专利名称：具有释放生长激素特性的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的化合物、其药学上可接受的盐、含有它们的组合物和它们用于治疗由缺乏生长激素引起的医学病症的用途。
背景技术：
生长激素是一种刺激所有能够生长的组织生长的激素。此外，已知生长激素对代谢过程具有许多作用，例如刺激蛋白质合成和游离脂肪酸移动并且引起碳水化合物至脂肪酸代谢的能量代谢的转换。生长激素缺乏可能导致许多严重的医学病症，例如侏儒症。
生长激素从脑垂体中释放。该释放是在许多激素和神经递质直接或者间接地紧紧控制之下。生长激素的释放可以通过生长激素释放激素(GHRH)刺激以及通过生长素抑制素来抑制。在这两种情况下，激素均从丘脑下部释放，但是它们的作用主要通过位于脑垂体中特定的受体调节。其他刺激生长激素从脑垂体中释放的化合物也有描述。例如精氨酸、L3，4二羟基苯丙氨酸(L-多巴)、高血糖素、后叶加压素、PACAP(脑垂体腺苷酰基环化酶激活的肽)、蕈毒硷受体激动剂以及合成的六肽、GHRP(释放生长激素的肽)或者通过直接作用于脑垂体上或者通过影响GHRH和/或生长素抑制素从丘脑下部中释放内生的生长激素。
在希望增加生长激素水平的病症或状况中，生长激素的蛋白质性能使得除了肠胃外给药之外任何方式均不可行。此外，其他直接作用的天然的促分泌剂例如GHRH和PACAP是较长的多肽，据此理由优选肠胃外给药。
以前曾建议使用一些化合物用于增加哺乳动物中生长激素的水平，例如在EP 18 072、EP 83 864、WO 8302272、WO 8907110、WO 8901711、WO 8910933、WO 8809780、WO 9118016、WO 9201711、WO 9304081、WO 9413696、WO 9517423、WO 9514666、WO 9615148、WO 9622997、WO 9635713、WO 9700894、WO 9722620、WO 9723508、WO 9740023和WO 9810653中建议的。
释放生长激素化合物的组合物对于它们的生长激素释放能力以及它们的生物可利用率是重要的。因此本发明目的在于提供具有释放生长激素特性的新的化合物。此外，本发明的目的在于提供新的释放生长激素的化合物(生长激素促分泌剂)，其是特异性的和/或有选择性的并且没有或基本上没有副作用，例如释放LH、FSH、TSH、ACTH、后叶加压素、催产素、皮质醇和/或催乳激素。本发明再一个目的在于提供具有好的口服生物可利用率的化合物。
发明概述根据本发明，提供一种在体外正常的实验条件下直接作用在脑垂体细胞上以从其中释放生长激素的新的化合物。
释放生长激素的化合物可以在体外用作独特的研究工具，用于理解特别是怎样在脑垂体水平下调节生长激素的分泌。
此外，本发明释放生长激素的化合物还可以在体内给药以增加内生生长激素的释放。
发明说明因此，本发明涉及通过如在实施例1中所述的方法可获得的化合物，或其药学上可接受的盐。
此外，本发明涉及通过如在实施例1中所述的方法可获得的化合物，该化合物是2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺 或其药学上可接受的盐。
此外，本发明涉及化合物2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺 或其药学上可接受的盐。
通过如在实施例1中所述的方法可获得的化合物的结构可以例如通过X射线衍射分析证明(例如在RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，第十九版(1995)、特别是第160和561562页中所描述的那样)。
这里所述的两个或更多实施方案的任何一种可能的组合均包括在本发明范围内。
一般方法该专利中使用的方法是基于本领域熟知的肽偶合，决不应该被解译为以任何方式限制本发明。
在该方法中，在偶合氨基酸或肽残基之前，可以使用本领域技术人员熟知的方法除去适当的保护基例如叔丁氧基羰基(Boc)。也可以避免使用保护基。适当的氨基酸可以通过本领域已知的方法保护和脱保护，例如由T.W.Green所描述的(有机合成中的保护基团(Protective Groups in OrganicSynthesis)，2版，John Wiley and Sons，New York 1991)。
实施例1将详细地描述该方法。通过拆分3苄基哌啶1，3二羧酸1叔丁基酯的外消旋混合物得到一个对映体化合物，通过该方法得到的最终化合物是非对映体2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺，
而不是两个非对映体的混合物。
本发明的化合物对于通过酶蛋白水解的降解显示增加的抵抗力，因为它是非天然的、尤其因为天然的酰胺键被非天然的酰胺键模拟物取代。与已知的激素释放肽相比本发明化合物对于蛋白水解降解增加的抵抗力与在先文献中提出的肽相比预计提高了其生物利用率。
药物组合物本发明的化合物可以任选是药学上可接受的盐的形式例如本发明化合物的药学上可接受的酸加成盐，其包括那些通过式I化合物与无机或有机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、乙酸、磷酸、乳酸、马来酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、戊二酸、葡糖酸、甲磺酸、水杨酸、琥珀酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、氨基磺酸或富马酸和/或水反应制备的盐。
本发明的化合物可以以药学上可接受的酸加成盐形式，或如合适时以为碱金属或碱土金属或低级烷基铵盐形式给药。这种盐的形式被认为显示与游离碱形式大约相同等级的活性。
在另-方面，本发明涉及包括作为活性成分的本发明化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
含有本发明化合物的药物组合物可以通过常规技术来制备，例如按照在Remington′s Pharmaceutical Sciences，1985或RemingtonThe Scienceand Practice of Pharmacy，第十九版(1995)中所描述的方法制备。该组合物可以以常用的形式存在，例如胶囊剂、片剂、气雾剂、溶液、悬浮液或局部给药制剂。
使用的药物载体或稀释剂可以是常用的固体或液体载体。固体载体的例子是乳糖、白土、蔗糖、环糊精、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸或纤维素低级烷基醚。液体载体的例子是糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸酰胺、聚氧乙烯或水。
同样，载体或稀释剂可以包括本领域已知的任何持续释放材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独或与蜡混合。
如果固体载体用于口服，制剂可以被压片以粉状或小药丸形式放入硬明胶胶囊中，或者它可以是锭剂或糖锭形式。固体载体的量变化较广，但是通常为大约25毫克-大约1克。如果使用液体载体，制剂可以是糖浆、乳状液、软明胶胶囊或者无菌的可注射的液体例如含水的或不含水的液体悬浮液或者溶液。
可以通过常用的压片技术制备的典型的片剂可以含有核心活性化合物(以游离化合物或其盐)10毫克胶体二氧化硅(Aerosil) 1.5毫克微晶纤维素(Avicel)70毫克改性的纤维素树胶(AcDiSol) 7.5毫克硬脂酸镁包衣HPMC 大约9毫克*Mywacett 9-40T 大约0.9毫克*用作薄膜包衣增塑剂的酰化的单酸甘油酯。
对于鼻内给药，制剂可以含有溶解或悬浮在液体载体、对于气雾剂尤其是含水的载体中的本发明化合物。该载体可以含有添加剂例如增溶剂例如丙二醇、表面活性剂、吸收增强剂例如卵磷脂(磷脂酰胆碱)或环糊精，或防腐剂例如对羟基苯甲酸酯类。
通常，本发明的化合物以单位剂型配药，每单位剂量包括50200毫克活性成分和药学上可接受的载体。
当给病人例如人作为药物给药时，根据本发明化合物的剂量适合为0.01500毫克/天，例如大约5-大约50毫克、例如大约10毫克/剂量。
在另一方面，本发明涉及单位剂量形式的药物组合物，包括作为活性成分的大约10-大约200毫克通式I化合物或其药学上可接受的盐。
已经证明本发明的化合物具有在体内释放内生的生长激素的能力。因此该化合物可以用于治疗例如在生长激素缺乏的人或过了中年的病人或家畜中需要增加血浆生长激素水平的病症。
因此，在一特别方面，本发明涉及用于刺激生长激素从脑垂体中释放的药物组合物，该组合物包括作为活性成分的本发明的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。
在另一方面，本发明涉及用于刺激生长激素从脑垂体中释放的方法，该方法包括向需要的患者给药有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本发明涉及本发明化合物或其药学上可接受的盐用于制备刺激生长激素从脑垂体中释放的药物的用途。
对于本领域技术人员，熟知人的生长激素的当前和潜在的用途是不同的和各式各样的。因此，本发明的化合物可以用于刺激生长激素从脑垂体中释放的目的给药，于是具有类似于生长激素本身的效果或用途。本发明的化合物用于刺激老年人生长激素的释放，预防糖皮质激素分解代谢的副作用，预防和治疗骨质疏松症，治疗慢性疲劳综合症(CFS)，治疗急性的疲劳综合症和选择性手术之后肌肉损耗，刺激免疫系统，加速伤口愈合，加速骨折恢复，加速复杂性骨折例如内脱位的骨生成，治疗骨折继发性消瘦，治疗生长迟缓，治疗由肾衰竭或机能不全引起的生长迟缓，治疗心肌病，治疗与慢性肝病有关的消瘦，治疗血小板减少症，治疗与克罗恩氏病有关的生长迟缓，治疗短肠综合征，治疗与慢性阻塞性肺病有关的消瘦(COPD)，治疗与移植有关的并发症，治疗生理学上的短身材包括生长激素缺乏的孩子和与慢性病有关的短身材，治疗肥胖和与肥胖有关的生长迟缓，治疗厌食，治疗与PraderWilli综合症和特纳氏综合征有关的生长迟缓；提高患有部分生长激素不敏感综合症病人的生长速度，加速恢复和减少烧伤病人的住院治疗；治疗宫内生长迟缓、骨骼发育异常、皮质醇过多症和柯兴综合征；诱导脉动的生长激素释放；替换有压力病人的生长激素，治疗骨软骨发育不良、Noonan综合症、精神分裂症、抑郁症、阿尔茨海默氏病、迟延的伤口愈合和社会心理的丧失，治疗与肺机能不良和呼吸依赖性有关的异化作用；治疗心脏衰竭或相关的血管机能不良，治疗损害的心脏功能，治疗或预防心肌梗死，降低血压，预防心室机能不良或预防再灌注现象；治疗处于长期透析之中的成人；减弱大手术之后蛋白质分解代谢的反应，减少恶病质和由于慢性病如癌症或爱滋病导致的蛋白质的损失；治疗血胰岛素增多包括胰岛细胞增殖症，用于诱导排卵的辅助治疗；刺激胸腺的发育和预防与年龄有关的胸腺功能的下降，治疗免疫抑制病人；治疗sarcopenia，治疗与爱滋病有关的消瘦；改善肌力、可动性，保持虚弱老人的皮肤厚度、代谢的体内平衡和肾脏的体内平衡，刺激成骨细胞、骨头改型和软骨生长；调整食物摄入；刺激配对动物的免疫系统和治疗配对动物的衰老病症，促进家畜生长和刺激绵羊的羊毛生长，提高家畜的产奶量，治疗代谢综合症(综合症X)，治疗抗胰岛素性包括哺乳动物例如人中的NIDDM，治疗心脏中的抗胰岛素性，改善睡眠质量和矫正由于REM睡眠(REMsleep)的高度增加和REM潜伏的减少的相对的衰老hyposomatotropism，治疗低体温，治疗与年龄有关的虚弱，治疗充血性心力衰竭，治疗髋部骨折，治疗T4/T8细胞比例降低的个体的免疫缺乏，治疗肌肉萎缩，治疗过了中年的人的肌与骨的损伤，提高蛋白激酶B(PKB)的活性，改善总的肺机能，治疗睡眠障碍，治疗与气喘有关的生长迟缓，治疗与青少年风湿性关节炎有关的生长迟缓和治疗与囊性纤维化有关的生长迟缓。
对于上述适应症，剂量将根据给药方式和所希望的治疗而改变。然而，通常向病人和动物给药在0.0001和100毫克/千克体重/天之间的剂量水平以达到内生性生长激素有效的释放。此外当以上述剂量水平给药时，本发明的化合物没有或基本上没有副作用，这种副作用是例如释放LH、FSH、TSH、ACTH、后叶加压素、催产素、皮质醇和/或催乳激素。通常，适合于口服、鼻内、肺或经皮肤的给药剂量包括大约0.0001毫克-大约100毫克，优选大约0.001毫克-大约50毫克本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂。
可选择的是，本发明的药物组合物可以包括本发明化合物与一个或多个显示不同活性的化合物例如抗生素或其他药理学的活性物质相结合。
给药途径可以是能够有效地将活性化合物传输至适当的或所希望的作用位置的任何途径，例如口服、鼻内、肺的、经皮肤的或肠胃外的给药途径，优选口服途径。
本发明化合物除了药学用途外，也可以用于研究生长激素释放规则的体外工具。
本发明的化合物还可以用于评价脑垂体释放生长激素能力的体内工具。例如，可以在向人给药化合物之前和之后提取血清样品测定生长激素。比较每个血清样品中的生长激素将直接测定病人脑垂体释放生长激素的能力。
本发明的化合物向商业上重要的动物给药以提高它们的生长速度和程度以及提高产奶量。
本发明化合物另外的用途是与其他促分泌剂例如GHRP(2或6)、GHRH及其类似物、生长激素及其类似物或生长调节素包括IGF1和IGF2结合使用。
药理学方法本发明化合物可以在体外评价其对于大鼠脑垂体原始培养物中释放生长激素的效力和能力，这种评价可以按照如下所述的方法进行。
大鼠脑垂体细胞的分离是对O.Sartor等人方法(Endocrinology 116，1985，第952957页)的改变。雄性患白化病的SpragueDawley大鼠(250+/25克)从Mollegaard，Lille Skensved，Denmark购买。将大鼠放在几组笼中(四个动物/笼)并且放入12小时光循环的房间中。室温变化范围为1924℃，湿度为3060％。
将鼠去头然后解剖脑垂体。除去neurointermediate叶，立即将剩下的组织放入冰冷的分离缓冲剂(Gey′s介质(Gibco 04104030)，补充有0.25％D葡萄糖、2％非必需氨基酸(Gibco 04301140)和1％牛血清白蛋白(BSA)(SigmaA4503))中。将组织切成小块，转移到补充有3.8毫克/毫升胰蛋白酶(Worthington & num；3707 TRL3)和330毫克/毫升DNase(Sigma D4527)的分离缓冲剂中。该混合物在70转/分钟、37℃下和95/5％O2/CO2气氛中培养35分钟。然后将该组织在上述缓冲剂中洗涤三次。然后使用标准巴斯德移液管将该组织抽吸至单个细胞中。分散之后，通过尼龙过滤器(160毫米)过滤细胞除去未消化的组织。该细胞悬浮液用补充有胰蛋白酶抑制剂(0.75毫克/毫升，Worthington # 2829)的分离缓冲剂洗涤3次，最后再悬浮在培养介质补充有25mM HEPES(Sigma H3375)、4mM谷氨酰胺(Gibco 04305030H)、0.075％碳酸氢纳(Sigma S8875)、0.1％非必需氨基酸、2.5％胎牛血清胎牛血清(FCS，Gibco 01106290)、3％马血清(Gibco 03406050)、10％新鲜的大鼠血清、1nM T3(Sigma T2752)和40毫克/升地塞米松(Sigma D4902)的pH7.3的DMEM中至密度为2x×105细胞/毫升。该细胞接种至微量滴定板(Nunc，Denmark)中，其中200毫升ml/穴，在37℃和8％CO2下培养3天。
化合物测试培养之后，该细胞用刺激缓冲剂(补充有1％BSA(Sigma A4503)、0.25％D-葡萄糖(Sigma G5250)和25mM HEPES(Sigma H3375)的pH7.3的Hanks平衡盐水(Gibco 04104020))洗涤两次，在37℃下预培养1小时。该缓冲剂与90ml刺激缓冲剂(37℃)交换。加入十毫升测试化合物的溶液，该板在37℃和5％CO2下培养15分钟。滗析出介质，在rGH SPA测试系统中分析GH含量。
测试化合物的剂量范围为10pM至100mM。使用Hill等式(Fig P，Biosoft)建立剂量-反应关系。效力(最大的GH释放，Emax)用GHRP-6的％Emax表示。能力(EC50)被确定为诱导最大刺激GH释放一半的浓度。
本发明化合物使用如下所述的方法评价其代谢稳定性将化合物溶解在浓度为1毫克/毫升的水中。将25毫升该溶液加入到175毫升相应的酶溶液中(结果形成酶基质比例(w/w)大约为1∶5)。该溶液在37℃下放置过夜。相对相应的零-样品使用带有选择的分子离子离子监控器的流动注射电喷雾质谱法(ESMS)分析10毫升不同的降解溶液。如果与零-样品相比信号降低20％以上，为了明确地确定降解程度和位置通过HPLC和质谱法分析剩余溶液。
为了证明不同的溶液降解肽的能力，在稳定性测试中已经包括了几种标准的肽(ACTH410，血管紧张素114和胰高血糖素)。
标准的肽(血管紧张素114，ACTH 410和胰高血糖素)从Sigma，MO，USA购买。
酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶氨基肽酶M和羧肽酶Y和B)全部从Boehririger Mannheim GmbH(Mannheim Germany)购买。
胰酶混合物100mM碳酸氢铵中的胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶pH8.0(所有浓度均为0.025毫克/毫升)。
羧肽酶混合物50mM乙酸铵中的羧肽酶Y和B pH4.5(所有浓度均为0.025毫克/毫升)。
氨基肽酶M溶液100mM碳酸氢铵中的氨基肽酶M(0.025毫克/毫升)pH8.0使用两个不同的质谱仪进行质谱分析。装有电子喷雾离子源的Sciex API III三倍四极LCMS仪器(Sciex仪器，Thornhill，Ontario)和Biolon 20飞行时间血浆解吸仪器(Biolon Nordic AB，Uppsala，Sweden)。
在API III仪器上使用上述带有流动注射被分析物的分子离子的单个离子监控器进行化合物的定量分析(降解前后)。通过ABI 140B HPLC设备(PerkinElmer Applied Biosystems Divisions，Foster City，CA)控制液体流量(甲醇∶水1∶1)为100毫升/分钟。仪器参数被设定为标准操作条件，使用最强的分子离子(在大多数情况下相当于双倍电荷的分子离子)进行SIM监测。
此外降解产物的鉴定涉及使用在硝化纤维素涂覆的靶上点样的血浆解吸质谱法(PDMS)和标准的仪器装置。在此测定的质量准确度通常比0.1％好。
使用具有标准的乙腈TFA分离梯度的HYTACH C18反相4.6×105mm HPLC柱(Hewlett-Packard Company，Palo Alto，CA)进行降解产物的分离和离析。所用的HPLC体系是HP1090M(Hewlett-Packard Company，Palo Alto，CA)。
+稳定(在24小时之后降解溶液中的SIM信号减少小于20％)-不稳定(在24小时之后降解溶液中的SIM信号减少大于20％)药动学方法本发明化合物可以评价其口服的生物利用率，这样的评价可以按照如下所述的方法进行。
本发明化合物的药动学可以在禁食的长耳短腿小猎犬(Beagle dogs)中进行研究。
通过一周冲洗，分离静脉内给药和口服测试化合物的5％葡萄糖溶液。
在给药药物之前(计时起点)和给药之后0.08、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0小时立即收集血样。
血浆样品冷冻储存(＜18℃)待分析。
带有固相提取和UV检测的HPLC方法用于血浆中化合物的定量。
本发明化合物的口服有效性为大约50％。
通过非区室化(noncompartmental)方法使用基于PC的药动学软件WinNonlin，1.1版本(Scientific Consulting Inc.，Apex，NC，USA)计算化合物的药动学参数。
这里所述的任何新的特征或特征的结合被认为对本发明是必需的。
实施例制备本发明化合物和含有该化合物制剂的方法在下面实施例中进一步说明，然而这些实施例不能被理解为限制本发明。
化合物的结构通过高效液相色谱法(HPLC)、核磁共振(NMR，Bruker400MHz)或者液相色谱-质谱法(LCMS)确定。NMR位移(d)以百万分之几(ppm)为单位给出，仅给出选择的峰。mp是熔点并且以℃为单位给出。柱色谱法使用W.C.Still等人，J.Org.Chem.1978，43，29232925中所述的技术在Merck硅胶60(Art 9385)上进行。用作原料的化合物或者是已知的化合物或者是可以通过本身已知的方法很容易制备的化合物。所用的甲醇/氨溶液是甲醇中10％氨的溶液。
HPLC分析方法A1.
在42℃下以1毫升/分钟的速度洗脱的218TP544.6毫米×250毫米5m C18二氧化硅柱(The Seperations Group，Hesperia)上使用在214、254、276和301nm处的UV检测进行RP分析。该柱用在缓冲液中的5％乙腈平衡，所述缓冲液由0.1M硫酸铵组成的、用4M硫酸调节至pH2.5。注射之后，样品通过在相同的缓冲液中的5％-60％乙腈的梯度溶液洗脱50分钟。
方法B1.
在42℃下以1毫升/分钟的流量洗脱的218TP54 4.6毫米×250毫米5m C18二氧化硅柱(The Seperations Group，Hesperia)上使用在214、254、276和301nm处的UV检测进行RP分析。该柱用5％(乙腈+0.1％ TFA)的TFA水溶液(0.1％)平衡。注射之后，样品通过在相同的含水缓冲剂中5％-60％(乙腈+0.1％TFA)的梯度溶液洗脱50分钟。
方法h8在42℃下以1毫升/分钟的流量洗脱的218TP544.6毫米×150毫米C18二氧化硅柱上使用在214和254nm处的UV检测进行RP分析。该柱用5％乙腈、85％水和10％的0.5％三氟乙酸水溶液平衡，通过从5％乙腈、85％水和10％的0.5％三氟乙酸溶液至90％乙腈和10％的0.5％三氟乙酸的溶液的线性梯度溶液洗脱15分钟。
Chirale HPLC在室温下以0.7毫升/分钟的流量洗脱的，装有4.6毫米×80毫米Chiracel OJ前置柱的4.6毫米×250毫米Chiracel OJ柱(两个柱均购买自Daicel Chemical Industries，LTD)上使用在225和254nm处的UV检测进行Chiral HPLC。样品用庚烷(92)异丙醇(8)TFA(0.1)的等度洗脱液洗脱。
LCMS-分析在PE Sciex API 100 LC/MS体系中使用Waters3毫米×150毫米3.5mC18对称柱和20毫升/分钟流量的正离子喷雾进行LCMS分析。该柱用线性梯度的590％乙腈、850％水和10％三氟乙酸(0.1％)/水以1毫升/分钟的流量洗脱15分钟。
缩写TLC薄层色谱法DMSO 二甲亚砜min分钟h 小时Boc叔丁氧基羰基DMF二甲基甲酰胺THF四氢呋喃EDAC N-乙基-N′二甲氨基丙基碳二亚胺盐酸盐HOAt 1-羟基-7氮杂苯并三唑DIEA 二异丙基乙胺TFA三氟乙酸结构单元(Building blocks)用于下列实施例中的N甲基化氨基酸按照Can.J.Chem.1977，55，906中的方法制备。
甲酸-N′，N′-二甲基酰肼将50毫升甲酸甲酯和50毫升1，1-二甲基肼的混合物在室温下搅拌3天。在真空中浓缩形成结晶，将其在EtOH(5)庚烷(95)中搅拌，在冰箱中冷却过夜然后过滤50.7克(575毫摩尔)(收率88％)N，N，N′-三甲基肼，二盐酸盐向装有磁力搅拌器和加料漏斗的2升三颈圆底烧瓶中装入20.4克LiAlH4，抽空然后用氮气冲洗。然后将加料漏斗装上氮气鼓泡器，缓慢地加入250毫升无水的四氢呋喃(放热)。剧烈搅拌灰色的悬浮液，用1小时滴加含有40.0克甲酸N′，N′-二甲基酰肼的250毫升无水的四氢呋喃溶液。在室温下搅拌过夜。反应通过TLC(CH2Cl2(100)MeOH(10)NH3(1))监测。
向另一个装有干冰冷凝器的2升三颈圆底烧瓶中装入350毫升4.8MHCl/CH3OH，然后放入干冰浴(70℃)中。然后通过vigreux冷凝器将其连接到反应烧瓶上，反应烧瓶放置在油浴中。向该反应烧瓶中小心地加入200毫升四氢呋喃和200毫升MeOH的混合物。蒸馏产物和溶剂同时缓慢地加热至130℃，结果收集结晶的三甲基肼的二盐酸盐(在70℃)。移去干冰浴，使得温度上升到室温。在真空中浓缩获得稀薄的无色油，使用高真空泵将其干燥过夜45.2克(309毫摩尔)(收率68％)。在氮气下保存该非常吸湿的产物。
其他原料可以从Aldrich购买。
实施例1制备化合物2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺 或
2-氨基-N-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺的方法 步骤a哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯 向装有磁力搅拌器和加料漏斗的一颈圆底烧瓶(1升)中装入NaOH颗粒(15.6克)、四氢呋喃(400毫升)和3-哌啶甲酸乙酯(50毫升，324毫摩尔)。向在室温下搅拌的混合物中滴加溶于四氢呋喃(150毫升)中的Boc2O(84.9克，389毫摩尔)的溶液(1小时，白色固体沉淀，NaOH颗粒溶解，放热)。混合物在室温下搅拌过夜。将该混合物加入到乙酸乙酯(500毫升)和H2O(2000毫升)中，水层用乙酸乙酯(2×500毫升)反萃取，合并的有机层用盐水(100毫升)洗涤，MgSO4干燥，过滤然后在真空中浓缩获得哌啶-1，3-二-羧酸1-叔丁酯3-乙酯(82.5克)，为浅黄色油。
1HNMR(300MHz CDCl3)δ1.25(t，3H，CH3)；1.45(s，9H，3XCH3)；2.05(m，1H)；2.45(m，1H)；2.85(m，1H)；3.95(d(宽的)，1H)；4.15(q，2H，CH2)步骤b3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯(外消旋混合物) 将装有磁力搅拌器、温度计、氮气鼓泡器和加料漏斗的三颈圆底烧瓶(2升)抽空，用氮气冲洗，装入无水四氢呋喃(500毫升)然后冷却至70℃。然后加入二异丙胺锂(164毫升2.0M四氢呋喃溶液，327毫摩尔)。用45分钟向在70℃下搅拌的溶液中滴加含有哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯(80克，311毫摩尔)的无水四氢呋喃(50毫升)溶液(温度在70℃-60℃之间，澄清的红色溶液)。该混合物搅拌20分钟，随后用40分钟滴加含有苄基溴(37毫升，311毫摩尔)的无水四氢呋喃(250毫升)溶液(温度在70℃-60℃之间)。该混合物在70℃下搅拌1小时，然后在室温下放置过夜(浅橙色)。该反应混合物在真空中浓缩至大约300毫升，转移到分液漏斗中，用CH2Cl2(900毫升)稀释然后用H2O(900毫升)洗涤。由于不良分离，水层用CH2Cl2(200毫升)反萃取，合并的有机层用含水的NaHSO4(200毫升，10％)、含水的NaHCO3(200毫升，饱和的)、H2O(200毫升)、盐水(100毫升)洗涤，MgSO4干燥，过滤然后在真空中浓缩获得油状物，将其溶于乙酸乙酯(1)庚烷(10)中然后放置(aged)过夜。通过过滤移去形成的固体，用庚烷洗涤，在真空中干燥得到3苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯的外消旋混合物(81.4克)。
HPLC(h8)Rt＝15.79分钟。
LCMSRt＝7.67分钟。(m+1)＝348.0步骤c3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(外消旋混合物) 在装有冷凝器和磁力搅拌器的一颈圆底烧瓶(1升)中将3苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯3-乙酯(81克，233毫摩尔)溶于EtOH(400毫升)和NaOH(400ml，16％水溶液)中。该混合物在氮气下回流10小时，冷却至室温，在真空中浓缩至大约600毫升(固体沉淀)，用H2O(400毫升)稀释，在冰浴中冷却然后在剧烈搅拌下用4M H2SO4酸化直到pH＝3(最终温度28℃)。混合物用乙酸乙酯(2×700毫升)萃取，合并的有机层用盐水(200毫升)洗涤，MgSO4干燥，过滤然后在真空中浓缩获得油状物，将其溶于乙酸乙酯(1)庚烷(10)中然后放置过夜。通过过滤移去形成的结晶，用庚烷洗涤，在真空中干燥得到3苄基哌啶-1，3-二羧酸1叔丁酯的外消旋混合物(66.0克)。
HPLC(h8)Rt＝12.85分钟。
LCMSRt＝5.97分钟。(m+1)＝320.0Chirale HPLC(Chiracel OJ，庚烷(92)异丙醇(8)TFA(0.1))Rt＝8.29分钟46.5％Rt＝13.69分钟53.5％步骤d(3R)-3-苄基哌啶-1，3-二羧酸-1-叔丁酯或(3S)3苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(拆分3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯) 或 在装有磁力搅拌器的一颈烧瓶(5L)中将3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(76克，238毫摩尔)溶于乙酸乙酯(3.0L)中。然后加入H2O(30毫升)、R(+)1苯乙胺(18.2毫升，143毫摩尔)和Et3N(13.2毫升，95毫摩尔)，混合物在室温下搅拌过夜形成白色结晶的沉淀(41.9克)，通过过滤移去，用乙酸乙酯洗涤然后在真空中干燥。将该沉淀溶于含水的NaHSO4(300毫升，10％)和乙酸乙酯(600毫升)的混合物中，分层然后用乙酸乙酯(100毫升)反萃取水层。合并的有机层液用盐水(100毫升)洗涤，MgSO4干燥然后过滤。在真空中除去溶剂获得无色油，将其溶于乙酸乙酯(1)庚烷(10)中，然后陈化过夜。通过过滤移去已经形成的结晶，用庚烷洗涤，在真空中干燥得到一个化合物，其或者是(3R)-3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯或者是(3S)3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(27.8克)。
Chirale HPLC (Chiracel OJ，庚烷(92)异丙醇(8)TFA(0.1))Rt＝7.96分钟。95.8％ ee步骤e(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯或(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯 或 在装有大磁力搅拌器和加料漏斗/氮气鼓泡器的一颈圆底烧瓶(1L)中将三甲基肼二盐酸盐(15.3克，104毫摩尔)悬浮在四氢呋喃(250毫升)中。然后将烧瓶放入水浴(温度10-20℃)中，加入六氟磷酸溴-三-吡咯烷 (40.4克，86.7毫摩尔)，在剧烈搅拌下滴加二异丙基乙胺(59毫升，347毫摩尔)。混合物(含有重质沉淀)搅拌5分钟，用1.5小时缓慢地加入来自步骤d产物的四氢呋喃(250毫升)溶液，该产物或者是(3R)-3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯或者是(3S)-3-苄基哌啶-1，3-二羧酸1-叔丁酯(27.7克，86.7毫摩尔)。混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯(1000毫升)稀释，用H2O(500毫升)、含水的NaHSO4(200毫升，10％)、含水的NaHCO3(200毫升，饱和的)、盐水(200毫升)洗涤，MgSO4干燥，过滤然后在真空中浓缩获得浅橙色油。将该混合物溶于乙酸乙酯(300毫升)中，加入到SiO2(150克)中然后在真空中浓缩至干燥粉末，将其施加到充满SiO2(150克)的过滤器上，用庚烷(1升)洗涤，用乙酸乙酯(2.5升)析出所希望的化合物。在真空中浓缩之后，获得橙色油状产物，其或者是(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯或者是(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(49克)。
HPLC(h8)Rt＝14.33分钟。
步骤f(3R)-3-苄基-哌啶-3-羧酸三甲基酰肼或(3S)-3-苄基-哌啶-3-羧酸三甲基酰肼 或 在装有磁力搅拌器的一颈圆底烧瓶(2L)中将来自步骤e的产物(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1羧酸叔丁酯或(3S)3苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(56.7克，100.9毫摩尔)溶于乙酸乙酯(500毫升)(澄清的无色溶液)中。然后将该烧瓶放入水浴(温度1020℃)中，将HCl气体通过该溶液5分钟(粉状的沉淀)。搅拌1小时之后(沉淀大量的白色结晶)，该溶液用N2冲洗以除去过量的HCl。通过缓慢的过滤移去沉淀，用乙酸乙酯(2×100毫升)洗涤，在真空、40℃干燥过夜得到该产物，其或者是(3R)-3-苄基-哌啶-3-羧酸三甲基酰肼或者是(3S)-3-苄基-哌啶-3-羧酸三甲基酰肼(37.0克)。
HPLC(h8)Rt＝7.84分钟。
步骤g[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′--三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯或[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯 或 在装有磁力搅拌器和氮气鼓泡器的一颈圆底烧瓶(500毫升)中将BocDTrpOH(32.3克，106毫摩尔)溶于二甲基乙酰胺(250毫升)中。该溶液冷却至05℃，加入1羟基-7氮杂苯并三唑(14.4克，106毫摩尔)、1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(20.3克，106毫摩尔)、N-甲基吗啉(11.6毫升，106毫摩尔)。在05℃下搅拌20分钟之后，加入来自步骤f的产物(3R)-3-苄基-哌啶3羧酸三甲基酰肼或者是(3S)3苄基-哌啶3羧酸三甲基酰肼(37.0克，106毫摩尔)和N甲基吗啉(24.4毫升，223毫摩尔)。反应在室温下搅拌过夜。然后将混合物加入到乙酸乙酯(750毫升)中，用含水的NaHSO4(300毫升，10％)洗涤。使得层分离，水层用乙酸乙酯(500毫升)反萃取。合并的有机层用H2O(100毫升)、含水的NaHCO3(300毫升，饱和的)、H2O(100毫升)、盐水(300毫升)洗涤，MgSO4干燥，过滤然后在真空中浓缩获得橙色油状产物，其或者是[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯或者是[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯(56.7克)。
HPLC(h8)Rt＝14.61分钟。
LCMSRt＝7.35分钟。(m+1)＝562.6步骤h1-[(2R)2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基](3R)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基酰肼或1-[(2R)2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基(3S)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基酰肼 或
在装有磁力搅拌器的一颈圆底烧瓶(2L)中将来自步骤g的产物[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯或[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-((1H-吲哚-3-基)甲基)-2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯(56.7克，100.9毫摩尔)溶于乙酸乙酯(500毫升)中(澄清的无色溶液)。然后将该烧瓶放入水浴(温度1020℃)中，将HCl气体通过该溶液10分钟(重质沉淀的油)。该混合物用N2冲洗以除去过量的HCl，然后分离成油和乙酸乙酯层。丢弃乙酸乙酯层。将该油溶于H2O(500毫升)中，加入CH2Cl2(1000毫升)和固体Na2CO3直到pH＞7。分层，有机层用H2O(100毫升)、盐水(100毫升)洗涤，MgSO4干燥，过滤然后在真空中浓缩获得橙色泡沫状的产物，其或者是1-[(2R)2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基(3R)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基酰肼或1-[(2R)2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基(3S)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基酰肼(27克)。
HPLC(h8)Rt＝10.03分钟。
步骤i{1-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基氨基甲酰基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯或{1-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基氨基甲酰基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯 或
在装有磁力搅拌器和氮气鼓泡器的一颈颈圆底烧瓶(500毫升)中将BocAibOH(11.9克，58.4毫摩尔)溶于二甲基乙酰胺(125毫升)中。向在室温下搅拌的溶液中加入1羟基-7氮杂苯并三唑(7.95克，58.4毫摩尔)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(11.2克，58.4毫摩尔)和二异丙基乙胺(13.0毫升，75.8毫摩尔)。20分钟之后(黄色沉淀)，加入含有来自步骤h产物1-[(2R)-2-氨基-3-[1H-吲哚-3-基)丙酰基(3R)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基酰肼或1-[(2R)-2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基-(3S)-3-苄基哌啶-3-羧酸三甲基酰肼(27.0克，58.4毫摩尔)的二甲基乙酰胺(125毫升)溶液。反应混合物在室温下搅拌3小时。将混合物加入到乙酸乙酯(750毫升)中，用含水的NaHSO4(300毫升，10％)洗涤。使得层分离，水层用乙酸乙酯(500毫升)反萃取。合并的有机层用H2O(100毫升)、含水的NaHCO3(300毫升，饱和的)、H2O(100毫升)、盐水(300毫升)洗涤，MgSO4干燥，过滤然后在真空中浓缩至大约500毫升。然后加入SiO2(150克)，在真空中除去剩余的乙酸乙酯得到干燥粉末，将其施加到充满SiO2(150克)的过滤器上，用庚烷(1升)洗涤，用乙酸乙酯(2.5升)析出所希望的化合物。在真空中浓缩之后，获得橙色泡沫状的产物，其或者是{1-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基氨基甲酰基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯或者是{1-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代-乙基氨基甲酰基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯33.9克。
HPLC(h8)Rt＝14.05分钟。
步骤j2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺，富马酸盐或2-氨基-N-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺，富马酸盐 或 在装有磁力搅拌器的一颈圆底烧瓶(1L)中将来自步骤i的产物{1-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代-乙基氨基甲酰基]-1-甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯或{1-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代-乙基氨基甲酰基]1甲基乙基}氨基甲酸叔丁酯(23.8克，36.8毫摩尔)溶于乙酸乙酯(800毫升)中(澄清的黄色溶液)。然后将该烧瓶放入水浴(温度1020℃)中，将HCl气体通过该溶液5分钟(粉状的沉淀)。搅拌1小时之后(沉淀出大量的黄色粉末)，该溶液用N2冲洗以除去过量的HCl。通过缓慢过滤移去沉淀，在真空40℃下干燥过夜。
将非结晶的沉淀溶于H2O(500毫升)中，用乙酸乙酯(100毫升)洗涤。然后加入CH2Cl2(1000毫升)和固体Na2CO3直到pH＞7。分离2层，水层用CH2Cl2(200毫升)反萃取。合并的有机层用盐水(100毫升)洗涤，MgSO4干燥然后过滤。在减压下蒸发溶剂，再溶解在装有磁力搅拌器的一颈圆底烧瓶(1L)中的乙酸乙酯(500毫升)中。缓慢地加入(5分钟)含有富马酸(3.67克)的异丙醇(20毫升)和乙酸乙酯(50ml)的悬浮液，结果沉淀出白色结晶的盐。1小时之后，通过过滤分离沉淀，在真空40℃下干燥过夜得到得到白色粉末状的化合物2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺或2-氨基-N-[(1R)-2-[(3S)-3-苄基-3-(N，N′，N′-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]1-(1H-吲哚-3-基甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺的富马酸盐(13.9克)。
HPLC(A1)Rt＝33.61分钟。
HPLC(B1)Rt＝34.62分钟。
LCMSRt＝5.09分钟。(m+1)＝547.权利要求
1.通过如在实施例1中所述的方法可获得的化合物，或其药学上可接受的盐。
2.通过如在实施例1中所述的方法可获得的化合物，该化合物是2-氨基-N-[(1R)-2-[(3R)-3-苄基-3-(N，N＇，N＇-三甲基肼基羰基)哌啶-1-基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)-2-氧代乙基]-2-甲基丙酰胺 或其药学上可接受的盐。
3.一种药物组合物，包括作为活性成分的根据权利要求12中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。
4.根据权利要求3的用于刺激生长激素从脑垂体中释放的药物组合物。
5.根据权利要求3或权利要求4的用于向动物给药以增加它们的生长速度和程度、增加它们的奶和毛产量或用于治疗疾病的药物组合物。
6.刺激生长激素从哺乳动物的脑垂体中释放的方法，该方法包括向所述的哺乳动物给药有效量的根据权利要求1或2中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐，或根据权利要求35中任何一项的组合物。
7.增加生长速度和程度，奶和毛产量或用于治疗疾病的方法，该方法包括向需要的受治疗者给药有效量的根据权利要求1-2中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐，或根据权利要求35中任何一项的组合物。
8.根据权利要求12中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐用于制备药物的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中该药物用于刺激生长激素从哺乳动物的脑垂体中释放。
全文摘要
本发明涉及新的非对映的化合物、其药学上可接受的盐、含有它们的组合物和它们用于治疗由缺乏生长激素引起的医学病症的用途。
文档编号C07D401/06GK1420878SQ00815145
公开日2003年5月28日 申请日期2000年11月10日 优先权日1999年11月10日
发明者迈克尔·安克森 申请人:诺沃挪第克公司