一种用于超微量核酸提取的纳米磁珠的制备方法与流程

文档序号:17936999发布日期:2019-06-15 01:49阅读:362来源:国知局
一种用于超微量核酸提取的纳米磁珠的制备方法与流程
本发明属于生物
技术领域
,具体地,涉及一种用于超微量核酸提取的纳米生物磁珠的制备方法。
背景技术
:随着dna提取技术的不断完善和发展,磁珠法提取技术慢慢兴起,作为提取的核心材料生物纳米磁珠逐渐被人们所熟知。因为dna提取是所有后续研究的第一步,所以dna提取的效率和效果直接影响后续的研究。生物纳米磁珠是由磁性材料与高分子材料通过化学或物理方法复合而成的一种具有众多优异性能的功能材料。生物纳米磁珠作为近年发展起来的一种新型磁性材料,不但具有纳米效应,即表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和体积效应,还具有磁学性质,如超顺磁性与高磁化率等特性。其应用已经从传统的
技术领域
发展到高新
技术领域
,从单纯的磁学范围扩展到与磁学相关的交叉学科领域。以核酸分离领域应用最为广泛。生物纳米磁珠虽然在生物医药领域应用日益广泛,但仍然存在一定的问题:国外品牌的生物纳米磁珠在生物领域使用较为成熟,但其价格较高,以毫升计价,通常是国产的5~6倍,国产磁珠由于不能掌握制作磁珠的核心制备技术,制备的纳米磁珠颗粒尺寸有一定尺寸分布,并且生物相容性差,而且,还存在分散性差、改性过程中强磁性难以保持和功能化程度偏低等缺点。技术实现要素:为了解决现有技术中的不足,本发明的目的在于提供一种用于超微量核酸提取的纳米生物磁珠的制备方法,其工艺流程简单,操作简便,适宜于工业化大批量生产;制得的纳米生物磁珠,为核壳结构,表面羟基含量丰富,分散性优异,与dna结合能力强,每mg磁珠可结合不低于10ug的dna,可用在超微量核酸样本的提取中,提高对超微量核酸样本的检测灵敏度。为了实现上述目的,本发明采用的具体方案为:一种用于超微量核酸提取的纳米生物磁珠的制备方法,其包含以下步骤:步骤一:纳米四氧化三铁分散液制备取100g~10000g纳米四氧化三铁粉末经乙醇洗涤后再用含有表面活性剂的水溶液洗涤,然后分散在5~10l含有油酸的乙醇水溶液中,得纳米四氧化三铁初级溶液;将纳米四氧化三铁初级溶液用高压匀质机处理,所述高压匀质机工作参数为80mpa~150mpa、次数处理为1~6次,得纳米四氧化三铁分散液;步骤二:在纳米四氧化三铁表面包裹二氧化硅将步骤一所得纳米四氧化三铁分散液放入反应釜中,加入包含正硅酸四乙酯和氨水的混合液100~2000ml,反应1~5h,用醇水溶液洗涤后再用含有表面活性剂的水溶液洗涤,最后分散在含有表面活性剂的水溶液中,得磁珠溶液;将所得磁珠溶液用高压匀质机处理1~2次,所述高压匀质机工作参数为60~120mpa,处理结束后继续超声搅拌12~24h,超声搅拌过程中控制温度不超过30℃,然后用超纯水洗涤至溶液ph呈中性,保存在超纯水中,即得用于超微量核酸提取用的纳米生物磁珠。作为对上述方案的进一步优化,所述纳米四氧化三铁粉末是通过水解法、水热法、共沉淀法、或者球磨法制得的。作为对上述方案的进一步优化,步骤一中所述含有表面活性剂的水溶液中表面活性剂的体积分数为1%;所述表面活性剂为曲拉通、壬基酚聚氧乙烯醚、植物油、柠檬酸、十二烷基磺酸钠和十六烷基三甲基溴化铵中的一种或几种的混合物。更进一步地,所述植物油为玉米胚芽油。作为对上述方案的进一步优化,步骤二中所述含有表面活性剂的水溶液中表面活性剂的体积分数为1%-5%;所述表面活性剂为曲拉通、聚乙二醇、甘油、柠檬酸、十二烷基磺酸钠和十六烷基三甲基溴化铵中的一种或几种的混合物。作为对上述方案的进一步优化,步骤一所述纳米四氧化三铁粉末的粒径为10nm-500nm,饱和磁化强度不低于50emu/g。作为对上述方案的进一步优化,所述含有油酸的乙醇水溶液中油酸的含量为1~100ml。作为对上述方案的进一步优化,步骤二中所述超声的功率不低于800w。作为对上述方案的进一步优化,步骤二中所述包含正硅酸四乙酯和氨水的混合液中正硅酸四乙酯与氨水的比例为0.2~1.0。作为对上述方案的进一步优化,步骤二中所述醇水溶液中醇为乙醇、异丙醇、丙三醇中的一种或几种的复合物;所述醇水溶液中醇的浓度不低于50%。有益效果:1、本发明所述制备方法的工艺流程简单,操作简便,适宜于工业化大批量生产;制得的纳米生物磁珠,为核壳结构,磁响应性能强,表面羟基含量丰富,分散性优异,与dna结合能力强,可用在超微量核酸样本的提取中,dna得率高,且能提高对超微量核酸样本的检测灵敏度。2、采用本发明所述制备方法制备得到的纳米生物磁珠的表面羟基含量不低于0.2mmol/g,由于表面富含活泼的羟基,不仅可以有效改善其分散稳定性,并且便于通过反应与多种功能分子结合;粒径均匀,平均粒径为500nm-1500nm,优选的700-1200nm;饱和磁化强度不低于40emu/g,优选的不低于50emu/g。得到纳米生物磁珠每mg可结合不低于10ug的dna,尤其是可以达到每mg可结合不低于15ug的dna。3、本发明所述方法通过对原料、条件参数以及方法步骤进行改进,使其协调作用,通过表面改性及进一步功能化,控制并优化fe3o4磁核的强磁性,同时增强了纳米生物磁珠的分散稳定性及生物相容性。采用本发明方法制备的纳米生物磁珠提取,可得到较高质量的核酸,为后续研究奠定基础。附图说明图1是采用实施例1制备的纳米生物磁珠的粒径检测报告图;图2是采用实施例2制备的纳米生物磁珠的粒径检测报告图;图3是采用本发明制备的纳米生物磁珠提取的dna/rna样品的荧光定量检测的扩增曲线图;图4是基于图3的荧光定量检测结果图。具体实施方式一种用于超微量核酸提取的纳米生物磁珠的制备方法,其包含以下步骤:步骤一:纳米四氧化三铁分散液制备取100g~10000g纳米四氧化三铁粉末经过多次乙醇洗涤,然后再用含有1%表面活性剂的超纯水洗涤数次,最终分散在5~10l含有一定量油酸的乙醇水溶液中,得到纳米四氧化三铁初级溶液。其中所述油酸的含量为1~100ml,优选5~50ml。将上述纳米四氧化三铁初级溶液用高压匀质机处理,高压匀质机工作参数80mpa~150mpa、匀质处理1~6次,得到纳米四氧化三铁分散液。步骤二:在纳米四氧化三铁表面包裹二氧化硅将上述步骤一得到的纳米四氧化三铁分散液放入反应釜中,加入包含正硅酸四乙酯和氨水的混合液100~2000ml,反应1~5h,用醇水溶液洗涤2次,然后用含有表面活性剂的水溶液洗涤,最后分散在含有表面活性剂的水溶液中,得磁珠溶液将上述所得磁珠溶液用高压匀质机处理1~2次,高压匀质机工作参数60~120mpa,处理后继续超声搅拌12~24h,超声搅拌过程中控制温度不超过30℃,然后用超纯水洗涤至溶液ph呈中性,保存在超纯水中,即得用于超微量核酸提取用的纳米生物磁珠。所述纳米四氧化三铁粉末可以是通过水解法、水热法、共沉淀法、或者球磨法制得的,优选共沉淀法、球磨法。步骤一中所述表面活性剂为曲拉通、壬基酚聚氧乙烯醚、植物油(以玉米胚芽油为好)、柠檬酸、十二烷基磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或几种的混合物。所述纳米四氧化三铁粉末一次粒径为10nm-500nm,优选50-300nm;饱和磁化强度不低于50emu/g,优选不低于60emu/g。步骤一中所述纳米四氧化三铁在所述1%表面活性剂水溶液中沉降完全后,固液比高于1:1,优选不高于1:3。所述步骤一种高压匀质机工作参数为80mpa~150mpa,优选100mpa~120mpa;处理次数为1~6次,优选3~5次。步骤一所述纳米四氧化三铁初级溶液在用高压匀质机处理前、处理后、处理过程中处于混悬分散状态,使其处于该状态可以但不局限于利用搅拌、超声中的一种或多种方式共用;步骤二所述超声功率不低于800w,优选不低于1200w。步骤二中包含正硅酸四乙酯和氨水的混合液中正硅酸四乙酯与氨水的比例为0.2-1.0,优选0.3~0.6;包含正硅酸四乙酯和氨水的混合液的加入量为100~2000ml,优选150~1000ml。加入后反应时间为1~5h,优选2~4h。步骤二中所述醇水溶液中醇为乙醇、异丙醇、丙三醇中的一种或几种的复合物,所述醇水溶液中醇的浓度不低于50%,优选不低于80%。步骤二中所述含有表面活性剂的水溶液中表面活性剂的体积分数为1%~5%,所述表面活性剂为曲拉通、聚乙二醇、甘油、柠檬酸、十二烷基磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或几种的混合物。步骤二中所述高压匀质机工作参数为60~120mpa,优选60~90mpa。下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1一种用于超微量核酸提取的纳米生物磁珠的制备方法,包括以下具体步骤:步骤1、纳米fe3o4分散溶液制备取300g纳米四氧化三铁粉末用乙醇洗涤5次,然后再用1%柠檬酸溶液洗涤5次,最终分散在5l含有10ml油酸的95%乙醇溶液中,得到纳米四氧化三铁初级溶液。将上述纳米四氧化三铁初级溶液用高压匀质机处理3次,高压匀质机工作参数100mpa,得到纳米四氧化三铁分散液。步骤2:在纳米四氧化三铁表面包裹二氧化硅将上述纳米四氧化三铁分散液放入反应釜中,加入氨水600ml,滴加正硅酸四乙酯300ml,反应3h,用60%异丙醇水洗涤1次,然后用70%乙醇洗涤1次,再用含有1%柠檬酸水溶液洗涤3次,最后分散在含有1%柠檬酸的水溶液中。将上述磁珠溶液用高压匀质机处理2次,匀质机工作参数60mpa,处理后继续超声搅拌12h,超声功率800w,控制温度不超过30℃。然后用超纯水洗涤至溶液ph呈中性,保存在超纯水中,即得用于超微量核酸提取用的纳米生物磁珠。对采用上述方法制备的纳米生物磁珠进行质量评价,磁珠粒径数据(评价报告)见图1;由图1可知,粒径均匀,平均粒径在500nm-1500nm,可优选700-1200nm。磁珠表面羟基含量及最大dna结合量测定数据见附表1;实施例2一种用于超微量核酸提取的纳米生物磁珠的制备方法,包括以下具体步骤:步骤1、纳米fe3o4分散溶液制备同实施例一步骤2:在纳米四氧化三铁表面包裹二氧化硅将上述纳米四氧化三铁分散液放入反应釜中,加入氨水500ml,滴加正硅酸四乙酯200ml,反应3h,然后用70%乙醇洗涤2次,再用含有1%十二烷基磺酸钠的水溶液洗涤3次,最后分散在含有1%柠檬酸的水溶液中。将上述磁珠溶液用高压匀质机处理2次,匀质机工作参数80mpa,处理后继续超声搅拌18h,超声功率800w,控制温度不超过30℃。然后用超纯水洗涤至溶液ph呈中性,保存在超纯水中,即得用于超微量核酸提取用的纳米生物磁珠。对采用上述方法制备的纳米生物磁珠进行质量评价,磁珠粒径数据(评价报告)见图1;由图1可知,粒径均匀。磁珠表面羟基含量及最大dna结合量测定数据见附表1;实施例3一种用于超微量核酸提取的纳米生物磁珠的制备方法,包括以下具体步骤:步骤1、纳米fe3o4分散溶液制备取500g纳米四氧化三铁粉末用乙醇洗涤5次,然后再用1%十二烷基磺酸钠溶液洗涤5次,最终分散在5l含有20ml油酸的90%乙醇溶液中,得到纳米四氧化三铁初级溶液。将上述纳米四氧化三铁初级溶液用高压匀质机处理4次,高压匀质机工作参数为120mpa,得到纳米四氧化三铁分散液。步骤2:在纳米四氧化三铁表面包裹二氧化硅将上述步骤一所得纳米四氧化三铁分散液放入反应釜中,加入氨水500ml,滴加正硅酸四乙酯200ml,反应4h,然后用80%乙醇洗涤2次,再用含有1%十二烷基磺酸钠的水溶液洗涤3次,最后分散在含有1%柠檬酸的水溶液中。将上述磁珠溶液用高压匀质机处理2次,匀质机工作参数100mpa,处理后继续超声搅拌24h,超声功率1200w,控制温度不超过30℃。然后用超纯水洗涤至溶液ph呈中性,保存在超纯水中,即得用于超微量核酸提取用的纳米生物磁珠。磁珠表面羟基含量及最大dna结合量测定数据见附表1;表1:实施例1-3制备的纳米生物磁珠表面羟基含量及最大dna结合量实施例1实施例2实施例3羟基含量0.37mmol/g0.4mmol/g0.36mmol/gdna结合量18ug/mg19ug/mg18ug/mg实施例4采用本发明所述制备方法制备的一种用于超微量核酸提取的纳米生物磁珠,其具体使用(核酸提取)如下所示:(1)在1.5mlep管中加入20µl裂解液b;(2)加入200µl微量核酸样品;(3)加入300µl裂解液as,漩涡振荡混合均匀,56℃水浴10分钟。(4)将ep管从温育设备中取出,加入上述示例磁珠10µl,加入异丙醇300µl,室温颠倒混匀5分钟。然后将ep管置于磁力架上进行磁分离,静置至磁珠全部吸附至管壁,吸弃管内液体。(5)移去磁力架,加入500µl洗涤液aw,上下颠倒震荡ep管2分钟。(6)将ep管置于磁力架上,静置至磁珠全部吸附至管壁,吸弃管内液体。(7)移去磁力架,加入500µl洗涤液sw,上下颠倒震荡ep管2分钟。(8)将ep管置于磁力架上,静置至磁珠全部吸附至管壁,吸弃管内液体。(9)打开管盖,让磁珠在安全柜中晾干5分钟。(10)移去磁力架,加入50-100µl洗脱液s(nuclease-free)或去离子水,轻弹ep管使磁珠全部浸润在液体中,56℃水浴5-10分钟,期间每隔2-3分钟轻摇ep管混匀磁珠。(11)将ep管置于磁力架上,静置至磁珠全部吸附至管壁,吸取上清至一新的ep管(无菌无rnase污染),即得到样本的dna/rna。(12)取20ul得到的dna/rna样品进行荧光定量检测,检测结果见附图3所示。由图3可知,本发明得到的纳米生物磁珠用于超微量核酸提取可以得到较高质量的核酸,通过qpcr扩增,核酸的得率稳定,阈值靠前。需要说明的是,以上所述的实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。当前第1页12
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