专利名称：植物耐逆相关的信号传递基因及其编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地讲它涉及植物中的一类新的信号传递基因及其编码的蛋白质。
另外，在烟草中也相继克隆了4个可能的乙烯受体基因，TETR1(Accession NO.AF022727)，NTERS1，NTHK1。其中，NTHK1属于一类新的乙烯受体基因。对NTHK1的研究表明，它受到各种逆境(盐，干旱，伤害)的明显诱导[14]。受器结构域。过量表达的转基因拟南芥对盐和干旱胁迫的耐性比野生型明显提高，这表明NTHK1可能是一个有功能的信号传递基因。该基因及其编码蛋白质已申请专利，公开号为CN1288951A.
因而，本发明的一个目的是提供一种新的杂合型乙烯受体类信号传递蛋白及其编码基因，其表达受干旱、高温和伤害诱导，从而为植物耐逆性基因工程改良提供了目的基因和调控元件。
本发明的另一个目的是提供一类新的信号传递蛋白，此类蛋白中的一种的氨基酸序列如
图1所示。
本发明的还一个目的是提供编码上述新的信号传递蛋白的核苷酸序列，此类基因中的一种如图2所示。
本发明所述的蛋白质(基因)可以是来自所有单子叶和双子叶植物，如烟草、拟南芥、草坪草、杨树、大豆、小麦、水稻、棉花或蕃茄等。
本发明提供了NTHK2基因及其编码蛋白在一种培育耐逆植物品种中的应用。包括将本发明所述的信号系统基因导入植物细胞并使其表达。
可利用本发明NTHK2基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
本发明的NTHK2基因的受体植物包括单子叶和双子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、蔬菜、树木和草坪草等。
营养生长阶段的烟草(40到50cm高，15到20片叶)用于伤害处理。取成熟健康的叶剪成1到2cm2大小，在0.5×MS的溶液中摇动(150r/min)3小时。RNA提取按Zhang J.S.(1996)等的方法进行。用上述RNA制备mRNA然后合成cDNA构建cDNA文库。以烟草NTHK1基因(已申请专利，公开号为CN1288951A)为探针，从上述cDNA文库中筛选出数个阳性克隆，其中一个与NTHK1基因的同源性为51％。该片段命名为NTHK2。
运用RT-PCR方法获得NTHK2全基因。根据上述NTHK2序列设计并合成基因特异引物GSP1(389-415)和GSP2(203-228)。具体操作按照SMART RACE(CLONTECH)试剂盒进行。首先进行逆转录，反应体系为1μl伤害处理的烟草叶片的总RNA、1μl 5′-CDS引物、1μl SMARTII oligo引物(10μmol/L)和2μl灭菌水。混匀后，于70℃加热2min，置冰上冷却2min，离心使液体沉底。加入2μl 5×第一链缓冲液、1μl DTT(20mmol/L)、1μl dNTP(10mmol/L)和1μl MMLV逆转录酶(200U/μl)，42℃逆转录1.5hr，加入100μl灭菌水，于72℃加热2min终止逆转录反应。随后，以通用引物混合物(UPM)和GSP1进行“Touchdown”PCR扩增[16]。在Perkin-Elmer(PE)DNA Thermal Cycler 9600启动PCR反应，条件为5×(94℃30s，72℃ 3min)，5×(94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 3min)。通过上述RACE PCR反应，获得了单一条带A，长度大约为1.6Kb。以条带A为模板，使用巢式通用引物(NUP)和GSP2进行鉴定，获得单一条带B，长度大约为1.4Kb。因为GSP1和GSP2在位置上相差200bp，所以所得PCR片段与预计长度一致。从胶中回收B片段，纯化，直接测序。测序结果与已知序列进行拼接，并结合测序峰图进行校正。获得拼接好的序列(图2)。根据拼接好的序列，分别在编码区的5’和3’末端设计一对引物，以烟草的cDNA为模板扩增出单一条带，估计长度为2.3kb。该片段回收后，克隆至pGEM-T Easy载体测序。测序结果与拼接结果完全一致。NTHK2基因全长有3216bp，其中5’非编码区为509bp，3’非编码区为427bp，编码区为2280bp(图2)，编码产物为760个氨基酸(图1)，计算分子量为85.2KD，pI值为7.2。
NTHK2氨基酸序列与植物中的许多杂合型的乙烯受体基因有较高的同源性。例如，它与西红柿的乙烯受体同源物LeETR5的同源性为78.6％，与我们实验室所克隆的NTHK1的同源性为55％，与研究较为深入的ETR1有32.5％的同源性。因为ETR1、NTHK1及其他所比较的蛋白均为乙烯受体或其同源物，所以推测NTHK2也是烟草中的乙烯受体同源物。由SMART程序给出的结构预测参见图3。在NTHK2氨基端有一个信号肽结构，其后紧接着三个疏水螺旋为跨膜区，可能与乙烯的结合有关。有两个功能结构域，即组氨酸激酶结构域和接受域。但是，在激酶结构域中没有保守的组氨酸，这与NTHK1及ETR1不同，因此它具有不同的功能，该基因命名为NTHK2(Nicotiana Tobacum Histidine Kinase-like)。
本发明中克隆的植物信号系统基因NTHK2具有杂合型乙烯受体蛋白的特征，与NTHK1蛋白的相似性为55％，上述实验例表明其与已知此类蛋白有不同的功能，因此界定NHTK2为一个新的蛋白，其编码基因为一个新的基因。
图2.烟草NTHK2基因的核苷酸序列。
图3.高盐和干旱胁迫对NTHK2基因转录的诱导作用，盐和干旱对烟草幼苗中NTHK2表达的影响用不同浓度的NaCl和PEG溶液浇灌烟草幼苗，24h后收取材料进行竞争RT-PCR。
图4.冷及高温胁迫对NTHK2基因转录的诱导作用，冷、热激及ABA对烟草幼苗NTHK2表达的影响，用竞争RT-PCR法测定。
图5.剪切伤害对NTHK2基因转录的诱导作用，伤害对NTHK2表达的影响，烟草叶片剪切成1-2cm2的碎片并在0.5×MS中摇动不同时间，应用竞争RT-PCR完成。
权利要求
1.一种存在于植物中的信号传递蛋白，它具有如下的氨基酸序列LRWLFLGLLISLVIISVKANDTEFSNCNCDEEGMWSIHNILECQKVSDFLIAVAYFSIPLELLYFISCSNIPFKWVLIQFIAFIVLCGLTHLLNGLTYNSAHPSFQLIMSLTVAKILTALVSCATAITLLTLFPLLLKIKVRELFLTQNVMELDQEVGLMKKQKEVCMQVRMLTREIRKSIDKHNILYTTLVELSKTLNLHNCAVWMPNENRSVMNLTHGLSPGSAVEYHRSLPIDDPDVLEITKDKGVRILRQDSVLAAASSGGPGEPCTVAAIRMPLLRASDFKGGTPVLVDTRYAILVLVLPSGDFDWSSNEMEIVEVVADQVAVALSHATVLEESQLMREKLEIRNGLLQQAKENAVKATQARNSFQKVMNNGMRQPMHSVLGLLSILQDENFTSSNQRIIIDTMMRTSTVLSTLTNDAMDISEKDEGRIPVEMMPFQLHSLIREASCLVKCLCIYKGFGFSTDFPNSLPNLVMGDEMRTFQVLLHMVGHLLNISFGSGSVVFRVGTEDGNDKIWGARRHSIVDEYVTIKFETKINLESSQRNSSMSSIHFGGRRYNSKELKEGLSFRMCKKLVQMMQGNVYMSSNSEGRAQGMTLILRFLKQSSFRKHMFDLGNPLEQAISSSMFKGLQVLLADDDDVNRMVTKKLLEKLGCQVIAVSTGFQCLSAMGHSKTSIQVVILDLHMPEMDGFEVAIRVRKFHSHGWPLIIALSATSEELVWDRCLQVGINGLIRKPVLLQGMAEELQRVLQRAGEGF
2.按照权利要求1所述的信号传递蛋白质，它来自单子叶或双子叶植物。
3.按照权利要求1所述的信号传递蛋白质，它来自禾本科、茄科、豆科、十字花科、藜科、杨柳科。
4.按照权利要求1所述的信号传递蛋白质，它来自烟草、拟南芥、大豆、草坪草、棉花、小麦、油菜、蕃茄、杨树、玉米、高粱或水稻。
5.一种编码权利要求1所述的蛋白质的基因的核苷酸序列。
6.按照权利要求5所述的编码蛋白质的基因具有如下的核苷酸序列AAAAAAAAAAACTTTATGCTGTTTTAATAGGTTTTAACCTTTTTCTCTTCATAGTTTCTTGTTTTTGGAGTGCCAAAAAAAATCGAGGAACTTGGAATATTGTTTTTTCCAAGATCACTTTTTTATCATCAACTAGAATTTGGGTTTCTCTATTTATGTGTAAAGATTAAAGCTTTCTGCTCTTTTATTAGTTTTTAATCTTTTTCCCTTCATAATTTCTTGTTTTTGGAGTGCAAAGAAGAAAATTAATTGGGGAAAAGAATAATCTTGGATTGAAAATTTTGAGGCTTTGCTCAAAAGGGTATGCTAGATTTTGAGGAATATAGGTATGTTAGATCTAGGAATGTTAAAGATCATTTTTTGTTACTACTTTTTATTGGAGTTGTGAGCCAATGAGATCTAATTGGTTGTTTGCATTTCATGTTGATTGAGTTGAGATATTCAGAAAATTCAAAATTTTCCCAATTTGATGGTTTGAAAGGAGTCCTTTTAAGGTAAGAATATTAATTATGTTAAGGTGGTTGTTTCTAGGATTGTTGATTTCTTTGGTCATTATCTCTGTTAAAGCTAATGATACTGAATTCTCCAATTGTAACTGTGATGAAGAAGGTATGTGGAGTATACATAACATTCTTGAGTGCCAAAAGGTGAGTGATTTCTTGATTGCAGTTGCTTACTTTTCTATTCCACTTGAGTTGCTTTACTTTATTAGTTGCTCAAATATTCCTTTTAAATGGGTTCTTATCCAATTCATTGCATTCATAGTACTATGTGGCTTGACTCATTTGCTCAATGGATTGACTTATAATAGTGCTCATCCTTCCTTCCAATTGATAATGTCATTAACAGTTGCCAAAATCTTAACTGCCCTTGTTTCTTGTGCAACTGCAATTACCCTTTTGACTCTGTTCCCTCTACTCCTCAAAATAAAAGTTAGAGAACTGTTTTTGACACAAAATGTTATGGAGCTTGATCAAGAGGTTGGGTTGATGAAGAAGCAGAAAGAAGTATGTATGCAAGTCCGTATGCTTACACGAGAAATTAGGAAGTCGATTGATAAACACAATATCTTGTATACTACTCTAGTTGAGCTTTCAAAGACCTTGAATCTGCACAACTGTGCAGTTTGGATGCCAAATGAAAATAGGTCAGTGATGAACTTGACACATGGGTTAAGCCCCGGTTCTGCTGTAGAATACCATCGTTCACTTCCTATCGATGATCCGGATGTGTTGGAGATAACAAAGGACAAAGGGGTAAGGATTTTGAGGCAAGATTCAGTTCTTGCAGCTGCAAGCAGTGGAGGGCCTGGTGAGCCGTGTACTGTTGCAGCAATTCGGATGCCATTGCTTCGTGCTTCGGATTTCAAAGGGGGAACGCCGGTGTTGGTTGACACTCGTTACGCCATTTTGGTTTTGGTTCTTCCAAGTGGGGATTTTGATTGGAGCAGTAATGAGATGGAGATAGTGGAAGTAGTTGCTGATCAGGTGGCGGTGGCACTGTCTCATGCCACGGTTCTTGAAGAGTCTCAATTAATGAGGGAGAAACTAGAGATTAGGAATGGTTTGCTGCAGCAGGCTAAGGAGAATGCTGTGAAGGCAACACAGGCAAGGAATTCATTTCAAAAGGTAATGAACAATGGGATGAGACAGCCAATGCACTCAGTTTTGGGTTTGCTTTCCATACTTCAAGACGAGAACTTTACAAGCTCTAACCAGAGGATTATTATTGACACAATGATGAGAACAAGCACCGTTCTGTCAACTTTAACAAATGATGCAATGGATATATCCGAGAAAGATGAAGGAAGAATCCCAGTAGAAATGATGCCCTTTCAGCTGCATTCACTGATCAGAGAGGCTTCTTGTCTTGTTAAATGCCTGTGTATTTATAAGGGCTTTGGCTTTTCTACGGATTTTCCCAATTCTTTGCCTAATCTGGTGATGGGCGATGAAATGAGAACGTTTCAGGTGTTACTTCATATGGTGGGGCATCTATTAAATATCAGCTTTGGAAGCGGCTCCGTTGTATTCAGGGTTGGAACTGAGGATGGGAATGATAAGATTTGGGGAGCAAGAAGACATAGCATAGTTGATGAATACGTTACCATAAAATTTGAAACTAAAATTAATCTTGAAAGTTCTCAAAGAAATAGCTCAATGTCAAGTATTCACTTTGGTGGAAGGAGGTATAACAGCAAAGAGTTAAAGGAGGGCTTGAGTTTCCGCATGTGCAAAAAGCTTGTTCAGATGATGCAGGGAAACGTATATATGTCCTCAAATTCCGAGGGTCGTGCACAAGGGATGACTCTTATTCTCAGATTTCTAAAACAGTCATCATTTAGAAAACACATGTTTGATCTTGGAAATCCTTTGGAGCAAGCAATTTCCAGCTCAATGTTCAAAGGCCTTCAAGTTCTACTTGCTGATGACGATGACGTAAATAGAATGGTAACCAAAAAGCTGCTCGAAAAACTGGGTTGCCAAGTAATTGCTGTGTCAACTGGTTTTCAGTGCCTAAGTGCAATGGGCCATTCAAAAACTTCTATACAAGTTGTCATTTTGGATCTTCACATGCCGGAAATGGATGGATTTGAAGTGGCGATTAGGGTGCGCAAGTTCCACAGCCATGGTTGGCCGTTGATCATAGCCTTATCTGCTACTTCAGAGGAACTAGTTTGGGACAGATGCCTACAGGTCGGAATCAACGGTCTCATAAGAAAACCTGTTCTCTTGCAAGGAATGGCCGAGGAACTTCAGAGAGTCCTACAAAGGGCTGGTGAAGGCTTTTGATGTAATACTAATGGCGAAAACAAACTTGGAGTTCTCGAAATAGTCACGAGCCTGAATTCAAACCACCTTCACTCAGTAGCAGAGCCAGGAATTCTAACCAAGGATATTCAAAAAAAAATGCAGGAATGTCACACCAAGGATTCAACCCTGCAACTTAAAAGCAATTTTTGGACCGCCTTTGCCATTACACTAGAAACTTCTCTTATGTCTAGAGGATTCAAAAATACAAATATATGCACAAAAAAATTATTTTTCCCTATTTGCACAGTATAGTTTTCCAACGACTTCATTACATGTAGCTCCGCCAGTGCCTTTACTGACCATTGTAGAGATAACATCACAGCTTTGGCAGATAAATCAGCTTCTTGCTAACCTTGTAGTATGTGCAGTTTACATCATACAACATTACAACTTAAAAAAAAAA
7.按照权利要求1所述的蛋白质的氨基酸序列在植物基因工程中的应用。
8.按照权利要求5或6所述的核苷酸序列在植物基因工程中的应用。
全文摘要
本发明公开了存在于植物中的一类信号传递基因NTHK2以及其所编码的蛋白质和该基因在植物中受伤害(切割)、干旱和高温诱导的特点。该基因所编码的蛋白与植物中的杂合型乙烯受体蛋白有较高的同源性但并非同类，它是一类新的与植物耐逆性相关的蛋白。本发明还涉及NTHK1基因和所编码的蛋白在植物基因工程中的应用。
文档编号C07K14/415GK1438241SQ0210503
公开日2003年8月27日 申请日期2002年2月11日 优先权日2002年2月11日
发明者张劲松, 陈受宜, 张志刚 申请人:中国科学院遗传研究所