专利名称：快速分离,纯化核糖核酸(rna)的试剂及方法
技术领域：
本发明公开了一种快速分离，纯化核糖核酸(RNA)的方法及所需试剂。
核糖核酸(RNA)是构成生命的物质基础之一，它以单链的形式广泛地存在于生命体内。由于它的单链形式，加之核糖核酸酶广泛地存在于周围环境中，它很容易降解。因此，核糖核酸(RNA)的抽提，纯化特别困难。发明一个好的分离，纯化核糖核酸(RNA)的方法，一直是科学家的努力方向。
在目前现存的RNA分离，纯化方法过程中，科学家们普遍感到困难的有五个方面1)分离纯化环境中广泛存在着核糖核酸酶(RNase酶)，它们能迅速降解RNA；2)分离RNA需要复杂的操作技术，有的还需要很长时间离心，并且得量少；3)混在其间的脱氧核糖核酸(DNA)，蛋白质和其它的有机物质很难被去除；4)分离，纯化所需的试剂需要保持新鲜，存放的时间很短；5)分离出来的RNA，保存时间短。
为了克服以上所存在的问题，本发明介绍一种操作简单的混合试剂，并以此试剂来分离纯化RNA的方法。试剂的制备及操作方法如下溶液的配制溶液A100mM柠檬酸钠(Sodium citrate)，0.1％尿素，30mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1％二巯基乙醇(2-mercaptoethanol)，5M硫氰酸胍或异硫氰酸胍或氯化胍，以上成份调节PH值至6.5-7.0。*注0.1％二巯基乙醇(2-mercaptoethanol)需待使用前最后加入。溶液B80％PH值为6.5的酚，20％氯仿。溶液C100％异丙醇(isopropanol)。溶液D100mM柠檬酸钠(Sodium citrate)，30mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5M硫氰酸胍或异硫氰酸胍或氯化胍，以上成份调节PH值至6.5-7.0。将以上成份溶入焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。
基本过程取107-108动植物细胞，或30mg组织，1-2ml血液，用生理盐水清洗后，离心，在细胞沉淀物中加入600ul溶液A。充分混合后使细胞破裂，然后加入600ul溶液B。混合后离心14000rpm 15分钟，此时试管内溶液可分成三层，第一层为RNA，第二层为DNA和蛋白质，第三层为酚和氯仿，仔细吸取第一层溶液，转入一新试管再加入等量的溶液C，在冰上放置30分钟后，离心15分钟，RNA沉淀，除去上清，将沉淀物与750ul 100％乙醇，250ulDEPT水混合后，在4℃环境下，10000rpm离心10分钟。沉淀干燥后为RNA。加入溶液D混合后，在-20℃环境下可保存三个月至五年。
该方法抽提纯化的RNA可用于RT-PCR；Northern，dot与slot杂交；cDNA合成；mRNA提纯，RNA differential display；RDA(RNA differential analysis)该方法有如下优点1)分离纯化的RNA纯度高，得量高，很少或无杂质混杂。且能保存较长时间；2)溶液中存在着多种核糖核酸酶抑制剂，能很快使周围溶液中的核糖核酸酶失去活性，从而控制了核糖核酸的降解；3)实验时间短，整个过程只需一个小时；4)试剂可保存较长时间。
此方法实施十分简便，只需按说明书做即可。
下面是一个实例含有详细步骤1.取107-108常规培养的肿瘤细胞，用1ml生理盐水清洗；2.以5000rpm离心5分钟，除去上清，将沉淀物转入一个1.5ml试管；3.在沉淀物中加入溶液A600ul，充分混合；4.加入600ul溶液B，充分混合后在4℃环境下离心14000rpm 15分钟。
5.将上清(共三层，上清为第一层)转移至1.5ml清洁试管内，加入等量的溶液C，在冰上放置30分钟后，在4℃环境下离心14000rpm15分钟，除去上清。
6.在沉淀物中加入75ul 100％乙醇和25ul DEPC水混合后在4℃环境下离心10000rpm10分钟，除去上清，沉淀干燥后加入20-50ul溶液D。
按此方法可得50-100ug RNA*注所有试管都需经过严格消毒，以确保无核糖核酸酶
权利要求
一种快速分离，纯化核糖核酸(RNA)的试剂组合及其方法，其特征为1)细胞或组织在一种含有多种核糖核酸酶抑制剂(柠檬酸钠，尿素，乙二胺四乙酸，二巯基乙醇，硫氰酸胍或异硫氰酸胍或氯化胍，焦碳酸二乙酯)的裂解液(PH值为6.5-7.0)中裂解；2)然后再加入酸性(PH值为6.5)的80％酚，20％氯仿混合液混合，离心使RNA与DNA，蛋白质完全分离；3)RNA可存放于含有多种核糖核酸酶抑制剂(100mM柠檬酸钠，30mM乙二胺四乙酸，5M硫氰酸胍或异硫氰酸胍或氯化胍，以上成份溶入焦碳酸二乙酯水中调节PH值至6.5-7.0)。
全文摘要
快速分离,纯化核糖核酸(RNA)的试剂及方法,其主要步骤为:1)组织和细胞在多种核糖核酸酶抑制剂(柠檬酸钠,尿素,乙二胺四乙酸,二巯基乙醇,硫氰酸胍或异硫氰酸胍或氯化胍,以上成份调节pH值至6.5－7.0)的裂解液中裂解;2)氯仿,酸性酚分离RNA;3)异丙醇沉淀RNA;4)RNA溶于含有RNA酶抑制剂的水中。
文档编号C07H1/06GK1373136SQ0110556
公开日2002年10月9日 申请日期2001年3月6日 优先权日2001年3月6日
发明者耿东进 申请人:耿东进