根瘤菌w33菌株的新应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业技术和根瘤菌应用领域，涉及根瘤菌Rhizobiumsp.W33菌株的新 应用，具体涉及根瘤菌Rhizobiumsp.W33菌株在提高植物钾肥吸收利用率方面的应用。
【背景技术】
[0002] 我国钾肥资源缺乏，进口依赖率高，农业生产中投入的钾肥易淋失，利用率仅为 20%~60%，从而造成我国农业花费大量外汇进口钾肥，生产中使用越多、淋失越多、土壤 结构破坏越严重、作物产量和品质下降的恶性循环。国际上提出了养分资源综合管理技术， 强调减少化肥投入，保持或提高作物产量，保护生态环境的策略。我国也相应提出精确施 肥、开发缓效钾肥、培育耐低钾植物品种、使用有机肥等技术。然而上述技术存在若干问题， 比如缓效钾肥多用聚合材料包裹硫酸钾等，释放非常缓慢难以满足植物生长需求，包裹材 料存在二次污染的问题；比如低钾植物品种培育周期长、不适应复杂土壤生态环境等。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有技术存在的问题，提供根瘤菌Rhizobiumsp.W33菌株的 新应用。
[0004] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0005] 保藏号为CCTCCNO:M2012357的根瘤菌（Rhizobiumsp. )W33在提高植物钾吸收 量和钾肥利用率中的应用。
[0006] 所述的应用，优选将所述的根瘤菌W33进行活化，制备为细胞数量达到5亿CFU/ml 以上的菌悬液施用于土壤中。
[0007] 其中所述的活化方法优选为将所述的根瘤菌W33斜面菌种接种于固体培养基 中，30°C培养3d;然后选取饱满、粘稠的W33菌落接种于液体培养基，30°C150rpm振荡培 养16 - 20h;将发酵液转移至无菌离心瓶中，5000rpm离心5min收集菌体，用无菌去离子 水洗涤，重新悬浮，使细胞数量达到5亿CFU/ml以上；其中所述的固体培养基配方为蔗糖 10. 0g, (NH4)2S040 . 5g,Na2HP042. 0g,NaCl0.lg,KCl0. 191g,MgS04 ·7H20 0. 5g,H20 1000ml, 琼脂20g;所述的液体培养基配方为蔗糖10. 0g，（NH4)2S040 . 5g，Na2HP042. 0g，NaCl0.lg， KC1 0· 191g，MgS04 · 7H20 0· 5g，H20 1000ml。
[0008] 保藏号为CCTCCNO:M2012357的根瘤菌（Rhizobiumsp. )W33在吸持溶液中钾的 应用。
[0009] 保藏号为CCTCCNO:M2012357的根瘤菌（Rhizobiumsp. )W33在增加土壤多糖含 量中的应用。
[0010] 有益效果
[0011] (1)根瘤菌Rhizobiumsp.W33菌株能够吸持溶液中的钾元素，对K的吸持率达到 9% ~17%〇
[0012] (2)接种根瘤菌Rhizobiumsp.W33处理的土柱渗漏水中钾淋失量显著降低 21% - 24%。接菌W33处理lOd时土壤多糖含量增加70%。
[0013] (3)施用80%钾加上接种根瘤菌Rhizobiumsp.W33的处理，使得小麦幼苗生物量 显著增加49%，钾素吸收量显著增加58%，磷素吸收量显著增加56%，钾肥吸收利用率显 著增加5. 7倍。
[0014] 生物样品保藏信息
[0015] 植物促生细菌W33,分类命名为根瘤菌W33(Rhizobiumsp.W33)，保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年9月18日，菌种保藏 号为CCTCCNO:M2012357。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1菌株W33对溶液中K的吸持能力
[0017]配制培养基（蔗糖 10. 0g，（NH4)2S040 . 5g，Na2HP042. 0g，NaCl0·lg，KC1 0· 038g、 0· 115g或 0· 191g，MgS04.7H20 0.5g，H20 1000ml)，其中KC1 添加量分别为 0.038g、0. 115g 和0.1918，使得1((：1含量设置为20%、60%和100%1(，调节口!17.0-7.5，1151：灭菌301^11。 将W33(CCTCCNO:M2012357)接种于上述液体培养基中，30°C静置培养3d。取样测定发酵 液中W33(CCTCCNO:M2012357) 0D6。。值，将发酵液12000rpm离心5min，取上清液测定K元 素含量，计算菌体对K的吸持率。由表1可知，在20%、60%和100%K含量条件下，发酵液 中〇D6。。值达到0. 8左右，没有差异，说明W33在减少K含量条件下也能生长良好。接菌处 理后发酵液中K含量均比不接菌对照显著减少（P〈0. 01)，且在20%和60%K含量条件下， W33对K的吸持率可达17 %。
[0018] 表1菌株W33在不同K含量的培养液中的生长及其对K的吸持率
[0019]
[0020] 实施例2菌株W33的活化和菌悬液制备
[0021] 将W33(CCTCCNO:M2012357)斜面菌种接种于固体培养基（蔗糖10. 0g， (NH4)2S040 . 5g，Na2HP042. 0g，NaCl0·lg，KC1 0· 191g，MgS04 · 7H20 0· 5g，H20 1000ml，琼月旨 20g)中，30°C培养3d。然后选取饱满、粘稠的W33菌落接种于液体培养基（蔗糖10. 0g， (NH4)2S040 . 5g,Na2HP042.Og,NaCl0.lg,KC1 0. 191g,MgS04 · 7H20 0. 5g,H20 1000ml), 30°C150rpm振荡培养16 -20h。将发酵液转移至无菌离心瓶中，5000rpm离心5min收集菌 体，用无菌去离子水洗涤，重新悬浮，使细胞数量达到5亿CFU/ml以上。
[0022] 实施例3菌株W33接种土壤减少K淋失
[0023] 采用模拟土柱实验。土柱实验用高35cm、内壁直径4. 5cm的PVC管，管下端使用尼 龙网、滤纸、尼龙网依次包扎，并铺填30g洁净石英砂；取黄棕壤菜园土 0 - 20cm土层土样， 风干过5mm孔径筛，然后装入PVC管，每个土柱总计装风干土样400g。在土柱表面放置一张 直径42mm的滤纸片，以保证加水时表面平整和水分能够均匀地向土柱中渗透。加水160ml 调节土柱含水量至田间饱和持水量的60%，静置24h后，按0. 241gK20/kg土的施肥量将 KC1溶液均匀滴注在土柱上，静置24h后去掉滤纸片。按10%的接种量（菌液体积：土柱 重量=ml: 100g)将实施例2所得的W33菌悬液均匀地滴注在土柱土层表面，对照用等量 的无菌去离子水代替，每个处理设3个重复。将土柱放置于28°C的温室培养。采用间歇淋 洗法，分别在第ld、10d、20d、30d进行淋溶试验。用500mL量筒（精确度为lmL)准确量取 500mL的去离子水，在4h内分次缓慢浇灌。用500mL纯净水瓶（于试验前用去离子水洗净 并晾干）放在土柱下方在每次淋溶试验的12h内收集渗漏水。测定渗漏水中的K含量，计 算钾的淋失量。在30d时取出土柱中的土壤，风干后测定土壤中多糖的含量。由表2结果 表明，在接菌W33后第Id时，钾淋失量与对照相当。随着时间的延长，模拟土柱中钾素淋失 量减少，与对照相比，接菌W33处理的土柱渗漏水中钾淋失量显著降低21 %-24%。与对照 相比，接菌W33处理的土壤多糖含量增加40% - 70%，在接菌W33后的第10d，土壤多糖含 量增加最多。
[0024] 表2菌株W33对模拟土柱渗漏水钾素淋失量和土壤多糖含量的影响
[0025]
[0026] 实施例4菌株W33促进小麦幼苗生长及吸收钾磷
[0027] 采集菜园土，风干磨碎，装入塑料盆钵，每盆2kg，设置5个施钾肥水平：0 %K(不 施钾肥）、40%1((0.0968 1(20/1^土）、60%1((0.1458 1(20/1^土）、80%1((0.1938 1(20/1^ 土）、100%K(0. 241gK20/kg土），使用氯化钾；其他肥料用量为N0.lg/kg，P2050. 229g/kg， 使用硫酸铵和磷酸二氢铵。加水使盆栽土壤含水量为田间持水量的60%，保持2d。选取饱 满的小麦种子，用70%酒精浸泡lOmin表面消毒，然后用无菌水洗涤，置于垫有无菌滤纸的 无菌平皿中催芽。选取萌发一致的小麦种子播入盆钵，按10%的接种量将实施例2所得的 W33菌悬液均匀滴注在种苗周围土壤中，对照接等量灭菌悬液。植株生长期间适量浇水，保 持土壤湿度为田间持水量的60 %。生长30d后再接种实施例2所得的W33菌悬液10ml。生 长50d后收获小麦幼苗，取出整株幼苗，洗净，在105°C下杀青，70°C烘干，称量植物干重。植 物样品磨碎后用H2S04 -H202法消煮，用原子吸收分光光度法测定植株中钾含量。由表3可 知，施用80%和100%钾时，小麦生物量显著降低，说明施用大量钾并没有促生作用，反而 抑制了小麦幼苗的生长。在60% - 100%施钾水平条件下，接种W33后，小麦幼苗生物量显 著增加15%-69%，达到7.4-8. 3g/盆。由表4可知，随着施钾量的增加，小麦幼苗钾素吸 收量增加，施用80%和100%钾时，接种W33处理使得小麦幼苗钾素吸收量显著增加53% 和58%。施用80%和100%钾时，接种W33处理使得小麦幼苗磷素吸收量显著增加56%和50%〇
[0028] 表3菌株W33对小麦幼苗生长的影响
[0029]
[0030] 表4菌株W33对小麦幼苗吸收钾磷元素的影响
[0031]
[0032] 实施例5菌株W33促进钾肥利用率
[0033] 按照实施例4设计和进行试验，测试，按照下列公式计算钾肥吸收利用率（K recoveryefficiency,KRE)(%)，KRE=(施钾区植株总吸钾量-无钾区植株总吸钾量）/ 施钾量X100。由表5可知，在40% - 100%施钾水平条件下，未接菌处理的小麦盆栽中钾 肥吸收利用率仅为1. 7% - 6. 7%，接种W33处理后钾肥利用率提高1. 7倍-5. 7倍。施用 80%和100%钾时，接种W33处理使得小麦幼苗钾肥利用率显著增加3. 8倍和5. 7倍。
[0034] 表5菌株W33对钾肥吸收利用率的影响
[0035]
【主权项】
1. 保藏号为CCTCCNO:M2012357的根瘤菌（Rhizobiumsp. )W33在提高植物钾吸收 量和钾肥利用率中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于将所述的根瘤菌W33进行活化，制备为细胞 数量达到5亿CFU/ml以上的菌悬液施用于土壤中。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的活化方法为将所述的根瘤菌W33斜 面菌种接种于固体培养基中，30°C培养3d;然后选取饱满、粘稠的W33菌落接种于液体培养 基，30°C150rpm振荡培养16 -20h;将发酵液转移至无菌离心瓶中，5000rpm离心5min收集 菌体，用无菌去离子水洗涤，重新悬浮，使细胞数量达到5亿CFU/ml以上；其中所述的固体 培养基配方为蔗糖 10. 〇g，（NH4)2S040 . 5g，Na2HP042 . 0g，NaCl0·lg，KCl0· 191g，MgS04 ·7Η20 0· 5g，H20 1000ml，琼脂20g;所述的液体培养基配方为蔗糖10. 0g，（NH4) 2S040.5g， Na2HP042. 0g，NaCl0·lg，KC1 0· 191g，MgS04 · 7H20 0· 5g，H20 1000ml。4. 保藏号为CCTCCNO:M2012357的根瘤菌W33在吸持溶液中钾的应用。5. 保藏号为CCTCCNO:M2012357的根瘤菌W33在增加土壤多糖含量中的应用。
【专利摘要】本发明属于农业和农业技术和根瘤菌应用领域，公开了根瘤菌Rhizobium？sp.W33菌株的新应用。以根瘤菌Rhizobium？sp.W33为原料，经细菌活化后制备成菌悬液。接种在含钾液体培养基中，能够吸持溶液中的钾。接种在土壤中可以减少钾肥的淋失，显著促进植物生长及对钾、磷的吸收，提高钾肥吸收利用率。CCTCC NO：M 201235720120918
【IPC分类】C12N1/20, C05G3/04, C12R1/41, C05G3/00
【公开号】CN105418204
【申请号】CN201410444667
【发明人】何琳燕, 盛下放, 黄智 , 闫亚南
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2014年9月2日