一种制备氧化石墨烯材料的方法与流程

本发明属于医用生物材料、医疗器械、神经修复领域，具体涉及一种制备氧化石墨烯材料的方法。
背景技术：
：石墨烯是由碳原子通过sp2杂化形成的二维纳米结构的六角形的蜂巢状。独特的结构赋予了石墨烯独特的物理及电学等特性、优良的机械性能、导电性、较大的比表面积以及良好的生物相容性等。并且，石墨烯具有很好的抗菌活性，能够显著的促进干细胞的生长、分化和增殖。纯的胶原蛋白材料力学性能以及导电性能较差，降解速率较快，没有抗菌性，不利于其在组织工程中的应用。向石墨烯材料中掺入胶原可以制备具有导电性的神经修复材料，然而现有技术中提供的石墨烯和胶原掺杂的复合材料，未能研究其导电性能和力学性能之间的差异，并且未能够显著提高胶原的抗降解性。其中，cn107432952a采用化学气相沉积法制备了一种三维石墨烯-胶原复合支架，采用静电纺丝的方法成膜，并且交联采用的化学交联，制备工艺较为复杂，可能有化学残留，不适于工业生产。cn109833516a和cn109453430a分别提供了一种石墨烯导管和含有羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯材料，虽然均含有石墨烯，但未能提供兼具更好的导电效果、修复能力以及抗降解性好的材料。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明旨在提供一种天然可吸收的，具有良好的生物相容性以及一定三维孔隙、可塑性和机械强度的，且抗降解性好，在用于神经修复时能够延长神经修复时间的氧化石墨烯材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：1)制备氧化石墨烯：在冰水浴中依次加入浓硫酸、石墨粉和硝酸铵的固体混合物、高锰酸钾，搅拌反应，再加入双氧水，过滤并洗涤；2)将步骤1)获得的氧化石墨烯分散于水中，获得氧化石墨烯分散液；3)向步骤2)获得的氧化石墨烯分散液中加入胶原蛋白溶液，共混均匀，并真空冷冻干燥，获得共混物；4)将步骤3)所得的共混物溶于醋酸，搅拌均匀后离心，冷冻干燥并交联处理。在一种实施方式中，所述步骤1)中氧化石墨烯可以通过以下方法制得：在冰水浴条件下，将石墨和nano3放进三口烧瓶内，然后再向该三口烧瓶中缓慢地加入浓硫酸。开启搅拌，保持三口烧瓶内温度低于5℃的情况下，将kmno4分三次，每次间隔12min，慢慢加入三口烧瓶中，升高温度，至三口瓶内温度达到35℃，在此温度下保持6h。反应完成后，向三口烧瓶中加入去离子水，继续升温至95-100℃。最后将三口烧瓶内溶液倒入2000ml烧杯内，然后加入去离子水，并逐渐滴加入大量h2o2，除去多余的kmno4，最后溶液亮黄，无气泡产生。静置至完全沉淀，倒掉上层清液，用盐酸溶液和去离子水各洗两次。最后将产物离心至中性，冷冻干燥即得，密封保存。进一步地，所述步骤2)获得的共混物中，氧化石墨烯和胶原蛋白的质量比为0.5％-20％。进一步地，所述步骤2)获得的共混物中，氧化石墨烯和胶原蛋白的质量比为1％-16％，优选1％-4％，特别优选1％。进一步地，所述步骤2)中氧化石墨烯的尺寸为2-100μm，优选2-50μm，更优选2μm。进一步地，所述步骤2)中氧化石墨烯分散液的质量浓度为10-25mg/ml，优选为20mg/ml。进一步地，所述步骤3)中胶原蛋白溶液为胶原蛋白溶于醋酸获得的溶液，所述胶原蛋白溶液的质量分数为0.5％-0.8％，优选0.6％-0.7％，更优选0.68％。进一步地，所述步骤4)中醋酸的浓度为0.2-0.8m，优选为0.5m。进一步地，所述步骤4)中共混物溶于醋酸，以使得胶原蛋白的质量体积浓度为3％-10％，优选4％-8％，更优选5％。进一步地，所述步骤4)中离心的条件为温度2℃-10℃，转速3000-5000rpm，时间40-120min。优选的，所述离心的条件为温度4℃，转速4000rpm，时间60min。进一步地，所述步骤4)中交联处理包括重度脱水交联(dht)处理，条件为110℃处理1-4h。在其他的实施方式中，所述交联处理还可以选自戊二醛蒸汽交联、紫外光交联或高温真空交联。进一步地，所述方法的步骤3)中冷冻干燥分为预冻和冻干两步，所述预冻的步骤如下：将模具固定后，为沿轴向方向缓慢进样，冷冻成型。匀速升降机速度为10转/min，角度调节9，时间间隔5s，温度降至-60℃后停止下降，温度降至-80±10℃时提出，于冰箱冷冻室中调节1小时以上，调节温度-20℃。所述冻干程序如下：进一步地，上述方法步骤4)中还包括灭菌，灭菌方法为环氧乙烷气体灭菌或者钴60辐照灭菌，优选环氧乙烷气体灭菌。在一种实施方式中，上述氧化石墨烯的制备方法包括如下步骤：(1)制备氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯分散在纯水中，制备20mg/ml氧化石墨烯水溶液；(3)依据氧化石墨烯与胶原蛋白的质量比，分别取氧化石墨烯水溶液、水和质量分数0.68％的溶于0.5m醋酸溶液中的胶原蛋白溶液进行共混，机械搅拌均质均匀，抽真空冷冻干燥，获得共混物；(4)将获得的共混物溶于0.5m醋酸溶液中，使得胶原蛋白的最终质量体积浓度为5％，机械搅拌均质均匀；(5)离心，条件温度控制在4℃，转数4000rpm，时间60min；(6)取沉淀，注入模具，冷冻干燥后dht交联。另一方面，本发明还提供了一种使用上述方法制备获得的氧化石墨烯材料。另一方面，本发明还提供了上述氧化石墨烯材料和/或上述方法制备获得的氧化石墨烯材料在制备抗降解的细胞培养材料和/或神经修复材料中的应用，如作为细胞生长增殖的基底材料、受损神经细胞的诱导生长材料等。优选的，所述氧化石墨烯材料为多孔材料，并且孔的孔向各向相同，孔隙为50-220微米。进一步地，所述神经修复材料包括神经导管、神经修复支架等。进一步地，采用上述方法制备的氧化石墨烯材料，其导电性通过rts-8四探针测试仪测得，并且电导率不低于3.5×10-3s/m，优选，不低于3.9×10-3s/m，更优选，不低于4.8×10-3s/m，更优选，不低于10×10-3s/m。进一步地，采用上述方法制备的氧化石墨烯材料，其修复强度通过med-01医药包装性能测试仪测得，设定条件为10mm/min。实验表明，材料的最大修复强度不低于1.5n，优选，不低于1.8n，更优选，不低于2.2n，更优选，不低于2.3n，更优选，不低于2.5n。进一步地，采用上述方法制备的氧化石墨烯材料，其在ph为7的磷酸缓冲液(pbs)中开始出现碎裂降解的天数不低于1天，优选的，不低于4天；优选的，本申请提供的氧化石墨烯材料，在pbs溶液中的完全降解天数不低于10天，更优选，不低于14天。本发明的有益效果是：本发明提供的氧化石墨烯材料的制备方法，可以一步制得电导率高、缝合强度好且抗降解的氧化石墨烯材料，操作简单，工艺稳定，原材料的来源丰富低廉，易于工业化。实验表明，本发明提供的制备方法，在合适的胶原蛋白以及氧化石墨烯的质量比下，能够显示出更好的导电效果、缝合能力以及抗降解性，使其更加接近理想的生物细胞培养、修复以及诱导生长材料，特别是当含有质量体积浓度5％的胶原蛋白，和1％(氧化石墨烯和胶原蛋白的质量比)含量的氧化石墨烯时，其导电效果、缝合能力以及抗降解性能相对更好。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为胶原蛋白的质量体积浓度5％、氧化石墨烯与胶原蛋白的质量比为1％的氧化石墨烯材料的扫描电子显微镜(sem)图；图2为纯胶原蛋白材料的扫描电子显微镜(sem)图。具体实施方式为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。如未特殊说明，在下述实施例中的原料和试剂均可通过商业途径购得；在性能测试中，电导率测定所用的实验设备采用rts-8四探针测试仪，缝合强度的测定采用med-01医药包装性能测试仪，降解实验所用的磷酸缓冲盐溶液(pbs)由国药集团化学试剂有限公司提供，ph：7.4。在下述实施例中，均采用以下步骤进行冷冻干燥：第一步预冻：将模具固定后，为沿轴向方向缓慢进样，冷冻成型。匀速升降机速度为10转/min，角度调节9，时间间隔5s，温度降至-60℃后停止下降，温度降至-80±10℃时提出，于冰箱冷冻室中调节1小时以上，调节温度-20℃。第二步冻干，其中，冻干干燥程序如下：在下述实施例中，采用dht(重度脱水)交联，其中交联条件为：温度110℃，固定时间为2h。在下述实施例中，所述步骤1)中氧化石墨烯的方法如下：在冰水浴条件下，将5g的300目石墨，5gnano3放进500ml三口烧瓶内，然后再向该三口烧瓶中缓慢地加入150ml浓硫酸。开启搅拌，保持三口烧瓶内温度低于5℃的情况下，将15gkmno4分三次，每次间隔12min，慢慢加入三口烧瓶中，升高温度，至三口瓶内温度达到35℃，在此温度下保持6h。反应完成后，向三口烧瓶中加入200ml去离子水，继续升温至95-100℃。最后将三口烧瓶内溶液倒入2000ml烧杯内，然后加入700ml去离子水，并逐渐滴加入大量h2o2，除去多余的kmno4，最后溶液亮黄，无气泡产生。静置至完全沉淀，倒掉上层清液，500ml的盐酸溶液和去离子水各洗两次。最后将产物离心至中性，冷冻干燥即得，密封保存。实施例1本实施例提供的制备氧化石墨烯材料的方法，包括如下步骤：(1)制备氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯分散在纯水中，制备20mg/ml氧化石墨烯水溶液；(3)将0.3196ml氧化石墨烯水溶液、5.6804ml水和94ml质量分数0.68％的溶于0.5m醋酸溶液中的胶原蛋白溶液进行共混，机械搅拌均质均匀，抽真空冷冻干燥，获得共混物；(4)将获得的共混物溶于0.5m醋酸溶液中，使得胶原蛋白的最终质量体积浓度为5％，氧化石墨烯和胶原蛋白的质量比为1％，机械搅拌均质均匀；(5)离心，条件温度控制在4℃，转数4000rpm，时间60min；(6)取沉淀，注入模具，冷冻干燥后dht交联。实施例2本实施例提供的制备氧化石墨烯材料的方法，包括如下步骤：(1)制备氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯分散在纯水中，制备20mg/ml氧化石墨烯水溶液；(3)将0.6292ml氧化石墨烯水溶液、5.3608ml水和95ml质量分数0.68％的溶于0.5m醋酸溶液中的胶原蛋白溶液进行共混，机械搅拌均质均匀，抽真空冷冻干燥，获得共混物；(4)将获得的共混物溶于0.5m醋酸溶液中，使得胶原蛋白的最终质量体积浓度为5％，氧化石墨烯和胶原蛋白的质量比为2％，机械搅拌均质均匀；(5)离心，条件温度控制在4℃，转数4000rpm，时间60min；(6)取沉淀，注入模具，冷冻干燥后dht交联。实施例3本实施例提供的制备氧化石墨烯材料的方法，包括如下步骤：(1)制备氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯分散在纯水中，制备20mg/ml氧化石墨烯水溶液；(3)将1.2784ml氧化石墨烯水溶液、4.7216ml水和94ml质量分数0.68％的溶于0.5m醋酸溶液中的胶原蛋白溶液进行共混，机械搅拌均质均匀，抽真空冷冻干燥，获得共混物；(4)将获得的共混物溶于0.5m醋酸溶液中，使得胶原蛋白的最终质量体积浓度为5％，氧化石墨烯和胶原蛋白的质量比为4％，机械搅拌均质均匀；(5)离心，条件温度控制在4℃，转数4000rpm，时间60min；(6)取沉淀，注入模具，冷冻干燥后dht交联。实施例4本实施例提供的制备氧化石墨烯材料的方法，包括如下步骤：(1)制备氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯分散在纯水中，制备20mg/ml氧化石墨烯水溶液；(3)将2.5568ml氧化石墨烯水溶液、3.4432ml水和94ml质量分数0.68％的溶于0.5m醋酸溶液中的胶原蛋白溶液进行共混，机械搅拌均质均匀，抽真空冷冻干燥，获得共混物；(4)将获得的共混物溶于0.5m醋酸溶液中，使得胶原蛋白的最终质量体积浓度为5％，氧化石墨烯和胶原蛋白的质量比为8％，机械搅拌均质均匀；(5)离心，条件温度控制在4℃，转数4000rpm，时间60min；(6)取沉淀，注入模具，冷冻干燥后dht交联。实施例5本实施例提供的制备氧化石墨烯材料的方法，包括如下步骤：(1)制备氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯分散在纯水中，制备20mg/ml氧化石墨烯水溶液；(3)将5.1136ml氧化石墨烯水溶液、0.8864ml水和94ml质量分数0.68％的溶于0.5m醋酸溶液中的胶原蛋白溶液进行共混，机械搅拌均质均匀，抽真空冷冻干燥，获得共混物；(4)将获得的共混物溶于0.5m醋酸溶液中，使得胶原蛋白的最终质量体积浓度为5％，氧化石墨烯和胶原蛋白的质量比为16％，机械搅拌均质均匀；(5)离心，条件温度控制在4℃，转数4000rpm，时间60min；(6)取沉淀，注入模具，冷冻干燥后dht交联。对比例1对比例1提供了胶原蛋白在0.5m醋酸中的质量体积浓度为5％的纯胶原蛋白材料，不含氧化石墨烯，其余制备方法与实施例1相同。实施例6：性能测试采用四探针法测定上述各实施例所得的氧化石墨烯材料在湿润状态下的电导率，并分别以未添加氧化石墨烯的纯胶原蛋白，以及步骤1)所得的纯氧化石墨烯作为对比，所得结果见表1：表1各示例材料的导电性示例胶原浓度质量比电导率(×10-3s/m)p值纯胶原蛋白5％-2.04-实施例15％氧化石墨烯：胶原蛋白＝1％10.680.021实施例25％氧化石墨烯：胶原蛋白＝2％4.820.00002实施例35％氧化石墨烯：胶原蛋白＝4％4.880.012实施例45％氧化石墨烯：胶原蛋白＝8％3.910.026实施例55％氧化石墨烯：胶原蛋白＝16％3.580.022纯氧化石墨烯--8.34-注：*p＜0.05说明和纯胶原蛋白相比有显著性差异，**p＜0.01说明和纯胶原蛋白相比有非常显著性差异由表1可知，实施例1-5提供的氧化石墨烯材料所显示的电导率均高于纯胶原蛋白，并且与纯胶原蛋白相比均显示出了显著性差异，其中实施例2和纯胶原蛋白相比具有非常显著性差异。与此同时，与其它实施例相比，实施例1的导电性好于纯氧化石墨烯，由此可说明，向氧化石墨烯中加入适量的胶原蛋白对其导电性能够起到协同作用。采用以下方法测试各实施例所得的氧化石墨烯材料的缝合能力：将上述各实施例所得的材料制成同等大小的管状，并将其一端固定，在另一端距边缘2mm处用5-0尼龙单丝缝合线穿刺，将缝合线与拉力机相连，以10mm/min的速度进行拉伸，记录瞬间拉断时的最大承受力，即为该材料的缝合强度，所得结果见表2：表2各示例材料的缝合强度示例胶原浓度组成成分缝合强度(n)p1值p2值纯胶原蛋白5％-1.78±0.39--实施例15％氧化石墨烯：胶原蛋白＝1％2.37±0.440.036-实施例25％氧化石墨烯：胶原蛋白＝2％2.26±0.350.0220.640实施例35％氧化石墨烯：胶原蛋白＝4％2.52±0.470.0030.059实施例45％氧化石墨烯：胶原蛋白＝8％1.87±0.350.6300.055实施例55％氧化石墨烯：胶原蛋白＝16％1.58±0.360.3210.006注：*p1＜0.05说明和纯胶原蛋白相比有显著性差异，**p1＜0.01说明和纯胶原蛋白相比有非常显著性差异；*p2＜0.05说明和实施例1相比有显著性差异，**p2＜0.01说明和实施例1相比有非常显著性差异由表2可知，实施例1-3所得的氧化石墨烯材料，其缝合强度好于纯胶原蛋白，并且和纯胶原蛋白相比具有显著性差异，在缝合性能上显示出了更好的优势。其中，实施例3显示出了最高的缝合强度，但与此同时，实施例1显示出的缝合强度与实施例3相差较小，并且除实施例5外，其他实施例与实施例1相比没有显著性差异。将上述各示例所得材料裁剪成同样大小的正方形，同时浸没于200mlph为7的pbs缓冲液中，观察并统计材料开始出现碎裂的时间，其中纯胶原蛋白所得结果见表3：表3各示例材料的pbs开始碎裂时间示例胶原浓度组成成分开始碎裂时间(天)纯胶原蛋白5％-4.5(完全降解)实施例15％氧化石墨烯：胶原蛋白＝1％5实施例25％氧化石墨烯：胶原蛋白＝2％4实施例35％氧化石墨烯：胶原蛋白＝4％2.5实施例45％氧化石墨烯：胶原蛋白＝8％1.5实施例55％氧化石墨烯：胶原蛋白＝16％0.5实验结果表明，纯胶原蛋白在pbs溶液中不到1天就开始出现碎裂现象，并在4.5天左右即完全降解。而实施例1-4在1.5天之后才开始出现碎裂现象，特别是实施例1，在第5天才开始出现破裂，并在第14天才被完全降解，显示出了优异的抗降解性。此外，虽然实施例3中4％含量的氧化石墨烯材料的缝合强度略有增加，但和1％含量相比，无显著性差异，并且体外降解开始破裂时间较短，并综合氧化石墨烯含量过高可能导致不能预期的毒性角度考虑，优选实施例1。综合上述可得，向氧化石墨烯中添加一定的胶原蛋白，能够获得具有更好的导电效果、缝合能力以及抗降解性的材料，使其更加接近理想的生物细胞培养、修复以及诱导生长材料，特别是当含有质量体积浓度5％的胶原蛋白，和1％(氧化石墨烯和胶原蛋白的质量比)含量的氧化石墨烯时，其导电效果、缝合能力以及抗降解性能相对更好。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。当前第1页1 2 3