具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列的制作方法

专利名称：具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸和此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术：
人基因组学研究目前是国际上的热点，除人染色体DNA大规模测序，表达序列测序(EST)的方法外，还缺少从功能开始的筛选具有功能基因的高通量的方法。
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤，目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此，本领域迫切需要开发研究具有抑癌功能的人蛋白及其激动剂/抑制剂。

发明内容
本发明的目的是提供一类新的具有抑癌功能的人蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的具有抑癌功能的蛋白多肽，它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性(a)编码上述的具有抑癌功能的蛋白多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组SEQ ID NO3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36的编码区序列或全长序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有抑癌功能的蛋白活性的多肽的制备方法，该方法包含(a)在适合表达具有抑癌功能的蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有抑癌功能的蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的具有抑癌功能的蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续10个核苷酸至全长核苷酸，较佳地它含有连续的约10-800个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的具有抑癌功能的蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施例方式
本发明采用大规模cDNA克隆转染癌细胞，在获得具有抑癌作用的基础上，经测序证明为新的基因，进一步得到全长cDNA克隆。DNA转染试验证明，本发明的具有抑癌功能的蛋白对癌细胞(肝癌细胞)具有抑制克隆形成的作用，其抑制率在50％或50％以上。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的具有抑癌功能的蛋白或多肽”是指具有抑癌功能的蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化具有抑癌功能的蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有抑癌功能的人蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然具有抑癌功能的人蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。以PP2030蛋白(在本申请中，蛋白质的命名采用其克隆编号)为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ IDNO3所示的编码区序列有差别的核酸序列。再以PP2243蛋白(在本申请中，蛋白质的命名采用其克隆编号)为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO6所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO5的蛋白质，但与SEQ ID NO6所示的编码区序列有差别的核酸序列。对于本发明的其他具有抑癌功能的蛋白，可依此类推。
编码成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能(以PP2030蛋白为例)和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。
编码具有抑癌功能的蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时，DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时，DNA序列的直接化学合成是不可能的，选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定具有抑癌功能的蛋白的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2kb之内，较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测具有抑癌功能的蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或具有抑癌功能的蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的具有抑癌功能的蛋白多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，具有抑癌功能的人蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含具有抑癌功能的人蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的具有抑癌功能的人蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗具有抑癌功能的蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如癌症)，和用于筛选促进或对抗具有抑癌功能的蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制具有抑癌功能的人蛋白的功能。用表达的重组具有抑癌功能的人蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激具有抑癌功能的人蛋白功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)具有抑癌功能的人蛋白的药剂的方法。激动剂提高具有抑癌功能的人蛋白刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达具有抑癌功能的人蛋白的膜制剂与标记的具有抑癌功能的人蛋白一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。所述的拮抗剂可以与具有抑癌功能的人蛋白结合并消除其功能，或是抑制具有抑癌功能的人蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将本发明蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响具有抑癌功能的蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。
本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。具有抑癌功能的蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的具有抑癌功能的蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
具有抑癌功能的人蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于具有抑癌功能的蛋白的无表达或异常/无活性的具有抑癌功能的蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体可用于治疗具有抑癌功能的蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将具有抑癌功能的蛋白基因转移至细胞内。构建携带具有抑癌功能的蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，etal.)。另外重组具有抑癌功能的人蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制具有抑癌功能的人蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析。
本发明还提供了针对具有抑癌功能的人蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。这些抗体可用常规方法制备。抗具有抑癌功能的人蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的具有抑癌功能的人蛋白。
与具有抑癌功能的人蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。本发明中的抗体可用于治疗或预防与具有抑癌功能的人蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断具有抑癌功能的人蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如具有抑癌功能的人蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。
多克隆抗体的生产可用具有抑癌功能的人蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
具有抑癌功能的人蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.PatNo.4946778)也可用于生产抗具有抑癌功能的人蛋白的单链抗体。
能与本发明蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对具有抑癌功能的人蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测具有抑癌功能的人蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的具有抑癌功能的人蛋白水平，可以用作解释具有抑癌功能的人蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断具有抑癌功能的蛋白起作用的疾病。
具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用于具有抑癌功能的蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用于检测具有抑癌功能的蛋白的表达与否或在疾病状态下具有抑癌功能的蛋白的异常表达。如具有抑癌功能的蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断具有抑癌功能的蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用具有抑癌功能的蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测具有抑癌功能的蛋白的转录产物。
检测具有抑癌功能的蛋白基因的突变也可用于诊断具有抑癌功能的蛋白相关的疾病。具有抑癌功能的蛋白突变的形式包括与正常野生型具有抑癌功能的蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。这些序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。然而现在只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。为了将这些序列与疾病相关基因相关联。第一步就是将本发明DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomesa Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。
本发明的具有抑癌功能的蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
此外，由于本发明的具有抑癌功能的蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1cDNA基因的获得及对癌细胞克隆形成的抑制作用PP2030、PP2243、PP6569、PP7080、PP7302、PP7759、PP8304、PP8675、PP9455、PP9748、PP9932和PP10141是通过用常规方法构建人胎盘cDNA文库获得的。取3、6、9月龄的胎盘组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文库构建试剂盒(Stratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL)，反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受细胞，获得了1×106cfu/μg cDNA滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆，其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针，杂交筛选cDNA文库，挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒，按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染肝癌细胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后，加6μl H2O溶解，待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液，混匀后，室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液，均分加入3孔生长于96孔板的7721细胞中，37℃放置2小时，每孔再加50μl无血清培液，37℃24小时。每孔换100μl全培液，37℃24小时，换含G418的全培液100μl，37℃24-48小时，边观察，边换G418浓度不等的培液。约2-3次后，直到镜检细胞有克隆形成，计数。发现上述克隆有抑制癌细胞克隆形成作用，结果如下表所示。
cDNA克隆转染细胞(7721)克隆形成情况

对cDNA克隆采用双脱氧终止法，在ABI377 DNA自动测序仪上测定其一端近500bp的核苷酸序列。分析后，确定为新基因克隆，进行另一端测序，仍未获得全长cDNA序列，设计引物，再次进行测序，直到获得全长序列(SEQ ID NO1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34)。
实施例2从胎盘cDNA中PCR获得全长基因和重组蛋白表达取3、6、9月龄的人胎盘组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-SuperscriptII(GIBCO BRL)，反转录酶在42℃进行反转录反应，获得胎盘cDNA。利用各个基因的特异引物(如下表所示)，按97℃3′1个循环。94℃30″60℃30″72℃1′35个循环，72℃10′1个循环进行PCR扩增，获得含有完整开放阅读框序列的各蛋白基因的扩增产物。扩增产物经测序验证，与实施例1测得的序列相符，随后用常规技术将扩增产物转入宿主细胞，获得重组蛋白(SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35)。
基因特异引物


实施例3cDNA克隆序列分析1.PP2030A核苷酸序列(SEQ ID NO1)长度2144个碱基1 GCAACATGGC GGCTGCCGTG GTGCAGCGCC CGGGCTGAGC GACAGCAAGT GCAGCGGGCT61 CCTACCCCGG GTGAGGGGTG GCCTCCGCGT TGGATCGTGC CCTCTTCAGC CCGCTCCTGT121 CCCCGACATC ACGTGTATTC CGCACGTCCC CTCCGCGCTG TGTGTCTACT GAGACGGGGA181 GGCGTGACAG GGCCCGGGTC CCTTCTCAGT GGTGCTCTGT GCTTCAGGGC AAGCTCCCCG241 TCTCCGGGCG CACTTCCCTC GCCTGTGTTC GGTCCATCCT CCTTTCTCCA GCCTCCTCCC301 CTCGCAGGCG GATGACCCGG ACGACGGGCC AGTGCCTGGC ACCCCGGGGT TGCCAGGGTC361 CACGGGGAAC CCGAAGTCCG AGGAGCCCGA GGTCCCGGAC CAGGAGGGGC TGCAGCGCAT421 CACCGGCCTG TCTCCCGGCC GTTCGGCTCT CATAGTGGCG GTGCTGTGCT ACATCAATCT481 CCTGAACTAC ATGGACCGCT TCACCGTGGC TGGCGTCCTT CCCGACATCG AGCAAGTTCT541 TCAACATCGG GGACAGTAGC TCTGGGCTCA TCCAGACCGT GTTCATCTCC AGTTACATGG601 TGTTGGCACC TGTGTTTGGC TACCTGGGTG ACAGGTACAA TCGGAAGTAT CTCATGTGCG661 GGGGCATTGC CTTCTGGTCC CTGGTGACAC TGGGGTCATC CTTCATCCCC GGAGAGCATT721 TCTGGCTGCT CCTCCTGACC CGGGGCCTGG TGGGGGTCGG GGAGGCCAGT TATTCCACCA781 TCGCGCCCAC TCTCATTGCC GACCTCTTTG TGGCCGACCA GCGGAGCCGG ATGCTCAGCA841 TCTTCTACTT TGCCATTCCG GTGGGCAGTG GTCTGGGCTA CATTGCAGGC TCCAAAGTGA901 AGGATATGGC TGGAGACTGG CACTGGGCTC TGAGGGTGAC ACCGGGTCTA GGAGTGGTGG961 CCGTTCTGCT GCTGTTCCTG GTAGTGCGGG AGCCGCCAAG GGGAGCCGTG GAGCGCCACT1021 CAGATTTGCC ACCCCTGAAC CCCACCTCGT GGTGGGCAGA TCTGAGGGCT CTGGCAAGAA1081 ATCCTAGTTT CGTCCTGTCT TCCCTGGGCT TCACTGCTGT GGCCTTTGTC ACGGGCTCCC1141 TGGCTCTGTG GGCTCCGGCA TTCCTGCTGC GTTCCCGCGT GGTCCTTGGG GAGACCCCAC1201 CCTGCCTTCC CGGAGACTCC TGCTCTTCCT CTGACAGTCT CATCTTTGGA CTCATCACCT1261 GCCTGACCGG AGTCCTGGGT GTGGGCCTGG GTGTGGAGAT CAGCCGCCGG CTCCGCCACT1321 CCAACCCCCG GGCTGATCCC CTGGTCTGTG CCACTGGCCT CCTGGGCTCT GCACCCTTCC1381 TCTTCCTGTC CCTTGCCTGC GCCCGTGGTA GCATCGTGGC CACTTATATT TTCATCTTCA1441 TTGGAGAGAC CCTCCTGTCC ATGAACTGGG CCATCGTGGC CGACATTCTG CTGTACGTGG1501 TGATCCCTAC CCGACGCTCC ACCGCCGAGG CCTTCCAGAT CGTGCTGTCC CACCTGCTGG1561 GTGATGCTGG GAGCCCCTAC CTCATTGGCC TGATCTCTGA CCGCCTGCGC CGGAACTGGC1621 CCCCCTCCTT CTTGTCCGAG TTCCGGGCTC TGCAGTTCTC GCTCATGCTC TGCGCGTTTG1681 TTGGGGCACT GGGCGGCGCA GCCTTCCTGG GCACCGCCAT CTTCATTGAG GCCGACCGCC1741 GGCGGGCACA GCTGCACGTG CAGGGCCTGC TGCACGAAGC AGGGTCCACA GACGACCGGA
1801 TTGTGGTGCC CCAGCGGGGC CGCTCCACCC GCGTGCCCGT GGCCAGTGTG CTCATTTGAG1861 AGGCTGCCGC TCACCTACCT GCACATTTGC CACAGCTGGC CCTGGGCCCA CCCCACGAAG1921 GGCCTGGGCC TAACCCCTTG GCCTGGCCCA GCTTCCAGAG GACCCTGGGC CGTGTGCCAG1981 CTCCCAGACA CTACATGGGT AGCTCAGGGG AGGAGGTGGG GGTCCAGGAG GGGGATCCCT2041 CTCCACAGGG GCAGCCCCAA GGGCTCGGTG CTATTTGTAA CGGAATAAAA TTTGTAGCCA2101 GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAB核苷酸序列(SEQ ID NO2)长度420个氨基酸1 MVLAPVFGYL GDRYNRKYLM CGGIAFWSLV TLGSSFIPGE HFWLLLLTRG LVGVGEASYS61 TIAPTLIADL FVADQRSRML SIFYFAIPVG SGLGYIAGSK VKDMAGDWHW ALRVTPGLGV121 VAVLLLFLVV REPPRGAVER HSDLPPLNPT SWWADLRALA RNPSFVLSSL GFTAVAFVTG181 SLALWAPAFL LRSRVVLGET PPCLPGDSCS SSDSLIFGLI TCLTGVLGVG LGVEISRRLR241 HSNPRADPLV CATGLLGSAP FLFLSLACAR GSIVATYIFI FIGETLLSMN WAIVADILLY301 VVIPTRRSTA EAFQIVLSHL LGDAGSPYLI GLISDRLRRN WPPSFLSEFR ALQFSLMLCA361 FVGALGGAAF LGTAIFIEAD RRRAQLHVQG LLHEAGSTDD RIVVPQRGRS TRVPVASVLIC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO3) 克隆号PP2030起始编码子 597 ATG 终止编码子1857 TGA 蛋白质分子量 45299.37(注(1)给出的是起始和终止编码子第一个核苷酸的位置，(2)分子量单位是道尔顿)1 GC AAC ATG GCG GCT GCC GTG GTG CAG CGC CCG GGC TGA GCG ACA GCA 4748 AGT GCA GCG GGC TCC TAC CCC GGG TGA GGG GTG GCC TCC GCG TTG GAT 9596 CGT GCC CTC TTC AGC CCG CTC CTG TCC CCG ACA TCA CGT GTA TTC CGC143144 ACG TCC CCT CCG CGC TGT GTG TCT ACT GAG ACG GGG AGG CGT GAC AGG191192 GCC CGG GTC CCT TCT CAG TGG TGC TCT GTG CTT CAG GGC AAG CTC CCC239240 GTC TCC GGG CGC ACT TCC CTC GCC TGT GTT CGG TCC ATC CTC CTT TCT287288 CCA GCC TCC TCC CCT CGC AGG CGG ATG ACC CGG ACG ACG GGC CAG TGC335336 CTG GCA CCC CGG GGT TGC CAG GGT CCA CGG GGA ACC CGA AGT CCG AGG383384 AGC CCG AGG TCC CGG ACC AGG AGG GGC TGC AGC GCA TCA CCG GCC TGT431432 CTC CCG GCC GTT CGG CTC TCA TAG TGG CGG TGC TGT GCT ACA TCA ATC479480 TCC TGA ACT ACA TGG ACC GCT TCA CCG TGG CTG GCG TCC TTC CCG ACA527528 TCG AGC AAG TTC TTC AAC ATC GGG GAC AGT AGC TCT GGG CTC ATC CAG575576 ACC GTG TTC ATC TCC AGT TAC ATG GTG TTG GCA CCT GTG TTT GGC TAC6231 Met Val Leu Ala Pro Val Phe Gly Tyr 9624 CTG GGT GAC AGG TAC AAT CGG AAG TAT CTC ATG TGC GGG GGC ATT GCC67110 Leu Gly Asp Arg Tyr Asn Arg Lys Tyr Leu Met Cys Gly Gly Ile Ala 25672 TTC TGG TCC CTG GTG ACA CTG GGG TCA TCC TTC ATC CCC GGA GAG CAT71926 Phe Trp Ser Leu Val Thr Leu Gly Ser Ser Phe Ile Pro Gly Glu His 41720 TTC TGG CTG CTC CTC CTG ACC CGG GGC CTG GTG GGG GTC GGG GAG GCC76742 Phe Trp Leu Leu Leu Leu Thr Arg Gly Leu Val Gly Val Gly Glu Ala 57768 AGT TAT TCC ACC ATC GCG CCC ACT CTC ATT GCC GAC CTC TTT GTG GCC81558 Ser Tyr Ser Thr Ile Ala Pro Thr Leu Ile Ala Asp Leu Phe Val Ala 73816 GAC CAG CGG AGC CGG ATG CTC AGC ATC TTC TAC TTT GCC ATT CCG GTG86374 Asp Gln Arg Ser Arg Met Leu Ser Ile Phe Tyr Phe Ala Ile Pro Val 89864 GGC AGT GGT CTG GGC TAC ATT GCA GGC TCC AAA GTG AAG GAT ATG GCT91190 Gly Ser Gly Leu Gly Tyr Ile Ala Gly Ser Lys Val Lys Asp Met Ala105912 GGA GAC TGG CAC TGG GCT CTG AGG GTG ACA CCG GGT CTA GGA GTG GTG959106 Gly Asp Trp His Trp Ala Leu Arg Val Thr Pro Gly Leu Gly Val Val121960 GCC GTT CTG CTG CTG TTC CTG GTA GTG CGG GAG CCG CCA AGG GGA GCC 1007122 Ala Val Leu Leu Leu Phe Leu Val Val Arg Glu Pro Pro Arg Gly Ala 1371008 GTG GAG CGC CAC TCA GAT TTG CCA CCC CTG AAC CCC ACC TCG TGG TGG1055138 Val Glu Arg His Ser Asp Leu Pro Pro Leu Asn Pro Thr Ser Trp Trp 1531056 GCA GAT CTG AGG GCT CTG GCA AGA AAT CCT AGT TTC GTC CTG TCT TCC1103154 Ala Asp Leu Arg Ala Leu Ala Arg Asn Pro Ser Phe Val Leu Ser Ser 1691104 CTG GGC TTC ACT GCT GTG GCC TTT GTC ACG GGC TCC CTG GCT CTG TGG1151170 Leu Gly Phe Thr Ala Val Ala Phe Val Thr Gly Ser Leu Ala Leu Trp 1851152 GCT CCG GCA TTC CTG CTG CGT TCC CGC GTG GTC CTT GGG GAG ACC CCA1199186 Ala Pro Ala Phe Leu Leu Arg Ser Arg Val Val Leu Gly Glu Thr Pro 2011200 CCC TGC CTT CCC GGA GAC TCC TGC TCT TCC TCT GAC AGT CTC ATC TTT1247202 Pro Cys Leu Pro Gly Asp Ser Cys Ser Ser Ser Asp Ser Leu Ile Phe 2171248 GGA CTC ATC ACC TGC CTG ACC GGA GTC CTG GGT GTG GGC CTG GGT GTG1295218 Gly Leu Ile Thr Cys Leu Thr Gly Val Leu Gly Val Gly Leu Gly Val 2331296 GAG ATC AGC CGC CGG CTC CGC CAC TCC AAC CCC CGG GCT GAT CCC CTG1343234 Glu Ile Ser Arg Arg Leu Arg His Ser Asn Pro Arg Ala Asp Pro Leu 2491344 GTC TGT GCC ACT GGC CTC CTG GGC TCT GCA CCC TTC CTC TTC CTG TCC1391250 Val Cys Ala Thr Gly Leu Leu Gly Ser Ala Pro Phe Leu Phe Leu Ser 2651392 CTT GCC TGC GCC CGT GGT AGC ATC GTG GCC ACT TAT ATT TTC ATC TTC1439266 Leu Ala Cys Ala Arg Gly Ser Ile Val Ala Thr Tyr Ile Phe Ile Phe 2811440 ATT GGA GAG ACC CTC CTG TCC ATG AAC TGG GCC ATC GTG GCC GAC ATT1487282 Ile Gly Glu Thr Leu Leu Ser Met Asn Trp Ala Ile Val Ala Asp Ile 2971488 CTG CTG TAC GTG GTG ATC CCT ACC CGA CGC TCC ACC GCC GAG GCC TTC1535298 Leu Leu Tyr Val Val Ile Pro Thr Arg Arg Ser Thr Ala Glu Ala Phe 3131536 CAG ATC GTG CTG TCC CAC CTG CTG GGT GAT GCT GGG AGC CCC TAC CTC1583314 Gln Ile Val Leu Ser His Leu Leu Gly Asp Ala Gly Ser Pro Tyr Leu 3291584 ATT GGC CTG ATC TCT GAC CGC CTG CGC CGG AAC TGG CCC CCC TCC TTC1631330 Ile Gly Leu Ile Ser Asp Arg Leu Arg Arg Asn Trp Pro Pro Ser Phe 3451632 TTG TCC GAG TTC CGG GCT CTG CAG TTC TCG CTC ATG CTC TGC GCG TTT1679346 Leu Ser Glu Phe Arg Ala Leu Gln Phe Ser Leu Met Leu Cys Ala Phe 3611680 GTT GGG GCA CTG GGC GGC GCA GCC TTC CTG GGC ACC GCC ATC TTC ATT1727362 Val Gly Ala Leu Gly Gly Ala Ala Phe Leu Gly Thr Ala Ile Phe Ile 3771728 GAG GCC GAC CGC CGG CGG GCA CAG CTG CAC GTG CAG GGC CTG CTG CAC1775378 Glu Ala Asp Arg Arg Arg Ala Gln Leu His Val Gln Gly Leu Leu His 3931776 GAA GCA GGG TCC ACA GAC GAC CGG ATT GTG GTG CCC CAG CGG GGC CGC1823394 Glu Ala Gly Ser Thr Asp Asp Arg Ile Val Val Pro Gln Arg Gly Arg 4091824 TCC ACC CGC GTG CCC GTG GCC AGT GTG CTC ATT TGA GAG GCT GCC GCT1871410 Ser Thr Arg Val Pro Val Ala Ser Val Leu Ile *** 4211872 CAC CTA CCT GCA CAT TTG CCA CAG CTG GCC CTG GGC CCA CCC CAC GAA19191920 GGG CCT GGG CCT AAC CCC TTG GCC TGG CCC AGC TTC CAG AGG ACC CTG19671968 GGC CGT GTG CCA GCT CCC AGA CAC TAC ATG GGT AGC TCA GGG GAG GAG20152016 GTG GGG GTC CAG GAG GGG GAT CCC TCT CCA CAG GGG CAG CCC CAA GGG20632064 CTC GGT GCT ATT TGT AAC GGA ATA AAA TTT GTA GCC AGA AAA AAA AAA21112112 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA21442.PP2243A核苷酸序列(SEQ ID NO4)长度1721个碱基1 AGACACCTCC CATTCTGAGG GGAAGCCGCT GCACTCCCTG GGGGACCCCA GTCTGATGCC61 CTCCAGGAGG ATAAGTCTGA AGCCGGGCTG GGAAGGGAGC GGAGAGGCCC GAAACAGAGC121 AGCAGGCAGC GCCCTCTGCT GGCACCCTGG AGACAGCCTC GGCTGCGGGG CCCCTGCCTT181 CTAGTCCTCC CCAGCTTTCA GGACACCTTG ACAACCTGGG GTCCCTGCAG AAGTGGCCCG241 GCTGTCCCCC AAGTCTCCTG AAGCTATCTG GGTAGGGTGG GAGGCAGTGC TGTGAGCCAC301 AAATGCAAAG CAGAGGGGAC AGATGTTGGG ACTCAAAGAC ATGAGGTAGA GCTGGCCCCA361 TGGGTAGGTG CCACCACCAG AGCCCATGAG GCTTCGTGTT CTAGAAGGTG GTGGGTTAGT421 GCCGCACTGA GGGCGTGTCC GGGAGGGAGC ATGTGTCACC AGGGCTCAGG AAACAGCATG481 AGTCATGACG CGGGGGTGTT TAAGGCATTC GTGCCACAGC GGGGACCTCG GAGCTATGCC541 TTGATAAGGC AAGTGAGGTT ACATGTACGA TGATGCGGTT TGTGCTGCAG ACTGGAAAAA601 AGCAGGGGCT TTGTCCTCTC CTGACCCCCT CACACTCTGC CTTCACGGTA GGCTCCTGAG661 AGGGGGGTCT CCAAGGAGGG TGTCAGTACT GCAGCTTCAG CTGGCGTGGA TGGGGTGCTT721 ACAGGAGCAG CAGGGCTGAG GGAGATGACA GCAGTACGAA CCGTGGCTCT CCTGAGGCCT781 GGGTTTCCTC ATATGTAAAA TGGGGGTTGC ATTAGACCAT ACCCTTGGCC TGTGTTTAGG841 CAAATAGGGA TGAAAGTGGG GCCAAGGGCT GAAGAGCTGG GTCCGCTGCC GTCGTTGCCC901 TTCTTTCTTG CCAGGTGAGT GACTTGCGCA ATCAGGTCTA CCTGGAGGAT GGACTGGACC961 CCTTCCCAGC GAGGGCCGTG TGGTGGGCAG GCAGCTGATG CACAAGGCCT TGGACAGGTT1021 GGAGGAGCAC CCAGGCTCCA GGATGACTGC TGAGAAATTT CTGAACAGGC TCCCCAAGTT1081 TGTGATCCGG CAAGGCGAGG TGATTGACAT CCGGGGCCCC ATCAGGGACA CCTTGCAGAAl141 CTGCTGCCCA TTGCCTGCCC GGATCCAGGA GATTGTGGTG GAGACGCCCA CCTTGGCCGC1201 TGAGCGAGAG AGGAGCCAGG AGTCACCCAA CAACGCCGGC ACCCCCGCTC TCCATGCTGC1261 GCATCAAGTC TGAGAATGGG GAACAGGCCT TCCTACTGAT GATGCAGCCT GACAACACCA1321 TTGGGGACGT GCGAGCTCTG CTAGCGCAGG CCAGGGTCAT GGATGCCTCT GCCTTTGAGA1381 TCTTCAGCAC ATTCCCGCCC ACCCTCTACC AGGACGATAC ACTCACGCTG CAGGCTGCAG1441 GCCTTGTGCC CAAAGCAGCA CTGCTGCTGC GGGCACGCCG AGCCCCGAAG TCCAGCCTGA1501 AATTCAGTCC TGGTCCCTGT CCCGGTCCCG GTCCCGGCCC CAGTCCCGGT CCCGGTCCCG1561 GCCCCAGTCC CGGTCCCGGT CCCGGCCCCA GTCCCGGTCC CGGTCCCGGC CCCAGTCCCT1621 GTCCTGGACC CAGTCCCAGC CCCCAATAAA GCACCCGCCC CCTCAAAAAA AAAAAAAAAA1681 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AB核苷酸序列(SEQ ID NO5) 长度131个氨基酸1 MLRIKSENGE QAFLLMMQPD NTIGDVRALL AQARVMDASA FEIFSTFPPT LYQDDTLTLQ61 AAGLVPKAAL LLRARRAPKS SLKFSPGPCP GPGPGPSPGP GPGPSPGPGP GPSPGPGPGP121 SPCPGPSPSP QC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO6) 克隆号PP2243起始编码子 1254 ATG 终止编码子1647 TAA 蛋白质分子量 13257.451 AG ACA CCT CCC ATT CTG AGG GGA AGC CGC TGC ACT CCC TGG GGG ACC 4748 CCA GTC TGA TGC CCT CCA GGA GGA TAA GTC TGA AGC CGG GCT GGG AAG 9596 GGA GCG GAG AGG CCC GAA ACA GAG CAG CAG GCA GCG CCC TCT GCT GGC143144 ACC CTG GAG ACA GCC TCG GCT GCG GGG CCC CTG CCT TCT AGT CCT CCC191192 CAG CTT TCA GGA CAC CTT GAC AAC CTG GGG TCC CTG CAG AAG TGG CCC239240 GGC TGT CCC CCA AGT CTC CTG AAG CTA TCT GGG TAG GGT GGG AGG CAG287288 TGC TGT GAG CCA CAA ATG CAA AGC AGA GGG GAC AGA TGT TGG GAC TCA335336 AAG ACA TGA GGT AGA GCT GGC CCC ATG GGT AGG TGC CAC CAC CAG AGC383384 CCA TGA GGC TTC GTG TTC TAG AAG GTG GTG GGT TAG TGC CGC ACT GAG431432 GGC GTG TCC GGG AGG GAG CAT GTG TCA CCA GGG CTC AGG AAA CAG CAT479480 GAG TCA TGA CGC GGG GGT GTT TAA GGC ATT CGT GCC ACA GCG GGG ACC527528 TCG GAG CTA TGC CTT GAT AAG GCA AGT GAG GTT ACA TGT ACG ATG ATG575576 CGG TTT GTG CTG CAG ACT GGA AAA AAG CAG GGG CTT TGT CCT CTC CTG623624 ACC CCC TCA CAC TCT GCC TTC ACG GTA GGC TCC TGA GAG GGG GGT CTC671672 CAA GGA GGG TGT CAG TAC TGC AGC TTC AGC TGG CGT GGA TGG GGT GCT719720 TAC AGG AGC AGC AGG GCT GAG GGA GAT GAC AGC AGT ACG AAC CGT GGC767768 TCT CCT GAG GCC TGG GTT TCC TCA TAT GTA AAA TGG GGG TTG CAT TAG815816 ACC ATA CCC TTG GCC TGT GTT TAG GCA AAT AGG GAT GAA AGT GGG GCC863864 AAG GGC TGA AGA GCT GGG TCC GCT GCC GTC GTT GCC CTT CTT TCT TGC911912 CAG GTG AGT GAC TTG CGC AAT CAG GTC TAC CTG GAG GAT GGA CTG GAC959960 CCC TTC CCA GCG AGG GCC GTG TGG TGG GCA GGC AGC TGA TGC ACA AGG 10071008 CCT TGG ACA GGT TGG AGG AGC ACC CAG GCT CCA GGA TGA CTG CTG AGA 10551056 AAT TTC TGA ACA GGC TCC CCA AGT TTG TGA TCC GGC AAG GCG AGG TGA 11031104 TTG ACA TCC GGG GCC CCA TCA GGG ACA CCT TGC AGA ACT GCT GCC CAT 11511152 TGC CTG CCC GGA TCC AGG AGA TTG TGG TGG AGA CGC CCA CCT TGG CCG 11991200 CTG AGC GAG AGA GGA GCC AGG AGT CAC CCA ACA ACG CCG GCA CCC CCG 12471248 CTC TCC ATG CTG CGC ATC AAG TCT GAG AAT GGG GAA CAG GCC TTC CTA 12951 Met Leu Arg Ile Lys Ser Glu Asn Gly Glu Gln Ala Phe Leu 141296 CTG ATG ATG CAG CCT GAC AAC ACC ATT GGG GAC GTG CGA GCT CTG CTA 134315 Leu Met Met Gln Pro Asp Asn Thr Ile Gly Asp Val Arg Ala Leu Leu 301344 GCG CAG GCC AGG GTC ATG GAT GCC TCT GCC TTT GAG ATC TTC AGC ACA 139131 Ala Gln Ala Arg Val Met Asp Ala Ser Ala Phe Glu Ile Phe Ser Thr 461392 TTC CCG CCC ACC CTC TAC CAG GAC GAT ACA CTC ACG CTG CAG GCT GCA 143947 Phe Pro Pro Thr Leu Tyr Gln Asp Asp Thr Leu Thr Leu Gln Ala Ala 621440 GGC CTT GTG CCC AAA GCA GCA CTG CTG CTG CGG GCA CGC CGA GCC CCG 148763 Gly Leu Val Pro Lys Ala Ala Leu Leu Leu Arg Ala Arg Arg Ala Pro 781488 AAG TCC AGC CTG AAA TTC AGT CCT GGT CCC TGT CCC GGT CCC GGT CCC 153579 Lys Ser Ser Leu Lys Phe Ser Pro Gly Pro Cys Pro Gly Pro Gly Pro 941536 GGC CCC AGT CCC GGT CCC GGT CCC GGC CCC AGT CCC GGT CCC GGT CCC 158395 Gly Pro Ser Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Ser Pro Gly Pro Gly Pro1101584 GGC CCC AGT CCC GGT CCC GGT CCC GGC CCC AGT CCC TGT CCT GGA CCC 1631111 Gly Pro Ser Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Ser Pro Cys Pro Gly Pro1261632 AGT CCC AGC CCC CAA TAA AGC ACC CGC CCC CTC AAA AAA AAA AAA AAA 1679127 Ser Pro Ser Pro Gln ***1321680 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 17213.PP6569A核苷酸序列(SEQ ID NO7)长度2597个碱基1 GTTGGGGACT AGGCCACACC TCTCCCTCAT GCTTGTCACC ACTGCTACAC CTTGTCTGCC61 CACTTTCTCT CCTTCCCGCC CCTGGAGGTG AGACCCTCAC CTCTCTCGTG AGCATGCTGC121 CTCATGTCTT CCGTGCCGTC GTTCTGTGGC TGGGTGACTG TCCCTCAGGC CGCCAACCCT181 AGTTGGCTCT CACAGCAACT TCCAGTGCTC CTGGACGGGG ACTTCCTAAG CAGCATGGGG241 GCCACACGGG CCGGCCACGC ACACTGGCCT GGGTCCGCAT TCCCTATTTC AGGCTGTTGT301 CTCGGGTCAG ATCTCCGGAA GCGGCAGGAG CGCTGGGTCT CCTGGTCGTG GCCGGGCAGC361 GTCTTTCTTC TTCAGGGTCT GGATGCCACT TCCCGCCTCC TCCCTGTGCC CAGTGGAAGG421 AGAAACATCC TAGAGGGTGG AGACTGCCCT GTTITTCTTT TGCCATTGAG TCCCAGTGTG481 ACTCAAGCAC GAGGCCACCT TTCTCTGCCA GAGGACAGAA AGCTTCAGTG ACTGGCCCAG541 GGTCACACAG TTCTGCCGCC CAGCCCAGCA GCCTGAGCCA GCAGTCAGGA TGGGGTGGGG601 ACACTCCGTC TCTCTTGAGA CCCCACTCAG AGAATGGGGC TGACACTGTA GGAGAAATAT661 AAGCAGGACT CCTGCTGGCT GCTCCCCTCC TGCATGAGGC ATGTTAGAGG GACTGGGACC
721 GCCAGCCCCC AGCTCCCATG CCGGGCCTCG GCCAGTCTCA GCTCCTGTTT GGGAGGGGGG781 GCAGAGGGGC AGGGGGGCAG AAGTTGAGTC TGGGAGCTGG GGCAGGGCAC AGGCTCTAGG841 GTCCAGCTGT CCTCCTCTCC CCTCCCCTGC TGGCCACTCC TGCTGCCGTC TCCACAGCTC901 TGGAATGATG AAGTGGACAA GGTAAGTTGG GGCCTGGGGG GCTGGGCTCG AGGAAGAAGG961 GGTGGCGGGG TGCAGGCACA CTTGCTGCTG TGGGGTCTGA TCTGTTTCTC ACTCTGCCCC1021 ACACCCACTG GGGAGGGGTT ACTGCTTTCC CTCCCTGGGC CTCAGTTTCC CCTCTGTGGG1081 GAAATGTTTT CTCCACAGTA CCCTGTAGCA CACAGTAGGC CCTCAGGATG CACTTGCTGG1141 GTGGATTTCT CCGATGGGTG ATGGAGGAAG GGTCTGTCAC TGCAGCTGCC TGTGGGGTCC1201 TGAGTGGGGC TCTAGCTTCT CTGGGGTTGG GGCTCCAGGT GTGAAGTCAG GCATAGACCC1261 AGAAGGCTCT CTGTGTTCCC AGGGGAAAGG GACAGGCGGC TCCCAGGTAG GCTCCAGGAG1321 AAGACTGCGG GGAAGCTGGT GGGTGGTGTG TTGGGGTGCT CATGGCTGCC CTGCCCTGCC1381 CAGGCCGAGC AGGAGCTCCG CGTGGCCCAG ACAGAGTTTG ACCGGCAAGC AGAAGTGACC1441 CGTCTCTTGC TGGAGGGAAT CAGTAGCACT CACGTGAACC ACCTGCGCTG CCTCCACGAG1501 TTCGTCAAGT CTCAGACAAC CTACTACGCA CAGTGCTACC GCCACATGCT GGACTTGCAG1561 AAGCAGCTGG GCAGATTTCC CGGCACCTTC GTGGGCACCA CAGAGCCCGC CTCCCCACCC1621 CTGAGCAGCA CCTCACCCAC CACTGCTGCG GCCACTATGC CTGTGGTGCC CTCTGTGGCC1681 AGCCTGGCCC CTCCGGGGGA GGCCTCGCTC TGCCTGGAAG AGGTGGCCCC CCCTGCCAGT1741 GGGACCCGCA AAGCTCGGGT GCTCTATGAC TACGAGGCAG CCGACAGCAG TGAGCTGGCC1801 CTGCTGGCTG ATGAGCTCAT CACTGTCTAC AGCCTGCCTG GCATGGACCC TGACTGGCTC1861 ATTGGCGAGA GAGGCAACAA GAAGGGCAAG GTCCCTGTCA CCTACTTGGA ACTGCTCAGC1921 TAGGCAGGTG CCCCCATCCC CCCCGCATTC TGGCCTAGGC AGGAGAGGAT GGGCGCAGCC1981 CTGCCACTTA ACTTGTTTGT TGGTGACACA GTTGTTCAGA GTGGGGAGAA TTCACCCCAT2041 TCTGTCCCTG CCCCTAGTCA CCTAGCTGTG AGGGTGCCTG AGGCTGAATG GCTCCACCCC2101 TCCCCCAGCC CTGCTTCTGA CCTGTGGCTC TGGAGCCCCT GCCCCTGCCT GCATCCCCGA2161 GCACCCCACC CTCCAGGCTC CACTAAGGAG GGAGGGGCTG TTTGCAGCAG CTGCACTCAG2221 CACCTAGGCC AGGGTGGGGC CGCCGCAGAT GGGCTCAGGA AGCCCCAGGT GCACTCAGCG2281 AGAGCCCTGC CTTTCAGTTG CCAAAAGCTG CATCAGGGGA ATGCGGCAAG GCACACAGGG2341 CTCTGGCAGC CCCTGGGGAC TGGGCGCTGC CCCTGGGAGG GGAGAGCCTG GCCAGGGCTG2401 GTGTTGGGCC CGGAGCAGCA 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3061 GTCACGGGTA TGACCACTCA TTTGTCTCCT GCCCCCAACC GAAACCTTTT CTATCTTAGG3121 GTTTTTCCTT TTATCTCTTC CCACCTGACA ACCCGACCCC CTCTCACTTA CCCTGTGTGT3181 CTTGCCCCAC ACCCTTTCCA CTACTGTCCT TGACAGCAGG AGGCAGCAGA TTGCTGAGGC3241 CCCCACATGG AGGAGGATGT AGAACAGGCG GCTGCAAGTG GATGCGGTGA GAGAGGGCCA3301 CCTAGAGTGG CAGCAGCTGG CACAAGGAGC AGGCCCACAG CAGCACACCT GGGAGTAGAG3361 CAGATGCAAG GCAGCGAGGT GGAGACTTGC TGAGGAAAGG CATACGTTAA TGTATGTGTG3421 AGGTTAACCC AGGAGGTTGA ATTCCAAAAT TTCCCCTTCC CCTTTCTTCC TTTTACTCAG3481 GTTCTGTTTC AAGCTGATTC CAGCCATTTG GGATTGCCGC CCACTGACAA CTTAGTAGGG3541 CTTTCATTAT AAGCAGGCTT GAGATATCTG ACCTTTCTCT CGACCTAAAC ACCTGGGGCT3601 GGAAACATGG CGGGAGAGAT TTACAGATTA TACCTGGGGC AACGAACCAG AACGACATTA3661 GAGGAGAAAA GAGGCCTGTC GTTTTTATTG GCTTCTGCAC GTCTTCCTCC CCAGCTTCGG3721 CCACTCTCCC CTTCGCACCC TCTCACCTGA CAGAAGGGAC TTTTCACTAG GACACTGCTG3781 CCTCCGCTGT GCTGCTGTGC CAGGCCCAGG GAGGTGCCGG GGCTGGGGCC GGCCTTGGCA3841 CCCACCATCC TTGTCCCAGG GATTAGGCTT AGGTCCACCA GATGGAAGGC AGATGAGAGC3901 AGCAGTTGCT 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1141 TGCTGGACCA TGCCATGATT GGCCCCGAAG GCACAGACAA CTGCCATAAG TTTGTTGACA1201 TTCTTGGCTT ACGAACCATC TTTCCCCTCT TTATGAAATC TCCCAGGAAG ATCAAGAAAG1261 TGGGAACCAC TGAGAAGGAA CATGAAGAGC ATGTCTGTTC GATCCTGGCT TCCCTCCTGC1321 GGAACCTGAG AGGGCAGCAG CGGACCCGGC TTCTGAATAA ATTCACTGAA AATGACAGTG1381 AGAAGGTTGA CAGACTAATG GAGTTGCATT TTAAATATCT GGGTGCAATG CAGGTGGCGG1441 ACAAGAAGAT TGAAGGGGAA AAACACGACA TGGTCCGGCG AGGAGAGATC ATCGACAATG1501 ACACCGAGGA GGAGTTCTAC CTCCGGCGCC TGGATGCGGG GCTCTTTGTT CTCCAGCACA1561 TCTGCTACAT CATGGCCGAG ATCTGCAATG CCAATGTCCC CCAGATTCGC CAGAGGGTTC1621 ACCAGATCCT AAACATGCGA GGAAGCTCCA TCAAAATTGT CAGGCATATC ATCAAGGAGT1681 ATGCAGAGAA CATCGGGGAC GGCCGGAGCC CGGAGTTCCG GGAGAACGAG CAAAAGCGCA1741 TCCTGGGCTT GCTGGAGAAC TTCTAGAGGC ACCTTGGCCC TGCGCATCAT GGACTCTCTC1801 AGCTTCCCTC CCAGGATCAG TTTCTACACA ACTCTGTGTG GCTTTTGGAC AAATTAAAGC1861 TAGTTTTGGT AAAAAAAAAA AAAAAAAAB核苷酸序列 (SEQ ID NO20) 长度453个氨基酸1 MESELDLNDI IQEMHVVATM PDLYHLLVEL NAVQSLLGLL GHDNTDVSIA VVDLLQELTD61 IDTLHESEEG AEVLIDALVD 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TGA 蛋白质分子量 27672.571 GT TCA GCC CAG GAC TCC TGC CTC CCC CCA TTT CAG GTC CCA GGG GGC 4748 ACA GCC ACA GCA GGT GAC TCT CAG ACT TGC CTT GCG CCT GGG GAA TTT 9596 TCC AGT GAG GCA TTG AGT CCC AAG CTG TGC TGA GGA CAG TCT CCA AAT 143144 GAC AGC TGC ATG CCT GGA CCA CCC CAG CCC TCC CAC TAC ACC AGG GCC 191192 AGG AGC TCT TCT GAA ATG CTG ATA GCA TGT GTC CAG AGC CCT GTC TCT 239240 TTT CTG GAA TGT CCA AGA CCT TTG TCT GGA GCT TCC TTA TGC ATT TTC 287288 TGT CCT CTA AGT CCT CAG TGA GGA GGG CTG GAC AAG AAT CCA TTC CTT 335336 GGT TTA TTA CAG CCA GTG GGG GCC AGT GAA GGG GTG TCA GGC CAC AGG 383384 GCA GCT ATA TAG GGG CCA AAC AAG TGA GGT TTG ACT CCA TCC ATG TAG 431432 AAA GAT ATA TAA ATC CAT TCC ACA GTG AAA CAG GTG GCC TCG TGG GTA 479480 GTG ACC CTT CTG TCC CTA GAG GTT TAT TAC TAG AGG CTG GAC TAT CAC 527528 CTG TCC AGG GGA AAA GGG GAT CTG AAT AGA GTG AAA GGT TGG ACT GGG 575576 TGG CCC CTG AGG TCT CTT CCA GCC CTC AGT CTG AGG TTC TGT ATT GGA 623624 AAG TGC ATG GAG CCC ATG GAG ACC GCC GAG CCA CAG TCC TCG CCA 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61 SWWVVCGCSW LPCPAQAEQE LRVAQTEFDR QAEVTRLLLE GISSTHVNHL RCLHEFVKSQ121 TTYYAQCYRH MLDLQKQLGR FPGTFVGTTE PASPPLSSTS PTTAAATMPV VPSVASLAPP181 GEASLCLEEV APPASGTRKA RVLYDYEAAD SSELALLADE LITVYSLPGM DPDWLIGERG241 NKKGKVPVTY LELLSC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO27) 克隆号PP9455起始编码子 392 ATG 终止编码子1157 TAG 蛋白质分子量 27286.471G CCT GTT TGG GAG GGG GGG CAG AGG GGC AGG GGG GCA GAA GTT GAG 4647 TCT GGG AGC TGG GGC AGG GCA CAG GCT CTA GGG TCC AGC TGT CCT CCT 9495 CTC CCC TCC CCT GCT GGC CAC TCC TGC TGC CGT CTC CAC AGC TCT GGA142143 ATG ATG AAG TGG ACA AGG TAA GTT GGG GCC TGG GGG GCT GGG CTC GAG190191 GAA GAA GGG GTG GCG GGG TGC AGG CAC ACT TGC TGC TGT GGG GTC TGA238239 TCT GTT TCT CAC TCT GCC CCA CAC CCA CTG GGG AGG GGT TAC TGC TTT286287 CCC TCC CTG GGC CTC AGT TTC CCC TCT GTG GGG AAA TGT TTT CTC CAC334335 AGT ACC CTG TAG CAC ACA GTA GGC CCT CAG GAT GCA CTT GCT GGG TGG382383 ATT TCT CCG ATG GGT GAT GGA GGA AGG GTC TGT CAC TGC AGC TGC CTG4301 Met Gly Asp Gly Gly Arg Val Cys His Cys Ser Cys Leu 13431 TGG GGT CCT 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TAGTAATTTG GGGGATAAAG541 AGCTTTTGTC CTGATTGCTG AAACTTCCCA TTAATTGTCC AAAAATACTC TGCCGGTGGG601 TTAGATTCCG TGAAGCAGGA CAAGTCGAGG TTTTCTCCTG AACGGTAATA GGTGAATGAA661 GGGTAAATTC TGGGGAGGTC TGGACCATAG AGGACATTCA GGGTGACTGG GTTACTGCGG721 AGGCCACCAT ATCGGTCCCG TATTTCACAT TGATAGGGTC CTGTTTCATT TCTCGTGACA781 CTGGGTAGAA TGAGTATCCT GTTTTCAATG GGTCGCTTTA CCCCGGGACT GACGGGGAGG841 CTCTGACCGT TTAGCCACCA AATGTAGGTG TAGTTCTCAC TCTTAGGTTC ACAGGTGAAG901 GCTAAGACAT CCTTATTCTC CCTGGGGTTT AAGTTGTTGA TGGTGATGTA GGGGATGGGC961 AGCTTCGAGT ATAAGGTGAA GGTGAAATGT CGAATTTCTT CTCTAGTCTC ATCACCTCGC1021 TTTATGATGT GTAAGGTGTA GGTTCCTGCA TCCTTCCGGG TGACATTCTG GATCAGCAGG1081 GATGCGTTGG AATATACTGT TTCTCCGGAG GTGGCAGCCA TCTCCTTCTC GGCATCATGG1141 CCGCCCTCAG ACCCCTTGTG AAGCCCAAGA TCGTCAAAAA GAGAACCAAG AAGTTCATCC1201 GGCACCAGTC AGACCGATAT GTCAAAATTA AGCGTAACTG GCGGAAACCC AGAGGCATTG1261 ACAACAGGGT TCGTAGAAGA TTCAAGGGCC AGATCTTGAT GCCCAACATT GGTTATGGAA1321 GCAACAAAAA AACAAAGCAC ATGCTGCCCA GTGGCTTCCG GAAGTTCCTG GTCCACAACG1381 TCAAGGAGCT GGAAGTGCTG CTGATGTGCA ACAAATCTTA CTGTGCCGAG ATCGCTCACA1441 ATGTTTCCTC CAAGAACCGC AAAGCCATCG TGGAAAGAGC TGCCCAACTG GCCATCAGAG1501 TCACCAACCC CAATGCCAGG CTGCGCAGTG AAGAAAATGA GTAGGCAGCT CATGTGCACG1561 TTTTCTGTTT AAATAAATGT AAAAACTGCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AB核苷酸序列(SEQ ID NO32) 长度135个氨基酸1 MAALRPLVKP KIVKKRTKKF IRHQSDRYVK IKRNWRKPRG IDNRVRRRFK GQILMPNIGY61 GSNKKTKHML PSGFRKFLVH NVKELEVLLM CNKSYCAEIA HNVSSKNRKA IVERAAQLAI121 RVTNPNARLR SEENEC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO33) 克隆号PP9932起始编码子 1137 ATG 终止编码子1542 TAG 蛋白质分子量15859.031 GG AAC TAT CTC GAG TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT 4748 TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG AAC ATG TGC AAA TAA CTT TAT 9596 TAC CAT AAA CCT ATG AAT ACT CAT GAA TAG TTT CAC AAT TCT GGG GCA143144 TTC AGA TAG ACA GCA AAA GCA AAT ATT TCA ATT TTT GTT TAC AAA AGT191192 ATA CTT TAC CAA TTG CTG AAG AAA AAA AGT TCA TAA ATC TGG AGA ATA239240 AAA CAT TCA AAG AAT CAG CAC ATT TTC CAA TAA AAA ATT ATG AAA ACA287288 TTA TCC TTT TGA TTA TTT AGT CCA ATA ACA TTG AGT TTT TTT CTT CTT335336 TGT CTT GAA TTT CAT GAA GGT ATC AGC CTG TTC TTT TTC TCA GTG TCT383384 CAG TTG TTG CAG TCA TGA CTG AGA CTC TGT CAG GTC TCC ATG GCA GGG431432 ACC AGA GAC TTT GAC TGT CAT GGA TTT GGA GAT TTC CTT GCC AGT GGC479480 TGA GTT ATG AAC AGA GCA AGC ATA GAG CCC GCT ATG ATT TCT AGT AAT527528 TTG GGG GAT AAA GAG CTT TTG TCC TGA TTG CTG AAA CTT CCC ATT AAT575576 TGT CCA AAA ATA CTC TGC CGG TGG GTT AGA TTC CGT GAA GCA GGA CAA623624 GTC GAG GTT TTC TCC TGA ACG GTA ATA GGT GAA TGA AGG GTA AAT TCT671672 GGG GAG GTC TGG ACC ATA GAG GAC ATT CAG GGT GAC TGG GTT ACT GCG719720 GAG GCC ACC ATA TCG GTC CCG TAT TTC ACA TTG ATA GGG TCC TGT TTC767768 ATT TCT CGT GAC ACT GGG TAG AAT GAG TAT CCT GTT TTC AAT GGG TCG815816 CTT TAC CCC GGG ACT GAC GGG GAG GCT CTG ACC GTT TAG CCA CCA AAT863864 GTA GGT GTA GTT CTC ACT CTT AGG TTC ACA GGT GAA GGC TAA GAC ATC911912 CTT ATT CTC CCT GGG GTT TAA GTT GTT GAT GGT GAT GTA GGG GAT GGG959960 CAG CTT CGA GTA TAA GGT GAA GGT GAA ATG TCG AAT TTC TTC TCT AGT 10071008 CTC ATC ACC TCG CTT TAT GAT GTG TAA GGT GTA GGT TCC TGC ATC CTT 10551056 CCG GGT GAC ATT CTG GAT CAG CAG GGA TGC GTT GGA ATA TAC TGT TTC 11031104 TCC GGA GGT GGC AGC CAT CTC CTT CTC GGC ATC ATG GCC GCC CTC AGA 11511 Met Ala Ala Leu Arg 51152 CCC CTT GTG AAG CCC AAG ATC GTC AAA AAG AGA ACC AAG AAG TTC ATC 11996 Pro Leu Val Lys Pro Lys Ile Val Lys Lys Arg Thr Lys Lys Phe Ile 211200 CGG CAC CAG TCA GAC CGA TAT GTC AAA ATT AAG CGT AAC TGG CGG AAA 124722 Arg His Gln Ser Asp Arg Tyr Val Lys Ile Lys Arg Asn Trp Arg Lys 371248 CCC AGA GGC ATT GAC AAC AGG GTT CGT AGA AGA TTC AAG GGC CAG ATC 129538 Pro Arg Gly Ile Asp Asn Arg Val Arg Arg Arg Phe Lys Gly Gln Ile 531296 TTG ATG CCC AAC ATT GGT TAT GGA AGC AAC AAA AAA ACA AAG CAC ATG 134354 Leu Met Pro Asn Ile Gly Tyr Gly Ser Asn Lys Lys Thr Lys His Met 691344 CTG CCC AGT GGC TTC CGG AAG TTC CTG GTC CAC AAC GTC AAG GAG CTG 139170 Leu Pro Ser Gly Phe Arg Lys Phe Leu Val His Asn Val Lys Glu Leu 851392 GAA GTG CTG CTG ATG TGC AAC AAA TCT TAC TGT GCC GAG ATC GCT CAC 143986 Glu Val Leu Leu Met Cys Asn Lys Ser Tyr Cys Ala Glu Ile Ala His1011440 AAT GTT TCC TCC AAG AAC CGC AAA GCC ATC GTG GAA AGA GCT GCC CAA 1487102 Asn Val Ser Ser Lys Asn Arg Lys Ala Ile Val Glu Arg Ala Ala Gln1171488 CTG GCC ATC AGA GTC ACC AAC CCC AAT GCC AGG CTG CGC AGT GAA GAA 1535118 Leu Ala Ile Arg Val Thr Asn Pro Asn Ala Arg Leu Arg Ser Glu Glu1331536 AAT GAG TAG GCA GCT CAT GTG CAC GTT TTC TGT TTA AAT AAA TGT AAA 1583134 Asn Glu ***1361584 AAC TGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A 161112.PP10141A核苷酸序列(SEQ ID NO34)长度1744个碱基1 GTGGAAGTTG GCTGTCTTGT TTCTTGTGAC CTTGGGGGTG TAAAGGACAG AGCCCAGGCG61 ACCTAGGGCA CTATCTCCCT ACCCCACGCC TTCTCCCTTC CTCGTTCCTC CCTACCCTTA121 TCGCTTCTAC CCCGCCCACA CCGCCCTAAA CGGCTTCCTG GGGCGGAACT GTTTCGCTTT181 TCCCCGTCCC AGTGGAGGGT GGGGTGGGGG GGTCGCAGCC CTAAGCCTCT GGGAGACATG241 GAGCCCAGGA GGGCGGCGCC CGTGGTGCCT TGGCTGGGGG TCTCGGGAGG CCGCGGGGTC301 GGCATCGGCC GCGGCAGTTT GTGTACCATC TAGCCGGGGC CCTGGGCACT TGAGCTGCAG361 GATCTGGCGC GCCGTTTCGG GCCGGCAGGC AGGCCGGGCT GGTGCCGCTA GTGGTGCGGG421 CGCTGGAGCT CTTGGAACAG GCTGCCGTGG GGCCCGCCCC GGACTCGCTG CAGGTGTCGG481 CGCAGGCCGG ACGCAGGAGC TGCGGCGGCT GCGGGAGGAG AACGAGCGCC TCCGCAGGAG541 ACTGCGCGCG GGGCCACAGG AGGAGCGCGC GCTGCTGCGG CAGCTCAAGG AGGTCACGGC601 CGACAGCGGG ACGAACTCCG GGCGCACAAC CGCGACTGCG GCAGCGCGGC CAGGAGACCG661 AGGCGTTGCA GGAGCAGCTG CAGCGCCTCC TGCTGGTGAA CGCTGAGCTG CGGCACAAGC721 TGGCGGCCAT GCAGACCCAG NNNGCCGCGC AGGACCGCGA GAGGGAGCGC CAGCAGCCTT781 ACGAAGCCGC GACTCCGCAG GCTAAAGAGC GAGCGCGGGG GCAGCCGGGC GGCCCGGGCA
841 CCAGCACGGA CAGGAGCCCG AATGGGCGCC GCCGGCGCAG GCGCCCCAGG GAACCCTGAG901 GACCCGGCGG AGGCCGCGCA GCAGCTCGGG CGCCCCTCGG AGGCAGGGCA GTGCCGCTTC961 AGTCGGGAGG AGTTTGAGCA GATCCTTCAG GAGCGGAATG AACTCAAAGC CAAAGTGTTC1021 CTGCTCAAGG AGGAACTGGC CTACTTCCAG CGGGAGCTGC TCACAGACCA CCGGGTCCCC1081 GGCCTTCTGC TCGAGGCCAT GAAGGTGGCT GTCCGGAAGC AGCGGAAGAA GATCAAGGCC1141 AAGATGTTAG GGACACCAGA GGAAGCAGAG AGCAGTGAGG ATGAGGCTGG CCCATGGATC1201 CTGCTCTCCG ATGACAAGGG AGACCATCCC CCACCCCCGG AGTCCAAAAT ACAGAGTTTC1261 TTTGGCCTAT GGTATCGGGG TAAAGCTGAA TCCTCTGAGG ATGAGACCAG CAGCCCTGCA1321 CCCAGCAAGC TAGGGGGAGA AGAGGAGGCC CAACCACAGT CTCCAGCTCC TGATCCGCCC1381 TGTTCTGCCC TCCACGAACA CCTTTGTCTG GGGGCCTCAG CCGCCCCAGA GGCCTGACTT1441 AGGGGTCTGG CTGTGGAAGG ATGTGTGGCC TCAAATGAGG ACAGGGCTCC CGCCTTCACA1501 GCCCTCGCCA GGGGTCTGCC CCAATCCTGG CCTGCATCAG GGCAGGACGG GGTCTCAGCC1561 CGCCTCCCTC TCTACGTCTC TGTACCGAGC CTCTGGGGCC AGATATAAGA GTGCCTCTCT1621 GAGTCTCAGT TTCCCCATCC ATGAAATGAG AGCTGACTGC CTAGCTCCCA GGGCTTTGTG1681 CAGACGGCCT GAGCTCATGT AATAAAGAAC TGCCCGTAAT ACACAAAAAA AAAAAAAAAA1741 AAAAB核苷酸序列(SEQ ID NO35)长度191个氨基酸1 MGAAGAGAPG NPEDPAEAAQ QLGRPSEAGQ CRFSREEFEQ ILQERNELKA KVFLLKEELA61 YFQRELLTDH RVPGLLLEAM KVAVRKQRKK IKAKMLGTPE EAESSEDEAG PWILLSDDKG121 DHPPPPESKI QSFFGLWYRG KAESSEDETS SPAPSKLGGE EEAQPQSPAP DPPCSALHEH181 LCLGASAAPE AC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO36) 克隆号PP10141起始编码子 862 ATG 终止编码子1435 TGA 蛋白质分子量 20725.001 GTG GAA GTT GGC TGT CTT GTT TCT TGT GAC CTT GGG GGT GTA AAG GAC 4849 AGA GCC CAG GCG ACC TAG GGC ACT ATC TCC CTA CCC CAC GCC TTC TCC 9697 CTT CCT CGT TCC TCC CTA CCC TTA TCG CTT CTA CCC CGC CCA CAC CGC144145 CCT AAA CGG CTT CCT GGG GCG GAA CTG TTT CGC TTT TCC CCG TCC CAG192193 TGG AGG GTG GGG TGG GGG GGT CGC AGC CCT AAG CCT CTG GGA GAC ATG240241 GAG CCC AGG AGG GCG GCG CCC GTG GTG CCT TGG CTG GGG GTC TCG GGA288289 GGC CGC GGG GTC GGC ATC GGC CGC GGC AGT TTG TGT ACC ATC TAG CCG336337 GGG CCC TGG GCA CTT GAG CTG CAG GAT CTG GCG CGC CGT TTC GGG CCG384385 GCA GGC AGG CCG GGC TGG TGC CGC TAG TGG TGC GGG CGC TGG AGC TCT432433 TGG AAC AGG CTG CCG TGG GGC CCG CCC CGG ACT CGC TGC AGG TGT CGG480481 CGC AGG CCG GAC GCA GGA GCT GCG GCG GCT GCG GGA GGA GAA CGA GCG528529 CCT CCG CAG GAG ACT GCG CGC GGG GCC ACA GGA GGA GCG CGC GCT GCT576577 GCG GCA GCT CAA GGA GGT CAC GGC CGA CAG CGG GAC GAA CTC CGG GCG624625 CAC AAC CGC GAC TGC GGC AGC GCG GCC AGG AGA CCG AGG CGT TGC AGG672673 AGC AGC TGC AGC GCC TCC TGC TGG TGA ACG CTG AGC TGC GGC ACA AGC720721 TGG CGG CCA TGC AGA CCC AGN NNG CCG CGC AGG ACC GCG AGA GGG AGC768769 GCC AGC AGC CTT ACG AAG CCG CGA CTC CGC AGG CTA AAG AGC GAG CGC816817 GGG GGC AGC CGG GCG GCC CGG GCA CCA GCA CGG ACA GGA GCC CGA ATG8641 Met 1865 GGC GCC GCC GGC GCA GGC GCC CCA GGG AAC CCT GAG GAC CCG GCG GAG9122 Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Pro Gly Asn Pro Glu Asp Pro Ala Glu 17913 GCC GCG CAG CAG CTC GGG CGC CCC TCG GAG GCA GGG CAG TGC CGC TTC96018 Ala Ala Gln Gln Leu Gly Arg Pro Ser Glu Ala Gly Gln Cys Arg Phe 33961 AGT CGG GAG GAG TTT GAG CAG ATC CTT CAG GAG CGG AAT GAA CTC AAA 100834 Ser Arg Glu Glu Phe Glu Gln Ile Leu Gln Glu Arg Asn Glu Leu Lys 491009 GCC AAA GTG TTC CTG CTC AAG GAG GAA CTG GCC TAC TTC CAG CGG GAG105650 Ala Lys Val Phe Leu Leu Lys Glu Glu Leu Ala Tyr Phe Gln Arg Glu 651057 CTG CTC ACA GAC CAC CGG GTC CCC GGC CTT CTG CTC GAG GCC ATG AAG110466 Leu Leu Thr Asp His Arg Val Pro Gly Leu Leu Leu Glu Ala Met Lys 811105 GTG GCT GTC CGG AAG CAG CGG AAG AAG ATC AAG GCC AAG ATG TTA GGG115282 Val Ala Val Arg Lys Gln Arg Lys Lys Ile Lys Ala Lys Met Leu Gly 971153 ACA CCA GAG GAA GCA GAG AGC AGT GAG GAT GAG GCT GGC CCA TGG ATC120098 Thr Pro Glu Glu Ala Glu Ser Ser Glu Asp Glu Ala Gly Pro Trp Ile 1131201 CTG CTC TCC GAT GAC AAG GGA GAC CAT CCC CCA CCC CCG GAG TCC AAA1248114 Leu Leu Ser Asp Asp Lys Gly Asp His Pro Pro Pro Pro Glu Ser Lys 1291249 ATA CAG AGT TTC TTT GGC CTA TGG TAT CGG GGT AAA GCT GAA TCC TCT1296130 Ile Gln Ser Phe Phe Gly Leu Trp Tyr Arg Gly Lys Ala Glu Ser Ser 1451297 GAG GAT GAG ACC AGC AGC CCT GCA CCC AGC AAG CTA GGG GGA GAA GAG1344146 Glu Asp Glu Thr Ser Ser Pro Ala Pro Ser Lys Leu Gly Gly Glu Glu 1611345 GAG GCC CAA CCA CAG TCT CCA GCT CCT GAT CCG CCC TGT TCT GCC CTC1392162 Glu Ala Gln Pro Gln Ser Pro Ala Pro Asp Pro Pro Cys Ser Ala Leu 1771393 CAC GAA CAC CTT TGT CTG GGG GCC TCA GCC GCC CCA GAG GCC TGA CTT1440178 His Glu His Leu Cys Leu Gly Ala Ser Ala Ala Pro Glu Ala *** 1921441 AGG GGT CTG GCT GTG GAA GGA TGT GTG GCC TCA AAT GAG GAC AGG GCT14881489 CCC GCC TTC ACA GCC CTC GCC AGG GGT CTG CCC CAA TCC TGG CCT GCA15361537 TCA GGG CAG GAC GGG GTC TCA GCC CGC CTC CCT CTC TAC GTC TCT GTA15841585 CCG AGC CTC TGG GGC CAG ATA TAA GAG TGC CTC TCT GAG TCT CAG TTT16321633 CCC CAT CCA TGA AAT GAG AGC TGA CTG CCT AGC TCC CAG GGC TTT GTG16801681 CAG ACG GCC TGA GCT CAT GTA ATA AAG AAC TGC CCG TAA TAC ACA AAA17281729 AAA AAA AAA AAA AAA A 174权利要求
1.一种分离的具有抑癌功能的人蛋白，其特征在于，它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组SEQ ID NO3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36的编码区序列或全长序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8.一种具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达具有抑癌功能的人蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的具有抑癌功能的人蛋白特异性结合的抗体。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的蛋白以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了一类新的具有抑癌功能的人蛋白，编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病如癌症等的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸的用途。
文档编号C07K14/435GK1403480SQ01126728
公开日2003年3月19日 申请日期2001年9月12日 优先权日2001年9月12日
发明者顾健人, 杨胜利 申请人:上海新世界基因技术开发有限公司