一种微生物复合肥及其制备

一种微生物复合肥及其制备
【专利摘要】本发明公开了一种微生物复合肥，重量份数组成为：植物乳杆菌混合菌剂8?20份,混合曲霉培养物10?20份，枯草芽孢杆菌培养物8?15。本产品使用方法简单，每亩地使用量0.2?0.5公斤，成本仅为80?100元/亩，拌种或生长期灌水前地表喷洒。CGMCC No.940520140702CGMCC NO.1176320151130
【专利说明】
-种微生物复合肥及其制备
技术领域
[0001] 本发明设及一种复合肥，属于农用肥料技术领域。
【背景技术】
[0002] 微生物肥的功效发挥主要是通过对传统化肥、有机肥的增效作用，对±壤的改良 活化作用，W及微生物的生理作用等方式来实现的。因此，微生物肥料就有了化肥、有机肥、 有益生物菌的多种肥力和功效，是活化肥料养分、提高肥料效果、改良作物品质、促进农业 增产增效的理想肥料。微生物肥料是活体肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物 的生命活动来完成。只有当运些有益微生物的生命活动来完成。只有当运些有益微生物处 于旺盛的繁殖和新陈代谢的情况下，物质转化和有益代谢产物才能不断形成。因此，微生物 肥料中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性的基础，而不像其它肥料是W氮、 憐、钟等主要元素的形式和多少为基础。正因为微生物肥料是活制剂，所W其肥效与活菌数 量、强度及周围环境条件密切相关，包括溫度、水分、酸碱度、营养条件及原生活在±壤中± 著微生物排斥作用都有一定影响。
[0003] 一株产耐高溫a-淀粉酶的枯草芽抱杆菌，申请号:201310566374.5.本发明公开了 一株产耐高溫Q-淀粉酶的枯草芽抱杆菌，所述枯草芽抱杆菌(Baci Ilussubti Iis )Li-2013- 02于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(CGMCC)，保藏 号为CGMCCNo. 7926。该菌株产耐高溫a-淀粉酶的枯草芽抱杆菌Li-2010经紫外线-氯化裡- 硫酸二乙醋复合诱变筛选获得，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点，应用前景 非常广阔。一株高产纤维素酶的黑曲霉.申请号：201310571925.7.本发明公开了一株高产 纤维素酶的黑曲霉，本发明属于黑曲霉领域，特别设及高产纤维素酶的黑曲霉菌株。本发明 所提供的黑曲霉(Aspergi Ilusniger )，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCCNo. 7927。发酵罐实验跟踪的各项性能指标表明，该菌株 代谢正常，产纤维素酶能力强，是一株优良的纤维素酶高产菌株。
[0004] 由于我国长期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我国的微生物肥料产业依然 存在整体水平不高、技术创新不足、产品质量与应用效果表现欠稳定的问题。在农业可持续 发展已成为人类共识的今天，运些问题成了微生物肥行业函待打通的"瓶颈"。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种微生物复合肥：
[0006] 重量份数组成为:植物乳杆菌混合菌剂8-20份，混合曲霉培养物10-20份，枯草芽 抱杆菌培养物8-15;
[0007] 所述混合曲霉培养物的组成及重量份数如下：黑曲霉培养物5-9份，泡盛曲霉培养 物1-3份；
[000引所述黑曲霉(Aspergillus niger)为CGMCC NO.7927。
[0009]植物乳杆菌混合菌剂组成及重量份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉1-2份，植 物乳杆菌CGMCC 11763菌粉5-8份；
[0010] 所述枯草芽抱杆菌培养物制备:从斜面转接培养枯草芽抱杆菌，逐级扩培后的种 子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得枯草芽抱杆菌培养物。
[0011] 植物乳杆菌剂的制备方法:从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转 接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低溫负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加 载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀;浓缩液与载体的重量比为0.5-0.6:1，载体 组成为:化C〇3 20-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0012] 泡盛曲霉培养物制备:菌种培养，固体发酵培养:抱子液接种到米曲霉固态发酵培 养料中，26-33 °C培养至菌丝长满培养料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0013] 黑曲霉培养物制备:菌种培养，采用常见固体发酵培养方法制备:抱子液接种到固 态发酵培养料中，26-33 °C培养至菌丝长满培养料，干燥，粉碎干燥物。
[0014] 有益效果
[0015] 本发明的肥料能够增强作物的抗旱能力。本发明的肥料由复合微生物发酵而成， 能够改善±壤的微生态环境，为农作物的生长提供有益条件。本发明的肥料能够改良±壤。 肥料中有益微生物能产生糖类物质，占±壤有机质的0.1%，与植物粘液，矿物胚体和有机 胶体结合在一起，可W改善±壤团粒结构，增强±壤的物理性能和减少±壤颗粒的损失，在 一定的条件下，还能参与腐殖质形成。所W施用微生物肥料能改善±壤物理性状，有利于提 高±壤肥力。
[0016] 本产品使用方法简单，每亩地使用量0.2-0.5公斤，成本仅为80-100元/亩，拌种或 生长期灌水前地表喷洒。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的 范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本 发明实质和范围的前提下，对运些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。
[0018] 本发明中植物乳杆菌CGMCC 9405菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆 状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽抱;在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致 密，形态为圆形，边缘较整齐。
[0019] 理化特征为:过氧化氨酶(-)，明胶液化(-)，吗I噪实验( + )，运动性(-)，发酵产气 (-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氨气体(-),PH4.0MRS培养基中生长(+ )。
[0020] 本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育：
[0021] 原始出发菌种^试管活化^硫酸二乙醋(DES)诱变^亚硝基脈(NTG)诱变^等离 子体诱变^平板初筛^摇瓶复筛^传代稳定性试验。
[0022] 本发明所采用的出发菌株在MRS葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/L/d, 当培养基pH为3.5时几乎停止生长，对亚硝酸钢的分解速率为0.34mg/h/kg白菜。出发菌株 为李政采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。
[0023] 为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用DES和NTG 技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用MRS碳酸巧平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发 酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验， 评价其遗传稳定性。
[0024] 植物乳杆菌tlj-2014遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都 比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把植物乳杆菌tlj-2014作为选育得到的目的菌 株。
[0025] 经验证发现:该诱变菌株的乳酸生产速率可W达到35g/L/d，该菌株经过71小时发 酵后乳酸浓度达到95g/l;能够在pH为1.80的条件下存活。降解亚硝酸盐速度快，分解能力 达到9.8mg/h/kg(自然发酵过程亚硝酸盐积累的速率大约为1. Img/h/kg)，能够耐1%胆盐。
[0026] 因此采用该菌种生产泡菜，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在5mg/kgW下，远低于 国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
[0027] 植物乳杆菌(Xactobaci Ilus plantarum) tlj-2014,该菌株已于2014年7月2 日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101),保藏号为CGMCC NO.9405。
[0028] 1. DES诱变选育
[0029] 1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L 一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 月旨，葡萄糖20g/L)培养基的250血S角瓶中，200巧m，37°C培养1化左右，使菌体处于对数生 长前期。
[0030] 2)取5mL菌液，500化pm离屯、IOmin收集菌体，用生理盐水洗涂2次。
[0031] 3)用PH7.0憐酸缓冲液稀释成IO7个/mL菌悬液。
[0032] 4)取32血PH7.0的憐酸钟缓冲液、SmL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL S角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1 % (v/v)。
[0033] 5)在37°C摇床中150rpm反应30min，取ImL混合液，加入0.5mL 25%化2S2O3溶液中 止反应。
[0034] 6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸巧筛选培养基(含lOOg/L葡 萄糖的碳酸巧MRS培养基)平皿中。在37°C培养2~3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株 转印到抑为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低抑值改性MRS培养基)上和亚硝酸钢筛选培养 基(单一氮源为2g/L亚硝酸钢的改性MRS筛选培养基)上。
[0035] 7)在37 °C培养2~3天后，挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钢筛选培 养基上生长并且在碳酸巧筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆菌L1。
[0036] 2.亚硝基脈诱变
[0037] 1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌Ll 一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 月旨)培养基(葡萄糖浓度为60g/L)的250血S角瓶中，200巧m，37°C培养1化左右，使菌体处于 对数生长前期。
[0038] 2)取5mL菌液5000巧m离屯、IOmin收集菌体，用生理盐水洗涂2次。
[0039] 3)用抑6.0憐酸缓冲液稀释成IO7个/血菌悬液。
[0040] 4)取10血菌悬液转移至IOOmL^角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成终浓度为lOmg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酬，W利于NTG溶解。
[0041 ] 5)在37°C下200rpm振荡反应30min，5000rpm离屯、IOmin收集菌体，用无菌生理盐水 洗涂数次，中止反应。
[0042] 6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸巧筛选培养基(含lOOg/L葡 萄糖的碳酸巧MRS培养基)平皿中。在37°C培养2~3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株 转印到抑为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低抑值改性MRS培养基)上和亚硝酸钢筛选培养 基(单一氮源为2g/L亚硝酸钢的改性MRS筛选培养基)上。
[0043] 7)挑选菌株方法:挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钢筛选培养基上 生长并且在碳酸巧筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合W上条件的菌落。
[0044] 3.摇瓶复筛
[0045] 1)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL培养基MRS (无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为lOOg/L)的250mLS角瓶中，200rpm，37°C培养1加左右，使菌 体处于对数生长中期。
[0046] 2)分别取5mL菌液，接入装有50mL碳酸巧筛选液体培养基(含250g/L葡萄糖的碳酸 巧MRS培养基)平皿中、抑为1.5、1.8和2.0的LPHMRS液体培养基(低抑值改性MRS培养基）和 亚硝酸钢液体筛选培养基（单一氮源为2g/L亚硝酸钢的改性MRS筛选培养基）上（注:采用 250mLS角瓶）。20化pm，37°C培养3-4天，每天分别检测碳酸巧筛选液体培养基中k乳酸产 生速率、LP丽RS液体培养基中的生物量和亚硝酸钢液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速 率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸巧筛选液体培养基中心乳酸产生速率、LP歷RS液体 培养基中的生物量和亚硝酸钢液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。
[0047] 3)选择兼具高k乳酸产生速率、耐受低抑(该菌种仅能在最低为抑1.8的培养基中 生长)和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为L2菌。
[004引 4.遗传稳定性试验
[0049]将L2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情 况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说 明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌化actobacillus plantarumHlj- 2014。
[(K)加]5.化发酵罐试验
[0051] 1)取斜面上的植物乳杆菌L2-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂）（葡萄糖浓度 为150g/L)培养基的250mLS角瓶中，200巧m，37°C培养1化左右，使菌体处于对数生长中期。
[0052] 2)将对数期的菌种接入装有化MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的化发酵 罐中。接种量为10%，37°C下10化pm培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0.化/min)，后 期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌L2的乳酸产量达到95g/L。运样的产乳酸速率 利于泡菜的快速发酵。
[0053] 3)将对数期的菌种接入装有化pH为1.8的LPHMRS液体培养基(初始葡萄糖为50g/ L)的化发酵罐中。接种量为10%，37°C下10化pm培养8小时，对数前期溶氧控制10 % (通气 0.化/min)，后期厌氧，整个过程用0.5mol/L的氨氧化钢将发酵液抑控制在1.8，总培养时间 为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌L2的生物量为2.5g/L，说明植物乳杆菌L2能够在 P化.8的环境中生存。
[0054] 4)将对数期的菌种接入装有化亚硝酸钢液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸 钢的改性MRS筛选培养基）的化发酵罐中。接种量为10 %，37 °C下10化pm培养8小时，对数前 期溶氧控制10 % (通气O.化/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L 的亚硝酸钢溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌L2对亚硝酸钢的降解 速率。结果发现:在该条件下，L2对亚硝酸钢的降解速率可W达到563mg/h/L。
[0055] 5)将对数期的菌种IOmL接入装有化g预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行 加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，L2菌对亚硝酸 钢的分解速率为9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钢含量始终低于5mg/kg，远低于国家标 准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
[0化6] 发明所述植物乳杆菌（LactobaciIlus plantarunOXH于2015年11月30日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 11763,保 藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。 [0化7] 植物乳杆菌益生特性如下：
[005引本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC NO. 11763经实验发现能够在抑为1.50的条件 下存活，在1 %胆盐培养4小时后仍处于存活状态;植物乳杆菌CGMCC NO. 11763降解亚硝酸 盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓 度在4.8mg/kgW下；CGMCC NO. 11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76%。 CGMCC NO. 11763黏附能力测定的自凝集率为95.71 %。
[0化9] CGMCC NO. 11763对胆固醇降解能力研究和测定：
[0060] 取Iml CGMCC NO. 11763母液接种于IOmL的MRS胆固醇液体培养基（胆固醇含量 O.lmg/ml，抑6.2)中，37°C的恒溫静置分别培养20h、40h、60h备用，W接入1血无菌水的MRS 胆固醇培养基为对照，取W上培养不同时间的菌液样品及对照液各lml，9000r/min，4°C下 离屯、lOmin，得到发酵上清液，邻苯二甲醒法测定上清液中胆固醇含量(具体为:取各上清液 0 . Iml于相应的试管中，加冰醋酸0.3ml，Img/ml的邻苯二甲醒0.15ml，缓缓加入浓硫酸 1.Oml，混合均匀。室溫静置IOmin，于550nm下测吸光值）。每一处理3个重复，W同样方法制 作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率，结果见表1。可知，CGMCC NO. 11763 对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76%。
[0061 ]表1对胆固醇的降解情况
[0062]
[0063] CGMCC NO. 11763菌株的耐胆盐试验：
[0064] 取CGMCCN0.11763菌液ImL接种菌种于含有不同胆盐（含量梯度为0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、l%)的10血MRS液体培养基(PH=6.4)，置于37°C下分别培养0、2、4h， 每个处理3个重复。各取Iml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释 液于MRS中涂布，于37°C生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平 板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1 %处理4h后菌的生长量依然达到 0.59±0.92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。
[0065] 表2耐胆盐能力检测[(±s) X 107cfu/ml]
[0066]
[0067] CGMCC NO. 11763菌株的耐酸试验
[0068] 取CGMCC NO. 11763母液按Iml接种菌种于不同抑值(抑梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的10血MRS液体培养基，置于37°C下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取Iml 样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1 ml稀释液于MRS中涂布，于37 °C生化 培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说 明该菌具有很强的耐酸能力。
[0069] 表3耐酸能力检测[(±s) X 107cfu/ml]
[00701
[0071] CGMCC NO. 11763菌株的黏附能力测定
[0072] 培养CGMCC NO. 11763(MRS液体培养基）、大肠杆菌D册a(LB液体培养基)24h得发酵 液，分别置于3000r/min、4°C下离屯、IOmin，收集菌泥，分别用抑=7.0的无菌憐酸盐缓冲液 (PBS)洗涂菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4°C下离屯、 IOmin，收集菌体）。自凝集率（％ ):用无菌的PBS将菌泥CGMCC NO. 11763制成在波长600皿处 的吸光值为〇.4±0. UA 0)的悬浮菌液及菌悬液，静置24h后测定吸光值A 24,自凝集率 (%)公式为(4 0-4 24)心0。；他凝集率（％):将〔610：^).11763和大肠杆菌0册〇的悬菌 液调节成在波长600皿处的吸光值为0.6±0.1 (A 0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光 值A 24,他凝集率（％ )公式为(A 0 -A 24VA 0。测定结果见表4,可知CGMCC NO. 11763的 自凝集率为95.71 %，有很强的黏附能力。
[0073] 表4黏附能力表
[0074]
[00巧]菌株生理特性
[0076] 所述植物乳杆菌(Xactobaci Ilus plantarunOXH于2015年11月30日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 11763,保藏地 址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
[0077] 该菌株特点如下:在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛， 不产芽抱;在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
[0078] 理化特征为:过氧化氨酶(-)，明胶液化(-)，吗I噪实验( + )，运动性(-)，发酵产气 (-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氨气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+ )。经过 生理生化鉴定为为植物乳杆菌化actobaci Ilus PIantarum)，命名为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)XH。
[0079] 菌株能够在57°C下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。
[0080] 本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆维吾尔族老乡家中酸奶中分离得到， 采集时间2015年6月2日。
[0081 ] 化发酵罐试验
[0082] (1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO. 11763-环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 脂）（葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mLS角瓶中，200巧m，37°C培养12h左右，使菌体处 于对数生长中期。
[0083] (2)将对数期的菌种接入装有化MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的化发酵 罐中。接种量为10%，37°C下10化pm培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0.化/min)，后 期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌CGMCC NO. 11763的乳酸产量达到llOg/L。运样 的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。
[0084] (4)将对数期的菌种接入装有化亚硝酸钢液体筛选培养基（单一氮源为2g/L亚硝 酸钢的改性MRS筛选培养基）的化发酵罐中。接种量为10%，37°C下10化pm培养8小时，对数 前期溶氧控制10% (通气0.化/min),后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加 20g/L的亚硝酸钢溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCC NO. 11763 对亚硝酸钢的降解速率。结果发现:在该条件下，XH对亚硝酸钢的降解速率可W达到653mg/ h/L。
[0085] (5)将对数期的菌种IOmL接入装有化g预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行 加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，XH菌对亚硝酸 钢的分解速率为l〇.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钢含量始终低于4.8mg/kg，远低于国家 标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
[0086] 本发明提供的黑曲霉菌株(Aspergillus nige;r)Li-2013-03是由实验室保藏的一 株产纤维素酶产的黑曲霉(Aspergillus niger化i-2010经多轮亚硝基脈诱变，然后对突变 株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌 株(Aspergillus nigei〇Li-2013-〇3。
[0087] 本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉(Aspergillus nigeiOLi- 2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 屯、（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏号为 CGMCC NO.7927O
[0088] 产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括W下步骤：
[0089] 1)斜面培养:将原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger化i-2010划线接种斜面培养 基，3(TC培养2~3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色抱子。所述斜面培养基组成如下 麦芽汁1000 mUpH值自然，121°C灭菌20min;
[0090] 2)抱子悬液制备（W下步骤均在无菌条件下操作）：向试管斜面加入15mL无菌水， 把抱子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的ISOmLS角瓶 中，将立角瓶放入摇床振荡10-15min，使抱子分散。
[00川 3)亚硝基脈(NTG)诱变
[0092] A.用无菌水将抱子悬浮液调节为稀释成IO6-IO7个/mL。
[0093] B.取10血菌悬液转移至IOOmLS角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成终浓度为lOmg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酬，W利于NTG溶解。
[0094] C.在30 °C下200rpm振荡反应30min，SOOOrpm离屯、IOmin收集菌体，用无菌生理盐水 洗涂数次，中止反应。
[00M] D.适当稀释将抱子浓度调节为IO3个/mL,取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于 纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30°C培养2~3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株 200支。（所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下:纤维素粉lOg、刚果红0.2g、硫酸锭 5邑、硫酸儀0.25g、憐酸二氨钟Ig、氯化钢O.lg、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5- 6，12^C灭菌20min)。
[0096] E.复筛:将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，3(TC培养至抱子铺 满斜面。分别将抱子W无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mLS角瓶中进行发酵， 接种量10%(v/v)，3(rC、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。（所述复筛培 养基组成如下：纤维素粉50g、硫酸锭5g、硫酸儀0.25g、憐酸二氨钟Ig、氯化钢0.1 g、自来水 定容1000 mL, pH值5-6,121°C灭菌20min)。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。
[0097] 4)遗传稳定性试验
[0098] 将Li-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后 的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标 都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
[0099] 5)放大试验
[0100] ①种子培养:将纤维素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger Li-2013-03接入 SOOmLS角瓶中，种子培养基装量100毫升，30°C、150巧m摇床培养72-9化。
[0101] ③种子罐培养:将种子液WlO % (v/v)接种量接入装有7.化发酵液的IOL发酵罐 中，控制抑值恒定为6.0 ± 0.2，培养溫度30 ± 0. rC，揽拌速度300巧m，通风量(v/v) 1:0.8- 1.2,培养时间96h，溶解氧20-30%。所述发酵培养基组成为:纤维素粉lOOg、硫酸锭5g、硫酸 儀0.25g、憐酸二氨钟Ig、氯化钢O.lg、自来水定容100〇111^9巧直5-6，121°(：灭菌2〇111111。
[0102] 发酵结束后，取发酵上清液(粗酶液)进行酶活力检测经测定，菌株Aspergillus niger Li-2013-03的外切(6-葡聚糖酶、内切(6-葡聚糖酶、(6-葡萄糖巧酶和滤纸酶活力分别 达到620U/mL、1289U/血、45抓/mL和732U/血，分别比出发菌株Aspergillus nigerLi-2010 提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
[0103] 本发明提供的枯草芽抱杆菌(Baci Ilus subtil is化i-2013-02。该菌株已于2013 年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(简称CGMCC，地址为：中 国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.7926。
[0104] 所述菌株特点如下：
[0105] 所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运 动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用巧樣酸盐，硝酸还原、V-P实 验成阳性。
[0106] 所述枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02由一株保藏于本实验室的产 耐高溫Q-淀粉酶的枯草芽抱杆菌Li-2013经紫外线-氯化裡-硫酸二乙醋复合诱变筛选获 得，具体筛选步骤如下：
[0107] (1)菌悬液的制备
[0108] 将在平板划线分离后长出的Li-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40°C培 养1化后，取ImL培养液离屯、后用生理盐水洗涂两次，并重悬与9mL生理盐水中。
[0109] (2)紫外线-氯化裡-硫酸二乙醋复合诱变
[0110] 将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下揽拌照射100s。将 经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化裡平板，并W未经紫外照射的菌液稀释涂平板做 对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置4(TC培养4她，在长出菌落的平板 上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释 后与硫酸二乙醋原液充分混合，并于40°C震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂 布于氯化裡平板。
[0111] (3)高产菌种的初筛
[0112] 将上述涂布均匀的平板，置4(TC培养4她，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌 落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得=株菌Li-2013-01，Li-2013-02，Li-2013-03
[0113] (4)摇瓶发酵复筛
[0114] 将获得的S株菌^-2013-01，^-2013-02，^-2013-03在含有301111^发酵培养基的 250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10% (V/V)，40°C、lOOr/min培养72h，离屯、取发酵上 清液制得粗酶液。
[011引（5)酶活测定
[0116]酶活单位的定义：ImL粗酶液，于105°C、pH 4.2条件下，Imin液化Img可溶性淀粉， 即为1个酶活力单位，WlVmL表示。
[0117] 经测定，菌株Li-2013-02,为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL，比原始菌 株酶活提高1.6倍。
[0118] 所述氯化裡平板：淀粉1 %，蛋白腺1 %，（NH)2S040.4%瓜册〇4〇. 8%，CaCl2〇. 2%， 氯化裡0.9%，琼脂2%。
[0119] 所述的种子培养基:酵母粉0.5%，蛋白腺1%，可溶性淀粉1% ,NaCl 1%。
[0120] 所述的发酵培养基：玉米粉5%~15%，豆饼粉4%~10%，（NH)2S040.4%， K2HP040.8%，CaC120.2%。
[0121] 所述的摇瓶培养条件：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10% (V/V)，100r/min、40°C发酵培养72h。
[0122] 由菌株Li-2013-02发酵获得了一种耐高溫的a-淀粉酶，其酶学性质如下：
[0123] (1)该酶溫度适应范围较宽，最适作用溫度在1〇5-115°(：之间，且在110°(：^下保存 的溫度稳定性较好，而115°C W上保存长时间溫度稳定性较差。
[0124] (2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0-7.0之间均有较高酶活力，在抑值为3.0 时酶活完全稳定。
[0125] (3)酶活性：由本发明所提供的突变株Li-2013-02,制备的耐高溫a-淀粉酶酶活力 为30000-35000U/ml。
[0126] 1、本发明使用紫外线-氯化裡-硫酸二乙醋复合诱变的方法获得了一株高产耐高 溫曰-淀粉酶的枯草芽抱杆菌Li-2013-02,该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点。
[0127] 2、有该菌株生产所得的耐高溫a-淀粉酶酶活力高达30000-35000u/ml，；适用溫度 范围为25-115°C，最适反应溫度110°C，在110°C酶活完全稳定;适用反应pH值范围为3.0- 7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2，比现有的耐高溫a-淀粉酶酶活力 高，酶作用最适抑值范围宽泛，耐溫度高，特别适合反应溫度高、液化工艺与糖化工艺并存 的工业化需求。
[012引实施例1
[0129] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种微生物复合肥：
[0130] 重量份数组成为:植物乳杆菌混合菌剂16份，混合曲霉培养物18份，枯草芽抱杆菌 培养物10;
[0131] 所述混合曲霉培养物的组成及重量份数如下：黑曲霉培养物9份，泡盛曲霉培养物 1份；
[0132] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)为CGMCC NO.7927。
[0133] 植物乳杆菌混合菌剂组成及重量份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份，植物 乳杆菌CGMCC 11763菌粉7份；
[0134] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
[0135] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0136] 泡盛曲霉菌剂的制备方法：
[0137] 技术方案如下：
[0138] 斜面菌种活化培养:将泡盛曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27 °C培养3天。
[0139] 固体一级种子培养:挑取泡盛曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升S角 瓶中进行种子培养，30°C培养3天即可。
[0140] 固体二级种子培养:将上述培养好的固体一级种子揽拌为碎块后加入装有1000克 培养基的5000毫升=角瓶中进行种子培养，培养条件:3(TC培养3天即可。
[0141] 固体发酵培养:将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混 合均匀后培养，曲料培养溫度控制在26-35°C，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时 间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术;待培养料长满菌丝即可结束培养，培养 基预先经高溫蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制溫度i2rc，时间1小时。
[0142] 干燥粉碎:发酵结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥溫度控制 在60°C，干燥到水分含量在10% W下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目W 上。
[0143] 培养基组成：固体原料:教皮80 %，豆饼粉10 %，玉米淀粉10 %，添加等量自来水； 初始抑自然。
[0144] 枯草芽抱杆菌培养物的制备方法：
[0145] 1.发酵液的获得:采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽抱杆菌发酵液；
[0146] (1)-级种子培养:将枯草芽抱杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100 毫升，旋转式摇床180转/分，培养溫度30°C，培养时间24小时；
[0147] (2)二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中， 培养条件与一级种子相同；
[0148] (3)=级种子培养:将二级种子W10%接种量接入5000毫升=级种子摇瓶中，培养 基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养溫度30°C，培养时间24小时；
[0149] (4)-级种子罐培养:将S级种子W10%接种量接入总容积为15化的一级种子罐， 发酵培养基装量IOOL，培养溫度28°C，揽拌速度100转/分，通风量（V/V) 1: 0.5，罐压 0.05Mpa，培养时间24小时；
[0150] (5)发酵培养:将一级种子罐菌种W10%接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐， 发酵培养基装量1吨，培养条件培养溫度28°C，揽拌速度100转/分，通风量(V/V) 1:0.5，罐压 0.05Mpa，培养时间24小时。
[0151] 培养基组成:葡萄糖6%，酵母提取物1 %，蛋白腺0.2%，化C031 %，P册.8。
[0152] 植物乳杆菌剂的制备方法：
[0153] (1)-级种子培养:将植物乳杆菌菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升， 培养溫度30°C，培养时间24小时；
[0154] (2)二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中， 培养条件与一级种子相同；
[0K5] (3)=级种子培养:将二级种子W10%接种量接入5000毫升=级种子摇瓶中，培养 基装量1000毫升，培养溫度30°C，培养时间24小时；
[0156] (4)-级种子罐培养:将S级种子W5%接种量接入总容积为15化的一级种子罐， 发酵培养基装量10化，培养溫度30°C，罐压0.05Mpa，培养时间18小时；
[0157] (5)发酵罐培养:将一级种子罐菌种W5%接种量接入总容积为3吨二级种子罐，发 酵培养基装量2吨，培养条件培养溫度30°C，罐压0.05Mpa，培养时间22小时。发酵完毕发酵 液经低溫负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好 的载体，混合均匀;浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为:CaO)3 25份，糊精12份。流 化床干燥，干燥溫度50°C。
[0158] 培养基组成为:酪蛋白腺1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，乙 酸钢0.5%，巧樣酸二胺0.2%，1'"6611 80 0.1%，1(2册04 0.2%，]\1邑504.7肥0 0.02%， MnS04.肥0 0.005%,CaCOS 2%,琼脂 1.5%,P册.8。
[0159] 实施例2
[0160] 基本同实施例1
[0161] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种微生物复合肥：
[0162] 重量份数组成为:植物乳杆菌混合菌剂20份，混合曲霉培养物10份，枯草芽抱杆菌 培养物8;
[0163] 所述混合曲霉培养物的组成及重量份数如下：黑曲霉培养物6份，泡盛曲霉培养物 2份；
[0164] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)为CGMCC NO.7927。
[0165] 植物乳杆菌混合菌剂组成及重量份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份，植物 乳杆菌CGMCC 11763菌粉5份；
[0166] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
[0167] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0168] 产品效果实验
[0169] 试验地的选择与试验设计:试验于2015年在宁夏盐池县进行。
[0170] 试验田旱地田种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.3公斤，出苗1 个月左右通过働地松±方式使用发明产品0.2公斤，对照组使用市售微生物肥料。
[0171] 发明产品使用玉米地玉米产量达到290公斤，对照组达到110公斤。
【主权项】
1. 一种微生物复合肥，重量份数组成为:植物乳杆菌混合菌剂8-20份，混合曲霉培养物 10-20份，枯草芽孢杆菌培养物8-15。2. 如权利要求1所述一种微生物复合肥，其特征在于，所述混合曲霉培养物的组成及重 量份数如下:黑曲霉培养物5-9份，泡盛曲霉培养物1 -3份。3. 如权利要求2所述一种微生物复合肥，其特征在于，所述黑曲霉（Aspergi Ilus niger)为CGMCC N0.7927。4. 如权利要求1所述一种微生物复合肥，其特征在于，植物乳杆菌混合菌剂组成及重量 份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉1-2份，植物乳杆菌CGMCC 11763菌粉5-8份。5. 如权利要求1-4任一所述一种微生物复合肥，一种微生物复合肥:重量份数组成为： 植物乳杆菌混合菌剂16份，混合曲霉培养物18份，枯草芽孢杆菌培养物10份。6. 如权利要求5所述一种微生物复合肥，其特征在于，所述混合曲霉培养物的组成及重 量份数如下：黑曲霉培养物9份，泡盛曲霉培养物1份;所述黑曲霉(Aspergi Ilusniger)为 CGMCC NO.7927〇7. 如权利要求5所述一种微生物复合肥，其特征在于，植物乳杆菌混合菌剂组成及重量 份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份，植物乳杆菌CGMCC 11763菌粉7份。8. 如权利要求5所述一种微生物复合肥，其特征在于，枯草芽孢杆菌（Baci Ilus subtilis subsp)CGMCC7926,泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484〇
【文档编号】C12R1/125GK105924238SQ201610248607
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】李秉京
【申请人】义乌市锦钰信息科技有限公司