专利名称：肝癌转移相关因子HAb18G及其反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与肝癌转移相关的生物分子及用生物技术生产的抗肝癌反义核酸药物。
原发性肝癌是我国发病率较高的恶性肿瘤之一，由于其病变迅速，若不经治疗，大部分患者都会在确诊后3-4个月内死亡，故被称为“癌中之王”，它最大的特点是高转移、高复发。恶性肿瘤的转移虽然极其复杂，但在其侵袭、转移演进过程中，癌细胞必须首先具备降解细胞外结缔组织、间质和血管基底膜这些天然屏障的能力，这依赖于蛋白水解酶的作用。蛋白水解酶主要包括四类即丝氨酸蛋白酶(如纤溶酶原激活物PAS)，半胱氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶B)以及天门冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶)和基质金属蛋白酶(MMPs)。其中MMPs最为重要，大量研究表明，恶性肿瘤组织中MMPs的含量及活性显著高于周围正常组织，且与肿瘤的恶性程度呈正相关(Davies B,Miles DW,et al.，《英国癌症杂志》，1993；67:1126-1131)。因此，减少MMPs的含量从而抑制肝癌的侵袭能力，是肿瘤基因治疗的一种方法。
本发明的目的是在克隆肝癌转移相关因子HAb18G基础上，提供一种能封闭HAb18G蛋白表达的反义RNA表达质粒载体PCI-asHAb18G。
本发明技术方案是1．肝癌转移相关因子HAb18G的克隆用人新鲜肝癌组织免疫小鼠而得到鼠源性肝癌特异性单抗HAb18(陈志南，《单克隆抗体》1990；8(1):11)，用此单抗从人肝癌组织cDNA文库中筛选得到其相应抗原分子，由于我们是用抗体HAb18得到该蛋白分子，故将其命名为HAb18G，查询Gene Bank发现其基因序列与白细胞分化抗原CD147分子核苷酸序列一致，为CD147分子家族的一员，HAb18G由269个氨基酸组成，其N端为信号肽序列，富含疏水残基，其后为胞膜外功能域，在第206-209由24个氨基酸组成穿膜区，由羧基端的39个氨基酸组成胞浆内结构域。类似的分子在类风湿性关节炎及反应性关节炎患者外周血粒细胞表面(Watcharak,Eddafiebiger,StepanovaI《免疫学杂志》1992(3):847)肺癌(Guo H,Zucker S,et al.《生物化学杂志》,1997；272(1):24)脑(Schlos shauer B,Herzog K.H.《细胞生物学杂志》1990；110(4):1261)等组织中均有发现，其功能各不相同，而在肝癌组织中尚无报道，其功能更不为人所知。该分子存在大量翻译后修饰，在不同的种属，不同的器官呈现出不同的糖基化方式，因此，在肝癌组织中发现的HAb18G分子，尽管一级结构与CD147分子一致，但其糖基化方式可能与其它组织类似分子不同，因而功能也可能有所差异。研究其功能，发现其与肝癌的转移成正相关，其作用途径为诱导肝癌细胞周围成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶MMPs，MMPs可以降解肝癌细胞周围的间质成分因而可以促进肝癌细胞的转移。因此有理由相信，在研究该蛋白分子功能的基础上，设计抑制其功能的抑制剂，有望降低肝癌的转移与侵袭从而利于疾病的康复。
2．HAb18G的功能研究HAb18G分子的主要功能是刺激人成纤维细胞产生MMPs。我们用提纯的HAb18G抗原刺激人成纤维细胞，证实了上述结论，具体方法如下将纯化的HAb18G样品进行SDS-PAGE电泳，其中与常规蛋白电泳不同之处在于此分离胶中含1.0mg/ml的明胶，浓缩胶浓度为5％，样品不经煮沸，样品缓冲液中不含DTT(二硫代苏糖醇)。电泳结束后将凝胶置于洗脱液中室温洗脱2次，45’/次，再用0.1M NaCl漂洗2次，20’/次，然后将凝胶置于孵育液中，37℃孵育24h以上。考马斯亮蓝染色后经脱色液脱色，使凝胶的蓝色背景上出现MMPs酶解透明条带为最佳反差效果。酶谱法显示人成纤维细胞受纯化的HAb18G刺激后，其分泌MMPs含量和种类均有明显差异，即在蓝色胶上可见三条不同分子量的白色酶解条带。分别为92KD的Ⅳ型胶原酶酶原MMP-9,72KD的Ⅳ型胶原酶酶原MMP-2和MMP-2的激活物，43KD的Ⅰ型膜型基质金属蛋白酶MT1-MMP。
从其功能试验可以得知，HAb18G主要是通过刺激人成纤维细胞产生几种MMPs，再由MMPs的酶解作用下使肝癌细胞转移和侵袭能力提高。正是在了解到其功能之后，我们试图找到一些可以减少其表达量的办法，因而可以对肝癌实施基因治疗，反义核酸是显而易见的办法。
3．HAb18G蛋白的反义RNA质粒载体的构建用XbaⅠ、XhoⅠ双酶切原核扩增质粒载体，PBlue scriptks(+/-)HAb18G(本发明人构建含HAb18G cDNA全长)得到HAb18G cDNA全长，将其连接在用XhoⅠ、XbaⅠ双酶切的真核表达载体PCI-neo(购自promega公司)上，由于酶切顺序相反，HAb18G cDNA被反接到PCI-neo载体上，从而能转录出与HAb18G mRNA互补的反义RNA，阻断mRNA的蛋白翻译过程，封闭HAb18G分子的表达。
4．HAb18G反义RNA质粒载体PCI-asHAb18G的功能a．转染肝癌细胞前后HAb18G表达的比较。
用HAb18G反义核酸PCI-asHAb18G转染高表达HAb18G肝癌细胞系HHCC，经筛选建株后，转染细胞的免疫组化染色强度明显降低，流式细胞仪证实其膜表面荧光强度减弱。这些变化主要是由于反义RNA封闭了HAb18G的表达，封闭效率高达95％。
b.MMPs抑制实验用反义RNA封闭的HHCC(人肝癌细胞)与人成纤维细胞共培养，收集培养物上清做SDS-PAGE凝胶酶谱电泳，实验证明，经反义RNA封闭的HHCC刺激人成纤维细胞分泌MMPs的能力大为减弱。主要反映在MMPs的量减少。
c．细胞基底膜侵袭实验方法为在24孔板中放入细胞培养小室，小室底端用带有8um小孔的多孔滤膜封闭。将Matrigel(主要成分为Ⅳ型胶原)加在滤膜上，形成胶膜，将HHCC和成纤维细胞加入小室中，培养过夜。擦去膜上细胞，将膜固定、染色、计数穿到膜下面的细胞数。实验表明，由于反义RNA封闭的HHCC刺激人成纤维细胞分泌MMPs的能力大为减弱，在MMPs分泌量减少的情况下，肝癌细胞降解胶原的能力下降，从而穿膜能力降低，穿膜细胞数目减少。转染此载体的肝癌细胞与未转染的细胞相比侵袭力大为下降(P＜0.01)综上所述本发明首先从肝癌组织中发现了HAb18G分子的基础上，用反义核酸的手段从分子水平封闭HAb18G的表达，从而减少MMPs的产生，可以抑制肝癌细胞的侵袭能力，改变肿瘤细胞的生物学行为，抑制了肝癌细胞的转移，该产品在基因治疗肿瘤方面具有一定的作用。
权利要求
1.一种肝癌转移相关因子HAb18G，其特征是用人新鲜肝癌组织免疫小鼠而得到鼠源性肝癌特异性单抗HAb18，用此单抗从人肝癌组织cDNA文库中筛选得到其相应抗原分子HAb18G，其基因序列与白细胞分化抗原CD147分子核苷酸序列一致，为CD147分子家族的一员，HAb18G由269个氨基酸组成，其N端为信号肽序列，富含疏水残基，其后为胞膜外功能域，在第206-209由24个氨基酸组成穿膜区，由羧基端的39个氨基酸组成胞浆内结构域。
2.一种肝癌相关因子HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI-asHAb18G，其特征是将HAb18GcDNA全长序列反接到真核表达载体PCI-neo，构建成能转录HAb18G反义RNA，从而封闭HAb18G表达的质粒载体。
全文摘要
本发明涉及一种肝癌转移相关因子HAb18G及其反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G。本发明用肝癌特异性单抗HAb18从人肝癌组织cDNA文库中筛选得到相应的抗原HAb18G,并制备了其反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G,从分子水平封闭HAb18G的表达,从而减少MMPs的产生,可以抑制肝癌细胞的侵袭能力,改变肿瘤细胞的生物学行为,抑制了肝癌细胞的转移,该产品在基因治疗肿瘤方面具有一定的作用。
文档编号C07K14/435GK1325907SQ0111527
公开日2001年12月12日 申请日期2001年5月25日 优先权日2001年5月25日
发明者陈志南, 李郁, 邢金良 申请人:陈志南