甾醇类化合物在抑制反硝化微生物脱氮活性中的应用

文档序号:9573986阅读:989来源:国知局
甾醇类化合物在抑制反硝化微生物脱氮活性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农田氮素损失阻控技术研究领域,具体涉及一种留醇类化合物在抑制 反硝化微生物脱氮活性中的应用。
【背景技术】
[0002] 自20世纪70年代以来,我国化肥氮的年使用量快速增加,对我国农业发展发挥了 巨大作用。但是,过量氮肥的施用和大量氮素的流失,不仅造成资源浪费和经济损失,而且 导致环境污染问题日趋严重。我国氮肥在农田去向比例中,作物吸收只占35%、氨挥发损失 11 %、硝化-反硝化损失34 %、淋洗损失2 %、地表径流损失5 %、未知部分13 %,氮肥利用 率比发达国家低10~20个百分点。因此,在我国农业高度集约化种植条件下,如何通过调 控氮素损失的关键过程,提高氮肥利用率,减少氮素损失,同时缓解由此造成的环境问题, 是农田氮素调控领域的研究热点。
[0003] 反硝化是农田氮素损失的主要途径之一,是由反硝化微生物将硝酸盐转化还原为 氮气和氧化亚氮的生物学过程。目前针对反硝化氮素损失的调控措施中,主要通过施用硝 化抑制剂来抑制土壤硝化作用,从而减少硝酸盐产生。但对于已被转化成硝酸盐的氮素,需 要抑制其反硝化损失,使更多的硝酸盐能被作物利用。然而,以往研究大都忽略了自然界中 植物对反硝化的抑制效应。浮萍是一种在农田地区广泛存在的小型浮叶植物,对农田生态 系统氮素调起了重要作用。植物根系能通过分泌特定的化合物或本身植物残体,改变根际 微生物的反硝化活性和群落结构。因此,强化植物-微生物的根际效应,如添加能抑制反硝 化微生物脱氮的特定化合物,将有效减少土壤硝酸盐的反硝化损失,提高氮肥利用率,为农 田氮素调控技术提供新的方法和思路。
[0004] 目前市场上常用的能减少农田硝酸盐损失的制剂,主要以硝化抑制剂类的化学品 为主,如2-氯-6-三氯甲基吡啶(CP)、双氰胺(D⑶)、3, 4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP),主要 作用是抑制土壤硝化过程,它们对于抑制氮素主要损失的反硝化过程有较大局限性。而且, 这些化合物成本较高,在土壤和水体中易流失和被微生物分解。至今,植物源能抑制微生物 反硝化除氮的特定化合物鲜有报道,而这类"绿色"物质在植物-微生物根际信号传导过程 起了重要作用,能切实抑制反硝化微生物的活性,在农田氮素损失阻控领域具有广阔的应 用前景。

【发明内容】

[0005] 解决的技术问题:本发明提供一种留醇类化合物在抑制反硝化微生物脱氮活性中 的应用。该物质能通过抑制反硝化微生物的活性来减弱氮素去除效率,以解决农田生态系 统中大量氮素反硝化损失(氮肥利用率低)的技术难题,同时本发明的"植物源"物质也能 改善外加化学硝化抑制剂易流失和被微生物分解的问题,大大增强对反硝化微生物转化农 田土壤硝酸盐的抑制效率,节约外加氮肥增效剂的成本。
[0006] 技术方案:留醇类化合物豆甾醇
[0007]
在抑制反硝化微生物脱氮活性中的应用。
[0008] 所述反硝化微生物为焚光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。
[0009] 上述留醇类化合物豆留醇抑制荧光假单胞菌的反硝化活性。
[0010] 上述留醇类化合物豆留醇减少农田氮素反硝化损失。
[0011] 上述甾醇类化合物豆甾醇添加浓度为5-60mg·L1。
[0012] 抑制荧光假单胞菌反硝化活性的组合物,有效成分为上述留醇类化合物豆甾醇。
[0013] 减少农田氮素反硝化损失的组合物,有效成分为上述留醇类化合物豆甾醇。
[0014] 有益效果:⑴本发明化合物能在低剂量下高效抑制反硝化微生物的活性,避免 实际应用过程中因抑制有益微生物生长而引起土壤微生物群落结构失衡现象;
[0015] (2)本发明化合物是一种脂溶性化合物,在土壤和水体中不易流失,能保证应用的 稳定性和高效性。
[0016] (3)本发明提供一种"绿色"反硝化抑制剂,可以减少农田生态系统中硝酸盐的反 硝化损失,从而提高土壤肥力。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明的浮萍提取物活性组分的GC/MS分析谱图。本发明抑制剂豆甾醇为 30.llmin出峰的物质;
[0018] 图2为本发明脱氮抑制物质与其他甾醇抑制率的比较(mean土SE,n= 3),不同的 小写字母表示组间有显著差异(P〈〇. 05,LSDtest);
[0019] 图3为本发明脱氮抑制物质剂量-荧光假单胞菌脱氮效率抑制率关系曲线 (mean土SE,η= 3) 〇
【具体实施方式】
[0020] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本 发明。
[0021] 对太湖地区筛选到紫背浮萍(Spirodelapolyrrhiza)的提取物进行提取、分离和 生物活性检测,并对活性组分进行GC/MS鉴定。在紫背浮萍提取物活性组分中分离鉴定到 3种留醇类化合物,其中豆留醇stigmastero1 (分子量:412. 70),具有显著的反硝化抑制效 果。本发明中的反硝化微生物为常见的荧光假单胞菌。该化合物在添加浓度为5-60π^·?/ 时,可对荧光假单胞菌脱氮率有约5-25 %的抑制效果。本发明的植物源化合物在微生物脱 氮过程中主要起化学信号作用,抑制了反硝化微生物的活性,而不是抑制了反硝化微生物 的生长。
[0022] 实施例1高效抑制反硝化的甾醇类化合物与同类物质间的效果比较
[0023] 1. 1实验设计
[0024](1)标准品:3种甾醇类化合物,豆甾醇(Stigmasterol),菜油甾醇(Campesterol) 和β-谷留醇(β-sitosterol),均购于Sigma-Aldrich公司(St.Louis,M0,USA),并溶解 于CH2C12 中。
[0025] (2)微生物菌株:荧光假单胞菌(ACCC01047),购于中国农业微生物菌种保藏管 理中心。
[0026] (3)LB培养基:10g/Ltryptone,5g/Lyeastextract,10g/LNaCl,pH7.0〇
[0027] (4)反硝化培养基:0· 72g/LKN03,1.Og/LKH2P04,0.20g/LMgS04·7H20,2. 8g/L C4H4Na204 · 6H20,pH7. 0〇
[0028] (5)生物活性实验
[0029]收集在LB培养液中活化20h的荧光假单胞菌,离心lOmin(5, 000g,4°C),然后重 新悬浮于无菌的反硝化培养液中。lmL荧光假单胞菌菌液和20μL各作用物质,添加到含 有19mL反硝化培养液的50mL三角瓶中,使得最终作用物质的浓度为20mg·L\在摇床中 30°C,120rpm培养。对照为添加20yL CH2C12,实验设置3个重复。培养72h后,吸取lmL菌 液离心lOmin(10, 000g),上清液测定总氮含量(碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法)。菌 液的生物量用比浊法测定,即用分光光度计(Bio-Rad3000 ;USA)测定菌体在600nm处吸光 度。荧光假单胞菌脱氮率(%)和抑制率(%)的计算方法如下:
[0032] (6)数据分析
[0033] 数据处理结果均以(mean土SE)表示,采用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分 析及组间两两比较。
[0034] 1. 2实验结果
[0035] 对浮萍提取物活性组分进行GC/MS分析,鉴定到3种含量高的留醇类化合物,在 30.llmin(图1)出峰的物质为本发明抑制剂豆留醇。通过3种留醇类化合物的抑制效果反 证实验,发现在浓度为20mg·L1时,同一类化合物的不同物质对荧光假单胞菌脱氮率有不 同的影响(表1)。在添加浓度20mg·L1本发明抑制剂处理后,豆甾醇对荧光假单胞菌的 脱氮率有最显著的抑制作用(P〈〇. 05),抑制率约为19.3% (图2)。但其他2种作用物质添 加后对荧光假单胞菌的脱氮率无显著影响。而且,豆留醇的抑制率与其他2种作用物质有 显著差异(图2)。结果表明,本发明的抑制剂豆留醇对荧光假单胞菌的脱氮率有特定的抑 制效果。
[0036] 相对于对照,这3种作用物质的添加对荧光假单胞菌的生长基本无影响,各处理 的〇D6。。值在0.45之间(表1)。可见,本发明的抑制剂主要是抑制了荧光假单胞菌的反硝 化活性。
[0037] 另外,由于添加20mg · L 1豆留醇到反硝化培养液中,其总有机碳浓度(T0C)相对 于反硝化培养液中T0C占低于2%的含量,因此,本发明的抑制剂主要是起化学信号作用抑 制反硝化活性,而不是简单抑制反硝化微生物的生长。
[0038] 表 1
[0039]
[0040] *不同的小写字母表示组间有显著差异(P〈0. 05,LSDtest)
[0041] 实施例2抑制剂豆留醇对荧光假单胞菌脱氮效率的抑制作用
[0042] 2. 1实验设计
[0043] 分别添加5, 10, 20, 40, 60mg·L1的本发明抑制剂豆甾醇于反硝化培养液中,再添 加lmL荧光假单胞菌菌液,于摇床中30°C,120rpm培养,对照为CH2C12。培养72h后,菌液 按照1. 1中方法离心,上清液测定总氮浓度,计算各处理后的脱氮抑制率(% )。
[0044] 2. 2实验结果
[0045] 本发明抑制剂在添加浓度为5-60mg*L1时,对荧光假单胞菌的脱氮率有约5-25% 的抑制效果(图3)。由于在添加40mg*L1浓度时,脱氮抑制率为24. 6%,已基本达到最高 值,所以考虑到成本,建议在应用过程中豆甾醇的添加量为40mg*L1左右,同时为应用于其 他反硝化菌株的剂量作参考。
【主权项】
1. 甾醇类化合物豆甾醇在抑制反硝化微生物脱氮活性中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于所述反硝化微生物为荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)〇3. 根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述留醇类化合物豆留醇抑制荧光假单胞 菌的反硝化活性。4. 根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述留醇类化合物豆留醇减少农田氮素反 硝化损失。5. 根据权利要求1~4任一所述的应用,其特征在于所述留醇类化合物豆留醇添加浓 度为 5_60mg · L ^6. 抑制荧光假单胞菌反硝化活性的组合物,其特征在于有效成分为权利要求1所述的 甾醇类化合物豆甾醇。7. 减少农田氮素反硝化损失的组合物,其特征在于有效成分为权利要求1所述的甾醇 类化合物豆甾醇。
【专利摘要】甾醇类化合物在抑制反硝化微生物脱氮活性中的应用,结构式为,本发明化合物能在低剂量下高效抑制反硝化微生物的活性,避免实际应用过程中因抑制有益微生物生长而引起土壤微生物群落结构失衡现象;本发明化合物是一种脂溶性化合物,在土壤和水体中不易流失,能保证应用的稳定性和高效性;本发明提供一种“绿色”反硝化抑制剂,可以减少农田生态系统中硝酸盐的反硝化损失,从而提高土壤肥力。
【IPC分类】C05G3/08
【公开号】CN105330493
【申请号】CN201510767401
【发明人】陆玉芳, 施卫明, 孙力
【申请人】中国科学院南京土壤研究所
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月11日
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1