专利名称：一种龙血竭总黄酮制备工艺及其新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物制备工艺及其新用途，特别是涉及一种龙血竭总黄酮制备工艺及其新用途。
背景技术：
血竭作为传统名贵中药材，始载于《唐本草》，在以往的医疗实践中，其来源曾经长期依赖进口。在我国研制出进口代用品龙血竭以后，近年来对龙血竭则进行了比较系统的研究。其中很多文献报道集中在龙血竭的化学成份研究上。我国的广西血竭(龙血竭)和云南血竭均含有挥发油、黄酮、酚类、强心苷、多糖等成份。药理作用研究表明龙血竭具有消炎止痛作用、对血液流变学的双向调节作用；对子宫平滑肌收缩的抑制作用等。
临床应用研究表明龙血竭具有促进表皮修复、治疗冠心病、消化道出血、大面积褥疮、结肠炎等作用。
技术内容本发明目的在于提供一种龙血竭总黄酮制备工艺及其新用途。
本发明目的是提供如下技术方案实现的。
龙血竭药材粉碎成粗粉，加6-10倍量乙酸乙酯回流提取2-3次，每次1-2小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以320-40倍提取物量的0.2-0.5％NaOH溶液搅拌20-40分钟使溶解，滤过；滤液用5-12％HCl调pH至1～2，静置8-24小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，60℃以下真空干燥，粉碎，即得龙血竭总黄酮。
本发明是通过如下实验例实现的。
实验例1龙血竭总黄酮对大鼠实验性静脉血栓形成的影响实验分组与剂量设计，实验动物随机分为5组①膜型动物组实验动物20只。每日灌服0.25％CMC(溶剂对照)，1ml/100g体重，连续2周。
②阳性药舒血宁组实验动物15只。每日灌服舒血宁80mg/kg体重，连续2周。
③龙血竭大剂量组实验动物15只。每日灌服龙血竭总黄酮160mg/kg体重，连续2周。
④龙血竭中剂量组实验动物15只。每日灌服龙血竭总黄酮80mg/kg体重，连续2周。
⑤龙血竭十剂量组实验动物15只。每日灌服龙血竭总黄酮40ms/kg体重，连续2周。
实验步骤，末次给药后1小时，以戊巴比妥钠(40mg/kg，ip)麻醉，开腹分离下腔静脉，于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉。由于静脉血流阻断，血栓形成。缝合腹壁，结扎后4小时重新开腹，在结扎下方2cm处夹闭血管，剖开管腔，取出血栓称湿重，干燥后再称干重。取平均值，经t检验，进行组间比较。
实验结果见表1。
表1龙血竭总黄酮对大鼠实验性静脉血栓形成的影响(X±SD)血栓重量(X±SD)及重量降低百分率(％)动物数组别 降低(只) 湿重(mg) 干重(mg) 降低(％)(％)模型组 18 18.8±5.7 6.7±2.0阳性药组15 7.9±4.1**57.9 3.1±1.7**53.7大剂量组15 7.5±4.3**60.1 3.0±1.5**55.2中剂量组14 10.3±6.4**45.2 4.0±2.3**40.3小剂量组13 14.7±8.1 21.8 5.7±2.817.2注经t检验，与模型动物组相比，**P＜0.01。
龙血竭总黄酮160mg/kg体重和80mg/kg体重，连续灌胃1周，可明显抑制大鼠实验性深静脉血栓形成。血栓的湿重、干重与模型组动物相比均有明显的降低(P＜0.01)，且有一定的量效关系，龙血竭总黄酮40mg/kg体重组实验动物血栓的湿重、于重与模型组动物相比，降低不明显(P＞0.05)。龙血竭总黄酮大剂量组的疗效与阳性对照药舒血宁相当。
实验例2龙血竭总黄酮对局灶性脑缺血大鼠的行为及脑组织损伤的影响实验动物随机分为7组，即①模型组(溶剂对照，n＝13)每日灌服0.25％CMC，0.5ml/100g体重，连续4大。末次给药15min后按方法3.2复制局灶性脑缺血模型。
②假手术组(n＝6)每日灌服0.25％CMC，0.5ml/100g，连续4天。末次给药15min后手术同模型组，但不插线。
③尼莫地平组(n＝10)每日灌服尼莫地平5mg/kg体重，0.5ml/100g，连续4天。末次给药15min后手不同模型组。
④脑得生组(n＝10)每日灌服脑得生2.7g/kg体重，0.5ml/100g，连续4天。末次给药15min后手术同模型组。
⑤龙血竭总黄酮大剂量组(n＝15)每日灌服龙血竭总黄酮100mg/kg体重，0.5ml/100g，连续4天。末次给药15min后手术同模型组。
⑥龙血竭总黄酮中剂量组(n＝10)每日灌服龙血竭总黄酮50mg/kg体重，0.5ml/100g，连续4天。木次给药15min后手术同模型组。
⑦龙血竭总黄酮小剂量组(n＝8)每日灌服龙血竭总黄酮25mg/kg体重，0.5mi/100g，连续4天。末次给药15min后手术同模型组。
大鼠局灶性脑缺血模型参照Longa方法，阻塞大脑中动脉(MCA)造成大鼠局灶性脑缺血模型。取SD大鼠，以10％的水合氯醛麻醉(350mg/kg，ip)，仰位固定，沿颈部中线切开皮肤及皮下组织，分离右侧颈总动脉及其颈内和颈外分支。结扎颈总和颈外动脉，动脉夹夹闭颈内动脉，剪开颈总动脉远心端，将直径为0.26mm的尼龙线插入颈总动脉，穿过颈内和颈脉动脉分叉处进入颈内动脉。
松开动脉夹，继续将线插入到颈内动脉的颅内段。当感到明显阻力时，此时插入线的总长度约为2.0cm，即可阻断MCA。结扎插线以防脱落，缝合皮肤。
神经功能行为评分和脑梗死范围测定脑缺血24h后，对大鼠的神经功能行为进行评分。评分参照Bederson和Lin的方法进行。具体方法如下(总分为11分)①提起鼠尾离开地面，观察前肢情况。正常大鼠两前肢对称地伸向地面。出现腕曲、肘曲、肩内旋者分别评为1～3分，同时出现肩内旋伴腕曲或肘曲者评为4分。②将大鼠置平滑地板上，分别推左(或右)肩向对侧移动，检查抵抗推动的阻力。正常大鼠双侧阻力明显对称。右肩向左侧移动时，发现阻力下降者，根据下降的轻、中、重程度，分别评为1～3分。③将大鼠两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。正常大鼠两前肢肌张力明显对称。发现左前肢肌张力下降者，根据下降的轻、中、重程度，分别评为1～3分。③将大鼠置地板上，观察其行走。出现明显转圈者，评为1分，否则0分。分数越高，说明动物的行为障碍越严重。评分采用单盲法。
脑梗死范围测定采用TIC染色法。脑缺血24h后，大鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，将前脑冠状切成5片。切片位置为大脑前极和视交叉连线中点、视交叉部位、漏斗柄部位和漏斗柄与后极之间处。将脑片浸入5mlTTC染色液中(包括4％TTC 1.5ml，1mol/LK2HPO40.1ml和蒸馏水3.4ml)，37℃避光染色30min。然后照相，计算机分析，获得梗死区域面积占前脑半球总面积的百分比，来表示脑梗死范围。
统计学处理，所有数据皆以平均值±标准差表示。两组间比较用t检验。
结果1、龙血竭总黄酮对局灶性脑缺血后神经功能行为评分的影响大脑中动脉阻断24h引起局灶性脑缺血-后，模型组大鼠左前肢肌张力下降，表现左前肢腕曲、胴曲、肩内旋和握持力下降，神经功能均评分为8.6分。假手术组部分动物左前肢肌张力也稍有下降，神经功能平均评分为2.2分，明显低于模型组(P＜0.01)。龙血竭总黄酮100、50、25mg/kg体重、尼莫地平5mg/kg体重或脑得生2.7g/kg体重给药后神经功能行为评分分别下降17.2％、12.9％(P＜0.01)、11.5％(P＜0.05)、9.5％和6.0％。
表2.龙血竭总黄酮对局灶性脑缺血后神经功能行为评分的影响剂量 动物数 神经功能行为评分 药物组下降百分率分组(mg/kg) (只) (X±SD) (％)模型组- 138.6±1.2 -假手术组 - 6 2.2±2.4**-尼莫地平组5 107.8±1.5 9.5脑得生组 2700 108.1±2.0 6.0龙血竭大剂量组100157.1±1.7 17.2龙血竭中剂量组50 107.5±0.5**12.9龙血竭小剂量组25 8 7.6±0.9*11.5
注经t检验，与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
2、龙血竭总黄酮对局灶性脑缺血后脑梗死范围的影响大脑中动脉阻断24h后，可见明显的脑组织缺血梗死区(未染色部位)。模型组大鼠脑梗死范围占前脑半球面积的28.0％。龙血竭总黄酮100、50、25mg/kg体重、尼莫地平5mg/kg体重或脑得生2.7g/kg体重给药后脑梗死范围分别减少21.5％、48.9％(P＜0.01)、40.3％(P＜0.01)、18.1％(P＜0.05)和21.7％。
表3.龙血竭总黄酮对局灶性脑缺血后脑梗死范围的影响剂量 动物数 脑梗死范围(％)分组 药物组下降百分率(％)(mg/kg)(只) (X±SD)模型组 -1328.0±6.0-尼莫地平组 51020.1±8.3*28.2脑得生组 2700 1021.6±10.4 22.7龙血竭大剂量组 100 1521.9±10.6 21.5龙血竭中剂量组 50 1014.3±11.3**48.9龙血竭小剂量组 25 8 16.7±8.1*40.3注经t检验，与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果表明，脑缺血24h后，模型组大鼠的左前肢肌张力明显下降，神经功能行为评分为8.6分脑组织染色出现明显的缺血梗死区，占前脑半球面积的28.0％。龙血竭总黄酮50、25mg/kg体重，连续灌胃4天，可显著降低大鼠的神经功能行为评分(P＜0.01或P＜0.05)，并明显减少了脑梗死范围(P＜0.01)，疗效强于阳性对照药尼莫地平5mg/kg体重及脑得生2.7g/kg体重。
实验例3龙血竭总黄酮对大鼠脑血流量的影响实验分组与剂量设计实验动物随机分为5组，①伪模型动物组实验动物20只。仪实施假手术，不测脑血流量。
②正常动物组兼模型动物组实验动物25只。每日灌服0.25％CM((溶剂对照)1ml.100g体重，连续10天。
③阳性药舒血宁组实验动物15只。每日灌服舒血宁100mg/kg体重，连续10天。
④龙血竭大剂量组实验动物25只。每日灌服龙血竭总黄酮200mg/kg体重，连续10天。
⑤龙血竭小剂量组实验动物25只。每日灌服龙血竭总黄酮100mS/kg体重，连续10天。
两个实验共用一批动物，前期给药方式相同。正常对照组动物测完脑血流量后，实施双侧颈总动脉结扎，在脑水肿实验中为模型动物组。
实验步骤，末次给药后1小时，以水合氯醛(0.35g/kg，中)麻醉，分离大鼠两侧颈总动脉，分别埋线后，再分离左侧颈外动脉，埋线后，将直径为1mm电磁流量计探头钩在左侧颈总动脉上，稍后片刻，待颈总动脉血流稳定后，记录颈总动脉血流量数值。结扎左侧颈外动脉，此时电磁流量计显示的是颈内动脉血流量数值，可在一定程度上反映脑血流量。记录后，摘下电磁流量计探头，迅速结扎双侧颈总动脉。伪模型组动物只埋线不结扎。缝合切口，单笼放置观察，室温保持在18±1℃。记录48小时内实验动物死亡情况。48小时内若遇动物刚刚死亡，立即断头取脑，称重。其余动物48小时时，取脑称湿重。110℃烤10小时脱水后，称干重。计算脑内含水量，并进行组间统计学比较。
实验结果见表4、表5。
表4.龙血竭总黄酮对大鼠脑血流量的影响剂量 实验动物数 颈内动脉血流量分组(mg/kg) (只) (ml/min.)正常对照组 -25 3.8±1.1舒血宁组100 25 4.9±1.7*龙血竭大剂量组 200 25 5.0±1.9*龙血竭小剂量组 100 25 4.5±1.2*注经t检验，与正常对照组相比，*P＜0.05。
表5龙血竭总黄酮对结扎双侧颈总动脉造所致大鼠缺血性脑水肿的影响剂量 48小时内死亡数(只) 48小时内动物脑湿重 脑干重 脑含水量组别(mg/kg)实验动物总数(只)(死亡率％) (g)(g) (％)伪模型组 - 0/20 0 1.238±0.061 0.278±0.015 77.5±0.342模型组- 13/25 52 1.374±0.031##0.282±0.013 79.4±0.980##舒血宁组 100 10/25 40 1.313±0.054**0.279±0.014 78.7±0.642*龙血竭大剂量组200 10/25 40 1.325±0.075*0.284±0.013 78.5±0.907*龙血竭小剂量组100 12/25 48 1.358±0.051 0.287±0.011 78.9±0.624注经t检验，与假手术组相比，##P＜0.01；与模型组相比，**P＜0.01、*＜0.05实验表明，龙血竭总黄酮200mg/kg体重和100mg/kg体重，连续灌胃10天，可明显增加实验动物的脑血流量，经t检验，与正常对照绢动物相比，P＜0.05，药效与阳性对照药舒血宁100mg/kg相当；龙血竭总黄酮200mg/kg体重，连续灌胃10天，可明显降低结扎双侧颈总动脉造成急性脑缺血大鼠的脑含水量，经t检验，与模型动物组相比，P＜0.05，疗效与舒血宁100mg/kg相当，并有降低实验动物48小时内死亡率的趋势。
实验例4龙血竭总黄酮对结扎冠脉所致大鼠急性心肌缺血引起的心电图改变及心肌梗塞面积影响实验分组与剂量设计实验动物随机分为5组，每组22只。即①模型动物组每日灌服0.25％CMC(溶剂对照)，1ml/100g体重，连续10天。
②阳性药5-单硝组每日灌服5-单硝10mg/kg体重，连续10天。
③阳性药舒血宁组每日灌服舒血宁100mg/kg体重，连续10天。
④龙血竭大剂量组每日灌服龙血竭总黄酮200mg/kg体重，连续10天。
⑤龙血竭小剂量组每日灌服龙血竭总黄酮100mg/kg体重，连续10天。
实验步骤，末次给药后1小时，以乌拉坦(1.2g/kg，ip)麻醉后，测肢体II导联心电图。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左缘1cm处，剪开胸壁肌肉及二条肋骨，迅速打开胸腔，暴露心脏，于心耳下方冠状动脉根部结扎冠脉，立即将心脏放回，排挤出胸腔空气，用止血钳闭合胸腔；记录术后即刻、2小时、6小时时心电图，随后取出心脏，以冷生理盐水洗挣后，放-20℃冰箱冷冻过夜。次日，将冷冻的心脏由结扎处至心尖部等厚切成5片，浸入新鲜制的0.5％N-BT磷酸缓冲液(PH＝7.4)中。37℃水浴振摇10-15min。用滤纸吸干切片表面的染色液，细心分离染色部分(兰色为正常组织)和未染色部分(白色为梗塞部分)，称重。记算梗死面积(梗塞部位重量/全心重量)，即 实验结果见表6。
表6.龙血竭总黄酮对结扎冠脉所致大鼠急性心肌缺血引起的心电图改变及心肌梗塞面积影响动物数J点升高分组 梗塞面积(只) 正常时 结扎后 2小时6小时模型组 150.24±0.04 0.8±0.6 6.7±2.3 5.7±2.0 5.0±1.45-单硝组130.16±0.07**0.8±0.6 6.0±1.5 4.1±1.2*3.3±1.2**舒血宁组130.17±0.06**0.7±0.5 6.2±1.7 4.2±1.6*3.6±1.4*大剂量组140.17±0.05**0.6±0.6 5.5±1.0 4.0±1.5*3.5±1.8*小剂量组150.19±0.05*0.6±0.5 5.7±1.6 4.3±1.6*3.6±1.6*注经t检验，与模型组相比，**P＜0.01、*P＜0.05龙血竭总黄酮200mg/kg体重、100mg/kg体重，连续灌胃10天，可明显减少结扎冠状动脉所致大鼠急性心肌缺血引起的心肌梗死面积，并可降低由心肌缺血造成的肢体II导联心电图了点的升高。
实施例龙血竭药材粉碎成粗粉，加8倍量乙酸乙酯回流提取2次，每次1小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以30倍提取物量的0.35％NaOH溶液搅拌30分钟使溶解，滤过；滤液用10％HCl调pH至1～2，静置12小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，60℃以下真空干燥，粉碎，过80目筛，即得龙血竭总黄酮。
权利要求
1.一种龙血竭总黄酮制备方法，其特征在于该方法为龙血竭药材粉碎成粗粉，加6-10倍量乙酸乙酯回流提取2-3次，每次1-2小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以20-40倍提取物量的0.2-0.5％NaOH溶液搅拌20-40分钟使溶解，滤过；滤液用5-12％HCl调pH至1～2，静置8-24小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，60℃以下真空干燥，粉碎，即得龙血竭总黄酮。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于该方法为龙血竭药材粉碎成粗粉，加8倍量乙酸乙酯回流提取2次，每次1小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以30倍提取物量的0.35％NaOH溶液搅拌30分钟使溶解，滤过；滤液用10％HCl调pH至1～2，静置12小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，60℃以下真空干燥，粉碎，过80目筛，即得龙血竭总黄酮。
3.龙血竭总黄酮在抑制静脉血栓形成的药物中的应用。
4.龙血竭总黄酮在抑制局灶性脑缺血的药物中的应用。
5.龙血竭总黄酮制备治疗缺血性脑水肿的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的治疗缺血性脑水肿是指增加脑血流量。
全文摘要
本发明公开一种龙血竭总黄酮的制备工艺，该制备工艺为将龙血竭药材粉碎成粗粉，加乙酸乙酯回流提取，滤过，回收乙酸乙酯并浓缩至干；本发明还公开了龙血竭总黄酮在抑制静脉血栓形成、局灶性脑缺血、制备治疗缺血性脑水肿药物中新用途。
文档编号C07D311/30GK1482124SQ02129688
公开日2004年3月17日 申请日期2002年9月12日 优先权日2002年9月12日
发明者屠鹏飞, 萧伟, 胡迎庆, 戴翔翎, 夏月, 沈静, 毕宇安, 章晨峰, 徐玉玲 申请人:江苏康缘药业股份有限公司