专利名称：C－反应蛋白测定方法和测定试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及C-反应蛋白测定用试剂和测定方法，更详细地说就是涉及具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体的C-反应蛋白测定试剂、以及应用该试剂测定C-反应蛋白的方法、含有具磷酸胆碱基团的表面活性剂、具阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体的C-反应蛋白测定试剂、以及应用该试剂测定C-反应蛋白的方法。
作为急性相反应物质一种的C-反应蛋白(C-reactive protein)作为各种感染性疾病、炎症性疾病和发生组织破坏的疾病等诊断和过程观察的标记物，是临床检查领域内经常测定的一个项目。作为C-反应蛋白的测定方法，已知有使用和C-反应蛋白特异结合的抗体或抗血清的毛细管法、一维免疫扩散法、免疫比浊法、胶乳免疫比浊法等测定方法。这些测定方法利用抗原C-反应蛋白和抗体结合形成巨大凝聚体而检测种种凝聚。
例如，在胶乳免疫比浊法中，使用承载(致敏)抗体的粒径0.1～1微米的聚苯乙烯胶乳等载体，和相应的抗原发生抗原抗体反应时，反应液中的散射光增加，透过光减少，以吸光度或积分球浊度检测此变化就能够测定C-反应蛋白。但是，在观察此抗原抗体反应所致凝聚的方法中，已知会引起所谓“前带现象”(prozone phenomenon)的问题。所说的“前带现象”是因抗原和抗体相比有更高浓度，反而使浊度减少的现象。结果使测定时试样中抗原虽然有很高浓度，但得出低浓度的错误结论。为了避免此前带现象，必需将试样稀释、或增加使用的抗体而进行再次测定，使操作复杂化。
已知磷酸胆碱在钙离子存在下和C-反应蛋白特异结合，形成凝聚体[J.Immunol.,124,1396(1980)]。此外，已知使用对硝基苯基磷酸胆碱琼脂糖B层析柱进行亲合层析而精制C-反应蛋白[《检查と技术》，24(5),409(1996)]。还有，作为C-反应蛋白的定量方法，有使用含磷脂酰胆碱、胆固醇、氯化胆碱、钙等的试剂的方法(特开昭52-123295号公报)、使用含结合磷酸胆碱的高分子的试剂的方法、以及使用含结合磷酸胆碱的高分子和C-反应蛋白的特异抗体的试剂的方法(特开昭62-259063号公报)。此外，作为应用积分球浊度进行检测、使用胶乳试剂的C-反应蛋白测定方法，例如有使用协和梅迪克斯公司的C-反应蛋白用胶乳试剂(Extel CRP用EL1200)的方法。
本发明的目的在于提供避免前带现象、无需稀释含高浓度C-反应蛋白试样的测定方法及其所用的试剂。
本发明者们对上述课题进行了深入研究，结果发现，(A)使用具有磷酸胆碱和阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体、或(B)使用具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体，能够测定试样中的C-反应蛋白，对于含高浓度C-反应蛋白的试样无需稀释就能避免前带现象而测定C-反应蛋白，从而完成了本发明。
即，本发明涉及一种C-反应蛋白的测定方法，其特征在于使用含有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体、或使用具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体来测定C-反应蛋白(发明1)。
此外，本发明涉及根据发明1记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物中阳离子性基团为通式(Ⅰ) [式(Ⅰ)中R1、R2和R3相同或不同，表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X1-表示无机阴离子或有机阴离子。]所示的基团(发明2)；根据发明1或2记载的C-反应蛋白的测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱外的阴离子基团的化合物为具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体结合的共聚物(发明3)；根据发明3记载的C-反应蛋白的测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体分别为具有磷酸胆碱基和乙烯基的单体、以及具有阳离子性基团和乙烯基的单体(发明4)；根据发明4记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体和具有阳离子性基团和乙烯基的单体分别为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱和氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵(发明5)；根据发明1记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有具有磷酸胆碱基团的表面活性剂为通式(Ⅱ) [式(Ⅱ)中Y1表示疏水基团。]所示的化合物(发明6)。
此外本发明涉及根据发明6记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于式(Ⅱ)所示的化合物是从溶血磷脂酰胆碱己酸酯、溶血磷脂酰胆碱肉豆蔻酸酯、溶血磷脂酰胆碱棕榈酸酯、溶血磷脂酰胆碱硬脂酸酯、大豆来源的溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱二丁酸酯、磷脂酰胆碱二己酸酯、磷酸胆碱油氧基乙酯、神经鞘氨基磷酸胆碱中选出的1种或2种以上的化合物(发明7)；根据发明1、6和7任一项记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有阳离子性基团的表面活性剂为铵盐的表面活性剂(发明8)；根据发明8记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于铵盐表面活性剂为通式(Ⅲ) [式(Ⅲ)中Y2表示疏水基团、R1、R2、R3相同或不同、表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X2-表示无机阴离子或有机阴离子。]所示的化合物(发明9)；根据发明9记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于式(Ⅲ)所示的化合物为从氯化十八烷基三甲基铵、氯化十六烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵等中选出的1种或2种以上的化合物(发明10)；根据发明1～10任一项记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于C-反应蛋白的抗体为水不溶性载体担载的(发明11)；根据发明11记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于不溶性载体为聚苯乙烯类胶乳(发明12)。
还有，本发明涉及一种C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于含有具磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体、或者含有具磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有除磷酸胆碱基团外的阳离子基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体(发明13)；根据发明13记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物中的阳离子性基团为通式(Ⅰ) [式(Ⅰ)中R1、R2和R3相同或不同，表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X1-表示无机阴离子或有机阴离子。]所示的基团(发明14)；根据发明13或14记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物为具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体结合而成的共聚物(发明15)；根据发明15记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体分别为具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体和具有阳离子性基团和乙烯基的单体(发明16)；根据发明16记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体和具有阳离子性基团和乙烯基的单体分别为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱和氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵(发明17)。
此外，本发明还涉及根据发明13记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团的表面活性剂为通式(Ⅱ) 所示的化合物(发明18)；根据发明18记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于式(Ⅱ)的化合物为从溶血磷脂酰胆碱己酸酯、溶血磷脂酰胆碱肉豆蔻酸酯、溶血磷脂酰胆碱棕榈酸酯、溶血磷脂酰胆碱硬脂酸酯、大豆来源的溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱二丁酸酯、磷脂酰胆碱二己酸酯、磷酸胆碱油氧基乙酯、神经鞘氨基磷酸胆碱中选出的1种或2种以上的化合物(发明19)；根据发明13、18和19任一项记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有阳离子性基团的表面活性剂为铵盐表面活性剂(发明20)；根据发明20记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于铵盐的表面活性剂为通式(Ⅲ) [式(Ⅲ)中Y2表示疏水基团，R1、R2、R3相同或不同，表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X2-表示无机阴离子或有机阴离子。]所示的化合物(发明21)；根据发明21记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于式(Ⅲ)所示的化合物为从氯化十八烷基三甲基铵、氯化十六烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵等中选出的1种或2种以上的化合物(发明22)；根据发明13～22任一项记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于C-反应蛋白的抗体为水不溶性载体担载的(发明23)；根据发明23记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于不溶性载体为聚苯乙烯类胶乳(发明24)。
图1表示使用实施例A-1和比较例A-1～A-3的试剂，测定0～100mg/dL的C-反应蛋白的结果。
图2表示使用实施例A-1、比较例A-1和比较例A-4的试剂，测定0～100mg/dL的C-反应蛋白的结果。
图3表示使用实施例A-2和比较例A-5的试剂，测定0～100mg/dL的C-反应蛋白的结果。
图4表示使用实施例A-3和比较例A-5的试剂，测定0～100mg/dL的C-反应蛋白的结果。
图5表示使用实施例A-9和比较例A-1的试剂，测定0～100mg/dL的C-反应蛋白的结果。
图6表示使用实施例B-1和B-2以及比较例B-1～B-4的试剂，测定0～100mg/dL的C-反应蛋白的结果。
图7表示使用实施例B-3和比较例B-5的试剂，测定0～100mg/dL的C-反应蛋白的结果。
图8表示使用实施例B-2、实施例B-4、实施例B-5和比较例B-1的试剂，测定0～100mg/dL的C-反应蛋白的结果。
本发明的C-反应蛋白的测定方法由特征为使用具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体、测定C-反应蛋白的方法〔下面称为“本发明的C-反应蛋白的测定方法(A)”〕，和特征为使用具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体、测定C-反应蛋白的方法(下面称为“本发明的C-反应蛋白的测定方法(B)”)组成；此外，本发明的C-反应蛋白测定用试剂是由以含有具磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱以外的阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体为特征的试剂〔下面称为“本发明的C-反应蛋白测定用试剂(A)”〕、和以含有具磷酸胆碱基团的表面活性剂、具阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体为特征的试剂〔下面称为“本发明的C-反应蛋白测定用试剂(B)”〕组成的。
在本发明的C-反应蛋白测定方法(A)和C-反应蛋白测定用试剂(A)中，作为具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物，只要是同一分子内至少有一对磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物，可以用任何符合要求的化合物，但从充分避免前带现象方面考虑，优选在同一分子内具多个磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱外阳离子基团的化合物，例如油脂、碳水化合物、蛋白质、多糖、核酸等天然化合物中引入这两种基团制得的化合物、合成化合物中引入这两种基团制得的化合物、用合成方法结合有其它含这些基团化合物的合成化合物等。此外，作为本发明中具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱外的阳离子性基团的化合物的分子量，没有特殊的限定，为充分避免前带现象，优选500～5000000，更优选1000～1000000，特别优选5000～100000。
作为上述具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外阳离子性基团的化合物中的阳离子性基团，除了磷酸胆碱基团外可以是其它带正电荷的基团，并没有特殊的限定，但为了充分避免前带现象，优选通式(Ⅰ)[式(Ⅰ)中R1、R2和R3相同或不同，表示氢、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基，X1-表示无机阴离子或有机阴离子。]所示的阳离子性基团。 作为通式(Ⅰ)中的烷基，是直链或支链，优选碳数1～24的烷基，更优选碳数1～12的烷基，特别优选碳数1～6的烷基，具体例子有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等；此外，作为烯基，是直链或支链，优选碳数2～24的烯基，更优选碳数2～12的烯基，特别优选碳数2～6的烯基，具体例子有乙烯基、烯丙基、2-丁烯基、2-戊烯基、2-己烯基等。此外，作为取代烷基和取代烯基的取代基，例如有烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烯氧基、烯酰基、烯酰氧基、芳酰基、取代或非取代苯基、取代或非取代萘基等，烷氧基、烷酰基和烷酰氧基的烷基部分分别和上述的烷基意义相同。此外，烯氧基、烯酰基和烯酰氧基的烯基部分分别和上述烯基意义相同。作为芳酰基，例如有苯甲酰基、萘甲酰基等。作为取代苯基、取代萘基的取代基，例如有烷基、烯基等，烷基、烯基分别和上述烷基、烯基的意义相同。
作为无机阴离子，例如有氟、氯、溴、碘等卤素、硝酸根等无机酸阴离子等。作为有机阴离子，例如有甲酸、乙酸等有机羧酸根离子等。
作为向天然化合物和合成化合物引入磷酸胆碱基团和阳离子性基团的方法，可按以前公知的方法，例如将天然化合物或合成化合物的羟基、羧基、氨基等官能团与向具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物引入的官能团进行反应的方法；作为向磷酸胆碱基团和阳离子性基团引入的官能团，例如与天然化合物和合成化合物具有的与上述官能团结合的基团，有羟基、氨基、羧基、醛基等。
作为将具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物以合成方式结合的方法没有特殊的限定，可以将具有磷酸胆碱基团的化合物和具有阳离子性基团的化合物作为单体，以加聚等高分子化方法制造。作为所说的单体，例如具有磷酸胆碱基团和乙烯基的化合物及具有阳离子性基团和乙烯基的化合物、具有磷酸胆碱基团或阳离子性基团的二醇化合物及具有阳离子性基团或磷酸胆碱基团的二羧酸化合物、具有磷酸胆碱基团或阳离子性基团的二胺化合物及具有阳离子性基团或磷酸胆碱基团的二羧酸化合物等，特别优选具有磷酸胆碱基团和乙烯基的化合物以及具有阳离子性基团和乙烯基的化合物，因为它们对于高分子化的制造方法来说其分子量或组成比容易控制。
作为上述具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体，只要是能够共聚的就可以，没有特殊的限定，具体例子有2-丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(下面简称MPC)、2-(甲基)丙烯酰氧基乙氧基乙基磷酸胆碱、6-(甲基)丙烯酰氧基己基磷酸胆碱、10-(甲基)丙烯酰氧基乙氧基壬基磷酸胆碱、烯丙基磷酸胆碱、丁烯基磷酸胆碱、己烯基磷酸胆碱、辛烯基磷酸胆碱、癸烯基磷酸胆碱等。此外，这些单体例如可按特开昭54-6325号公报、特开昭58-154591号公报所示的公知方法制造。
作为上述具有阳离子性基团和乙烯基的单体，只要是能够发生游离基聚合就可，没有特殊的限定，具体例子有氯化[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)丙基]三甲基铵、氯化[3-(丙烯酰氧基氨基)丙基]三甲基铵、氯化[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基铵、氯化[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基铵、氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵(下面简称QA)、氯化2-羟基-3-丙烯酰氧基丙基三甲基铵等。此外，这些单体可以作为常规试剂获得。
具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体是具有阳离子性基团和乙烯基的单体的组合，没有特殊的限定，从能够充分避免前带现象出发，优选上述的MPC和QA的组合。此外，将具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体与具有阳离子性基团和乙烯基的单体高分子化时，可以混合使用其它能够发生游离基聚合的具有乙烯基的单体。作为所说的其它可以游离基聚合的具有乙烯基的单体，例如有(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸正丁酯、(甲基)丙烯酸异丁酯、(甲基)丙烯酸戊酯、(甲基)丙烯酸己酯、(甲基)丙烯酸庚酯、(甲基)丙烯酸辛酯、(甲基)丙烯酸十三烷基酯、甲基丙烯酸2-羟基乙基酯等(甲基)丙烯酸酯，苯乙烯、α-甲基苯乙烯、甲基“核取代”苯乙烯、氯代苯乙烯等苯乙烯系单体，氯乙烯、氯亚乙烯、乙烯、丙烯、异丁烯等取代或非取代烃单体，乙基乙烯基醚、正丁基乙烯基醚等乙烯基醚类单体等。
作为聚合含有本发明所用的具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体、具有阳离子性基团和乙烯基的单体、以及根据需要所用的其它可游离基聚合的具有乙烯基的单体的组合物的方法，例如有特开平9-3132号公报、特开平8-333421号公报、特开平11-35605号公报等记载的公知的聚合方法。具体地说可以在聚合温度30～150℃、聚合时间2～72小时的条件下进行游离基聚合。此外，作为游离基聚合反应中的引发剂，例如有2,2’-偶氮双(2-甲基丙酰脒)二盐酸盐、4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2’-偶氮双[2-(5-甲基-2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、2,2’-偶氮双异丁基酰胺二水合物、2,2’-偶氮二异丁腈、过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化苯甲酰、过氧化二碳酸二异丙基酯、过氧化-2-乙基己酸叔丁基酯、过氧化新戊酸叔丁基酯、过氧化二异丁酸叔丁基酯、过氧化月桂酰、偶氮二异丁腈、2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)、过氧化新癸酸叔丁基酯、或它们的混合物等。此外，作为聚合溶剂，例如有水、乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇、苯、甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、氯仿及其混合物等。
聚合上述MPC和QA时，从聚合性方面考虑，作为聚合引发剂优选使用2,2’-偶氮双(2-甲基丙酰脒)二盐酸盐，其用量相对单体成分100份重量优选0.01～10重量份，更优选0.1～5重量份。此外，作为MPC和QA的聚合溶剂，从溶解性和聚合性等方面考虑，特别优选水、乙醇。此外，聚合体的精制可应用再沉淀法、透析法、超滤法等一般的精制方法。
本发明所用的聚合体的分子量没有特殊的限定，优选500～5000000，更优选1000～1000000，特别优选5000～100000。此分子量用凝胶渗透层析(GPC)进行分析，以聚乙二醇换算的值表示。此外，以具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子基团的单体为结构单元的共聚物中，阳离子性基团的摩尔含量相对磷酸胆碱基团优选1～95％，更优选5～90％，特别优选10～30％。
应用本发明的C-反应蛋白测定方法(A)和C-反应蛋白测定用试剂(A)的C-反应蛋白的测定是在反应液中将具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的混合物及C-反应蛋白的抗体和含C-反应蛋白的样品接触而进行。作为所说的反应液只要为水性介质，没有特殊的限定，优选缓冲液。作为缓冲液，例如有甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液等。此外，在反应液中优选加入氯化钙等钙离子，以提高避免前带现象的效果和扩大测定范围。作为钙离子的浓度，例如优选1～20mmol/L，更优选2～10mmol/L。 C-反应蛋白测定的反应液中具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物的浓度没有特殊的限定，优选0.0001～1％重量，更优选0.005～0.5％重量，特别优选0.01～0.1％重量。具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的聚合体只要有上述的较少的添加量，就可以避免前带现象并扩大测定范围。
作为本发明的C-反应蛋白测定方法(B)和C-反应蛋白测定用试剂(B)中具有磷酸胆碱基团的表面活性剂，可以使用具有磷酸胆碱基团、且显示出表面活性的任何物质，为充分避免前带现象，优选通式(Ⅱ)[式(Ⅱ)中Y1表示疏水基团]所示的表面活性剂。 作为通式(Ⅱ)所示的表面活性剂中的疏水基团只要是相对于磷酸胆碱基团的亲水性、显示出疏水性的基团，没有特殊的限定，例如以烃为基本骨架的基团，有取代或非取代烷基、取代或非取代烯基等。作为式(Ⅱ)中的烷基，是直链或支链，优选碳数1～30的烷基，更优选碳数2～24的烷基，特别优选碳数3～20的烷基，例如有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十五烷基、二十烷基等；此外，作为烯基，是直链或支链，优选碳数2～24的烯基，更优选碳数3～12的烯基，特别优选碳数3～6的烯基，例如有乙烯基、烯丙基、2-丁烯基、2-戊烯基、2-己烯基等。此外，作为取代烷基和取代烯基的取代基，有烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烯氧基、烯酰基、烯酰氧基、芳酰基、羟基、取代或非取代氨基、取代或非取代苯基、取代或非取代萘基等，烷氧基、烷酰基和烷酰氧基的烷基部分分别和上述的烷基意义相同，此外，烯氧基、烯酰基和烯酰氧基的烯基部分分别和上述的烯基意义相同。作为芳酰基，有苯甲酰基和萘甲酰基等。另外，作为取代氨基的取代基，有烷基、烯基等；作为取代苯基和取代萘基的取代基，有羟基、烷基、烯基等；这里的烷基、烯基分别和上述的烷基、烯基意义相同。
作为上述本发明式(Ⅱ)所示的表面活性剂，优选疏水基团为碳数2～24的烷基或烯基(也包括磷酸胆碱基团和该烷基或烯基之间有氧亚甲基、氧亚乙基、氧亚丙基的情况)、酰基链碳数4～24的1位或2位的单甘油酯、相同或不同的酰基链碳数4～24的二甘油酯、或具有神经鞘氨醇结构的表面活性剂，例如有溶血磷脂酰胆碱己酰基、溶血磷脂酰胆碱肉豆蔻酰基、溶血磷脂酰胆碱棕榈酰基、溶血磷脂酰胆碱硬脂酰基、大豆来源的溶血磷脂酰胆碱等溶血磷脂酰胆碱(溶血卵磷脂)、磷脂酰胆碱二丁酰基、磷脂酰胆碱二己酰基等短链酰基磷脂酰胆碱、磷酸胆碱油氧基乙基酯、神经鞘氨基磷酸胆碱等。
作为本发明的C-反应蛋白测定方法(B)和C-反应蛋白测定用试剂(B)中具有阳离子性基团的表面活性剂，可用任何具有除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团、且显示出表面活性的物质，优选铵盐表面活性剂，从充分避免前带现象方面考虑特别优选通式(Ⅲ)[式(Ⅲ)中Y2表示疏水基团，R1、R2、R3相同或不同、表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X2-表示无机阴离子或有机阴离子。]所示的表面活性剂。
作为通式(Ⅲ)中的疏水基团Y2，只要是相对于阳离子性基团的亲水性显示出疏水性的基团即可，没有特殊的限定，例如以烃为基本骨架的基团，有取代或非取代烷基、取代或非取代烯基；作为上述烷基，直链或支链，优选碳数1～30的烷基，更优选碳数2～24的烷基，特别优选碳数3～20的烷基，例如有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十五烷基、二十烷基等；此外，此外，作为烯基，是直链或支链，优选碳数2～24的烯基，更优选碳数3～12的烯基，特别优选碳数3～6的烯基，具体例子有乙烯基、烯丙基、2-丁烯基、2-戊烯基、2-己烯基等。此外，作为取代烷基和取代烯基的取代基，例如有烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烯氧基、烯酰基、烯酰氧基、芳酰基、羟基、取代或非取代氨基、取代或非取代苯基、取代或非取代萘基等，烷氧基、烷酰基和烷酰氧基的烷基部分分别和上述的烷基意义相同；此外，烯氧基、烯酰基和烯酰氧基的烯基部分分别和上述烯基意义相同。作为芳酰基，例如有苯甲酰基、萘甲酰基等。作为取代氨基的取代基，例如有烷基、烯基等；作为取代苯基、取代萘基的取代基，例如有羟基、烷基、烯基等；这里烷基、烯基分别和上述烷基、烯基的意义相同。
作为R1、R2和R3中的烷基，是直链或支链，优选碳数1～12的烷基，更优选碳数1～6的烷基，例如有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等；此外，作为R1、R2和R3中的烯基，是直链或支链，优选碳数2～12的烯基，更优选碳数3～6的烯基，例如有乙烯基、烯丙基、2-丁烯基、2-戊烯基、2-己烯基等。此外作为R1、R2和R3中取代烷基和取代烯基的取代基，例如有烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烯氧基、烯酰基、烯酰氧基、芳酰基、羟基、取代或非取代氨基、取代或非取代苯基、取代或非取代萘基等；烷氧基、烷酰基和烷酰氧基的烷基部分分别和上述R1、R2和R3的烷基意义相同；此外，烯氧基、烯酰基和烯酰氧基的烯基部分分别和上述R1、R2和R3的烯基意义相同。作为芳酰基，例如有苯甲酰基、萘甲酰基等。作为取代氨基的取代基，例如有烷基、烯基等；作为取代苯基、取代萘基的取代基，例如有羟基、烷基、烯基等；这里烷基、烯基分别和上述烷基、烯基的意义相同。
作为无机阴离子，例如有氟、氯、溴、碘等卤素，硝酸等无机酸阴离子。作为有机阴离子，有甲酸、乙酸等有机羧酸离子。
此外，作为上述具有阳离子性基团的表面活性剂，例如有氯化十八烷基三甲基铵、氯化十六烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵等长链烷基铵盐，十六烷基胺乙酸盐、十八烷基胺盐酸盐等长链烷基胺盐，烷基吡啶鎓盐等。
具有磷酸胆碱基团的表面活性剂和具有阳离子性基团的表面活性剂可以任意组合，为充分避免前带现象，优选使用疏水基团链长相近的具磷酸胆碱基团的表面活性剂和具阳离子性基团的表面活性剂。例如优选前者为酰基链碳数为16的溶血磷脂酰胆碱棕榈酸酯、后者为酰基链碳数为16的氯化十六烷基三甲基铵的组合；或者前者酰基链碳数为18的溶血磷脂酰胆碱硬脂酸酯、后者为酰基链碳数为18的氯化十八烷基三甲基铵的组合。
具有磷酸胆碱基团的表面活性剂和具有阳离子性基团的表面活性剂在C-反应蛋白测定反应液中所用的浓度分别为0.0001～5％重量，优选0.001～1％重量，更优选0.01～0.5％重量。此外，具有磷酸胆碱基团的表面活性剂和具有阳离子性基团的表面活性剂的摩尔比可为任意值，但优选1∶10～5∶10。
作为本发明中C-反应蛋白的抗体，可以是多克隆抗体、单克隆抗体的任一个，这些抗体可以是市售品或按公知的方法制备而成。此外，C-反应蛋白的抗体优选以水不溶性载体担载的方式使用。作为水不溶性载体，优选胶乳特别是聚苯乙烯类胶乳，其容易担载抗体。作为水不溶性载体的粒径，优选0.1～1微米。抗体在水不溶性载体上的担载(致敏)可按公知的结合方法进行。使用的抗体的浓度没有特殊限定，优选能够单独测定C-反应蛋白的浓度。
本发明的C-反应测定测定方法(A)是利用抗原抗体反应的测定方法，其特征在于使用具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体测定C-反应蛋白。此外，本发明的C-反应蛋白测定方法(B)是利用抗原抗体反应的测定方法，其特征在于使用具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体测定C-反应蛋白。作为这些利用抗原抗体反应的测定方法，例如有公知的免疫比浊法、胶乳免疫比浊法、明胶凝聚反应、脂质体免疫测定法、荧光免疫测定法、酶联免疫测定法等，为充分避免前带现象，优选胶乳免疫比浊法。作为胶乳，优选聚苯乙烯类，此外作为该胶乳的粒径，优选0.1～1微米。这些方法，加入所定量的抗体致敏胶乳悬浊液、所定量的缓冲液和一定量浓度已知的标准液或待测样品，充分搅拌后，用积分球式浊度计根据所定时间间隔的浊度变化测定浊度变化量(ΔIST)，用吸光度测定计测定所定时间间隔的吸光度变化量(ΔmAbs.值)。
本发明的C-反应蛋白测定用试剂(A)的特征在于含有具磷酸胆碱基团、阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体；此外，本发明的C-反应蛋白测定用试剂(B)的特征在于含有具磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体；除这些化合物和抗体外，还可含有各种表面活性剂、无机盐、缓冲液等。作为表面活性剂，例如有Triton X-100、Tween 20等；作为无机盐，例如有氯化钙等钙盐等；作为缓冲液，例如有甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液等。对于C-反应蛋白测定用试剂中的表面活性剂、无机盐和缓冲液的含量，它们在反应液中的浓度分别优选0.001～0.1％重量，特别优选1～7mmol/L、0.1～10mmol/L和10～200mmol/L。
如上所述，应用本发明C-反应蛋白测定方法和C-反应蛋白测定用试剂的C-反应蛋白测定是使用C-反应蛋白的抗体进行C-反应蛋白的测定，这些C-反应蛋白的测定方法和C-反应蛋白测定用试剂中，以抗原将抗体取代，即用C-反应蛋白抗原将C-反应蛋白的抗体取代，从而提供了C-反应蛋白的抗体的测定方法和C-反应蛋白的抗体测定用试剂。作为上述C-反应蛋白抗原，可以是C-反应蛋白自身或包括C-反应蛋白的磷酸胆碱结合区域和抗C-反应蛋白的抗原决定簇部分的肽。此外，所说的C-反应蛋白抗原，和C-反应蛋白的抗体一样，优选以粒径0.1～1微米的聚苯乙烯胶乳等载体担载使用。
因此，(a)使用具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白抗原的C-反应蛋白抗体的测定方法，含有具磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白抗原的C-反应蛋白抗体测定用试剂，或者(b)使用具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白抗原的C-反应蛋白抗体的测定方法、含有具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白抗原的C-反应蛋白的抗体测定用试剂，与本发明的C-反应蛋白测定方法和C-反应蛋白测定用试剂一样，能够在C-反应蛋白抗体的测定时避免前带现象，扩大测定范围，即使在样品中存在高浓度C-反应蛋白的抗体时，也能够不稀释样品而以原液直接进行测定。
调制下述的C-反应蛋白测定试剂。试剂1甘氨酸缓冲液、pH8.6(关东化学社制造) 100mmol/L氯化钙(关东化学社制造)5mmol/L试剂2抗C-反应蛋白抗体结合胶乳(参考例1调制)1g/L比较例A-2调制下述C-反应蛋白测定试剂。试剂1甘氨酸缓冲液、pH8.6(关东化学社制造) 100mmol/L氯化钙(关东化学社制造)5mmol/L参考例6(后述)制造的聚合物 20mg/L试剂2抗C-反应蛋白抗体结合胶乳(参考例1调制)1g/L比较例A-3试剂1甘氨酸缓冲液、pH8.6(关东化学社制造) 100mmol/L氯化钙(关东化学社制造)5mmol/L参考例7(后述)制造的聚合物 20mg/L试剂2抗C-反应蛋白抗体敏化胶乳(参考例1调制)1g/L比较例A-4调制下述的C-反应蛋白测定试剂。试剂1甘氨酸缓冲液、pH8.6(关东化学社制造) 100mmol/L氯化钙(关东化学社制造)5mmol/L
参考例4(后述)制造的聚合物20mg/L试剂2未结合抗C-反应蛋白抗体的胶乳〔参考例2(后述)调制〕1g/L
1g/L
如图1所示，使用比较例A-1的试剂测定时(-◆-图)、使用比较例A-2的试剂测定时(-■-图)和使用比较例A-3的试剂测定时(-▲-)，C-反应蛋白为10mg/dL以上的浓度就发生前带，不能达到避免前带的效果。与此相反，使用实施例A-1的试剂测定时(-●-)，至少到100mg/dL的浓度也能避免前带。还有，使用比较例A-2的试剂1中的聚合物为10mg/L～1g/L特定浓度的试剂、比较例A-3的试剂1中的聚合物为10mg/L～1g/L特定浓度的试剂，不能避免前带。此外，实施例A-1的试剂1中的聚合物为5mg/L的浓度就能避免前带。
如图2所示，使用比较例A-1的试剂测定时(-●-图)，C-反应蛋白为10mg/dL以上浓度就发生前带，ΔIST值减少。此外，使用只使用没有结合抗体胶乳的比较例A-4的试剂进行测定时，(-■-图)，未见△IST值增加。另一方面，使用实施例A-1的试剂测定时(-▲-图)，至少到100mg/dL的浓度也未见前带现象，ΔIST值浓度依赖性地增加，测定范围扩大。此结果表明，在本发明的测定方法中，具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的反应所致的浊度上升以及C-反应蛋白抗体和C-反应蛋白的反应所致的浊度上升的相加作用，不能避免前带现象；在和C-反应蛋白的反应中，具有磷酸胆碱基团和阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白抗体的协同作用可能能够避免前带现象。
如图3所示，使用比较例A-5的试剂测定时(-▲-图)，C-反应蛋白为20mg/dL以上的浓度就发生前带现象，ΔIST值减少。与此相反，使用实施例A-2的试剂测定时(-●-)，至少到100mg/dL的浓度也能避免前带，定量性大幅度上升。还有，使用实施例A-2的试剂1中的聚合物浓度为10mg/L的试剂也能达到相同效果。
在37℃下，分别将实施例A-3和比较例A-5的225微升试剂1、75微升试剂2和3微升C-反应蛋白标准血清混合后，测定19点和27点之间的吸光度变化量(波长570nm)。结果如图4所示。图4中横轴的CRP表示C-反应蛋白的浓度，纵轴的ΔmAbs.表示吸光度的变化量。如图4所示，使用比较例A-5的试剂测定时(-▲-)，C-反应蛋白为10mg/dL以上的浓度就发生前带，测定值减少。与此相反，使用实施例A-3的试剂测定时(-●-)，至少到100mg/dL的浓度也能避免前带，定量性大幅度上升。
1g/L比较例B-1调制下述C-反应蛋白测定试剂。试剂1甘氨酸缓冲液(关东化学社制造) 100mmol/L氯化钙(关东化学社制造) 5mmol/L试剂2抗C-反应蛋白抗体结合胶乳(参考例1调制)1g/L比较例B-2调制下述C-反应蛋白测定试剂。试剂1甘氨酸缓冲液(关东化学社制造) 100mmol/L氯化钙(关东化学社制造) 5mmol/L氯化十六烷基三甲基铵(Cation PB-40，日本油脂公司制造) 0.5g/L试剂2抗C-反应蛋白抗体结合胶乳(参考例1调制)1g/L比较例B-3调制下述C-反应蛋白测定试剂。试剂1甘氨酸缓冲液(关东化学社制造) 100mmol/L氯化钙(关东化学社制造) 5mmol/L溶血卵磷脂(Sigma公司制造) 0.2g/L试剂2抗C-反应蛋白抗体结合胶乳(参考例1调制)1g/L比较例B-4
调制下述C-反应蛋白测定试剂。试剂1甘氨酸缓冲液(关东化学社制造) 100mmol/L氯化钙(关东化学社制造) mmol/L氯化十六烷基三甲基铵(Cation PB-40，日本油脂公司制造) 0.5g/L溶血卵磷脂(Sigma公司制造) 0.1g/L试剂2未结合抗C-反应蛋白抗体的胶乳(参考例2调制)1g/L
结果如图6所示。图6中横轴的CRP表示C-反应蛋白的浓度，纵轴的ΔIST表示积分球式浊度的变化量。使用比较例B-1的试剂测定时(-×-)，C-反应蛋白为10mg/dL以上的浓度就发生前带。此外，使用比较例B-2的试剂测定时(-■-)，可见避免前带的倾向，但未见测定范围的改善。使用比较例B-3的试剂测定时(-▲-)，未见避免前带的效果。使用比较例B-4的试剂测定时(-○-)，完全不能检出。与此相反，使用实施例B-1的试剂测定时(-◆-)，测定范围大幅度改善。使用实施例B-2的试剂测定时(-●-)，至少到100mg/dL的浓度也能避免前带，定量性大幅度上升。
结果如图7所示。图7中横轴的CRP表示C-反应蛋白的浓度，纵轴的ΔmAbs.(570nm)表示吸光度的变化量。使用比较例B-5的试剂测定时(-▲-)，C-反应蛋白为5mg/dL以上的浓度就发生前带，吸光度变化量下降。与此相反，使用实施例B-3的试剂测定时(-●-)，至少到100mg/dL的浓度吸光度变化量也不下降，避免了前带，定量性大幅度上升。
结果如图8所示。图8中横轴的CRP表示C-反应蛋白的浓度，纵轴的ΔmAbs.表示吸光度的变化量。使用比较例B-1的试剂测定时(-◆-)，C-反应蛋白为10mg/dL以上的浓度就发生前带，吸光度变化量下降。与此相反，使用实施例B-2的试剂测定时(-■-)、使用实施例B-4的试剂测定时(-▲-)和使用实施例B-5的试剂测定时(-×-)，至少到100mg/dL的浓度吸光度变化量也不下降，避免了前带，定量性大幅度上升。参考例1(CRP测定用胶乳试剂的调制)将0.8毫升平均粒径130nm的聚苯乙烯胶乳溶液(协和梅迪克斯公司制造，100mg/mL)和1毫升山羊抗C-反应蛋白多克隆抗体溶液(东方酵母公司(Oriental Yeast)制造、10mg/mL、50mM磷酸-氯化钠150mM,pH7.2)混合，在37℃下搅拌30分钟。接着，加入1毫升(20mg/mL、50mM磷酸-氯化钠150mM,pH7.2)牛血清白蛋白(BSA、Sigma公司制造)，在37℃下搅拌2小时，进行封闭处理。然后离心分离(50000转、30分钟)使胶乳以片状沉淀，废弃上清后，加入10毫升含3毫克/毫升BSA的50mM咪唑-盐酸溶液(pH7.8)，充分搅拌后，用超声波粉碎机进行分散处理。上述操作重复3次，以除去过剩存在的抗体溶液。最后调节胶乳浓度至1毫克/毫升，作为C-反应蛋白测定用胶乳试剂。此试剂在4℃下保存。参考例2除不使用山羊抗C-反应蛋白多克隆抗体外，其它参照参考例1相同的方法，调制不含抗C-反应蛋白抗体的对照试剂。参考例3除使用0.8毫升平均粒径220nm的聚苯乙烯胶乳溶液(协和梅迪克斯公司制造，100mg/mL)外，其它按参考例1相同方法，调制C-反应蛋白测定用胶乳试剂。最终浓度和参考例1一样调节至1毫克/毫升，保存于4℃。参考例4使用37.2克2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(日本油脂公司制造)、12.8克氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵(日本油脂公司制造)、0.3克聚合引发剂2，2’-偶氮双(2-甲基丙酰脒)二盐酸盐(和光纯药工业公司制造“V-50”)和150克作为聚合介质的水，在70℃下加热4小时，进行聚合反应。聚合反应结束后，将反应液缓慢滴入1.5升丙酮中，沉淀聚合物。滤取沉淀物，干燥后，加入蒸馏水溶解使浓度为5.0％重量。关于分子量，将聚合体的磷酸缓冲液用凝胶渗透层析(GPC)分析的结果换算成聚乙二醇，得出重均分子量为37000。本化合物以7∶3的摩尔比含有磷酸胆碱基团和阳离子基团。参考例5使用45.9克2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(日本油脂公司制造)、4.1克氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵(日本油脂公司制造)、0.3克聚合引发剂2,2’-偶氮双(2-甲基丙酰脒)二盐酸盐(和光纯药工业公司制造“V-50”)和150克作为聚合介质的水，在70℃下加热4小时，进行聚合反应。聚合反应结束后，将反应液缓慢滴入1.5升丙酮中，沉淀聚合物。滤取沉淀物，干燥后，加入蒸馏水溶解使浓度为5.0％重量。关于分子量，将聚合体的磷酸缓冲液用凝胶渗透层析(GPC)分析的结果换算成聚乙二醇，得出重均分子量为33000。本化合物以9∶1的摩尔比含有磷酸胆碱基团和阳离子基团。参考例6使用50.0克2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(日本油脂公司制造)、0.24克聚合引发剂偶氮二异丁腈和光纯药工业公司制造“AIBN”)和100克作为聚合介质的乙醇，在70℃下加热4小时，进行聚合反应。聚合反应结束后，将反应液缓慢滴入1.5升丙酮中，沉淀聚合物。滤取沉淀物，干燥后，加入蒸馏水溶解使浓度为5.0％重量。关于分子量，将聚合体的磷酸缓冲液用凝胶渗透层析(GPC)分析的结果换算成聚乙二醇，得出重均分子量为108000。参考例7
使用35.7克2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(日本油脂公司制造)、4.3克甲基丙烯酸丁酯(和光纯药工业公司制造)、0.82克聚合引发剂偶氮二异丁腈(和光纯药工业公司制造“AIBN”)和160克作为聚合介质的乙醇，在70℃下加热4小时，进行聚合反应。聚合反应结束后，将反应液缓慢滴入1.5升丙酮中，沉淀聚合物。滤取沉淀物，干燥后，加入蒸馏水溶解使浓度为5.0％重量。关于分子量，将聚合体的磷酸缓冲液用凝胶渗透层析(GPC)分析的结果换算成聚乙二醇，得出重均分子量为87000。本化合物以8∶2的摩尔比含有磷酸胆碱基团和丁基基团。参考例8使用74.3克2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(日本油脂公司制造)、25.7克氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵(日本油脂公司制造)、0.45克聚合引发剂2,2’-偶氮双(2-甲基丙酰脒)二盐酸盐(和光纯药工业公司制造“V-50”)和900克作为聚合介质的水，在60℃下加热4小时，进行聚合反应。聚合反应结束后，将反应液缓慢滴入1.5升丙酮中，沉淀聚合物。滤取沉淀物，干燥后，加入蒸馏水溶解使浓度为5.0％重量。关于分子量，将聚合体的磷酸缓冲液用凝胶渗透层析(GPC)分析的结果换算成聚乙二醇，得出重量平均分子量为13000。本化合物以7∶3的摩尔比含有磷酸胆碱基团和阳离子基团。接着，用离心过滤管(临界分子量10000、Millipore公司制造)进行离心分离(3000×g、30分钟)，回收滤液得到分子量10000以下的成分。
使用本发明的C-反应蛋白用试剂，在C-反应蛋白测定时能够避免前带现象，扩大测定范围。这样，即使在样品中含有高浓度的C-反应蛋白时，仍然可以不稀释样品而直接定量原液。
权利要求
1．一种C-反应蛋白的测定方法，其特征在于使用含有磷酸胆碱基团、除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体、或使用具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体来测定C-反应蛋白。
2．根据权利要求1记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物中的阳离子性基团为通式(Ⅰ)所示的基团 式(Ⅰ)中R1、R2和R3相同或不同，表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X1-表示无机阴离子或有机阴离子。
3．根据权利要求1或2记载的C-反应蛋白的测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱外的阴离子基团为具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体结合的共聚物。
4．根据权利要求3记载的C-反应蛋白的测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体分别为具有磷酸胆碱基和乙烯基的单体、以及具有阳离子性基团和乙烯基的单体。
5．根据权利要求4记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体和具有阳离子性基团和乙烯基的单体分别为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱和氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵。
6．根据权利要求1记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有具有磷酸胆碱基团的表面活性剂为通式(Ⅱ)所示的化合物 式(Ⅱ)中Y1表示疏水性基团。
7．根据权利要求6记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于式(Ⅱ)所示的化合物是从溶血磷脂酰胆碱己酸酯、溶血磷脂酰胆碱肉豆蔻酸酯、溶血磷脂酰胆碱棕榈酸酯、溶血磷脂酰胆碱硬脂酸酯、大豆来源的溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱二丁酸酯、磷脂酰胆碱二己酸酯、磷酸胆碱油氧基乙酯、神经鞘氨基磷酸胆碱中选出的1种或2种以上的化合物。
8．根据权利要求1、6和7任一项记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于具有阳离子性基团的表面活性剂为铵盐的表面活性剂。
9．根据权利要求8记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于铵盐表面活性剂为通式(Ⅲ)所示的化合物 式(Ⅲ)中Y2表示疏水性基团、R1、R2、R3相同或不同、表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X2-表示无机阴离子或有机阴离子。
10．根据权利要求9记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于式(Ⅲ)所示的化合物为从氯化十八烷基三甲基铵、氯化十六烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵等中选出的1种或2种以上的化合物。
11．根据权利要求1～10任一项记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于C-反应蛋白的抗体为水不溶性载体担载的。
12．根据权利要求11记载的C-反应蛋白测定方法，其特征在于不溶性载体为聚苯乙烯类胶乳。
13．一种C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于含有具磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物和C-反应蛋白的抗体、或者含有具有磷酸胆碱基团的表面活性剂、具有除磷酸胆碱基团外的阳离子基团的表面活性剂和C-反应蛋白的抗体。
14．根据权利要求13记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物中的阳离子性基团为通式(Ⅰ)所示的基团 式(Ⅰ)中R1、R2和R3相同或不同，表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X1-表示无机阴离子或有机阴离子。
15．根据权利要求13或14记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团和除磷酸胆碱基团外的阳离子性基团的化合物为具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体结合而成的共聚物。
16．根据权利要求15记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团的单体和具有阳离子性基团的单体分别为具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体和具有阳离子性基团和乙烯基的单体。
17．根据权利要求16记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团和乙烯基的单体和具有阳离子性基团和乙烯基的单体分别为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱和氯化2-羟基-3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲基铵。
18．根据权利要求13记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有磷酸胆碱基团的表面活性剂为通式(Ⅱ)所示的化合物 式(Ⅱ)中Y1表示疏水基团。
19．根据权利要求18记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于式(Ⅱ)的化合物为从溶血磷脂酰胆碱己酸酯、溶血磷脂酰胆碱肉豆蔻酸酯、溶血磷脂酰胆碱棕榈酸酯、溶血磷脂酰胆碱硬脂酸酯、大豆来源的溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱二丁酸酯、磷脂酰胆碱二己酸酯、磷酸胆碱油氧基乙酯、神经鞘氨基磷酸胆碱中选出的1种或2种以上的化合物。
20．根据权利要求13、18和19任一项记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于具有阳离子性基团的表面活性剂为铵盐表面活性剂。
21．根据权利要求20记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于铵盐的表面活性剂为通式(Ⅲ)所示的化合物 式(Ⅲ)中Y2表示疏水基团，R1、R2、R3相同或不同，表示氢、取代或非取代烷基、取代或非取代烯基，X2-表示无机阴离子或有机阴离子。
22．根据权利要求21记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于式(Ⅲ)所示的化合物为从氯化十八基烷三甲基铵、氯化十六烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵等中选出的1种或2种以上的化合物。
23．根据权利要求13～22任一项记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于C-反应蛋白的抗体为水不溶性载体担载的。
24．根据权利要求23记载的C-反应蛋白测定用试剂，其特征在于不溶性载体为聚苯乙烯类胶乳。
全文摘要
避免前带现象、无需稀释即可测定含高浓度C－反应蛋白样品的方法和其所用的试剂。使用具有磷酸胆碱基团、通式(Ⅰ)[R
文档编号C07K14/435GK1311438SQ0110831
公开日2001年9月5日 申请日期2001年2月27日 优先权日2000年2月29日
发明者横滨裕明, 梅原晴美, 松森繁, 山田智, 首藤健志郎, 榊秀次郎, 铃木宪 申请人:协和梅迪克斯株式会社