专利名称：一制胰脂菌素的提纯方法
技术领域：
本发明涉及一种一制胰脂菌素的提纯方法。更尤其，本发明涉及一种将双流萃取形式的液-液萃取与逆流萃取形式的反萃取结合起来的方法，作为将一制胰脂菌素以异常高的产率和纯度从粗一制胰脂菌素中分离出来的方法。
一制胰脂菌素作为关键中间体，用于在预防和治疗与肥胖症有关的疾病中有用的四氢一制胰脂菌素(THL，Orlistat)的制备，是极其重要的。
一制胰脂菌素，用于其生产的一种发酵方法，用于将其从微生物中分离出来的一种方法以及用于将其氢化成四氢一制胰脂菌素的一种方法已经知道，并且在例如美国专利No.4,598,089中被描述。
一制胰脂菌素被描述如下
一种用于制备粗一制胰脂菌素的方法也已经在欧洲专利申请No.96106598中描述。此方法包括好氧培养放线菌目例如毒三素链霉菌的微生物，直至初始生长阶段基本完成，已经产生足够的细胞物质。微生物在基本不含脂肪和油的含水介质中产生一制胰脂菌素，并且该含水介质含有合适的碳和氮源以及无机盐。然后，将亚油酸与抗氧化剂一起，以及任选与辛酸和N-甲酰左旋亮氨酸或优选左旋亮氨酸一起加入到培养液中。发酵完成后，发酵液被萃取。生成的粗一制胰脂菌素可以例如通过色谱法被进一步浓缩和提纯，如在美国专利No.4,598,089中所描述的。
用以浓缩一制胰脂菌素的多级色谱方案或液-液萃取与用以获得纯净的一制胰脂菌素的多级色谱法相结合是用于提纯粗一制胰脂菌素的现有技术方法的特点。这些方法典型地应用于实验室规模的发酵代谢物的分离。但是，这些方法通常不适合于经济的、大规模的工艺。
通过蒸馏来提纯粗一制胰脂菌素的尝试失败了。一制胰脂菌素在60℃下可稳定几个小时，但因为其蒸汽压低(7×10-7毫巴)，因此在这个温度下的真空蒸馏(＜2毫巴)是不可行的。在更高的温度下，一制胰脂菌素通过去除二氧化碳而降解。
粗一制胰脂菌素也能够通过一制胰脂菌素在低于-20℃的温度下结晶而提纯。但是低温结晶需要昂贵的技术设备，并且这种结晶的产率很大程度地取决于粗一制胰脂菌素的质量。尤其当粗一制胰脂菌素的质量差时，通过结晶获得的一制胰脂菌素产率低。
本发明提供一种新型的、简单的和价格便宜的用于从粗一制胰脂菌素中以高产率和纯度提纯一制胰脂菌素的方法，即使原材料的质量差。
用于从粗一制胰脂菌素中提纯一制胰脂菌素的本发明的方法包括a)一制胰脂菌素的液-液萃取，从选自脂族烃或芳香烃的一种非极性溶剂中萃取到选自羧酸、醇、O-单取代的单或寡乙二醇、二醇或偶极非质子传递溶剂的一种极性溶剂中，然后b)用水稀释极性溶剂相或者改变相比率，并且将一制胰脂菌素反萃取到一种新鲜的非极性溶剂中。
提出以下的定义来解释和定义用于描述本发明的各种术语的意义和范围。
术语“双流萃取”是指两种溶剂逆流萃取。萃取按下图所示进行
互溶度低的两种溶剂从萃取单元的顶部和底部引入。要被分离的混合物(进料)可以从任何地方引入，除非与冲洗溶剂结合，优选从萃取单元的中间位置引入。在上图中，萃取以那样一种方式进行，那就是萃取溶剂和萃取液各自都含有密度较高的溶剂(重相)，冲洗溶剂和萃余液各自都含有密度较低的溶剂(轻相)。
术语“逆流萃取”是指要被萃取的物质(进料)与所用的溶剂中的一种一起被加入。在那种情况下，杂质从将要被提纯的化合物中分离出来的程度不象在双流萃取的情况中那么高，因为冲洗区被省略。
逆流萃取按下图所示进行
互溶度低的一种溶剂(与进料在一起)和另一种溶剂从萃取单元的顶部和底部引入。在一个出口，富含目标物质的萃取溶剂从柱中出来(萃取液)。在另一个出口，用于引入进料的溶剂(贫化了目标物质)(萃余液)，从柱中出来。在上图中，萃取被表明以那样一种方式进行，那就是进料和萃余液各自都含有密度较高的溶剂(重相)，用于萃取的溶剂和萃取液各自都含有密度较低的溶剂(轻相)。
术语“粗一制胰脂菌素”是指含有一制胰脂菌素和杂质的粗产物，来自发酵过程，在分离细胞物质、萃取和浓缩后产生。
本发明涉及将两种液-液萃取结合起来的一种方法，作为将一制胰脂菌素以高纯度和实际定量的产率从粗一制胰脂菌素中分离出来的方法。
总的来说，用于从粗一制胰脂菌素中提纯一制胰脂菌素的方法包括将一制胰脂菌素从选自脂族烃或芳香烃的一种非极性溶剂萃取到选自羧酸、醇、O-单取代的单或寡乙二醇、二醇或偶极非质子传递溶剂的一种极性溶剂中的液-液萃取，接着用水稀释极性溶剂相或者改变相比率，并将一制胰脂菌素反萃取到一种新鲜的非极性溶剂中。
液-液萃取在下面的溶剂系统中进行非极性溶剂选自脂族烃或芳香烃。优选的脂族烃是C5-C8脂族烃；更优选C6-C7脂族烃例如己烷或庚烷。芳香烃可以选自苯，任选被1～3个甲基取代。优选的芳香烃是苯和甲苯。
极性溶剂可以选自羧酸，例如甲酸或C1-C3烷基羧酸例如乙酸或丙酸；或C1-C3醇，例如甲醇、乙醇、丙醇；或O-单取代的单或寡乙二醇，例如乙二醇单甲基醚；或C2-C3二醇，例如乙二醇或1，3-丙二醇或糠醇或四氢糠醇。偶极非质子传递溶剂包括溶剂例如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜、乙腈、环丁砜、硝基甲烷等等。优选的极性溶剂是可溶于水的有机羧酸、醇或O-单取代的单或聚乙二醇，例如乙酸、甲醇或乙二醇单甲基醚，尤其优选的是乙酸。
极性溶剂可以直接应用或者作为与水的混合物使用。
在第一个萃取步骤中，粗一制胰脂菌素中的非极性杂质被去除，在第二个萃取步骤中，粗一制胰脂菌素中的极性杂质被去除。将一制胰脂菌素萃取到一种极性溶剂中导致非极性杂质的去除，将一制胰脂菌素萃取到一种非极性溶剂中导致极性杂质的去除。
在一个优选的实施方案中，在两个萃取中应用同样的溶剂。紧接着第一个萃取之后的是第二个步骤，包括用水稀释极性溶剂或者改变相比率，以改变一制胰脂菌素的分配。
在一个更优选的实施方案中，第一个萃取以这样一种方式进行，那就是将一制胰脂菌素萃取到极性溶剂中，紧接着用一种非极性溶剂，优选与第一个萃取步骤中所用的非极性溶剂一样的溶剂，将一制胰脂菌素从极性溶剂中反萃取出来。
在一个优选的实施方案中，第一步的液-液萃取的特点是极性溶剂含有约1～约20％的水，更优选约5％的水。
在一个更优选的实施方案中，非极性溶剂是脂族烃。尤其优选的是庚烷。
在本发明的最优选的实施方案中，第一步的液-液萃取按双流萃取进行，一制胰脂菌素被萃取到极性溶剂中。进料是粗一制胰脂菌素，它可以用所用的溶剂中的一种稀释。一制胰脂菌素被萃取到极性(重)相中。非极性杂质如脂肪酸或甘油酯保留在非极性(轻)相中。因为一制胰脂菌素和杂质的分配系数取决于浓度，两种溶剂的相比率、萃取系统的理论级数以及进料与溶剂的比率必须以一种合适的方式调整(“Lo，TC，Bairds，MHI，Hafez，M，Hanson，C(1983)；溶剂萃取手册(Handbook of solvent extraction)，Wiley，New York”)。分配系数对浓度的依赖程度随萃取系统中所用的极性溶剂的种类不同而变化很大。含水乙酸给出了很好的结果，这样可以获得高浓度，从而获得高生产率，所用的溶剂最少。
萃取可以通过应用一种连续的萃取装置例如搅拌器沉降器系统或者应用一种萃取柱例如脉冲筛板萃取器或搅拌柱而进行。
在优选的实施方案中，在反萃取(提纯的第二步)之前，极性溶剂通过加入水被稀释到约70％～90％，优选约80％。
在本发明的最优选的实施方案中，第二个提纯步骤的反萃取按逆流萃取进行，一制胰脂菌素被萃取到非极性溶剂中。在那种情况下，第一个萃取步骤的萃取液能够被直接应用。与双流萃取相反，双流萃取需要浓缩后的一制胰脂菌素进料，在按逆流萃取在一个连续的工艺中进行第二个萃取的情况下，在第一个萃取后无需浓缩一制胰脂菌素。一制胰脂菌素被萃取到非极性(轻)相中，极性杂质仍保留在极性(重)相中。
在发酵期间，生成了若干种一制胰脂菌素的氨基酸类似物。一制胰脂菌素本身含有N-甲酰基(S)亮氨酸作为一个支链，而副产物含有其它的N-甲酰氨基酸。这些副产物中的一种是含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素(methionine-analogous lipstatin)。粗一制胰脂菌素含有相对一制胰脂菌素高达3％的这种副产物。对于一制胰脂菌素的提纯，去除这种杂质是非常重要的。否则，后续的氢化将被这种含硫化合物抑制。按照本发明，如果粗一制胰脂菌素中的含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素在萃取之前被氧化，粗一制胰脂菌素的提纯可以被进一步改善。直接通过一制胰脂菌素的结晶或萃取提纯而去除含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素是不可能的，除非将其氧化成相应的亚砜或砜之后。这种氧化通过一种常规的方法进行，例如通过应用在乙酸中的过乙酸。含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素可以被氧化成亚砜或者氧化成砜
氧化剂以相对含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素为等摩尔的量或高达1.5当量的量被应用，如果要求氧化成亚砜，或者为双倍量，如果要求氧化成砜。应避免大大过量，以防止一制胰脂菌素被氧化降解。氧化在0°～50℃下进行，优选在室温下进行；反应在几分钟内完成。用于氧化的溶剂并不重要，优选在萃取提纯过程中应用的溶剂中的一种也应用于氧化。含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素可以在粗一制胰脂菌素的阶段被氧化，或者在第一个萃取提纯步骤后被氧化。优选粗一制胰脂菌素以高浓度的庚烷溶液被氧化，生成的混合物作为第一个萃取提纯步骤的进料而被应用。氧化后的含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素是一种极性杂质，在第二个萃取中被去除，其中它留在极性相中。
如果系统(含水乙酸/庚烷)应用于萃取提纯，由于一制胰脂菌素和氧化后的含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的分配系数之间的差异，第二个萃取步骤按逆流萃取进行就足够了，在加水后直接应用来自第一个萃取步骤的萃取液。因此在最优选的实施方案中，从粗一制胰脂菌素中提纯一制胰脂菌素是通过粗一制胰脂菌素在约95％乙酸/庚烷中双流萃取，然后用水稀释一制胰脂菌素溶液至约80％乙酸，用庚烷逆流萃取溶液而获得。然后，提纯后的一制胰脂菌素可以通过浓缩或结晶从庚烷中分离出来。这个优选的方法按下图解释
正如上面所指出的，通过上面描述的方法中的任何一个制备得到的一制胰脂菌素可以通过氢化转换成四氢一制胰脂菌素(orlistat)。一制胰脂菌素的氢化能够按照原本知道的例如在美国专利NO.4,598,089中所描述的方法，在有合适的催化剂存在的情况下进行。能够应用的催化剂的实例是钯/碳、氧化铂、钯和类似的物质。用于氢化的溶剂并不重要。最优选的溶剂是用在最后的萃取步骤中的那种溶剂。在那种情况下，含有一制胰脂菌素的萃取液直接或浓缩后用于氢化。其它合适的溶剂是例如低级醇，例如甲醇和乙醇、醚例如叔-丁基甲基醚或四氢呋喃、乙酸或卤代溶剂例如二氯甲烷。氢化优选在低的氢气压力和室温下进行。因此，本发明也包括在上面的萃取工艺后紧接着将一制胰脂菌素氢化成四氢一制胰脂菌素。优选，反应在含贵金属的一种氢化催化剂存在的情况下，在25℃和低的氢气压力例如0.5至5巴下进行。
四氢一制胰脂菌素可以通过结晶提纯和分离。优选一种非极性溶剂例如己烷或庚烷用于氢化和结晶。
总而言之，本发明涉及一种上面定义的方法，包括a)含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的氧化b)粗一制胰脂菌素在约95％乙酸/庚烷中的双流萃取；c)用水将一制胰脂菌素溶液稀释到约80％乙酸；以及d)用庚烷逆流萃取溶液。
此方法可以紧接着将一制胰脂菌素氢化成四氢一制胰脂菌素，任选接着四氢一制胰脂菌素的结晶。
本发明还包括一种用于制备四氢一制胰脂菌素的方法，包括a)含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的氧化b)粗一制胰脂菌素在约95％乙酸/庚烷中的双流萃取；c)用水将一制胰脂菌素溶液稀释到约80％乙酸；以及d)用庚烷逆流萃取溶液，接着e)将一制胰脂菌素氢化成四氢一制胰脂菌素。
此外，本发明涉及上面方法的应用，用于一制胰脂菌素和四氢一制胰脂菌素的制备。
下面的实施例将说明本发明的优选的实施例，但没有限制本发明的范围的意思。
实施例实施例1来自发酵过程的一制胰脂菌素在分离生物质和萃取后被浓缩。所用的材料含有58％(重量/重量)的一制胰脂菌素(高压液相色谱法分析)和0.9％(重量/重量)的含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素(1H-NMR分析)。a.含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的氧化用77毫升庚烷稀释55.7克粗一制胰脂菌素。加入212微升37％过乙酸在乙酸中的溶液，将混合物在室温下搅拌30分钟。b.用庚烷/95％含水乙酸的双流萃取为了模拟具有7个分离级的萃取器，应用7个分液漏斗。
从a.中描述的氧化步骤中得到的混合物被分成6份，每份被加入到第四个分液漏斗(sf-4)中。从sf-4进料开始，加入50毫升庚烷和100毫升95％含水乙酸，这相当于庚烷/含水乙酸的相比率为1/2。混合物被摇晃，相被分离。上层相被传递到下一个分液漏斗中，下层相被传递到前面的分液漏斗中。在一开始，应用新鲜的溶剂，它们一步步地被来自前面和后面的分液漏斗的相更换。当所有的分液漏斗按这种方式填充后，仅仅将庚烷加入到第一个分液漏斗中，将含水乙酸加入到第7个分液漏斗中。含一制胰脂菌素的萃取液被汇集。萃余液中的一制胰脂菌素通过薄层色谱法监测，以将其含量保持在1克/升以下，用以控制预先计算的相比率和浓度。
当所有粗一制胰脂菌素被加完时，加入未负荷的两种溶剂，直至将所有一制胰脂菌素从系统中冲洗掉。下图解释此萃取
通过在减压下将溶剂蒸馏掉，萃取液被浓缩至体积为约600毫升。用Karl Fischer方法测定的水含量为3.5％。c.逆流萃取为了模拟具有7个分离级的萃取器，又使用7个分液漏斗。
从b.产生的萃取液(600毫升)被分成6份(每份100毫升)，每份与30毫升水一起被加入到第7个分液漏斗中。将130毫升庚烷加入到第1个分液漏斗中。萃取按类似于b)部分的模拟连续方法进行，上层相传递到下一个分液漏斗，下层相传递到前面的分液漏斗。萃余液中的一制胰脂菌素通过薄层色谱法进行监测，以将其含量保持在1克/升以下，用以控制预先计算的相比率和浓度。当来自第一个萃取步骤的所有萃取溶液都被加完时，加入两种溶剂，直至将所有一制胰脂菌素冲洗掉。下图解释此萃取
汇集提纯后的在庚烷中的一制胰脂菌素(萃取液)，在减压下将其浓缩至体积为250毫升。这个溶液含有35.3克纯度为90％(重量/重量)(高压液相色谱法)提纯的一制胰脂菌素。这相当于98％的产率，以一制胰脂菌素在提纯后的产物中的含量相对于在粗产物中一制胰脂菌素进行计算。d.氢化250毫升提纯后的一制胰脂菌素溶液在不锈钢高压釜中，在25℃和5巴的压力下，以及有3.5克5％位于活性炭上的钯存在的情况下被氢化共6小时。催化剂被滤去，滤液被蒸发。将残余物溶解在700毫升庚烷中，四氢一制胰脂菌素在0℃下结晶。将产物过滤，用冷庚烷冲洗，并在25℃下在真空中干燥。制得28克纯度为96％(重量/重量)(高压液相色谱法)的四氢一制胰脂菌素。这相当于85％的产率，相对于在提纯后的产物中的一制胰脂菌素。经过从己烷重结晶后的四氢一制胰脂菌素的纯度为97％(重量/重量，用高压液相色谱法)。
实施例2将一个7级搅拌器沉淀器系统，使用与实施例1中所用的相同的溶剂，用于连续萃取。
所用的浓缩的粗一制胰脂菌素纯度为65％(重量/重量)，含有0.14％(重量/重量)的含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素。a.用庚烷/95％含水乙酸的双流萃取用100千克庚烷稀释100千克粗一制胰脂菌素，此溶液用作原料。搅拌器沉淀器中装有庚烷和95％含水乙酸，相比率为1/2(体积/体积)。加入37.5升/小时的庚烷、75升/小时的95％含水乙酸和15升/小时的粗一制胰脂菌素溶液，用于萃取提纯。将庚烷加入到第1个搅拌器，一制胰脂菌素溶液加入到第4个搅拌器，含水乙酸加入到第7个搅拌器中。含一制胰脂菌素的萃取液和含非极性杂质的萃余液被收集。一制胰脂菌素在萃余液中的含量通过薄层色谱法监测，以将含量保持在1克/升以下。加完所有的粗一制胰脂菌素后，继续加入两种溶剂，直至将所有一制胰脂菌素冲洗掉。萃取液的样品(下层相)被浓缩，一制胰脂菌素纯度为71％(重量/重量)。总的来说，获得1500千克萃取液，水含量为4.6％(KarlFischer方法)。b.含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的氧化向来自前面萃取的萃取液溶液中加入60毫升37％过乙酸在乙酸中的溶液，将混合物在室温下搅拌30分钟。c.逆流萃取加入280升水，以将水含量调节为20％。因为在加入水后一制胰脂菌素的油相分离，此溶液用600升庚烷萃取。将萃取液分离，然后将其加入到连续萃取的庚烷相中。
与第一个萃取中应用的同样的搅拌器沉淀器被应用于一制胰脂菌素在含水乙酸中的剩余溶液的后续的连续萃取。连续萃取通过向第1个搅拌器中加入50升/小时的庚烷，以及向第7个搅拌器中加入50升/小时的一制胰脂菌素在含水乙酸中的溶液进行。将庚烷萃取液加入到前面获得的萃取液中，通过在减压下将溶剂蒸馏掉，此溶液被浓缩到体积为约1000升。一个样品被浓缩至干得到一制胰脂菌素，纯度为86％(重量/重量)。d.氢化获得的溶液以同样大小的3个批量氢化。氢化在玻璃内衬的搅拌氢化反应器中进行。对于一批次，应用2千克5％位于活性炭上的钯。氢化在1小时后完成；氢气压力达到5巴。将催化剂滤去，滤液通过将溶剂蒸馏掉而被浓缩。产物干燥后的样品含有90％(重量/重量)的四氢一制胰脂菌素(质量高于提纯后的一制胰脂菌素的质量，因为一制胰脂菌素含有“可转换的”副产物，那就是具有不同位置的或仅仅带一个C＝C双键的异构体，它们在氢化后也被转换成四氢一制胰脂菌素)。加入600千克庚烷，四氢一制胰脂菌素在0℃下结晶。将产物滤去，用冷庚烷冲洗，在减压下干燥。
一个批次产生17千克纯度为97％(重量/重量)的四氢一制胰脂菌素。这相当于四氢一制胰脂菌素产率为76％，相对于在粗一制胰脂菌素中的一制胰脂菌素。
实施例3来自发酵过程的粗一制胰脂菌素在分离生物质和萃取后被浓缩。材料中含有62％(重量/重量)一制胰脂菌素和0.1％(重量/重量)含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素。a.含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的氧化用75毫升庚烷稀释53克粗一制胰脂菌素。加入24微升37％过乙酸在乙酸中的溶液，将混合物在室温下搅拌30分钟。b.用庚烷/10％含水甲醇的双流萃取按照实施例1所描述的应用用以模拟连续萃取的7个分液漏斗的相同系统。从a)中所描述的氧化步骤中产生的混合物被分成6份，将每份加入到第4个分液漏斗中。将100毫升庚烷加入到第1个分液漏斗，10毫升10％含水甲醇加入到第7个分液漏斗中，这相当于庚烷/含水甲醇的相比率为10/1。萃取液(上层相，一制胰脂菌素在庚烷中)被汇集。当所有粗一制胰脂菌素被加完时，继续加入两种新鲜溶剂，直至将所有一制胰脂菌素冲洗掉。通过在减压下将溶剂蒸馏掉，萃取液被浓缩至体积为110毫升。c.用庚烷/10％含水甲醇的额外的双流萃取从上面的萃取获得的溶液被分成6份。借助于与前面所应用的相同的7个分液漏斗系统，进行同种萃取，但相比率不同。将每份原料加入到第4个分液漏斗中。将100毫升庚烷加入到第1个分液漏斗中，100毫升10％含水甲醇加入到第7个分液漏斗中，这相当于庚烷/含水甲醇的相比率为1/1。萃取液(下层相，一制胰脂菌素在含水甲醇中)被汇集。当所有粗一制胰脂菌素被加完时，继续加入两种新鲜的溶剂，直至将所有一制胰脂菌素冲洗掉。通过在减压下将溶剂蒸馏掉，萃取液被浓缩至体积为250毫升。d.一制胰脂菌素萃取到庚烷中的分批萃取将水加入到从c)获得的萃取液溶液中，以将水含量调节到50％。将此混合物萃取两次，每次用600毫升庚烷。通过将溶剂蒸馏掉，浓缩萃取液。制得34克纯度为86％(重量/重量)的一制胰脂菌素。这相当于89％的产率，以一制胰脂菌素在提纯后的产物中的含量相对于在粗产物中的一制胰脂菌素来计算。e.氢化氢化和结晶以类似于实施例1的方式进行。四氢一制胰脂菌素以97％(重量/重量)的纯度及90％的产率，相对于在提纯后的产物中的一制胰脂菌素获得。
实施例4应用与实施例3中所描述的7级萃取同样的一套装置，提纯来自与实施例3同样的批次的粗一制胰脂菌素。作为变化，10％含水乙二醇单甲基醚和庚烷用作溶剂。浓度和相比率与实施例3相比保持不变。提纯后的一个一制胰脂菌素样品测定值为80％(重量/重量)。氢化和四氢一制胰脂菌素的结晶按在前面的实施例中所描述的方式进行。获得纯度为96％(重量/重量)的四氢一制胰脂菌素。
实施例5将含有测定值为55％的一制胰脂菌素(重量/重量)和0.6％(重量/重量)的含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的粗一制胰脂菌素在搅拌的Kuehni柱中提纯。a.用庚烷/95％含水乙酸的双流萃取将一个尺寸为以下值的Kuehni柱E60用于萃取柱内径6厘米，柱高度180厘米，实际级数50，挡板自由横断面积10％。以130转/分钟搅拌柱。新鲜的95％含水乙酸作为分散相以4.0升/小时的流率从柱的顶部入口处加入。新鲜的庚烷作为连续相以1.75升/小时的流率从柱的底部入口处加入。一个40％(重量/重量)粗一制胰脂菌素在庚烷中的溶液以0.775千克/小时的流率从第27实际级(从底部开始计算)加入到柱中。达到平衡时，柱底部出口处萃取液相中的一制胰脂菌素的产率为＞99％，一制胰脂菌素纯度为70％(重量/重量)。含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的含量为0.6％(重量/重量)。b.用过乙酸氧化在95％含水乙酸萃取液中的含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素通过加入等摩尔量的37％过乙酸而氧化。c.用庚烷/75％含水乙酸的逆流萃取将一个具有与a)部分所描述的尺寸相同的Kuehni柱用于萃取。以205转/分钟搅拌柱。在95％含水乙酸中的一制胰脂菌素萃取液(几个萃取批次的集合，一制胰脂菌素纯度为68％(重量/重量)，按照a)部分制备)作为分散相以8.6升/小时的流率从柱的顶部入口处加入。新鲜的去离子水以2.1升/小时的流率从柱的第47实际级(从底部开始计算)加入。新鲜的庚烷作为连续相以6.0升/小时的流率从柱的底部入口处加入。达到平衡时，在柱的顶部出口处萃取液相中的一制胰脂菌素的产率为97％，一制胰脂菌素的纯度为88％(重量/重量)。这相当于96～97％的产率，按一制胰脂菌素在提纯后的产物中的含量相对于在粗产物中的一制胰脂菌素来计算。
权利要求
1.一种用于从粗一制胰脂菌素中提纯一制胰脂菌素的方法，包括a)将一制胰脂菌素从选自脂族烃或芳香烃的一种非极性溶剂中萃取到选自羧酸、醇、O-单取代的单或聚乙二醇、二醇或偶极非质子传递溶剂的一种极性溶剂中的液-液萃取，接着b)用水稀释极性溶剂相或者改变相比率，以及将一制胰脂菌素反萃取到一种新鲜的非极性溶剂中。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤a)的极性溶剂含有约1～20％的水。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤a)的极性溶剂含有约5％的水。
4.根据权利要求1～3中的任一项的方法，其中非极性溶剂是脂族烃。
5.根据权利要求4的方法，其中非极性溶剂是庚烷。
6.根据权利要求1～5中的任一项的方法，其中极性溶剂是可溶于水的有机羧酸、醇或者O-单取代的单或寡乙二醇。
7.根据权利要求6的方法，其中极性溶剂是乙酸、甲醇或乙二醇单甲基醚。
8.根据权利要求1～7中的任一项的方法，其中在权利要求1中所定义的步骤a)的液-液萃取是双流萃取，一制胰脂菌素被萃取到极性溶剂中。
9.根据权利要求1～8中的任一项的方法，其中在反萃取之前，通过加入水，极性溶剂被稀释到约90％～约70％。
10.根据权利要求9的方法，其中通过加入水，极性溶剂被稀释到约80％。
11.根据权利要求1～10中的任一项的方法，其中权利要求1的步骤b)中所定义的反萃取是逆流萃取，一制胰脂菌素被萃取到非极性溶剂中。
12.根据权利要求1～11中的任一项的方法，其中粗一制胰脂菌素的含蛋氨酸类似物的副产物在萃取之前被氧化。
13.根据权利要求1～12中的任一项的方法，接着将一制胰脂菌素氢化成四氢一制胰脂菌素。
14.根据权利要求13的方法，其中氢化反应在有含有贵金属的氢化催化剂存在的情况下，在25℃和低的氢气压力下进行。
15.根据权利要求1～12中的任一项的方法，包括a)含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的氧化b)粗一制胰脂菌素在约95％乙酸/庚烷中的双流萃取；c)用水将一制胰脂菌素溶液稀释到约80％乙酸；以及d)用庚烷逆流萃取溶液。
16.根据权利要求15的方法，接着将一制胰脂菌素氢化成四氢一制胰脂菌素。
17.根据权利要求16的方法，接着四氢一制胰脂菌素的结晶。
18.从粗一制胰脂菌素中提纯一制胰脂菌素的一种方法，包括a)含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的氧化b)粗一制胰脂菌素在约95％乙酸/庚烷中的双流萃取；c)用水稀释一制胰脂菌素溶液到约80％乙酸；以及d)用庚烷逆流萃取溶液。
19.一种用于制备四氢一制胰脂菌素的方法，包括a)含蛋氨酸类似物的一制胰脂菌素的氧化b)粗一制胰脂菌素在约95％乙酸/庚烷中的双流萃取；c)用水稀释一制胰脂菌素溶液到约80％乙酸；以及d)用庚烷逆流萃取溶液，接着e)一制胰脂菌素氢化成四氢一制胰脂菌素。f)四氢一制胰脂菌素的结晶。
20.根据权利要求1～19中的任一项的方法应用于制备一制胰脂菌素或四氢一制胰脂菌素。
21.前面所描述的发明。
全文摘要
本发明涉及一种用于提纯一制胰脂菌素的方法。更尤其,本发明涉及一种将双流萃取形式的液－液萃取与逆流萃取形式的反萃取结合起来的方法,作为将一制胰脂菌素以异常高的产率和纯度从粗一制胰脂菌素中分离出来的方法。
文档编号C07D305/12GK1266058SQ0010117
公开日2000年9月13日 申请日期2000年1月28日 优先权日1999年1月29日
发明者S·多斯沃德, E·库普弗, G·斯坦鲍尔, E·斯坦文德 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司