专利名称：一段脲解支原体dna序列(2)特异性的确定及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一段脲解支原体(Ureaplasma urealyticum)DNA序列(2)特异性的确定及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
脲解支原体是一种人类生殖器经常感染的病原物，可引发许多泌尿生殖道疾病，准确的诊断是进行即时而可靠的治疗的依据，目前只能根据临床指征进行诊断。PCR和基因芯片诊断是一种快速而准确的检测方法。而这一类的诊断方法依赖于获得特异的核酸序列。
发明内容
本发明在于通过生物信息学和分子生物学技术，确定了一段脲解支原体特异核苷酸序列及其PCR引物。该序列和相应的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法进行脲解支原体的诊断。
本发明的技术方案为本发明利用现有的方法确定了长度为288bp的一段脲解支原体特异DNA序列(2)及其PCR引物，用引物进行PCR扩增，其序列如下taatccagct gttgcgtttg ctttattagc tatgcattta aaaatagatt taaaaactgc 60tttatatacg catctttact ctacagttgc cgcattaacg caaaactgtg tacgtgcaat 120tccattagga caagttaagg gacaaaaaat aatttatcaa cttaaacatg tttattttga 180tgatattgtt aataaagtct ttacattgga ttttaaaaca gatttttgca aaaatatacc 240aggccttgaa attgcacaaa tggaacacga ggacacacct gttcgctt 288引物序列为1.5’-taatccagctgttgcgtttg-3’2.5’-aagcgaacaggtgtgtcctc-3’上述脲解支原体的特异DNA序列(2)用于诊断脲解支原体的基因芯片的探针序列，并通过上述的引物序列进行PCR扩增，标记后进行杂交检测或直接用于PCR诊断。
用本发明建立的临床检测技术所使用的方法具有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
图1为临床标本的PCR扩增图谱。
图2、图2续是测序图。其中图2是测定的序列、图2续是原始测序图谱。
图3是用Blast软件对PCR扩增产物的测序结果与预计序列的比较分析。
图4、图4续(1)、图4续(2)、图4续(3)是基因数据库中Blast搜索结果。
图5为基因芯片杂交结果。
具体实施例方式首先以脲解支原体为关键词，在基因数据库中搜索脲解支原体的核苷酸序列。共获得数条关系较密切的核苷酸序列，将这些核苷酸序列用NCBI网上的Blast在线使用软件比对基因数据库中的核苷酸序列(nr)，排出非特异性的核苷酸序列，获得了1Kb特异性的核苷酸序列。以这段序列设计了20余对PCR引物，以临床标本提取DNA，进行PCR扩增，筛选到一对适合进行PCR扩增的序列及引物，PCR扩增获得的产物与预计大小一致(见图1，图中序号为1.标准分子量DNA，分子量大小从上至下分别为622，527，404，309，242/238，217，201，190，180，160+160，147+147，123；2.4.5临床阴性标本，没有扩增产物；3.临床阳性标本，扩增产物很纯，大小290左右，与预计大小一致。图谱结果显示用本发明中的引物能特异的扩增临床样品)，然后用T-vector进行克隆，并测序(测序报告见图2、图2续，图中从55位开始，到342位，共288bp为克隆序列，其余序列为克隆载体序列)，序列为288bp，通过Blast软件比对预计序列，显示与预计的序列一致(见图3，图中除第48位、119位、143位、154位由c改变为t，第61位、68位由g改变为t，第62、70、121、140位由t改变为c，第65位由c改变为g，第67、88位由a改变为g外，其余均与预计序列一致)，表明该序列可以被特异性的扩增，可用于脲解支原体PCR检测。序列用NCBI网站的Blast搜索基因数据库的DNA(包含cDNA)序列，该序列只与脲解支原体的序列一致，而与其它的物种序列没有同源性见图4、图4续(1)、图4续(2)图4续(3)，图中搜寻结果表明，只有脲解支原体的质粒DNA序列与本序列同源，并且是完全配对。而其它的序列，由于没有引物与之配对，故在检测中不会被检测到。用这一序列标记后作为探针与含有9种泌尿生殖道感染病原物的45个基因位点的基因芯片杂交，只有本发明序列与此有杂交信号，而其它所有序列与此无杂交信号(见图5，图中是四个重复，每个重复含9种泌尿生殖道感染性疾病病原物共45个不同的位点和4个对照位点。杂交结果表明只有本序列有特异信号，而其它均无杂交信号)，表明该序列为脲解支原体的特异序列。
本发明可用于PCR方法或基因芯片方法进行脲解支原体的临床检测。用本发明提供的序列进行PCR扩增，根据PCR方法获得产物是否出现和大小判断是否为脲解支原体感染。也可用本序列为探针，作为基因芯片中的一个检测位点，然后用本发明中的PCR引物序列扩增临床标本，并标记后进行杂交检测。
说明书序列表SEQUENCE LISTING<110>昆明寰基生物芯片开发有限公司<120>一段脲解支原体DNA序列(2)特异性的确定及其应用<130>
<140>02133342.4<141>2002-06-20<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>288<212>DNA<213>脲解支原体(Ureaplasma urealyticum)<220>
<221>gene<222>(1)..(288)<223>
<400>1taatccagct gttgcgtttg ctttattagc tatgcattta aaaatagatt taaaaactgc 60tttatatacg catctttact ctacagttgc cgcattaacg caaaactgtg tacgtgcaat120tccattagga caagttaagg gacaaaaaat aatttatcaa cttaaacatg tttattttga180tgatattgtt aataaagtct ttacattgga ttttaaaaca gatttttgca aaaatatacc240aggccttgaa attgcacaaa tggaacacga ggacacacct gttcgctt 288
权利要求
1.一段脲解支原体DNA序列(2)特异性的确定，其特征在于该序列的长度为288bp，序列及PCR引物如下taatccagct gttgcgtttg ctttattagc tatgcattta aaaatagatt taaaaactgc 60tttatatacg catctttact ctacagttgc cgcattaacg caaaactgtg tacgtgcaat 120tccattagga caagttaagg gacaaaaaat aatttatcaa cttaaacatg tttattttga 180tgatattgtt aataaagtct ttacattgga ttttaaaaca gatttttgca aaaatatacc 240aggccttgaa attgcacaaa tggaacacga ggacacacct gttcgctt 288引物序列为1.5’-taatccagctgttgcgtttg-3’2.5’-aagcgaacaggtgtgtcctc-3’
2.一段脲解支原体DNA序列(2)特异性的应用，其特征在于该序列用于诊断脲解支原体的基因芯片的探针序列，并通过上述的引物序列进行PCR扩增，标记后进行杂交检测或直接用于PCR诊断。
全文摘要
本发明涉及一段脲解支原体DNA序列(2)特异性的确定及其应用，属于生物医学技术领域。本发明通过基因数据库资料的搜寻和分析，确定了一段脲解支原体DNA序列(2)的特异性及PCR扩增引物，该序列长度为288bp。通过对人类生殖道脲解支原体感染标本的PCR扩增，克隆，获得该序列，测序证明与预计序列一致。再经生物信息学方法分析，基因芯片杂交分析，结果证实了该序列对于脲解支原体的特异性。本发明作为基因芯片诊断的探针及PCR扩增检测序列，用于脲解支原体的诊断。用本发明建立的临床检测技术所使用的方法具有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
文档编号C07H21/04GK1514015SQ0213334
公开日2004年7月21日 申请日期2002年6月20日 优先权日2002年6月20日
发明者谭德勇, 朱宝生 申请人:昆明寰基生物芯片开发有限公司