专利名称：一种重组人骨形成蛋白－2截短突变体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种能够用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-2截短突变体(recombinant truncated human bone morphogenetic protein 2)并涉及一种采用基因工程手段利用大肠杆菌表达制备重组人骨形成蛋白-2截短突变体的方法。
当代医学对大面积骨缺损和骨肿瘤导致的骨缺损以及各种原因造成的骨不连无有效的治疗手段，而全世界每年有数以百万计的人因各种原因导致骨损伤和骨缺损，其中许多人因为没有有效的治疗手段而致残。
美国学者Urist发现了骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)证实了骨形成的诱导学说，从而为难治性和以往无法治愈的骨缺损和骨损伤提供了潜在的治疗途径。临床前动物实验证实了骨形成蛋白对各种骨缺损和骨损伤具有良好的治愈作用，提示骨形成蛋白具有良好的临床应用前景，将其应用于临床将产生巨大的社会和经济效益。
骨形成蛋白主要存在于骨组织中，但从骨组织中提取骨形成蛋白方法繁杂、获取量低、重复性差、难以得到足够量的骨形成蛋白单一纯品，而且临床上最好是应用人的骨形成蛋白(hBMP)，但人骨组织来源困难，限制了人骨形成蛋白的应用。人骨形成蛋白-2作为诱骨活性强、临床应用前景好的诱骨因子，美国、日本已在COS细胞、CHO细胞和昆虫细胞等真核系统中表达了人骨形成蛋白-2，产物具有较强的诱骨活性，其中美国的人骨形成蛋白-2现已进入III期临床；但真核系统表达产量低、生产成本高，限制了它的应用。国内和德国的研究组先后采用生产成本低、操作简单的大肠杆菌表达系统来制备有良好诱骨活性的不同形式的重组人骨形成蛋白，主要是表达制备人骨形成蛋白-2完整成熟肽即人骨形成蛋白-2羧基端114肽。而人骨形成蛋白-2成熟肽的氨基端有一个肝素结合位点，会非特异的结合于细胞外基质，使得的有效作用域值比较高，意味着完整的人骨形成蛋白-2完整成熟肽治疗骨损失的有效剂量比较大，这将加大生产商和使用者的经济方面和安全方面的压力。
为克服上述缺陷本发明的目的在于提供一种具有良好生物学活性、治疗骨损失有效剂量较小的重组人骨形成蛋白-2截短突变体，同时提供一种采用基因工程手段利用大肠杆菌制备重组人骨形成蛋白-2截短突变体的方法。该方法操作简便、价廉高效，其重组人骨形成蛋白-2截短突变体基因工程产物的生物学活性明显优于人骨形成蛋白-2完整成熟肽。
为达到上述目的本发明是以如下技术方案实现的用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-2截短突变体为人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体。其主要步骤包括①利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)所取得编码人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体的基因序列；②采用基因工程手段利用大肠杆菌系统表达重组人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体；③通过该表达产物的诱导表达、包涵体纯化、变性溶解、复性和纯化后获得有生物活性的人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因工程产物；④将适当剂量的人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因工程产物与多植骨材料复合。
我们通过实验发现人骨形成蛋白-2成熟肽氨基端的肝素结合位点对其许多生物学活性并无明显的影响，进而利用大肠杆菌系统表达制备了人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体，其活性约为人骨形成蛋白-2完整成熟肽的5倍。该基因工程产物与胶原、羟基磷灰石、珊瑚、聚乳酸和异种骨基质等植骨材料复合后，能够有效的修复动物颅骨、下颌骨、股骨、胫骨和尺骨等多种自身无法愈合的骨缺损，治疗效果明显优于单纯的植骨材料或自体骨移植。
下面结合具体实施方法和实验例对本发明作进一步说明。
实施方法1.编码人骨形成蛋白-2的截短突变体基因的获得根据已发表的人骨形成蛋白-2的基因全序列，设计聚合酶链式反应(PCR)引物，从胎骨cDNA文库中扩增得编码人骨形成蛋白-2羧基端107肽的基因序列。2.人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体的重组表达将编码人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因序列克隆到大肠杆菌表达载体pETI上，转化大肠杆菌JM105，得到表达人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体的稳定工程菌，目标产物的表达量达细菌总蛋白的40％-50％。3.人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因工程产物的获得工程菌经过高密度发酵后，裂菌获得以包涵体形式表达的目标产物，经过变性溶解和层析纯化后复性，再经过进一步层析纯化后，除菌、分装和冷冻干燥后得到人骨形成蛋白-2截短突变体的基因工程产物。
实验例1将1毫克人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因工程产物与珊瑚复合，用于治疗兔颅骨标准骨缺损(直径1.5厘米的圆洞，自身不能修复)，单纯珊瑚和自体松质骨移植作为对照。3个月左右，无论从大体解剖还是X射线检查以及组织学切片检查，都证明人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体与珊瑚复合治疗组的骨缺损得到很好的修复；而且人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体与珊瑚复合治疗组在新骨形成速度和形成量上均优于自体松质骨移植治疗组，更是明显优于单纯珊瑚治疗组。
实验例2将人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因工程产物1毫克与羟基磷灰石复合可以很好的修复兔下颌骨大面积缺损(8毫米×15毫米)，组织形态学分析表明在手术后3个月含人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因工程产物的移植物有60％以上被新骨组织所取代，而单纯材料对照组少于10％。
实验例3将人骨形成蛋白-羧基端107肽截短突变体基因工程产物和人骨形成蛋白-2完整成熟肽分别作用于NIH3T3和C3H10T1/2细胞，使用浓度每毫升10纳克到800纳克，分别在3天和5天测定细胞的成骨标志碱性磷酸酶(AKP或ALP)和骨钙素(OC)，发现人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因工程产物的活性约为人骨形成蛋白-2完整成熟肽的5倍。
权利要求
1.一种重组人骨形成蛋白-2截短突变体，其特征在于所述的截短突变体为人骨形成蛋白-2羧基端107肽。
2.根据权利要求1所述一种重组人骨形成蛋白-2截短突变体的制备方法，其特征在于①利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)所取得编码人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体的基因序列；②采用基因工程手段利用大肠杆菌系统表达重组人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体；③通过该表达产物的诱导表达、包涵体纯化、变性溶解、复性和纯化后获得有生物活性的人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因工程产物；④将适当剂量的人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体基因工程产物与多植骨材料复合。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述序列编码人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体的基因序列包括其突变体以及与其它目的基因的融合体。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述重组人骨形成蛋白-2羧基端107肽截短突变体包括其衍生的各种复合剂型和缓释剂型。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的多植骨材料包括胶原、羟基磷灰石、珊瑚、聚乳酸和异种骨基质等植骨材料。
全文摘要
本发明涉及一种能够用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白－2截短突变体及其制备方法,它包括:(1)利用反转录聚合酶链式反应获取编码人骨形成蛋白－2羧基端107肽截短突变体的基因序列;(2)利用基因工程手段获得人骨形成蛋白－2截短突变体的重组表达产物;(3)通过对表达产物的纯化获得具有良好活性的重组人骨形成蛋白－2截短突变体;(4)将适量人骨形成蛋白－2截短突变体基因工程产物与植骨材料复合。经实验证明:本发明能有效地修复多种无法或难以治愈的骨缺损,其活性约为人骨形成蛋白－2完整成熟肽的5倍。
文档编号C07K14/51GK1333295SQ00113869
公开日2002年1月30日 申请日期2000年7月11日 优先权日2000年7月11日
发明者韩延 申请人:韩延