本发明属于微生物技术领域，涉及一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂及其制备方法和应用。
背景技术：
桃小食心虫，属鳞翅目，蛀果蛾科具有其昼伏夜出及背光特点，是果树生产中发生面积最大、危害最严重的食心虫类害虫之一，主要是在幼虫期蛀果。一直以来，化学防治是控制食心虫的有效手段，但化学杀虫剂的持续性使用会产生抗药性及食品、环境安全性等一系列问题。且由于其昼伏夜出及背光的习性，化学农药存在夜间喷洒困难、命中率差等缺点，因此传统农药防治难度大，效果低，且容易造成环境污染，已经逐渐无法满足生产与市场的需求。
白僵菌，是一种昆虫病原真菌，可有效地杀死农业中大量的治病虫的数量，同时，不伤害其他昆虫和有益生物，完全符合安全绿色生物防治的宗旨，因而其具有广泛的应用前景。虽然白僵菌防治属于微生物杀虫剂，但是目前市场上的白僵菌产品由于其生产环境不稳定对白僵菌的实际效果影响较大，在培育中菌种常发生变异，容易出现生长瘠薄、产孢量少、杀虫毒力较低等情况，不利于白僵菌的大规模应用。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂及其制备方法和应用，解决了现有白僵菌产品的生长贫瘠、产孢量少、杀虫毒力较低的问题，同时该营养剂能为作物提供全方面营养，提高作物抗病抗虫能力。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂的制备方法，将白僵菌在含有腐植酸的复合型培养基中进行发酵，得到发酵中间物；将所得发酵中间物经风干处理后进行粉碎，得到具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
优选地，白僵菌为：球状白僵菌或布氏白僵菌。
优选地，含有腐植酸的复合型培养基为：液体培养基及固化培养液；
将白僵菌在含有腐植酸的复合型培养基中进行发酵，得到发酵中间物的具体操作包括：先将白僵菌在液体培养基中进行液体发酵培养，然后将液体发酵培养所得发酵液与固化培养液混合均匀后静置凝固，进行固体发酵，得到发酵中间物。
进一步优选地，液体发酵培养所得发酵液与固化培养液的混合体积比为3：(1～2)。
进一步优选地，液体发酵培养的条件包括：0～12h时间范围内，温度为22～25℃。
进一步优选地，固体发酵的条件包括：24～36h时间范围内、温度为25～28℃、湿度为50％～60％。
进一步优选地，液体发酵培养与固体培养均使用搅拌机使其混合均匀，所述搅拌机转速为100～150rpm/min。
进一步优选地，液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.0％～1.5％、酵母粉0.5％～1.0％、低阶煤基腐植酸盐1.0％～10.0％、硫酸镁0.5％～1.0％、氯化钙1.5％～3.0％、表面活性剂0.5％～1.0％、其余为水。
进一步优选地，固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠2％～3％、淀粉0.5％～1.0％、甘油0.5％～1.0％、其余为水。
其中，优选地，表面活性剂为：斯盘20、斯盘40、斯盘60、斯盘65、斯盘80、斯盘85。
其中，优选地，所述低阶煤基腐植酸盐为腐植酸铵、腐植酸钾、腐植酸钠中的一种或几种。
优选地，风干处理的温度为22～28℃。
优选地，粉碎后的粒径范围为60～80目。
本发明还公开了采用上述制备方法制得的一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
本发明还公开了上述一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂在虫害防治中的应用，将所述具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂与水以1：50～300的质量比混合均匀后进行使用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂的制备方法，通过将白僵菌在含有腐植酸的复合型培养基中发酵，能够在最终制得产品中加入腐殖酸，可以刺激植物生长，对作物的生长发育及体内生理代谢有刺激作用，并提高作物抗逆能力，还能有益为微生物提供一个优良的生存环境。通过将白僵菌生产发酵过程中的复合型培养基加工而成所得具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂产品，该复合型培养基载体富含经发酵而产生的大量氨基酸、多肽酶、微量元素等作物生长所必需的营养成分，可促进作物生长，长效性提高作物产量和品质；同时解决了现有白僵菌产品的生长贫瘠、产孢量少、杀虫毒力较低的问题。因此，本发明所述制备方法具有操作简单，对设备要求低，环境友好的特点。
进一步地，通过选择球状白僵菌或布氏白僵菌，通过选择球状白僵菌或布氏白僵菌，能够有效地减少农业生产中食心虫的数量，同时，不伤害其他昆虫和有益生物。
进一步地，通过采用特殊液固两相发酵，利用液体发酵培养快速产生大量的菌丝体或芽生孢子，再转到固体营养培养基上使其产生最接近自然接种体形态的气生分生孢子。该方法最大程度地利用了液体培养的优点，先生产大量的菌丝或芽生孢子，缩短了菌丝生长周期，生产方法简便，能耗和成本低，同时固体发酵产孢克服了液相发酵所产芽生孢子环境稳定性差等缺点。
进一步地，通过调整发酵液与固化培养液的混合体积比可有效的控制菌类的培养环境。
进一步地，通过使用天然高分子化合物腐殖酸低阶煤基腐植酸盐，能够对真菌孢子具有很好的保护作用，同时有效改善白僵菌孢子的微环境，促进白僵菌继续生长和产孢，也易于保存，腐植酸能起到表面活性剂的作用，使得所得具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末能够充分分散在溶液中，喷洒后的孢子粘附性好，存活期也更长。
进一步地，通过使用span系列表面活性剂可以有效提高营养剂在果树和防治生物的附着能力，充分发挥营养剂效果。
本发明还公开了采用上述制备方法制得的一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂，基于该复合型培养基载体富含经发酵而产生的大量氨基酸、多肽酶、微量元素等作物生长所必需的营养成分，在制成营养剂后，所述具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂既能为作物提供全方面营养，提高作物抗病能力，促进果树发育与结果；且其粘附性强、应用范围广、防治效果好。
本发明还公开了上述具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂在虫害防治中的应用，由于通过特殊液固两相发酵，可快速产生大量致病快，毒性强的白僵菌袍子，因此本发明所述具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂具有一定防治食心虫虫害的作用；其在具体应用中，操作方法简单，能够适用于推广使用。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂的制备方法，包括以下步骤：在液体培养基中培育白僵菌进行液体发酵培养，然后将液体发酵培养所得发酵液与固化培养液混合，混合体积比例为3：(1～2)，混合时使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置待其凝固进行固体发酵，当固体培养一段时间后，停止固体发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在22～28℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至60～80目大小，获得营养剂颗粒，即为本发明所述一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述发酵采用的发酵培养基原料为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.0％～1.5％、酵母粉0.5％～1.0％、低阶煤基腐植酸盐1.0％～10.0％、硫酸镁0.5％～1.0％、氯化钙1.5％～3.0％、其余为蒸馏水、表面活性剂0.5％～1.0％；固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠2％～3％、淀粉0.5％～1.0％、甘油0.5％～1.0％、其余为蒸馏水。
其中，所述低阶煤基腐植酸盐为腐植酸铵、腐植酸钾、腐植酸钠中的一种或几种。
所述表面活性剂为：斯盘20(span20)、斯盘40(span40)、斯盘60(span60)、斯盘65(span65)、斯盘80(span80)、斯盘85(span85)。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机搅拌均匀后静置发酵，所述搅拌机转速为100～150rpm/min。
所述液体发酵培养条件控制如下：0～12h时间范围内，温度为22～25℃。
所述固态发酵中条件控制如下：时间范围内24～36h、温度为25～28℃、湿度为50％～60％。
采用上述制备方法值得的一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂能够应用于食心虫的虫害防治中，其应用的具体使用方法，包括以下步骤：将本发明所述具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末和水以1：50～300的质量比例混合后充分摇匀，进行使用。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一：
所述发酵采用的发酵培养基分别为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.0％、酵母粉0.5％、腐殖酸钾3.0％、硫酸镁0.5％、氯化钙1.5％、蒸馏水1l、表面活性剂0.5％。固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠3％、淀粉1.0％、甘油0.5％、蒸馏水1l。
在液体培养基中培养所述白僵菌为球状白僵菌，表面活性剂为span20，然后将液体发酵培养基培养所得发酵液与固体培养液混合，混合比例为3：2，使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置进行固体发酵，在固体培养基培养一段时间，停止发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在25℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至80目大小，获得营养剂粉末，即为具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机，所述搅拌机转速为150pm/min。所述液体培养条件控制如下：培养时间为12h，培养温度为25℃；所述固态发酵中条件控制如下：培养时间为24h，培养温度为28℃、湿度为60％。
将制得的具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末和水以1：100的质量比例混合后充分摇匀，喷洒在果园中。
实施例二：
所述发酵采用的发酵培养基分别为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.5％、酵母粉0.5％、腐殖酸钾2.5％、硫酸镁1.0％、氯化钙1.5％、蒸馏水1l、表面活性剂1.0％。固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠3％、淀粉0.5％、甘油1.0％、蒸馏水1l。
在液体培养基中培养所述白僵菌为球状白僵菌，表面活性剂为span60，然后将液体发酵培养基培养所得发酵液与固化培养液混合，混合比例为3：2，使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置进行固体发酵，当固体培养基达24h，停止发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在25℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至80目大小，获得营养剂粉末，即为具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机，所述搅拌机转速为150pm/min。所述液体培养条件控制如下：培养时间为12h，培养温度为25℃；所述固态发酵中条件控制如下：培养时间为24h，培养温度为28℃、湿度为60％。
将制得的具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末和水以1：100的质量比例混合后充分摇匀，喷洒在果园中。
实施例三：
所述发酵采用的发酵培养基分别为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.5％、酵母粉0.5％、腐殖酸钾3.0％、硫酸镁1.0％、氯化钙2.5％、蒸馏水1l、表面活性剂1.0％。固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠2.5％、淀粉0.5％、甘油0.5％、蒸馏水1l。
在液体培养基中培养所述白僵菌为球状白僵菌，表面活性剂为span85，然后将液体发酵培养基培养所得发酵液与固化培养液混合，混合比例为3：2，使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置进行固体发酵，当固体培养基达24h，停止发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在25℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至80目大小，获得营养剂粉末，即为具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机，所述搅拌机转速为150pm/min。所述液体培养条件控制如下：培养时间为12h，培养温度为25℃；所述固态发酵中条件控制如下：培养时间为24h，培养温度为28℃、湿度为60％。
将制得的具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末和水以1：100的质量比例混合后充分摇匀，喷洒在果园中。
实施例四：
所述发酵采用的发酵培养基分别为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.0％、酵母粉1.0％、腐殖酸钾3.0％、硫酸镁1.0％、氯化钙2.0％、蒸馏水1l、表面活性剂0.5％。固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠2.5％、淀粉1.0％、甘油1.0％、蒸馏水1l。
在液体培养基中培养所述白僵菌为球状白僵菌，表面活性剂为span65，然后将液体发酵培养基培养所得发酵液与固化培养液混合，混合比例为3：2，使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置进行固体发酵，当固体培养基达24h，停止发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在25℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至80目大小，获得营养剂粉末，即为具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机，所述搅拌机转速为150pm/min。所述液体培养条件控制如下：培养时间为12h，培养温度为25℃；所述固态发酵中条件控制如下：培养时间为24h，培养温度为28℃、湿度为60％。
将制得的具有生物防治功能的农用腐殖酸将营养剂粉末和水以1：100的质量比例混合后充分摇匀，喷洒在果园中。
实施例五：
所述发酵采用的发酵培养基分别为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.5％、酵母粉1.0％、腐殖酸钾2.0％、硫酸镁0.5％、氯化钙2.0％、蒸馏水1l、表面活性剂1.0％。固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠3.0％、淀粉0.5％、甘油1.0％、蒸馏水1l。
在液体培养基中培养所述白僵菌为球状白僵菌，表面活性剂为span85，然后将液体发酵培养基培养所得发酵液与固化培养液混合，混合比例为3：2，使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置进行固体发酵，当固体培养基达24h，停止发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在25℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至80目大小，获得营养剂粉末，即为具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机，所述搅拌机转速为150pm/min。所述液体培养条件控制如下：培养时间为12h，培养温度为25℃；所述固态发酵中条件控制如下：培养时间为24h，培养温度为28℃、湿度为60％。
将制得的具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末和水以1：100的质量比例混合后充分摇匀，喷洒在果园中。
实施例六：
所述发酵采用的发酵培养基分别为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.0％、酵母粉1.0％、腐殖酸钾2.5％、硫酸镁1.0％、氯化钙2.5％、蒸馏水1l、表面活性剂1.0％。固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠3.0％、淀粉1.0％、甘油0.5％、蒸馏水1l。
在液体培养基中培养所述白僵菌为球状白僵菌，表面活性剂为span20，然后将液体发酵培养基培养所得发酵液与固化培养液混合，混合比例为3：2，使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置进行固体发酵，当固体培养基达24h，停止发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在25℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至80目大小，获得营养剂粉末，即为具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机，所述搅拌机转速为150pm/min。所述液体培养条件控制如下：培养时间为12h，培养温度为25℃；所述固态发酵中条件控制如下：培养时间为24h，培养温度为28℃、湿度为60％。
将制得的具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末和水以1：100的质量比例混合后充分摇匀，喷洒在苹果果园中。
实施例七：
所述发酵采用的发酵培养基分别为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.2％、酵母粉0.8％、腐植酸铵10％、硫酸镁0.7％、氯化钙3.0％、蒸馏水1l、表面活性剂0.7％。固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠2.0％、淀粉0.8％、甘油0.7％、蒸馏水1l。
在液体培养基中培养所述白僵菌为球状白僵菌，表面活性剂为span65，然后将液体发酵培养基培养所得发酵液与固化培养液混合，混合比例为3：1，使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置进行固体发酵，当固体培养基达24h，停止发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在22℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至60目大小，获得营养剂粉末，即为具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机，所述搅拌机转速为100pm/min。所述液体培养条件控制如下：培养时间为5h，培养温度为22℃；所述固态发酵中条件控制如下：培养时间为36h，培养温度为25℃、湿度为50％。
将制得的具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末和水以1：50的质量比例混合后充分摇匀，喷洒在苹果果园中。
实施例八：
所述发酵采用的发酵培养基分别为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.4％、酵母粉0.6％、腐植酸钠1％、硫酸镁0.9％、氯化钙1.8％、蒸馏水1l、表面活性剂0.9％。固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠2.0％、淀粉0.7％、甘油0.8％、蒸馏水1l。
在液体培养基中培养所述白僵菌为球状白僵菌，表面活性剂为span85，然后将液体发酵培养基培养所得发酵液与固化培养液混合，混合比例为3：1，使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置进行固体发酵，当固体培养基达24h，停止发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在28℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至70目大小，获得营养剂粉末，即为具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机，所述搅拌机转速为120pm/min。所述液体培养条件控制如下：培养时间为8h，培养温度为23℃；所述固态发酵中条件控制如下：培养时间为30h，培养温度为26℃、湿度为55％。
将制得的具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末和水以1：300的质量比例混合后充分摇匀，喷洒在苹果果园中。
实施例九：
所述发酵采用的发酵培养基分别为：液体发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：壳聚糖1.3％、酵母粉0.9％、腐植酸铵+腐植酸钾+腐植酸钠共5％(腐植酸铵、腐植酸钾、腐植酸钠的质量比为1:1:3)、硫酸镁0.8％、氯化钙2.7％、蒸馏水1l、表面活性剂0.6％。固化培养液由以下重量百分比的原料组成：海藻酸钠2.7％、淀粉0.6％、甘油0.9％、蒸馏水1l。
在液体培养基中培养所述白僵菌为球状白僵菌，表面活性剂为span20，然后将液体发酵培养基培养所得发酵液与固化培养液混合，混合比例为3：1.5，使用搅拌机搅拌，混合均匀后静置进行固体发酵，当固体培养基达24h，停止发酵，得到发酵中间物；将发酵中间物在28℃温度下自然风干，风干后对其进行粉碎，粉碎至75目大小，获得营养剂粉末，即为具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂。
所述液体培养与固体培养均采用搅拌机，所述搅拌机转速为135pm/min。所述液体培养条件控制如下：培养时间为10h，培养温度为24℃；所述固态发酵中条件控制如下：培养时间为32h，培养温度为27℃、湿度为53％。
将制得的具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂粉末和水以1：200的质量比例混合后充分摇匀，喷洒在苹果果园中。
实验检验：
(1)一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂对桃小食心虫防治效果的检验
在苹果果园进行防治试验。在果树上全面喷施菌液，以喷湿全部叶片为准。选取7棵树作为调查样本，每棵树选取合适的3根枝条进行套笼，套笼为长100cm，直径60cm的尼龙纱笼，每笼中有25头桃小食心虫幼虫，第一到六棵树对应实施案例一到六作为处理组，同时设置一组空白对照组，调查食心虫幼虫残留虫量，统计个小区稻水象甲死亡率。施菌后1、5、7d调查桃小幼虫死亡率按如下公式计算：
防治效果(％)＝(对照组活虫数－处理组活虫数)×100/对照组活虫数
表1不同实施案例的食心虫防治效果
由表1可知，实施例1～实施例9均对桃小食心虫的防治有显著作用且实施例1～实施例9防治效果明显。
(2)一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂对树叶叶绿素含量的影响：
对于生物界的几乎所有生物来说，光合作用是植物赖以生存的关键。叶绿素是植物进行光合作用必须的物质，本发明中叶绿素含量测试及计算方法用以下方法：在实用一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂后，称取实施例1～实施例6的果树叶片0.1g放入研钵研磨，加入少量碳酸钙。加入2ml的丙酮，研磨均匀后，添加2ml的丙酮，研磨至叶片泛白色，静置5～10min后，过滤到25ml棕色容量瓶中。用5ml丙酮清洗研钵，将其转移至漏斗过滤。将滤纸上残留的叶绿素用丙酮冲洗到棕色容量瓶中，用丙酮定容至25ml，摇匀。以纯丙酮溶液为对照组，然后分别在665nm、645nm波长下测定其吸光度，并计算叶绿素总含量。
叶绿素总含量：
其中：v为提取液总体积(ml)；w为植物样品鲜重(g)。
表2不同实施案例对植物叶绿素含量的影响
从实验数据可以看出用本专利发明的一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂对植物叶绿素的影响较为显著,其对植物生长有一定的促进作用。
(3)一种具有生物防治功能的农用腐殖酸营养剂对苹果中维生素c(vc)含量的影响：
在苹果生长过程中喷洒农用腐殖酸营养剂直至果实成熟，对果实的维生素c的含量进行检查。
维生素c含量的测定采用氧化型2,6-二氯酚靛酚在酸性条件下滴定测定，滴定时溶液由无色变为淡红色那一刻，即为滴定终点。首先取一定体积的标准vc溶液(0.1mg/ml)用2,6-二氯酚靛酚滴定至溶液呈粉红色且15s内无颜色消失发生，然后取同样量的2％的草酸做空白对照，并按上述方法滴定，最后称取苹果果肉100g捻碎后加入2％的草酸溶液15ml研磨成浆，将浆液转入到离心管中同时用少许2％的草酸溶液清洗研钵并合并液体，在8000r/min的转速下离心5min后将上清液转移至容量瓶中定容，取一定量的液体迅速用2,6-二氯酚靛酚滴定至液体呈粉红色，测定vc含量。vc含量按下式计算：
式中：
v为滴定样品所用2,6-二氯酚靛酚用量(ml)；
m为样品定容后的总体积(ml)；
n为所取待测样品的体积(ml)；
l为每1ml2,6-二氯酚靛酚溶液所氧化的vc含量(mg/ml)。
实验结果如下所示
表3农用腐殖酸营养剂对苹果果实维生素c的影响
综上所述，本发明公开了一种具有生物防治功能的腐殖酸营养剂，其制备反应原料包括：白僵菌、复合型培养基、低阶煤基腐植酸盐、表面活性剂。其制备方法通过将各反应原料经过混合及培育白僵菌，并磨制成粉末，最终制得一种具有生物防治功能的腐殖酸营养剂，所得具有生物防治功能的腐殖酸营养剂在给植物提供营养，促进植物生长的前提下，具有较好的生物防治功能，可用于推广农作物病虫害绿色防控产品和技术。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。