒抗寒剂主要原料组分的浓度选择设置外源硒浓度分别为0.2、0.4、0.6mg/l；6-ba浓度分别为10、15、20mg/l；3-吲哚乙酸浓度分别为50、100、150mg/l；其他制备与施用的条件和方法均与实施例3相同，如表1设计正交试验。表1主要原料组分不同浓度对外源硒抗寒剂性能的影响从表1可知，铁皮石斛抗寒剂中，当外源硒的浓度0.4～0.6mg/l、6-ba15～20mg/l、3-吲哚乙酸100～150mg/l时，可以达到对铁皮石斛的优异的抗寒效果。实施例5外源硒抗寒剂的施用条件及效果供试材料的制备以出瓶栽培一年的铁皮石斛组培苗为供试材料，供试材料栽培于江苏农林职业技术学院农博园内。时间为2017年12月至2018年2月，在此期间室外的最低温度为-6～6℃，最高温度为7～14℃。试验采用盆栽方式，将长势一致、无病虫害的铁皮石斛幼苗从大棚栽培床上挖出，移栽入装有铁皮石斛专用基质塑料盆钵内，每盆6株。置于大棚内正常培养15d，置于室外低温胁迫10d后，施用外源硒抗寒剂，设置仅喷水的空白对照组、0.4mg/l组、0.8mg/l组、1.6mg/l组、2.0mg/l组5个浓度组，浓度组的外源硒抗寒剂均按照实施例3中制备。每个处理进行5个重复，1个重复5盆，每个处理有25盆，每盆均用相同浓度的抗寒溶液进行处理1次。外源硒抗寒剂以叶面喷洒的形式施入，喷施至叶片完全湿润为准，之后置于大棚内恢复培养。大棚内温度保持在15～20℃，采用人工遮荫的方法，用遮阳网进行配合使用，每天控制透光率为60～70％。每3～5天浇水一次。植株存活情况的统计铁皮石斛在大棚内恢复培养期间定期观察植物生长状况，一个月后统计每个处理铁皮石斛植株存活率。存活率(％)＝存活植株数*100/植株总株数叶绿素含量的测定测定方法参照《植物生理生化实验原理与技术》中的叶绿体色素含量的测定。采集倒1-3叶，洗净、剪碎，称取0.1g左右置于试管内，加入95％乙醇20ml，用保鲜膜封口，黑暗放置24h后拿出摇匀。以95％乙醇为空白，在波长665nm和649nm下测定吸光值。计算公式：叶绿素浓度＝6.63a665+18.08a649；a665指的是叶绿素a在95％乙醇中最大吸收峰波长值；a649指的是叶绿素b在95％乙醇中最大吸收峰波长值；叶绿素含量(g/g·fw)＝c*v*/m*1000。c为叶绿素浓度(mg/l)；v为提取液体积(ml)；m为样品质量(g)；1000是表示1l＝1000ml。丙二醛含量的测定测定方法参照《植物生理生化实验原理与技术》中的植物组织中丙二醛含量的测定。采集植株顶部1-2cm长的鲜嫩茎，洗净、剪碎，称取0.25g左右，加入5％tca5ml，研磨后所得匀浆在3000r/min下离心10min，上清液为样品提取液，测量其体积(v)。取上清液2ml(v1)于试管中，加0.67％tba2ml，混合后在沸水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次，上清液为待测液(其体积记为v2)。测定待测液在450nm、532nm和600nm处的吸光值。计算公式：c(μmol/l)＝6.45*(a532-a600)-0.56*a450；其中a450、a532、a600分别代表的450nm、532nm、和600nm波长下的吸光度值。样品mda含量(μmol/g·fw)＝c*v2*v/m*v1*1000。c为待测液中mda的浓度(μmol/l)；v为提取液总体积(ml)；v1为待测液中加入的样品提取液体积(ml)；v2为待测液总体积。测试结果与分析外源硒抗寒剂对低温胁迫下铁皮石斛存活率的影响如表2示。表2喷施外源硒抗寒剂对低温胁迫下铁皮石斛存活率的影响编号存活率(％)空白32.40.4mg/l72.50.8mg/l92.01.6mg/l90.52.0mg/l45.3从表2可知，铁皮石斛经过低温胁迫后喷施外源硒抗寒剂，存活率与对照相比有所变化。其中，0.4mg/l、0.8mg/l和1.6mg/l外源硒抗寒剂浓度下，铁皮石斛存活率较高，分别为72.5％、92.02％和90.5％，三者差异不显著，显著高于对照和2.0mg/l外源硒抗寒剂浓度；而2.0mg/l外源硒抗寒剂浓度下铁皮石斛的存活率较低，与对照相比差异不显著。实验数据表明：铁皮石斛经过低温胁迫后，喷施一定浓度的外源硒抗寒剂可以使植物存活率显著提高，但外源硒抗寒剂的浓度并不是越高越好，本研究中喷施浓度0.4～1.6mg/l为优选浓度，为0.8～1.6mg/l为最佳浓度，存活率在一定程度上反映了铁皮石斛植物的抗寒性，存活率越高说明植物抗寒性越好。外源硒抗寒剂对低温胁迫下铁皮石斛叶绿素含量的影响如表2所示。表3喷施外源硒抗寒剂对低温胁迫下铁皮石斛叶绿素含量的影响编号叶绿素含量(g/g·fw)空白对照0.62620.4mg/l1.04050.8mg/l2.03761.6mg/l1.98422.0mg/l0.7218从表3可以看出，不同浓度的外源硒抗寒剂对低温胁迫下铁皮石斛叶绿素含量的总体变化趋势是随着浓度的增加，叶绿素含量呈下降趋势。在5个处理中，0.8mg/l的外源硒抗寒剂浓度下铁皮石斛的叶绿素含量最高，其次是1.6mg/l和0.4mg/l，三者差异不显著，显著高于对照和2.0mg/l外源硒抗寒剂浓度；对照和2.0mg/l外源硒抗寒剂浓度的铁皮石斛叶绿素含量均较低，差异不显著。数据表明：铁皮石斛经过低温胁迫后，喷施一定浓度的外源硒抗寒剂可以使植物叶绿素含量显著提高，但外源硒抗寒剂的浓度并不是越高越好，本研究中喷施浓度0.4～1.6mg/l为优选浓度，为0.8～1.6mg/l为最佳浓度，此浓度下，外源硒抗寒剂可以显著提高铁皮石斛的叶绿素含量，提高其抗寒性。叶绿素含量在一定程度上反映了铁皮石斛的光合特性和生长状况，叶绿素含量越高说明其生长越好，生长的越好说明其抗寒性越高。外源硒抗寒剂对低温胁迫下铁皮石斛丙二醛含量的影响如表3所示表4喷施外源硒抗寒剂对低温胁迫下铁皮石斛丙二醛含量的影响从表4可以看出，不同浓度的外源硒抗寒剂对低温胁迫下铁皮石斛丙二醛含量的总体变化趋势是随着浓度的增加呈上升趋势。5个处理中，浓度为0.8mg/l外源硒抗寒剂下铁皮石斛丙二醛含量最低，其次是浓度为1.6mg/l和0.4mg/l，三者差异不显著，显著低于对照和2.0mg/l外源硒抗寒剂浓度；对照和2.0mg/l外源硒抗寒剂浓度下铁皮石斛丙二醛含量均较高，二者差异不显著。实验数据表明：铁皮石斛经过低温胁迫后，喷施一定浓度的外源硒抗寒剂可以使植物丙二醛含量显著降低，但外源硒抗寒剂的浓度并不是越高越好，本研究中喷施浓度0.4～1.6mg/l为优选浓度，为0.8～1.6mg/l为最佳浓度，此浓度下，外源硒抗寒剂可以显著提高铁皮石斛的叶绿素含量，提高其抗寒性。植物器官在低温逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常利用其作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对低温逆境条件反应的强弱，其含量高低与植物抗寒性强弱成反比。丙二醛含量越低，表明植物抗寒性越强。结论：综合考虑存活率、叶绿素含量和丙二醛含量三个指标可认为，铁皮石斛经过低温胁迫后，本研究中以喷施浓度为0.4～1.6mg/l为优选浓度，更以0.8～1.6mg/l为最佳浓度的外源硒抗寒剂可以显著提高铁皮石斛的抗寒性。当前第1页12