专利名称：一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的高效表达的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，简称rh-bFGF)高效表达菌株的构建背景技术：
bFGF是一种碱性多肽，1974年由Gospodarowicz首次从牛脑垂体和脑组织中分离得到，由于具有促成纤维细胞(Balb/c3T3)增殖的特性，且具有较强的碱性(等电点为9.6)，因此命名为碱性成纤维细胞生长因子(A.Gopodarowicz，Nature，249，123，1974)。1984年Bohlen等进一步纯化bFGF并测定其氨基酸序列，确定了由牛脑垂体分离纯化得到的bFGF的N端15个氨基酸序列。1985年Esch等人报道了由牛脑垂体提取的bFGF的氨基酸全序列。1986年，Abraham等人报道了牛bFGF基因的克隆，随后他们又克隆了人bFGF(hbFGF)分子(EMBO Joumal，5，2523-2528 1986)。人与牛的bFGF分子相比，仅有两个氨基酸不同。全长hbFGF分子由155个氨基酸组成，分子量大约为17kD。bFGF在体内分布十分广泛，脑、心、肝、骨、眼、肾上腺、胎盘等处均有表达。bFGF是重要的促有丝分裂的因子，也是形态发生和分化的诱导因子，其生物学功能主要有促进新血管生成、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生、参与神经再生等。近年研究发现，bFGF还具有在动脉粥样硬化和血管损伤过程中介导血管平滑肌增生的作用。由于bFGF具有上述多种重要的生物学功能，因此国内外许多公司一直非常关注bFGF的开发，目前bFGF作为治疗创伤和溃疡方面的外用药物已经上市，治疗神经系统和心血管系统的注射用bFGF正在开发。总之，bFGF在医药应用方面有很大的潜力。
目前，仍主要采用大肠杆菌表达bFGF，但这一表达系统存在的主要问题是表达量太低(PCT专利，申请号WO86/07595)，近年有人利用PCR的方法在bFGF缺失体的N端引入碱基突变，使bFGF的表达量有所提高(公开专利CN 1188151)。但bFGF的表达量仍然仅占大肠杆菌总蛋白的15％左右，与某些细胞因子在大肠杆菌中的表达水平相比，还有很大差距。
发明内容
本发明的目的在于构建一种hbFGF的高效表达菌株。利用全基因合成技术，在不改变氨基酸序列的情况下将编码hbFGF基因密码子改为大肠杆菌偏性密码子，主要做以下突变编码精氨酸的密码子突变为CGT(共突变8个密码子，位点分别为31、48、69、90、106、116、118、129)，编码脯氨酸的密码子突变为CCG(共突变6个密码子，位点分别为10、29、45、58、141、150)，编码亮氨酸的密码子突变为CTG(共突变9个密码子，位点分别为62、64、83、91、92、107、134、147、149)。然后将之分别插入带有T7启动子的原核表达载体pET-23b和带有Tac启动子的原核表达载体pKK223-3中，构建成高效重组表达质粒pET-hbFGF和pKK223-hbFGF，然后转化大肠杆菌，获得阳性重组子。该重组子经培养及诱导表达，bFGF的表达量均占菌体蛋白总量的25％以上，明显高于相关文献报道的水平。
具体实施例方式
本发明利用全基因合成技术，合成了hbFGF的全长DNA，再将之克隆进pGEM-T载体，获得重组质粒pGEM-hbFGF。对重组质粒的序列分析表明，所获得的DNA序列与实验设计完全一致。
将hbFGF DNA由pGEM-hbFGF重组质粒亚克隆入带有T7启动子的高效表达载体pET-23b，和带有Tac启动子的高效表达载体pKK223-3中，获得了可编码hbFGF成熟蛋白的重组质粒pET-hbFGF和pKK223-hbFGF。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和E.coli JM109(DE3)受体细胞，构建成BL21(DE3)/pET-hbFGF和JM109(DE3)/PKK-hbFGF工程菌株。以上菌株均可高效稳定地表达目的蛋白，表达量占菌体总蛋白量的25％以上。
本发明运用重组DNA技术，在天然hbFGF的基因序列基础上将编码hbFGF的密码子突变为大肠杆菌偏性密码子，主要编码将精氨酸的8个密码子突变为CGT，编码脯氨酸的6个密码子突变为CCG，编码亮氨酸的9个密码子突变为CTG，从而使hbFGF在大肠杆菌中的表达水平明显提高，为进一步提高生产效率奠定了坚实的基础。
本发明用下述实例进行说明实施例1重组表达载体的构建根据文献报道的hbFGF全长基因序列，利用全基因合成技术，将密码子突变为大肠杆菌偏性密码子，主要将编码精氨酸的密码子突变为CGT(分别为31、48、69、90、106、116、118、129位密码子)编码脯氨酸的密码子突变为CCG，(分别为10、29、45、58、141、150位密码子)，编码亮氨酸的密码子突变为CTG(分别为62、64、83、91、92、107、134、147、149位密码子)。并为方便与表达载体连接，在hbFGF全基因序列的两端分别加入NdeI和BamHI的酶切位点。
(1)hbFGF基因克隆进pGEM-T载体全基因合成的hbFGF序列与美国Promega公司的pGEM-T载体连接，连接反应参照产品说明书进行。具体如下反应混合物 (单位μl)全基因合成产物 32×T4连接酶反应缓冲液(美国Promega公司生产) 5PGEM-T载体(美国Promega公司生产) 1T4连接酶(美国Promega公司生产)1总体积 10μl4℃连接过夜。
将连接反应混合物转化DH5α感受态细胞，经37℃培养过夜后，从琼脂板上挑取转化子，接种含氨苄青霉素的LB培养基，培养过夜后，用美国Promega公司质粒提取试剂盒小量制备质粒。质粒用NdeI和BamH I进行酶切，分别在3kb左右和486bp左右出现特异DNA条带，与预计情况相符，说明重组质粒构建成功，将获得的阳性重组子命名为pGEM-hbFGF(2)pET-rhbFGF重组表达载体的构建及转化大肠杆菌表达载体pET-23b质粒先经Nde I酶切，再用BamH I进行酶切。然后用1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的样品，再用美国Clontech公司生产的凝胶纯化试剂盒从胶中纯化出pET23b 3.7kb大小的酶切片段。
与此同时将pGEM-hbFGF质粒进行Nde I和BamH I双酶切，经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离后，用美国Clontech凝胶纯化试剂盒回收486bp的rhbFGF的片段。再将上述两种回收产物在T4 DNA连接酶催化下连接成重组质粒，然后将连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞，涂LB-Amp琼脂平板，置37℃培养过夜。
用美国Promega公司质粒提取试剂盒小量制备转化子质粒。质粒用Nde I和BamH I进行酶切可产生两条DNA片段，分别为3.7kb大小的pET-23b载体片段和486bp的rhbFGF DNA片段，与预计情况相符。将获得的阳性重组子命名为pET-hbFGF。阳性重组子由博亚公司进行序列测定，测序结果显示，所获得的阳性重组子序列与设计完全一致。
(3)pKK223-rhbFGF重组表达载体的构建与转化大肠杆菌表达载体pKK223-3质粒先经Smal酶切。然后将酶切产物经酚、氯仿抽提后乙醇沉淀，重悬于无菌纯净水中。
与此同时将pGEM-hbFGF质粒进行Nde I和BamH I双酶切，然后用DNA聚合酶I(Klenow大片段)补平酶切后的3’凹端，乙醇沉淀，并将沉淀重悬于无菌纯净水中。在T4 DNA连接酶催化下与酶切后的pKK223-3载体连接成重组质粒，将连接产物转化JM109(DE3)感受态细胞，涂LB-Amp琼脂平板，置37℃培养过夜。
用美国Promega公司质粒提取试剂盒小量制备转化子质粒。质粒用两端特异性引物进行PCR扩增，扩增出486bp的rhbFGF DNA片段，与预计情况相符。将获得的阳性重组子命名为pKK223-hbFGF。阳性重组子由博亚公司进行序列测定，测序结果显示，所获得的阳性重组子序列与设计完全一致。实施例2rh-bFGF的表达工程菌株BL21(DE3)/pET-hbFGF，JM109(DE3)/PKK223-hbFGF，分别经LB液体培养基(含氨苄青霉素100ug/ml)过夜活化，100倍放大培养，37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度为0.1mM，诱导表达4小时。收集菌体，SDS-PAGE电泳检定hbFGF表达量都占菌体总蛋白的25％以上。
附录一种重组人碱性成纤维细胞生长因子核苷酸序列和氨基酸序列<110>北京三元基因工程有限公司<120>一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的高效表达<160>2<210>1<211>465<212>DNA<213>人工序列<220><223>在天然hbFGF基因序列的基础上，将密码子突变为大肠杆菌偏性密码子<220><221>misc-feature<222>(93，144，207，270，318，349，355，387)<223>y＝t或c<400>1atggctgctg gttctatcac tactctgccg gctctgccgg aagacggtgg ttctggtgct 60ttccggccgg gtcacttcaa agacccgaaa cgyctgtact gcaaaaacgg tggtttcttc 120ctgcgyatcc acccggacgg tcgygttgac ggtgttcgyg aaaaatctga cccgcacatc 180aaactgcagc tgcaggctga agaacgyggt gttgtttcta tcaaaggtgt ttgtgctaac 240cgttacctgg ctatgaaaga agacggtcgt ctgctggctt ctaaatgtgt tactgacgaa 300tgtttcttct tcgaacgyct ggaatctaac aactacaaca cttaccgytc tcgyaaatac 360acttcttggt acgttgctct gaaacgyact ggtcagtaca aactgggttc caaaactggt 420ccgggtcaga aagctatcct gttcctgccg atgtctgcta aatct 465<210>2<211>155<212>PRT<213>人类(homo sapiens)<400>2Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp510 15Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys
20 25 30Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro35 40 45Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile50 55 60Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys65 70 75Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg80 85 90Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu95 100 105Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr110 115 120Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu125 130 135Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro140 145 150Met Ser Ala Lys Ser15权利要求
1.一种人工合成的人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)的基因序列，其特征在于在天然人全长碱性成纤维细胞生长因子基因序列的基础上，将密码子改为大肠杆菌偏性密码子。
2.根据权利要求1合成的基因序列，至少要引入下述突变将编码精氨酸的密码子突变为CGT或突变为CGC(有同样效果)，编码脯氨酸的密码子突变为CCG，编码亮氨酸的密码子突变为CTG。
3.将根据权利要求1和2构建的hbFGF DNA，与原核表达载体连接，转化大肠杆菌，构建成高效表达hbFGF的工程菌株，其特征在于(1)hbFGF DNA与具有T7或Tac启动子的原核表达载体连接，组装成高效重组表达质粒；(2)上述重组表达质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌JM109(DE3)，构建成高效表达hbFGF的工程菌株，经IPTG诱导表达。
全文摘要
本发明涉及一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的高效表达。本发明利用全基因合成技术，在不改变氨基酸序列的情况下，将编码人全长bFGF的密码子改为大肠杆菌偏性密码子，并将其构建入分别带有T7启动子的原核表达载体pET23b和带有Tac启动子的原核表达载体pKK223－3中，组成高效表达重组质粒pET－hbFGF，pKK223－hbFGF然后转化大肠杆菌，经IPTG诱导，hbFGF表达量占菌体总蛋白的25％以上，明显高于相关文献报道的表达水平。
文档编号C07H21/00GK1448510SQ0210385
公开日2003年10月15日 申请日期2002年4月4日 优先权日2002年4月4日
发明者刘爽, 刘金毅, 侯芳, 孙俭波, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司, 北京毕艾欧科技发展有限责任公司