胃蛋白酶敏感经过修饰的苏云金芽孢杆菌杀虫毒素的制作方法

专利名称：胃蛋白酶敏感经过修饰的苏云金芽孢杆菌杀虫毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis)Cry蛋白在哺乳动物消化道中的降解。它涉及苏云金芽孢杆菌Cry蛋白，这种蛋白的肽序列已被修饰以使它们对哺乳动物消化道中的特定酶尤其是胃蛋白酶敏感。根据本发明，通过将胃蛋白酶-切割位点插入其肽序列中来修饰所述Cry蛋白。本发明还涉及表达这些修饰的Cry蛋白的转化植物。
苏云金芽孢杆菌属的细菌(以后称为Bt)以其产生的杀虫毒素而著称。这些革兰氏阳性菌在其稳定期中形成伴孢晶体蛋白，这种晶体大大增强了其杀虫活性。这些细菌的晶体由杀虫毒素构成，这种杀虫毒素性质上是蛋白质，被称为Cry蛋白，并由cry基因编码。由于其杀虫特性，这种Cry蛋白被用于保护农作物抵抗有害昆虫，作为合成杀虫剂的替代物。目前，这种农学用途主要是通过两种方法实现的，即将该产品作为生物杀虫剂直接喷洒，以及用编码Cry蛋白的基因转化生长的植物。根据其所衍生的Bt菌株，所述Cry蛋白对不同的昆虫具有杀虫活性。Cry毒素对抗的昆虫的主要顺序为鳞翅目、鞘翅目和双翅目，但一些毒素有效对抗其它昆虫。所有分离自各种Bt菌株的Cry蛋白按照其序列同源性的功能分类归在一起，并用一代码表示以示区别(Crickmore等，1998，Microbiol.Molec.Biol.Review(62(3)，807-813)。因此，在农业上使用这些毒素的优点在于它们对一种或多种特定昆虫的作用特异性，而且还在于它们对哺乳动物、鸟类、两栖类和爬行类无毒性。
对哺乳动物没有毒性使得人们能够开发培养表达Cry蛋白的转基因植物，并将这些植物的种子用于人和动物的食物。然而，尽管它们对哺乳动物无毒，这些蛋白质中有一些在哺乳动物的消化物中相对是不降解的，无法降解致使这种毒性在所述哺乳动物的消化道中保留相对长的时间。此外，Cry蛋白在哺乳动物消化道中缺乏持久性也是行政当局(如美国环保署-EPA)需要考虑的标准之一，EPA允许含有这些蛋白质的种子或衍生自这些种子的制品在食物中销售。
本发明有可能克服上述缺点。本发明所基于的原则是，某些Cry蛋白在哺乳动物消化道中的稳定性被认为是因为这些蛋白质对所述消化道中特定的酶，尤其是蛋白酶不敏感。因此，解决这一问题的关键在于将对哺乳动物消化道的酶特异的特定位点人工整合入Cry蛋白中。因此，本发明的主题是对哺乳动物消化道中的特定酶类，尤其是哺乳动物胃中的特异性蛋白酶，更具体说是胃蛋白酶敏感的Cry蛋白进行修饰。胃蛋白酶是蛋白酶家族中一种特殊的酶，它是存在于哺乳动物胃中的主要蛋白酶(占胃蛋白酶类的95％)。这是一种天冬氨酸蛋白酶，它在最佳pH2时起作用。胃蛋白酶可作为降解Cry蛋白的酶来源的一种选择，因为它不存在于昆虫的消化管中，尤其是鳞翅目，其消化管的pH在10和11之间(Terra，W.B.和C.Ferreira，1994，Insect digestive enzymesproperties，compartmentalization andfunction。Comp.Biochem.Physiol.109B1-62)。昆虫中缺乏胃蛋白酶因此可保证将胃蛋白酶-特异性位点引入Cry蛋白不会增加它们在昆虫消化管中降解的风险。因此，本发明解决了上述技术问题，即增加Cry蛋白对哺乳动物消化道酶类的敏感性，而不改变所述Cry蛋白的杀虫性质。
然而，Cry蛋白是非常有组织的蛋白质，其活化形式由三个区域组成，且区域中和区域之间的结构-功能关系非常强。Cry蛋白的这种高水平的组织不允许在蛋白中任意插入突变。特别地，插入对哺乳动物胃中的酶类特异的切割位点必须不改变毒素的杀虫特性。
Cry蛋白是由苏去金芽孢杆菌以无活性的原毒素的形式天然产生的。使这些蛋白质起作用的天然方法包括，将所述晶体蛋白溶解在昆虫肠内，蛋白水解性降解释放的原毒素，使活化的毒素附着到所述昆虫肠内的受体中，并将所述毒素插入肠细胞的顶端膜中以产生离子通道或孔。昆虫肠内原毒素的蛋白水解性降解是在碱性pH和消化液中丝氨酸蛋白酶(基本为胰蛋白酶)的共同作用下发生的(Schnepf等，1998)。
Cry毒素由三个结构域-域I、域II和域III构成。域I大致占活化的毒素的N-末端一半部分。域II和域III各自大致占活化的毒素的四分之一。域III位于活化的毒素的C-末端。Cry蛋白的各个域有其自己的结构和功能。
域I由7个α-螺旋、6个两亲螺旋和一个疏水螺旋构成，它们通过由若干氨基酸构成的内螺旋环相互连接。该域是跨膜域，负责形成离子通道或孔(Aronson等，1995；Chen等，1993；Manoj-Kumar和Aronson，1999；Masson等，1999；Rang等，1999；Coux等，1999)。由域I的α-螺旋形成的跨膜实际上包括四个Cry蛋白，它们用四个各自的α4-螺旋形成完整的孔(Masson等，1999)。因此形成了四个α4-螺旋的圆柱形孔。该孔的内侧由两亲螺旋的亲水表面构成；由于负电荷残基存在于亲水表面，它们在孔的腔内，在含水介质中，并执行其离子运输功能。所述孔的外则由疏水表面构成，它将该孔锚定在脂质膜中。因此，由域I的α-螺旋形成的孔具有非常强的结构-功能关系，且随时间发生构象变化。因此，在域I的α-螺旋中引入突变很可能扰乱该域的功能，因此影响所述毒素的活性。
所述活化的毒素的域II和域III由β-片层构成，β-片层本身也呈非常紧密的形式。这两种域与受体位点识别(特异性)和毒素稳定性有关(Abdul-Rauf和Ellar，1999；Dean等，1996；Hussain等，1996；Lee等，1999；Rajamohan等，1996，1998；Wu和Dean，1996)。域III的交换引起特异性的变化(de Maagd等，1999)。该区域不十分保守，因此比域I可变。它与各毒素的特异性有关。这种变异性和对各毒素特异的相互作用与各毒素非常特异的宿主范围的特性有关，并与不同受体位点的识别有关。受体的识别通过域II和域III中的环发生，且这些环的构象从一种毒素到其它毒素微妙变化作为域II和域III的排列以及域II和域III之间相互作用的函数。域I还会干扰其它两个域并影响通常的构象(Rang等，1999，2001)。此外，对这两个域中结构-功能的关系知之甚少，实际上没有关于识别受体位所需的构象的信息。因此，很难预测在特异性上将修饰引入域II和域III的后果，识别受体位点的能力和Cry蛋白的毒性。此外，已知域II和域III中的突变很容易引起毒素在昆虫中不稳定，从而导致毒性丧失。
Cry蛋白的域I和域II之间还存在盐桥(salt bridge)。这些桥在毒素的稳定性及其功能方面起重要作用。人工消除Cry1Aa1中的这些桥显示，原毒素和活化的毒素不如亲本蛋白稳定(Vachon等，2000)。这些盐桥存在于域II和域I的α7-螺旋之间。已知的这些桥的重要性说明，在域II和域I的α7-螺旋中突变对扰乱Cry蛋白功能的风险高。
描述本发明涉及胃蛋白酶敏感修饰的Cry蛋白，其特征在于，它至少有一个额外的胃蛋白酶切割位点。
术语“Cry蛋白”是指苏云金芽孢杆菌(以后称为Bt)的细菌菌株产生的杀虫蛋白，其各种已经存在和即将出现的正模标本是由Bt分类委员会定位的(Crikmore，2001)，并可在互联网地址http//www.biols.susx.ac.uk/Home/NeilCrickmore/Bt/index.html上访问。特别地，这种Cry蛋白由cry基因编码，或由Bt细菌天然产生，或以重组的方式在宿主生物中完成，该宿主生物被cry基因或者被包含至少一个Cry蛋白的编码序列的基因转化。本发明的Cry蛋白还包括序列已被人工修饰以增加其杀虫活性或它们对处理条件抗性的Cry蛋白。该定义还包括具有杀虫活性的Cry蛋白片段，如截短的Cry蛋白，它仅含有完整Cry蛋白的N-末端部分，尤其是这种蛋白的域I(WO 94/05771)。还包括融合的Cry蛋白，如国际专利申请WO 94/24264所述。优选地，本发明的Cry蛋白选自Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。优选地，它是Cry9C蛋白，更优选地是Cry9Ca1蛋白(Lambert等，Appl.Environm.Microbiol.62，80-86；WO 94/05771)。特别地，本发明也适合任何Cry蛋白，其毒性已得到改善，例如，专利申请WO 97/49814或WO 99/00407中所描述的那些。
根据本发明，所述Cry蛋白是经过修饰的。术语“修饰的Cry蛋白”是指肽序列不同于衍生出这种蛋白的天然Cry蛋白肽序列的Cry蛋白。这种序列差异是通过遗传工程引入人工修饰的结果，尤其是在所述肽序列中插入或取代特定的氨基酸残基。特别地，所述修饰的Cry蛋白是通过修饰编码它的核苷酸序列产生的，尤其是用精通此领域的技术人员熟知的定点诱变技术(Hutchinson C.A.等，1978，J.Biol.Chem.2536551)。优选地，Cry蛋白的修饰包括氨基酸残基取代。
本发明的修饰的Cry蛋白是胃蛋白酶敏感的。胃蛋白酶蛋白水解作用的焦点是特定的由亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸构成的切割位点。所述蛋白酶解发生在残基的C-末端位置。根据本发明，术语“胃蛋白酶敏感的”是指修饰的Cry蛋白特有的经受被胃蛋白酶蛋白酶解的性质。Cry蛋白的蛋白酶解导致所述蛋白质的杀虫活性部分或全部丧失。因此，可通过使本发明的修饰的Cry蛋白与胃蛋白酶接触，最好是在体外，然后测量与未按本发明进行修饰的天然Cry蛋白相比所述修饰的Cry蛋白杀虫活性的损失来测量胃蛋白酶-敏感。例如，可用实施例7和8中所述的试验来测量本发明的Cry蛋白的胃蛋白酶敏感性。或者，可用蛋白质印迹技术来测量所述胃蛋白酶敏感性。采用这种技术，可通过观察与胃蛋白酶接触后修饰的Cry蛋白的结构降解来测量敏感性。该观察包括，与未按本发明修饰的天然Cry蛋白相比，凝胶电泳转移膜上与Cry蛋白相应的条带强度的消失或减小。这些技术的应用是精通此领域的技术人员的普通知识的一部分。
本发明的修饰的Cry蛋白的特征在于，它至少有一个额外的胃蛋白酶切割位点。所述“胃蛋白酶切割位点”是指由至少一个氨基酸残基构成的位点，识别胃蛋白酶的蛋白酶解的位点。被胃蛋白酶识别的氨基酸残基是亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸。术语“额外的胃蛋白酶切割位点”是指与Bt细菌产生的天然Cry蛋白相比额外的切割位点。
优选地，所述额外的胃蛋白酶切割位点由选自亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸残基的氨基酸残基表示。根据本发明的一个特定的实施方案，所述修饰的Cry蛋白有几个由相同的氨基酸残基表示的额外的胃蛋白酶切割位点。根据本发明的另一个实施方案，所述修饰的Cry蛋白有几个由不同氨基酸残基表示的额外的胃蛋白酶切割位点。
根据本发明的一个特定的实施方案，本发明的修饰的Cry蛋白的特征在于，它在域I的至少一个间-α-螺旋环(inter-α-helix loops)上有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。词名“域I的间-α-螺旋环”是指如Grochulski等(1995)和Li等(1991)所述，连接Cry蛋白的七个域I的α-螺旋的肽链。根据本发明，所述Cry蛋白应含有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。此外，所述额外的切割位点是在至少一个域I的间-α-螺旋环内。术语“额外的”因此应理解为与由Bt细菌产生的天然Cry蛋白的域I的间-α-螺旋环中天然存在的胃蛋白酶切割位点的数目相比是附加。该定义是指，本发明的修饰的Cry蛋白的特征在于，它在域I的间-α-螺旋环中有一定数目的胃蛋白酶切割位点，这一数目大于由Bt细菌产生的相同天然Cry蛋白中这些位点的数目，所述数目之间的差异至少差于1。
根据本发明的一个特定的实施方案，本发明的修饰的Cry蛋白在连接域I的α3和α4螺旋的间-α-螺旋环中至少有一个胃蛋白酶切割位点。
根据本发明的一个优选地实施方案，所述修饰的Cry蛋白是修饰的Cry9C蛋白。优选地，所述修饰的Cry蛋白是修饰的Cry9Ca1蛋白，它在氨基酸残基164上有胃蛋白酶切割位点。特别地，在按照本发明修饰的Cry9Ca1蛋白上，天然存在于Cry9Ca1蛋白164位的精氨酸残基被选自亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸残基替代。优选地，按照本发明修饰的Cry9Ca1蛋白选自其序列以标识符SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8表示的Cry蛋白。
本发明还涉及胃蛋白酶敏感的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点是通过用谷氨酸残基代替天冬氨酸残基，用苯丙氨酸残基代替色氨酸残基以及用亮氨酸残基代替缬氨酸或异亮氨酸残基引入的。优选地，所述修饰的Cry蛋白的取代程度为25％。词句“取代程度”是指被与本发明的修饰的Cry蛋白中的胃蛋白酶切割位点相应的氨基酸残基替代的天然Cry蛋白的氨基酸残基的百分比。
本发明的一个主题还包括增加Cry蛋白的胃蛋白酶敏感性的方法，其特征在于，在所述Cry蛋白中引入至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。词句“增加Cry蛋白的胃蛋白酶敏感性”是指与相应的天然Cry蛋白相比，通过所述方法增加获得的Cry蛋白的胃蛋白酶敏感性，这种增加导致蛋白水解破坏和所述Cry蛋白杀虫活性的丧失，这些作用可能是部分或完全的。
引入至少一个胃蛋白酶切割位点是通过遗传工程人工进行的。特别地，它包括插入或替代氨基酸残基。优选地，它包括取代。这种取代可通过精通此领域的技术人员熟知的定点诱变技术简单实现。
优选地，施用本发明所述方法的Cry蛋白选自Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。优选地，它是Cry9C蛋白，更优选是Cry9Ca1蛋白。
特别地，额外的胃蛋白酶切割位点由选自亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸残基表示。
根据本发明的一个特定的实施方案，本发明所述方法的特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶切割位点被引入所述Cry蛋白域I的至少一个间-α-螺旋环中。
根据本发明的另一个特定的实施方案，本发明所述方法的特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶切割位点被引入连接域I的α3和α4螺旋的间-α-螺旋环中。
根据本发明的一个优选地实施方案，本发明使用了Cry9C蛋白。优选地，它使用了Cry9Ca1蛋白，且额外的胃蛋白酶切割位点是通过氨基酸残基164的取代引入的。特别地，天然存在于Cry9Ca1蛋白164位的精氨酸残基被选自亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸残基取代。
本发明还涉及增加Cry蛋白胃蛋白酶敏感性的方法，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点是通过用谷氨酸残基取代天冬氨酸残基，用苯丙氨酸残基取代色氨酸残基以及用亮氨酸残基取代缬氨酸或异亮氨酸残基引入的。
优选地，引入所述Cry蛋白的取代程度为25％。
本发明还涉及编码本发明的修饰的Cry蛋白的多核苷酸。根据本发明，术语“多核苷酸”是指天然或人工的核苷酸序列，它可以是DNA或RNA类型，优选是DNA类型，尤其是双链的。
本发明还涉及功能性相互连接的嵌合基因，它含有至少一个在宿主生物中有功能的启动子，编码本发明修饰的Cry蛋白的多核苷酸以及在同一宿主生物中有功能的终止子元件。嵌合基因可以含有的各种元件首先是蛋白质转录、翻译和突变的调节元件，如启动子，编码信号肽或转运肽的序列，或构成聚腺苷酸化信号的终止子元件，其次，编码蛋白质的多核苷酸。词句“功能性相互连接”是指嵌合基因的所述元件以其中一种元件的功能受其它元件影响的方式相互连接。例如，当一个启动子能够影响所述编码序列的表达时，该启动子功能性连接于所述编码序列。本发明嵌合基因的构建以及它的各种元件的装配是用精通此领域的技术人员熟知的技术进行的，尤其是在Sambrook等(1989，分子克隆实验室手册，Nolan C.编，纽约冷泉港实验室出版社)中描述的那些技术。对构成嵌合基因的调节元件的选择主要取决于它们必需发挥作用的宿主种类，那些精通此领域的技术人员能够选择出在给定宿主生物中有功能的调节元件。术语“功能的”是指能够在给定宿主生物中发挥功能。
根据本发明的一个特定的实施方案，嵌合基因含有“组成型”启动子。本发明所述的组成型启动子可诱导编码序列在宿主生物的所有组织中表达，并且是连续的，即在所述宿主生物的整个生命周期中表达。一些启动子可以是组织特异的，即能够连续表达编码序列，但仅在宿主生物的特定组织中。组成型启动子可来源于任何类型的生物。在这些可用于本发明的嵌合基因的组成型启动子中，值得一提的是，例如，细菌启动子，如章鱼碱合酶基因或胭脂碱合酶基因的启动子，病毒启动子，如控制花椰菜花叶病毒19S或35S RNA转录的基因的启动子(Odell等，1985，Nature，313，810-812)，或木薯叶脉花叶病毒的启动子(如专利申请WO 97/48819中所述)。在这些植物来源的启动子中，值得一提的是核酮糖-二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基基因的启动子，如申请EP 0 507 698中所述的组蛋白基因的启动子，EF1-α基因的启动子(WO 90/02172)，肌动蛋白基因的启动子(US 5,641,876)，或遍在蛋白基因的启动子(EP 0342926)。
根据本发明的另一个特定地实施方案，所述嵌合基因含有可诱导的启动子。可诱导的启动子是当它自身被诱导剂诱导时才有功能的启动子，即只诱导编码基因的表达。诱导剂通常可在宿主生物中合成然后外部刺激所述生物的物质，这种外部刺激可能是物理性或化学性的，在自然界中有生命或无生命的。这种启动子是已知的，例如，专利申请WO 00/56897中所述的植物O-甲基转移酶类II(COMT II)基因的启动子，拟南芥(Arabidopsis)PR-1启动子(Lebel等，1998，PlantJ.16(2)223-233)，烟草倍半萜合酶基因的EAS4启动子(Yin等，1997，PlantPhysiol.115(2)，437-451)，或编码3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因的启动子(Nelson等，1994，Plant Mol.Biol.25(3)401-412)。
在可用于本发明的嵌合基因的终止子元件中，值得一提的是，例如，由编码根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶的基因的nos终止子元件(Bevan等，1983，Nucleic Acids Res.11(2)，369-385)，或如申请EP 0 633 317中所述的组蛋白基因的终止子元件。
根据本发明的一个特定的实施方案，本发明的嵌合基因的启动子和终止子元件在植物中都是有功能的。
所述嵌合基因还含有信号肽或转运肽似乎也是重要的，这可使它能够控制和定位Cry蛋白在宿主生物的特定细胞区室中产生，例如细胞质，在胞质的特定区室中，或细胞膜，就植物而论，在特定类型的细胞区室中，例如叶绿体，或在胞外基质中。
转运肽可以是单链或双链。双链转运肽可任选地被中间序列分离，即它们在转录方向含有编码植物基因转运肽的序列，该植物基因编码定位在质体中的酶，编码定位在质体中的酶的植物基因的成熟的N-末端部分的序列部分，然后是编码植物基因的第二转运肽的序列，该植物基因编码定位在质体中的酶。例如，在专利申请EP 0 508 909描述了这种双链转运肽。
值得一提的是用于本发明的单链肽特别包括Cornelissen等(1987，NucleicAcid Res.15，6799-6811)所述的烟草PR-1α基因的信号肽，尤其是当本发明的嵌合基因被引入植物细胞或植物时。
本发明还涉及含有本发明嵌合基因的载体。这种载体被用来转化宿主生物和在所述生物中表达本发明的修饰的Cry蛋白。这种载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒。通常，这种载体的主要性质是在宿主生物的细胞中保持其本身和自我复制的能力，尤其是依靠复制起点的存在，以及在其中表达修饰的Cry蛋白的能力。对这种载体的选择以及在其中插入本发明的嵌合基因的技术广泛描述在Sambrook等(1989，分子克隆实验室手册，Nolan C.编，纽约冷泉港实验室出版社)，且是精通此领域的技术人员普通知识的一部分。除本发明的嵌合基因外，用于本发明的载体也可含有可选择标记的嵌合基因。这种可选择标记使其可能选择有效转化的宿主生物，即那些已掺入载体的宿主生物。在这些可用于许多宿主生物的可选择标记中，值得一提的可由含有对抗生素抗性的基因的标记构成，如潮霉素磷酸转移酶的标记(Gritz等，1983，Gene 25179-188)。优选地，要转化的宿主生物是植物。在可用于植物的可选择标记中，值得一提的可由含有对除草剂有耐性的基因的标记构成，如对双丙氨酰膦有耐性的bar基因(White等，NAR 181062，1990)，对草甘膦有耐性的EPSPS基因(US 5,188,642)或对异噁唑有耐性的HPPD基因(WO 96/38567)。值得一提的还可由编码易于鉴别酶类如GUS酶的基因，或编码色素或调节转化的细胞中色素产生的酶的基因构成。这种可选择的标记基因特别描述在专利申请WO 91/02071和WO 95/06128中。
本发明还涉及用上述载体转化的宿主生物。术语“宿主生物”是指任何类型的生物，尤其是植物或微生物，如细菌、病毒、真菌或酵母。术语“转化的宿主生物”是指在其基因组中引入了本发明所述的嵌合基因，随后在其组织中产生了本发明的修饰的Cry蛋白。为得到本发明的宿主生物，那些精通此领域的技术人员可使用许多已知的转化方法。这些方法之一包括使要转化的细胞与聚乙二醇(PEG)接触，然后和本发明的载体接触(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。电穿孔是另一种方法，它包括将要转化细胞或组织以及本发明的载体置于电场中(Andreason和Evans，1988，Biotechniques 6(7)，650-660；Shigckawa和Dower，1989，Aust..J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另一种方法包括通过微注射将载体直接注射到宿主细胞或组织中(Gordon和Ruddle，1985，Gene(33(2)，121-136)。有利地，可使用“生物射弹”法。它包括用吸附有本发明载体的颗粒轰击细胞或组织(Bruce等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.US 86(24)，9692-9696；Klein等，1992，Biotechnology10(3)，286-291；美国专利4,945,050号)。优选地，植物的转化是用土壤杆菌属的细菌进行的，优选用根癌土壤杆菌(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等，1983，Gene 23(3)315-330)或发根土壤杆菌(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)感染所述植物的细胞或组织。优选地，用根癌土壤杆菌转染植物细胞是按照Ishida等(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)所述的方法进行的。
在以下专利和专利申请中特别描述了这些不同的技术US 4,459,355，US 4,536,475，US 5,464,763，US 5,177,010，US 5,187,073，EP 267,159，EP 604 662，EP 672 752，US 4,945,050，US 5,036,006，US 5,100,792，US 5,371,014，US 5,478,744，US 5,179,022，US 5,565,346，US 5,484,956，US 5,508,468，US 5,538,877，US 5,554,798，US 5,489,520，US 5,510,318，US 5,204,253，US 5,405,765，EP 270 615，EP 442 174，EP 486 233，EP 486 234，EP 539 563，EP 674 725，WO 91/02071和WO 95/06128。
本发明还涉及产生本发明的修饰的Cry蛋白的方法。该方法至少包括以下步骤(a)在适合所述生物生长和繁殖的培养基中培养本发明的转化的宿主生物，(b)提取由步骤(a)中培养的转化的生物产生的Cry蛋白。
根据选择用来实施该方法的宿主生物以及它所含的嵌合基因，Cry蛋白或是在宿主生物内产生，或被分泌到培养基中。要确保，如果所述蛋白质未被分泌到培养基中，则步骤(b)中的提取可能需要破坏微生物，或至少是含有它们的细胞，的步骤，以便释放Cry蛋白。提取步骤通常有两种可能性(分泌或不分泌蛋白质)，包括通过过滤或离心培养基从这些生物中除去宿主生物或碎片。
根据一个特定的实施方案，所述产生修饰的Cry蛋白的方法还包括额外的步骤(c)从培养基中纯化产生的Cry蛋白。
根据一个优选地实施方案，所述宿主生物是微生物。优选地，所述宿主生物是苏云金芽孢杆菌，且步骤(a)中的培养连续进行直到所述细菌的孢子形成期。
本发明还包括用本发明的载体转化的植物，其特征在于，它们含有本发明的嵌合基因，该嵌合基因稳定地整合到它们的基因组中，并在它们的组织中表达修饰的Cry蛋白。本发明还涉及这些植物的部分以及这些植物的后代。词句“这些植物的部分”是指这些植物的任何器官，无论它是气生的或地下的。气生的器官有茎、叶和花。地下的器官主要是根，但也可是块茎。术语“后代”主要是指种子，它含有这些植物相互繁殖而来的胚。此外，术语“后代”被用于在植株间杂交产生的新一代中形成的所有植株和种子，尤其是植株变种和本发明的转化的植株。
本发明的转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。优选地，这些植物具有农业价值。有利地，所述单子叶植物是小麦、玉米和水稻。有利地是，所述双子叶植物是油菜、大豆、烟草和棉花。
根据本发明一个特定的实施方案，除本发明的嵌合基因外，本发明的转化的植物至少包含另一种基因，该基因含有编码感兴趣的蛋白的多核苷酸。在编码感兴趣的蛋白的多核苷酸中，值得一提可由编码对除草剂抗性的酶的多核苷酸构成，例如编码bar酶的多核苷酸(White等，NAR 181062，1990)以耐受双丙氨酰膦，编码EPSPS酶的多核苷酸(US 5,188,642；WO 97/04103)以耐受草甘膦，或是编码HPPD酶的多核苷酸(WO 96/38567)以耐受异恶唑。这些植物还可含有对疾病有抗性的多核苷酸，例如编码如专利申请EP 0 531 498或美国专利5,866,788所述的草酸氧化酶的多核苷酸，或编码如专利申请WO 97/30082，WO 99/24594，WO 99/02717，WO 99/53053和WO 99/91089中所述的抗细菌和/或抗真菌肽的多核苷酸。值得一提的可由编码植物农艺特性的多核苷酸构成，尤其是编码如美国专利5,552,306和5,614,313，以及专利申请WO 98/46763和WO 98/46764所述的δ-6脱饱和酶的多核苷酸，或是编码如专利申请WO 00/01833和PCT/FR 99/03179所述的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的多核苷酸。本发明的转化的植物还含有编码其它杀虫毒素的多核苷酸，如编码其它苏云金芽孢杆菌Cry蛋白的多核苷酸(例如，参见国际专利申请WO 98/40490)。
本发明的一个主题还包括抗本发明的修饰的Cry蛋白或其片段的单克隆或多克隆抗体。产生抗体的技术广泛描述在一般的文献以及参考书中，如Immunological《简易免疫技术》(Techniques Made Easy)(1998，O.Cochet，J.-L.Teillaud，C.Sautès编，John Wiley & Sons，Chichester)。优选地，本发明的抗体被用于试验或试剂盒，以检测本发明的Cry蛋白。
以下实施例是用来阐述本发明的，而不是限制其范围。
实施例1在Cry9Ca1毒素的164位氨基酸上产生胃蛋白酶切割位点用胃蛋白酶识别的三种氨基酸之一亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸替代该毒素第164位上天然存在的精氨酸，以将胃蛋白酶-特异位点引入苏云金芽孢杆菌Cry9Ca1毒素。氨基酸164存在于连接域I的α3和α4螺旋的间-α-螺旋环(以后称为α3-α4间-螺旋环)。
α3-α4间-螺旋环的天然序列在天冬氨酸159和缬氨酸168之间。该环的序列如下DRNDTRNLSV。这种氨基酸序列相应于以下DNA序列，从碱基475-延伸到碱基504GAT CGA AAT GAT ACA CGA AAT TTA AGT GTTAsp Arg Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Val编码精氨酸的密码子164(CGA)被修饰成编码亮氨酸或苯丙氨酸或谷氨酸的密码子。该密码子可能性如下亮氨酸TTA，TTG，CTT，CTC，CTA或CTG苯丙氨酸TTT或TTC谷氨酸GAA或GAG在定点诱变中，对优选密码子的选择取决于生物体，其中，修饰的cry基因必须被表达，以及与此相应的变化。这种选择是精通此领域的技术人员的普通知识的一部分，技术人员将根据这种优选地密码子来选择用于生产的生物体。在此实施例中，所选供表达的生物是苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌优选使用的用来编码亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸的密码子分别是TTA(亮氨酸)、TTT(苯丙氨酸)和GAA(谷氨酸)。
因此，可采用以下诱变寡核苷酸进行在Bt中表达的修饰(在以下实施例中所述的寡核苷酸中，上一行的密码子与突变的密码子相对应，用黑体表述的碱基和氨基酸与特定突变的碱基和氨基酸对应)寡核苷酸No.15′-gat cga aat gat aca TTA aat tta agt gtt gtt-3′Asp Arg Asn Asp Thr Leu Asn Leu Ser Val Val寡核苷酸No.1用亮氨酸替代精氨酸164。
寡核苷酸No.25′-gat cga aat gat aca TTT aat tta agt gtt gtt-3′Asp Arg Asn Asp Thr Phe Asn Leu Ser Val Val寡核苷酸No.2用苯丙氨酸替代精氨酸164。
寡核苷酸No.35′-gat cga aat gat aca GAA aat tta agt gtt gtt-3′Asp Arg Asn Asp Thr Glu Asn Leu Ser Val Val
寡核苷酸No.3用谷氨酸替代精氨酸。
用来修饰cry9Ca1基因序列的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株的特征如下-JM 109基因型recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thiD(lac-proAb)F′(traD36 proAB+lacIq lacZ DM15)-BMH 71-18 mut S基因型thi，supE，Δ(lac-proAB)，(mutS∷Tn10)(F′，proAB，lacIqZΔM15)。
质粒DNA是按照碱裂解技术(alkaline lysis technique)(Birboim和Doly，1979)用小量制备(minipreparation)制备的。每个细菌集落于37℃在添加适当抗生素的2ml LB培养基中振荡培养过夜(200rpm)。然后将培养物转移到微量管中，然后在13500g离心5分钟。除去上清后，将细菌重悬于100μl 25mM Tris-HCl(pH 8)和10mM EDTA的溶液中，该溶液含有最终浓度为100μg/ml的Rnase A。加入200μl含有1％SDS的0.2 MNaOH溶液，并通过颠倒微量管混合悬液两次。加入150μl 2.55M乙酸钾溶液(pH 4.5)，并将悬液在冰中培育5分钟。在13500g离心15分钟后，将上清转移到含有1ml冷乙醇的微量管中。在13500g离心30分钟后，除去上清并用1ml 70％乙醇洗涤沉淀。在真空下将含有DNA的沉淀干燥数分钟，然后加到50μl无菌蒸馏水中。然后将样品置于65℃30分钟。
对最终体积为20μl的1μg DNA进行限制性内切酶消化，对每种酶供应商建议在占终体积的10X缓冲液的十分之一情况下，并使用5个单位的酶。对酶在最佳温度下反应2-3小时。
用小牛肠碱性磷酸酶作为限制性酶进行5’末端的去磷酸化。在50μl的终体积中，每μg DNA用5μl 10X去磷酸化缓冲液(500mM Tris-Hcl，pH 9.3，10mM MgCl2，1mM ZnCl2和10mM亚精胺)和1单位酶进行反应。在突出5’末端情况下反应在37℃进行1小时，在平端或3’突出端情况下则在55℃进行1小时。去磷酸化后，然后在65℃将酶钝化30分钟，然后对每体积提取物用两体积苯-氯仿-异戊醇(25-24-1)的混合物除去。然后用T4噬菌体DNA连接酶形成连接。它们是用相当于100ng的载体量进行的，且插入片段/载体的摩尔比在5和10之间。反应物的最终体积为30μl，并含有3μl 10X连接缓冲液(300mM Tris-Hcl，pH 7.8，100mM MgCl2，100mMDTT和10mM ATP)和3单位的酶。反应物在14℃培育过夜。
所述诱变寡核苷酸(寡核苷酸No.1，寡核苷酸No.2和寡核苷酸No.3)在5’位被磷酸化以进行连接。将100pmol寡核苷酸和5单位T4多核苷酸激酶在37℃培育30分钟，最终体积为25μl，在有2.5μl 10X磷酸化缓冲液(700mM Tris-HCl，pH 7.6，100mM MgCl2和50mM DTT)和最终浓度为1mM的ATP的情况下。然后将酶在70℃灭活10分钟。
按照以下所述的常规方法进行定点诱变。精通此领域的技术人员已知的其它方法描述在文献中并得到一样的结果。所用定点诱变法是制造商描述的，它被用于Promega公司的Altered SitesII系统。该诱变系统和方法的详细描述可在Promega公司的互联网地址http//www.promega.com中找到。cry9Ca1基因被预克隆成携带四环素抗性基因和含有点突变的氨苄青霉素抗性基因的噬菌粒(phagemide)pAlter-1(Promega)。将要突变的DNA片段预克隆成质粒pAlter-1。加入2μl 2M NaOH，2mM EDTA，终体积为20μl，并在室温培育5分钟，使0.5pmol质粒DNA变性。加入2μl 2M醋酸铵，pH 4.6，和75μl乙醇，并将混合物在-70℃培育30分钟。在4℃以14000g离心15分钟后，用200μl 70％乙醇洗涤沉淀，并于4℃以14000g离心15分钟。然后在真空下干燥变性的DNA沉淀，并将其重悬于100μl无菌蒸馏水中。在杂交缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2，50mM NaCl)存在时，将10μl变性的DNA，即0.05pmol，与0.25pmol磷酸化的氨苄青霉素-抗性基因修复寡核苷酸，0.25pmol四环素-抗性基因破坏寡核苷酸和1.25pmol磷酸化的诱变寡核苷酸(寡核苷酸No.1，No.2或No 3)混合，并在75℃培育5分钟，然后缓慢冷却至室温。加入5μl无菌蒸馏水，3μl 10x合成缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 7.5，20mM DTT，10mM ATP，5mM dNTP)，10单位T4 DNA聚合物和3单位T4 DNA连接酶，并在37℃培育90分钟进行反应。然后在1.5μl上述反应物存在时，将200μl感受态大肠杆菌BMH 71-18在冰中培育30分钟。然后将细菌在42℃放置50秒进行热休克，再在冰中放置2分钟。然后加入900μlLB培养基并将悬液在37℃振荡培育1小时。然后加入4ml LB培养基(添加有氨苄青霉素，最终浓度为100μg/ml)并将培养物在37℃振荡培育过夜。按照上述质粒DNA提取方法，用4ml培养物制备质粒DNA的小量制备。然后在1ng质粒DNA存在时将200μl感受态大肠杆菌JM109在冰中培育30分钟。然后将细菌在42℃放置50秒进行热休克，再在冰中放置2分钟。然后加入900μl LB培养基并将悬液在37℃振荡培育过夜。然后将100μl细菌悬液取出铺在含有固体LB培养基的培养皿上，培养基中添加最终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素。筛选获得的重组体以发现感兴趣的克隆。用上述小量制备技术将几个集落的质粒DNA分离以进行研究，然后测序此DNA。用添加有终浓度为12.5μg/ml四环素的培养基选择重组体。通过在定点诱变后测序DNA控制所需突变的正确性和缺乏不需要的突变的鉴定。用Wizard Plus SV Minipreps DNA纯化系统(Promega)，按照供应商推荐的方法纯化供测序的DNA样品，并在ABI 377自动测序仪(Perkin-Elmer)上，用按照链终止法进行测序反应(Sanger等，1977)，通过PCR(使用ABI PRISM BigDye终止子循环测序试剂盒系统(ABI PRISM BigDye terminator Cycle Sequencing Kit system))进行测序。在进行样品的测序反应和自动分析时，所用方法是供应商(AppliedBiosystems)推荐的。
实施例2在Cry9Ca1毒素的α3-α4间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点用胃蛋白酶识别的氨基酸即亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸替代该间-螺旋环的至少一个氨基酸，以将胃蛋白酶-特异位点引入CrygCa1毒素的α3-α4间-螺旋环。因此，编码这三种氨基酸的密码子将替代天然存于从碱基475延伸到碱基504的区域中的密码子。这三种氨基酸密码子的可能性如实施例1所述。
如实施例1，选择用来产生修饰的Cry蛋白的生物是苏云金芽孢杆菌，因此对置换密码子的选择和实施例1一样。此外，如果选择了另一种产生菌，那些精通此领域的技术人员将能够根据选的产生菌的功能来调节优选密码子。
α3-α4间-螺旋环的各种可选序列都是可能的，它们都含有可变数量的亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸残基。一些可能性列于表1中。α3-α4间-螺旋环的修饰的可能性不限于表中给出的那些。在表1中给出列表的目的是阐述修饰的一些可能性，而不是要将本发明的范围限制与此。那些精通此领域的技术人员能够根据生物知道各氨基酸特异的密码子，将能够根据所有的可能性修改实施例1中所述的方法以修饰α3-α4间-螺旋环，尤其是表1中未描述的那些。
表1.Cry9Ca1毒素的α3-α4间-螺旋环的可能修饰的例子蛋白质 氨基酸序列 核苷酸序列
Cry9Ca1 DRNDTRNLSVgat cga aat gat aca cga aat tta agt gttAsp Arg Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser ValMutant No.1 ELNEFLNLSVgaA TTa aat gaA TTT TTa aat tta agt gttGlu Leu Asn Glu Phe Leu Asn Leu Ser ValMutant No.2 ELNELLNLSVgaA TTa aat gaA TTa TTa aat tta agt gttGlu Leu Asn Glu Leu Leu Asn Leu Ser ValMutant No.3 ELLEFLLLSVgaA TTa TTA gaA TTT TTa TTA tta agt gttGlu Leu Leu Glu Phe Leu Leu Leu Ser ValMutant No.4 ELLELLLLSVgaA TTa TTA gaA TTa TTa TTA tta agt gttGlu Leu Leu Glu Leu Leu Leu Leu Ser ValMutant No.5 ELLEELLLSVgaA TTa TTA gaA GAa TTa TTA tta agt gttGlu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Leu Ser ValMutant No.6 ERLEFLLLSVgaA cga TTA gaA TTT TTa TTA tta agt gttGlu Arg Leu Glu Phe Leu Leu Leu Ser ValMutant No.7 ERLELLLLSVgaA cga TTA gaA TTa TTa TTA tta agt gttGlu Arg Leu Glu Leu Leu Leu Leu Ser ValMutant No.8 ERLEELLLSVgaA TTa GAA gaA TTa TTa TTA tta agt gttGlu Leu Glu Glu Leu Leu Leu Leu Ser ValMutant No.9 ELLEEEELSVgaA TTa TTA gaA GAa GAa GAA tta agt gttGlu Leu Leu Glu Glu Glu Glu Leu Ser Val对每种突变体，在α3-α4间-螺旋环内对几种氨基酸的取代需要连续使用一些诱变寡核苷酸。所述需要用来产生表1所给突变体例子的诱变寡核苷酸如下(从4号到20号)。
Oligonucleotide No.4 cga aat gat aca cga TTA tta agt gtt gtt cgtArg Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ser Val Val ArgOligonucleotide No.5 cga aat gat aca cga GAA tta agt gtt gtt cgtArg Asn Asp Thr Arg Glu Leu Ser Val Val ArgOligonucleotide No.6 ttg gct gat cga aat gaA TTT TTa aat tta agt gtt gttLeu Ala Asp Arg Asn Glu Phe Leu Asn Leu Ser Val ValOligonucleotide No.7 ttg gct gat cga aat gaA TTT TTa tta tta agt gtt gttLeu Ala Asp Arg Asn Glu Phe Leu Leu Leu Ser Val ValOligonucleotide No.8 ttg gct gat cga aat gaA TTa TTa aat tta agt gtt gttLeu Ala Asp Arg Asn Glu Leu Leu Asn Leu Ser Val ValOligonucleotide No.9 ttg gct gat cga aat gaA TTa TTa tta tta agt gtt gttLeu Ala Asp Arg Asn Glu Leu Leu Leu Leu Ser Val ValOligonucleotide No.10ttg gct gat cga aat gaA GAa GAa gaa tta agt gtt gttLeu Ala Asp Arg Asn Glu Glu Glu Glu Leu Ser Val ValOligonucleotide No.11ttg gct gat cga aat gaA GAa TTa tta tta agt gtt gttLeu Ala Asp Arg Asn Glu Glu Leu Leu Leu Ser Val ValOligonucleotide No.12caa aat tgg ttg gct gaA TTa aat gaa tta tta aatGln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Asn Glu Leu Leu AsnOligonucleotide No.13caa aat tgg ttg gct gaA TTa aat gaa ttt tta aatGln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Asn Glu Phe Leu AsnOligonucleotide No.14caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa ttt tta tta ttaGln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Phe Leu Leu LeuOligonucleotide No.15caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa tta tta tta ttaGln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Leu Leu Leu LeuOligonucleotide No.16caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa gaa tta tta ttaGln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu LeuOligonucleotide No.17caa aat tgg ttg gct gaA cga TTA gaa ttt tta tta ttaGln Asn Trp Leu Ala Glu Arg Leu Glu Phe Leu Leu LeuOligonucleotide No.18caa aat tgg ttg gct gaA cga TTA gaa tta tta tta ttaGln Asn Trp Leu Ala Glu Arg Leu Glu Leu Leu Leu LeuOligonucleotide No.19caa aat tgg ttg gct gaA TTa gaA gaa tta tta tta ttaGln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Glu Glu Leu Leu Leu LeuOligonucleotide No.20caa aat tgg ttg gct gaA TTa TTA gaa gaa gaa gaa ttaGln Asn Trp Leu Ala Glu Leu Leu Glu Glu Glu Glu Leu连续的定点诱变方法与实施例1中所述的方法类似。不同之处在于寡核苷酸的组合。对于表1中所述的各个突变体的例子，寡核苷酸的连续组合如下所述。
突变体No.1突变体No.1的产生需要按照实施例1所述的方法进行两次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.6，第二次用寡核苷酸No.13。寡核苷酸No.13被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.6引入的修饰。
突变体No.2突变体No.2的产生需要按照实施例1所述的方法进行两次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.8，第二次用寡核苷酸No.12。寡核苷酸No.12被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.8引入的修饰。
突变体No.3突变体No.3的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.7，第三次用寡核苷酸No.14。寡核苷酸No.7被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.14被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.7引入的修饰。
突变体No.4突变体No.4的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.9，第三次用寡核苷酸No.15。寡核苷酸No.9被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.15被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.9引入的修饰。
突变体No.5突变体No.5的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.11，第三次用寡核苷酸No.16。寡核苷酸No.11被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.16被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.11引入的修饰。
突变体No.6突变体No.6的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.7，第三次用寡核苷酸No.17。寡核苷酸No.7被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.17被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.7引入的修饰。
突变体No.7突变体No.7的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.9，第三次用寡核苷酸No.18。寡核苷酸No.9被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.18被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.9引入的修饰。
突变体No.8突变体No.8的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.4，第二次用寡核苷酸No.9，第三次用寡核苷酸No.19。寡核苷酸No.9被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.4引入的修饰，寡核苷酸No.19被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.4和No.9引入的修饰。
突变体No.9突变体No.9的产生需要按照实施例1所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.5，第二次用寡核苷酸No.10，第三次用寡核苷酸No.20。寡核苷酸No.10被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.5引入的修饰，寡核苷酸No.20被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.5和No.10引入的修饰。
根据这一方法，所述寡核苷酸被分成三类，第一类寡核苷酸，第二类寡核苷酸和第三类寡核苷酸。分类如下第一类寡核苷酸寡核苷酸No.4，5，6和8第二类寡核苷酸寡核苷酸No.7，9，10，11，12和13第三类寡核苷酸寡核苷酸No.14，15，16，17，18，19和20。
产生这些突变体的完整方法与实施例1中所描述的相同。该方法对每种诱变系列都是共同的，只是诱变寡核苷酸和用来抑制/恢复对抗生素抗性的寡核苷酸发生了变化。在突变后对感兴趣的克隆进行筛选，这些克隆已经整合了上述突变。如果该步骤是第一类和第二类诱变的最后步骤，来自该系列实验的材料被作为初始材料分别供第二类和第三类诱变重新使用，第二类和第三类诱变分别使用了第二类或第三类寡核苷酸。然后可用获自DNA基质的质粒DNA和用来修复四环素抗性基因的寡核苷酸和用来破坏氨苄青霉素抗性基因的寡核苷酸以及第二类诱变寡核苷酸进行诱变的第二次循环。然后用添加有终浓度为12.5μg/ml四环素的培养基选择重组体。可用在第二次诱变循环终点获得的作为DNA基质的质粒DNA和用来修复氨苄青霉素抗性基因的寡核苷酸和用来破坏四环素抗性基因的寡核苷酸以及第三类诱变寡核苷酸进行诱变的第三次循环。然后用添加有终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的培养基选择重组体。当产生突变体所需的所有诱变完成后，按实施例1的描述进行控制突变的步骤。
实施例3在Cry9Ca1毒素的α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点Cry9Ca1毒素的α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的天然序列的位置列于表2。核苷酸序列和在cry9Ca1基因中相应的位置列于表3。
表2.Cry9Ca1毒素的α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的位置和序列环 序列 位置环α4-α5 FAVNGQQVPLL 苯丙氨酸187-亮氨酸197环α5-α6 LFGEGWGF 亮氨酸216-苯丙氨酸223环α6-α7 LRGTN 亮氨酸257-天冬氨酸261表3.编码α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的cry9ca1基因的位置和序列环 序列 位置环α4-α5TTT GCA GTA AAT GGA CAG CAG GTT CCA TTA CTG 559-591环α5-α6CTT TTT GGA GAA GGA TGG GGA TTC 646-669环α6-α7TTA AGA GGA ACA AAT 769-783核苷酸和氨基酸序列的重叠如下环α4-α5TTT GCA GTA AAT GGA CAG CAG GTT CCA TTA CTGPhe Ala Val Asn Gly Gln Gln Val Pro Leu leu环α5-α6 CTT TTT GGA GAA GGA TGG GGA TTCLeu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe环α6-α7 TTA AGA GGA ACA AATLeu Arg Gly thr Asn用胃蛋白酶识别的氨基酸，即亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸，替代Cry9Ca1毒素α4-α5，α5-α6或α6-α7间-螺旋环的至少一个氨基酸，以将胃蛋白酶-特异位点引入这些间-螺旋环。因此，编码这三种氨基酸的密码子将替代天然存于从碱基559延伸到591(α4-α5间-螺旋环)、646-669(α5-α6间-螺旋环)和769-783(α6-α7间-螺旋环)的区域中的密码子。这三种氨基酸密码子的可能性如实施例1所述。
如实施例1，选择用来产生修饰的Cry蛋白的生物是苏云金芽孢杆菌，因此对置换密码子的选择也和实施例1一样。此外，如果选择了另一种产生菌，那些精通此领域的技术人员将能够根据所选择的产生菌的功能来调节优选密码子。
α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的各种可选序列都是可能的，它们都含有可变数量的亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸残基。一些可能性列于表4、5和6中。α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的修饰可能性不限于表4、5和6中给出的那些。在表4、5和6中给出列表的目的是阐述修饰的一些可能性，而不是要将本发明的范围限制与此。那些精通此领域的技术人员能够根据生物知道各氨基酸特异的密码子，将能够根据所有的可能性修改该实施例中所述的方法以修饰α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环，尤其是表4、5和6中未列出的那些。
表4.Cry9Ca1毒素的α4-α5间-螺旋环可能修饰的例子蛋白质 氨基酸序列 核苷酸序列Cry9Ca1 FAVNGQQVPLL ttt gca gta aat gga cag cag gtt cca tta ctgPhe Ala Val Asn Gly Gln Gln Val Pro Leu leuMutant No.10 FLLNLFFLPLL ttt TTa Tta aat TTa TTT TTT TtA cca tta ctgPhe Leu leu Asn Leu Phe Phe Leu Pro Leu leuMutant No.11 FLLNLEELPLL ttt TTa Tta aat TTa GaA GaA TtA cca tta ctgPhe Leu leu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu leuMutant No.12 FEENLEFLPLL ttt GAa GAa aat TTa GaA GaA TtA cca tta ctgPhe Glu Glu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu leuMutant No.13 FEENFLLFPLL ttt GAa GAa aat TTT TTA TTA Ttt cca tta ctgPhe Glu Glu Asn Phe leu Leu Phe Pro Leu leuMutant No.14 FEENFEEFPLL ttt GAa GAa aat TTT GaA GaA Ttt cca tta ctgPhe Glu Glu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu leuMutant No.15 FLLNFEEFPLL ttt Tta TTa aat TTT GaA GaA Ttt cca tta ctgPhe Leu leu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu leuMutant No.16 FLLNEFFEPLL ttt TTa TTa aat GAa TTT TTT gAA cca tta ctgPhe Leu leu Asn Glu Phe Phe Glu Pro Leu leu表5.Cry9Ca1毒素的α5-α6间-螺旋环可能修饰的例子蛋白质 氨基酸序列 核苷酸序列Cry9Cal LFGEGWGFctt ttt gga gaa gga tgg gga ttcLeu Phe Gly Glu Gly Trp Gly PheMutant No.17 LFLELFLFctt ttt TTa gaa TTa tTT TTa ttcLeu Phe Leu Glu Leu Phe Leu PheMutant No.18 LFLLLFLFctt ttt TTa TTa TTa tTT TTa ttcLeu Phe Leu Leu Leu Phe Leu PheMutant No.19 LFLEEFELctt ttt TTa gaa gAa tTT gAa TTALeu Phe Leu Glu Glu Phe Glu LeuMutant No.20 LFEEEFELctt ttt gAa gaa gAa tTT gAa TTALeu Phe Glu Glu Glu Phe Glu LeuMutant No.21 LFEEEFEEctt ttt gAa gaa TTa tTT gAa GAALeu Phe Glu Glu Glu Phe Glu Glu
表6.Cry9Ca1毒素的α6-α7间-螺旋环可能修饰的例子蛋白质氨基酸序列 核苷酸序列Cry9Ca1 LRGTN tta aga gga aca aatLeu Arg Gly thr AsnMutant No.22 LLELN tta TTa gAa TTa aatLeu Leu Glu Leu AsnMutant No.23 LLFLN tta TTa TTT TTa aatLeu Leu Phe Leu AsnMutant No.24 LELLN tta GAa TTa TTa aatLeu Glu Leu Leu AsnMutant No.25 LLFFN tta TTa TTT TTT aatLeu Leu Phe Phe AsnMutant No.26 LEELN tta GAa GAa TTa aatLeu Glu Glu Leu AsnMutant No.27 LEFLN tta GAa TTT TTa aatLeu Glu Phe Leu AsnMutant No.28 LEFEN tta GAa TTT GAa aatLeu Glu Phe Glu AsnMutant No.29 LEEEN tta GAa gAa GAa aatLeu Glu Glu Glu Asn3-1-在α4-α5间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点对每种突变体，在α4-α5间-螺旋环内对几种氨基酸的取代需要连续使用一些诱变寡核苷酸。需要用来产生表4所给突变体例子的诱变寡核苷酸如下(从21号到34号)。
Oligonucleotide No.21gct att cca ttg ttt TTa Tta aat gga cag cag gttAla Ile Pro Leu Phe Leu leu Asn Gly Gln Gln ValOligonucleotide No.22gct att cca ttg ttt GAa GAa aat gga cag cag gttAla Ile Pro Leu Phe Glu Glu Asn Gly Gln Gln ValOligonucleotide No.23tta tta aat gga cag cag TtA cca tta ctg tca gtaLeu leu Asn Gly Gln Gln Leu Pro Leu Leu Ser Val
Oligonucleotide No.24tta tta aat gga cag cag Ttt cca tta ctg tca gtaLeu leu Asn Gly Gln Gln Phe Pro Leu Leu Ser ValOligonucleotide No.25tta tta aat gga cag cag gAA cca tta ctg tca gtaLeu leu Asn Gly Gln Gln Glu Pro Leu Leu Ser ValOligonucleotide No.26gaa gaa aat gga cag cag TtA cca tta ctg tca gtaGlu Glu Asn Gly Gln Gln Leu Pro Leu Leu Ser ValOligonucleotide No.27gaa gaa aat gga cag cag Ttt cca tta ctg tca gtaGlu Glu Asn Gly Gln Gln Phe Pro Leu Leu Ser ValOligonucleotide No.28cca ttg ttt tta tta aat TTa TTT TTT tta cca tta ctg tca gtaPro Leu Phe Leu Leu Asn Leu Phe Phe Leu Pro Leu Leu Ser ValOligonucleotide No.29cca ttg ttt tta tta aat TTa GaA GaA tta cca tta ctg tca gtaPro Leu Phe Leu Leu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu Leu Set ValOligonucleotide No.30cca ttg ttt gaa gaa aat TTa GaA GaA tta cca tta ctg tca gtaPro Leu Phe Glu Glu Asn Leu Glu Glu Leu Pro Leu Leu Ser ValOligonucleotide No.31cca ttg ttt gaa gaa aat TTT TTA TTA ttt cca tta ctg tca gtaPro Leu Phe Glu Glu Asn Phe Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ser ValOligonucleotide No.32cca ttg ttt gaa gaa aat TTT GaA GaA ttt cca tta ctg tca gtaPro Leu Phe Glu Glu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu Leu Ser ValOligonucleotide No.33cca ttg ttt tta tta aat TTT GaA GaA ttt cca tta ctg tca gtaPro Leu Phe Leu Leu Asn Phe Glu Glu Phe Pro Leu Leu Ser ValOligonucleotide No.34cca ttg ttt tta tta aat GAa TTT TTT gaa cca tta ctg tca gtaPro Leu Phe Leu Leu Asn Glu Phe Phe Glu Pro Leu Leu Ser Val连续的定点诱变方法与实施例2中所述的方法类似。不同之处在于寡核苷酸的组合。对于表4中所述的各个突变体，寡核苷酸的连续组合如下所述。
突变体No.10突变体No.10的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.21，第二次用寡核苷酸No.23，第三次用寡核苷酸No.28。寡核苷酸No.23被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.21引入的修饰，寡核苷酸No.28被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.21和No.23引入的修饰。
突变体No.11突变体No.11的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.21，第二次用寡核苷酸No.23，第三次用寡核苷酸No.29。寡核苷酸No.23被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.21引入的修饰，寡核苷酸No.29被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.21和No.23引入的修饰。
突变体No.12突变体No.12的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.22，第二次用寡核苷酸No.26，第三次用寡核苷酸No.30。寡核苷酸No.26被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.22引入的修饰，寡核苷酸No.30被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.22和No.26引入的修饰。
突变体No.13突变体No.13的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.22，第二次用寡核苷酸No.27，第三次用寡核苷酸No.31。寡核苷酸No.27被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.22引入的修饰，寡核苷酸No.31被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.22和No.27引入的修饰。
突变体No.14突变体No.14的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.22，第二次用寡核苷酸No.27，第三次用寡核苷酸No.32。寡核苷酸No.27被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.22引入的修饰，寡核苷酸No.32被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.22和No.27引入的修饰。
突变体No.15突变体No.15的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.21，第二次用寡核苷酸No.24，第三次用寡核苷酸No.33。寡核苷酸No.24被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.21引入的修饰，寡核苷酸No.33被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.21和No.24引入的修饰。
突变体No.16突变体No.16的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.21，第二次用寡核苷酸No.25，第三次用寡核苷酸No.34。寡核苷酸No.25被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.21引入的修饰，寡核苷酸No.34被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.21和No.25引入的修饰。
根据这一方法，用来产生表4中所述突变体No.10-No.16的寡核苷酸被分成三类，第一类寡核苷酸，第二类寡核苷酸和第三类寡核苷酸。分类如下第一类寡核苷酸寡核苷酸No.21和22第二类寡核苷酸寡核苷酸No.23，24，25，26和27第三类寡核苷酸寡核苷酸No.28，29，30，31，32，33和34。
3-2-在α5-α6间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点对每种突变体，在α5-α6间-螺旋环内对几种氨基酸的取代需要连续使用一些诱变寡核苷酸。需要用来产生表5所给突变体例子的诱变寡核苷酸如下(从35号-44号)。
Oligonucleotide No.35gat gca tct ctt ttt TTa gaa gga tgg gga ttcAsp Ala Ser Leu Phe Leu Glu Gly Trp Gly PheOligonucleotide No.36gat gca tct ctt ttt TTa TTa gga tgg gga ttc acaAsp Ala Ser Leu Phe Leu Leu Gly Trp Gly Phe ThrOligonucleotide No.37gat gca tct ctt ttt gAa gaa gga tgg gga ttcAsp Ala Ser Leu Phe Glu Glu Gly Trp Gly PheOligonucleotide No.38tta gaa gga tgg gga TTa aca cag ggg gaa attLeu Glu Gly Trp Gly Leu Thr Gln Gly Glu IleOligonucleotide No 39gga gaa gga tgg gga GAA aca cag ggg gaa attGly Glu Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Glu IleOligonucleotide No.40gca tct ctt ttt tta gaa TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa attAla Ser Leu Phe Leu Glu Leu Phe Leu Phe Thr Gln Gly Glu IleOligonucleotide No.41gca tct ctt ttt tta tta TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa attAla Ser Leu Phe Leu Leu Leu Phe Leu Phe Thr Gln Gly Glu IleOligonucleotide No.42gca tct ctt ttt tta gaa TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa attAla Ser Leu Phe Leu Glu Glu Phe Glu Leu Thr Gln Gly Glu IleOligonucleotide No.43gca tct ctt ttt gaa gaa TTa tTT TTa ttc aca cag ggg gaa attAla Ser Leu Phe Glu Glu GLu Phe Glu Leu Thr Gln Gly Glu IleOligonucleotide No.44gca tct ctt ttt gaa gaa TTa tTT TTa gaa aca cag ggg gaa attAla Ser Leu Phe Glu Glu Glu Phe Glu Glu Thr Gln Gly Glu Ile连续的定点诱变方法与实施例2中所述的方法类似。不同之处在于寡核苷酸的组合。对于表5中所述的各个突变体，寡核苷酸的连续组合如下所述。
突变体No.17突变体No.17的产生需要按照以下所述的方法进行进行两次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.35，第二次用寡核苷酸No.40。寡核苷酸No.40被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.35引入的修饰。
突变体No.18突变体No.187的产生需要按照以下所述的方法进行进行两次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.36，第二次用寡核苷酸No.41。寡核苷酸No.41被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.36引入的修饰。
突变体No.19突变体No.19的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.35，第二次用寡核苷酸No.38，第三次用寡核苷酸No.42。寡核苷酸No.38被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.35引入的修饰，寡核苷酸No.42被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.35和No.38引入的修饰。
突变体No.20突变体No.20的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.37，第二次用寡核苷酸No.38，第三次用寡核苷酸No.43。寡核苷酸No.38被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.37引入的修饰，寡核苷酸No.43被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.37和No.38引入的修饰。
突变体No.21突变体No.21的产生需要按照以下所述的方法进行三次连续系列的定点诱变，第一次诱变用寡核苷酸No.37，第二次用寡核苷酸No.39，第三次用寡核苷酸No.44。寡核苷酸No.39被限定识别在第一次诱变时用寡核苷酸No.37引入的修饰，寡核苷酸No.44被限定识别在前两次诱变时用寡核苷酸No.37和No.39引入的修饰。
根据这一方法，用来产生表5中所述突变体No.17-No.21的寡核苷酸被分成三类，第一类寡核苷酸，第二类寡核苷酸和第三类寡核苷酸。分类如下第一类寡核苷酸寡核苷酸No.35，36和37第二类寡核苷酸寡核苷酸No.38，39，40和41第三类寡核苷酸寡核苷酸No.42，43和44。
3-3-在α6-α7间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点对每种突变体，在α6-α7间-螺旋环内对几种氨基酸的取代需要连续使用一些诱变寡核苷酸。需要用来产生表6所给突变体例子的诱变寡核苷酸如下(从45号到52号)。
Oligonucleotide No.45ggt tta gat cgt tta TTa gAa TTa aat act gaa agt tggGly Leu Asp Arg Leu Leu Glu Leu Asn Thr Glu Ser TrpOligonucleotide No.46ggt tta gat cgt tta TTa TTT TTa aat act gaa agt tggGly Leu Asp Arg Leu Leu Phe Leu Asn Thr Glu Ser TrpOligonucleotide No.47ggt tta gat cgt tta GAa TTa TTa aat act gaa agt tggGly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Asn Thr Glu Ser TrpOligonucleotide No.48ggt tta gat cgt tta TTa TTT TTT aat act gaa agt tggGly Leu Asp Arg Leu Leu Phe Phe Asn Thr Glu Ser TrpOligonucleotide No.49ggt tta gat cgt tta GAa GAa TTa aat act gaa agt tggGly Leu Asp Arg Leu Glu Glu Leu Asn Thr Glu Ser TrpOligonucleotide No.50ggt tta gat cgt tta GAa TTT TTa aat act gaa agt tggGly Leu Asp Arg Leu Glu Phe Leu Asn Thr Glu Ser TrpOligonucleotide No.51ggt tta gat cgt tta GAa TTT GAa aat act gaa agt tggGly Leu Asp Arg Leu Glu Phe Glu Asn Thr Glu Ser TrpOligonucleotide No.52ggt tta gat cgt tta GAa gAa GAa aat act gaa agt tggGly Leu Asp Arg Leu Glu Glu Glu Asn Thr Glu Ser Trp
寡核苷酸No.45被用来产生突变体No.22。
寡核苷酸No.46被用来产生突变体No.23。
寡核苷酸No.47被用来产生突变体No.24。
寡核苷酸No.48被用来产生突变体No.25。
寡核苷酸No.49被用来产生突变体No.26。
寡核苷酸No.50被用来产生突变体No.27。
寡核苷酸No.51被用来产生突变体No.28。
寡核苷酸No.52被用来产生突变体No.29。
产生这些突变体的完整方法与实施例2中所描述的相同。该方法对每种突变体都是共同的，只是诱变寡核苷酸和用来抑制/恢复对抗生素抗性的寡核苷酸发生了变化。
实施例4在各种Cry毒素的α3-α4，α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环中产生胃蛋白酶切割位点几组Cry蛋白具有结构相似性。尤其是在Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19或Cry20家族的蛋白中。这些相似性在文献中被证实(Schnepf等，1998)。其它在该文献中未引用的Cry蛋白也和这些家族有结构和序列相似性。实施例4的目的是证实本发明，如实施例2和3中有关Cry9Ca1蛋白的例证对所有这些结构类似家族的适用性。
实施例2和3中所述的间-螺旋环的修饰可用等价的方式对所有Cry蛋白进行，其中可能鉴别与Cry9Ca1毒素的域I中存在的那些类似的间-螺旋环。如果确定了这些不同Cry毒素的中间-螺旋环的位置和序列，对精通此领域的技术人员而言，用实施例2和3中提供的技术细节形成与实施例2和3所给类似的修饰就非常容易了。在本发明中，在Cry毒素中产生供胃蛋白酶降解的特异位点的元件除Cry9Ca1毒素外，还有Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。为在Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19或Cry20毒素中产生被胃蛋白酶降解的位点，对这些间-螺旋环的修饰需要以下步骤1)根据下表6-13所给的间-螺旋环的序列和位置，像实施例2和3和表1，4，5和6中所给的那样，建立含有一个或多个亮氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸残基的可能突变体的列表。
2)考虑宿主生物的密码子偏爱建立突变体基因的序列，如果所述生物是苏云金芽孢杆菌，则亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸优选使用的密码子分别是TTA，TTT和GAA。
3)合成诱变寡核苷酸以修饰编码毒素的基因序列，该毒素是基于实施例2和3中所给的那些模型选出的。
4)用如实施例2和3中所述的单个或多个诱变策略，并按照实施例2和3中详细描述的实验方法。
Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20毒素的域I的α3-α4，α4-α5，α5-α6和α6-α7间-螺旋环的定位和它们的序列给在下表7，8，9，10，11，12和13中。这些序列是对苏云金芽孢杆菌分类委员会(Crickmore等，2001)定义的各个正模标本蛋白给出的。然而，由于内-正模标本(intra-holotype)序列的同源性，即同一正模标本的不同亚型之间的序列同源性非常高，那些精通此领域的技术人员可修改实施例4中所述的方法使其适合所有的Cry蛋白亚型。
表7.Cry1蛋白中α3-α4间-螺旋环的定位和序列蛋白质氨基酸 在蛋白质上核苷酸序列在基因上的位置序列的位置Cry1AaDPTN120 to 123gatcctactaat 358 to 369Cry1AbDPTN120 to 123gatcctactaat 358 to 369Cry1AcDPTN120 to 123gatcctactaat 358 to 369Cry1AdDPTN120 to 123gatcctactaat 358 to 369Cry1AeDPTN120 to 123gatcctactaat 358 to 369Cry1AfDPTN120 to 123gatcctactaat 358 to 369Cry1AgDPTN120 to 123gatcctactaat 358 to 369Cry1BaNRDD139 to 142aaccgtgacgat 415 to 426Cry1BbNRND144 to 147aaccgaaatgat 430 to 441Cry1BcNRND144 to 147aaccgaaatgat 430 to 441Cry1BdNRND144 to 147aaccgaaatgat 430 to 441Cry1CaDPNN119 to 122gatcctaataat 355 to 366Cry1CbDPDN119 to 122gatcctgataat 355 to 366Cry1DaDPTN119 to 122gatcctaataat 355 to 366Cry1DbDPSN119 to 122gatccgtctaat 355 to 366Cry1EaDPTN118 to 121gatcctactaat 352 to 363Cry1EbDPTN117 to 120gatcctactaat 349 to 360Cry1FaNPNN118 to 121aatcctaataat 352 to 363Cry1FbNPNN118 to 121aatcctaataat 352 to 363Cry1GaDPNN118 to 121gatcctaataat 352 to 363Cry1GbDPDN118 to 121gatcctgataac 352 to 363Cry1HaSPNN122 to 125tctcctaataat 364 to 375Cry1HbSPNN121 to 124tctcctaataat 361 to 372Cry1IaNRNN148 to 151aatcgtaataac 442 to 453Cry1IbNRNN148 to 151aatcgtaataac 442 to 453Cry1IcNRNN148 to 151aatcgtaataac 442 to 453Cry1IdNRNN148 to 151aatcgcaataac 442 to 453Cry1IcNRNN148 to 151aatcgcaacaac 442 to 453Cry1IaDPDN119 to 122gatcctgataac 355 to 366Cry1JbTPDN119 to 122actccagataac 355 to 366Cry1KaNRND145 to 148aaccgaaatgat 433 to 444
表8.Cry1蛋白α4-α5间-螺旋环的位置和序列蛋白质氨基酸序列 在蛋白质上 核苷酸序列在基因上的位置的位置Cry1AaLAVQNYQVPLL148 to 158ttggcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 to 474FLAVQNYQVPLL 148 to 158tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 to 474Cry1AbFAVQNYQVPLL148 to 158tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 to 474Cry1AcFAVQNYQVPLL148 to 158tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 to 474LAVQNYQVPLL148 to 158ttggcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 to 474Cry1AdFTVQNYQVPLL148 to 158tttgcagttcaaaattatcaagtacctcttcta 442 to 474Cry1AeFTVQNYQVPLL148 to 158tttgcagttcaaaattatcaagtacctcttcta 442 to 474Cry1AfFAVQNYQVPLL148 to 158tttgcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 to 474Cry1AgLAVQNYQVPLL148 to 158ttggcagttcaaaattatcaagttcctctttta 442 to 474Cry1BaFAIRNQEVPLL167 to 177ttcgcaattagaaaccaagaagttccattattg 499 to 531Cry1BbFRIRNEEVPLL172 to 182ttcagaatacgaaatgaagaagttccattatta 514 to 546Cry1BcFRIRNEEVPLL172 to 182ttcagaatacgaaatgaagaagttccattatta 514 to 546Cry1BdFRIRNEEVPLL172 to 182ttcagaatacgaaatgaagaagttccattatta 514 to 546Cry1CaFRISGFEVPLL147 to 157tttcgaatttctggatttgaagtacccctttta 439 to 471Cry1CbFRIAGFEVPLL147 to 157tttcgaattgctggatttgaagtacccctttta 439 to 471Cry1DaFRVQNYEVALL147 to 157tttagagttcaaaattatgaagttgctctttta 439 to 471Cry1DbLRVRNYEVALL147 to 157ttaagagttcgtaattatgaagttgctctttta 439 to 471Cry1EaLFSVQNYQVPFL 145 to 156cttttttcagttcaaaattatcaagtcccattttta433 to 468Cry1EbLFSVQGYEIPLL 144 to 155cttttttcagttcaaggttatgaaattcctctttta430 to 465Cry1FaNFTLTSFEIPLL 145 to 156aattttacacttacaagttttgaaatccctctttta433 to 468Cry1FbNFTLTSFEIPLL 145 to 156aattttacacttacaagttttgaaatccctctttta433 to 468Cry1GaTLAIRNLBVVNL 145 to 156actttggcaattcggaatcttgaggtagtgaattta433 to 468Cry1GbLMAIPGFELATL 145 to 156cttatggcaattccaggttttgaattagctacttta433 to 468Cry1HaLREQGFEIPLL150 to 160ctgagagaacaaggctttgaaattcctctttta 448 to 480Cry1HbLREQGFEIPLL149 to 159ctgagagaacagggctttgaaattcctctttta 445 to 477Cry1IaFAVSGEEVPLL176 to 186tttgcagtgtctggagaggaggtaccattatta 526 to 558Cry1IbFAVSGEEVPLL176 to 186tttgcagtatctggtgaggaagtaccattatta 526 to 558Cry1IcFAVSGEEVPLL176 to 186tttgcagtatctggtgaggaagtaccattatta 526 to 558Cry1IdFAVSGEEVPLL176 to 186tttgcagtttctggagaagaggtgccgctatta 526 to 558Cry1IeFAVSGEEVPLL176 to 186tttgcagtatcaggtgaggaagtaccattattg 526 to 558Cry1JaFRIIGFEVPLL147 to 157tttcggataattggatttgaagtgccactttta 439 to 471Cry1JbFRIPGFEVPLL147 to 157tttcggattcccggatttgaagtgccacttcta 439 to 471Cry1KaFSIRNEEVPLL173 to 183ttcagcatacgaaacgaagaggttccattatta 517 to 549
表9.Cry1蛋白α5-α6间-螺旋环的位置和序列蛋白质氨基酸序列在蛋白质上 核苷酸序列 在基因上的位置的位置Cry1Aa FGQRWGFD 178 to 185tttggacaaaggtggggatttgat532 to 555Cry1Ab FGQRWGFD 178 to 185tttggacaaaggtggggatttgat532 to 555Cry1Ac FGQRWGFD 178 to 185tttggacaaaggtggggatttgat532 to 555Cry1Ad FGQRWGFD 178 to 185tttggacaacgttggggatttgat532 to 555Cry1Ae FGQRWGLD 178 to 185tttggacaacgttggggacttgat532 to 555Cry1Af CGQRSGFD 175 to 182tgtggacaaaggtcgggatttgat523 to 546Cry1Ag FGQRWGFD 178 to 185tttggacaaaggtggggatttgat532 to 555Cry1Ba FGSEFGLT 197 to 204tttggtagtgaatttgggcttaca589 to 612Cry1Bb FGSEWGMA 202 to 209tttggtagtgaatgggggatggca604 to 627Cry1Bc FGSEWGMA 202 to 209tttggtagtgaatgggggatggca604 to 627Cry1Bd FGSEWGMA 202 to 209tttggtagtgaatgggggatggca604 to 627Cry1Ca FGERWGLT 177 to 184tttggagaaagatggggattgaca529 to 552FGERWGVT 177 to 184tttggagaaagatggggagtgaca529 to 552Cry1Cb FGARWGLT 177 to 184tttggagcaagatggggattgaca529 to 552Cry1Da FGERWGYD 177 to 184ttcggagaaagatggggatatgat529 to 552Cry1Db YGQRWGFD 177 to 184tacggtcagagatggggctttgac529 to 552Cry1Ea FGQAWGFD 176 to 183tttgggcaggcttggggatttgat526 to 549Cry1Eb FGQRWGFD 175 to 182tttggacaacgttggggatttgat523 to 546Cry1Fa FGQGWGLD 176 to 183tttgggcagggttggggactggat526 to 549Cry1Fb FGQGWGLD 176 to 183tttgggcagggttgggggctggat526 to 549Cry1Ga FGERWGLT 176 to 183tttggagaaagatggggattaaca526 to 549Cry1Gb FGERWGLT 176 to 183tttggggagagatggggattgaca526 to 549Cry1Ha FGQRWGLD 180 to 187tttgggcaaagatggggacttgac538 to 561Cry1Hb FGQRWGLD 179 to 186tttggacagagatggggacttgat535 to 558Cry1Ia FGKEWGLS 206 to 213tttggaaaagagtggggattatca616 to 639Cry1Ib FGKEWGLS 206 to 213tttggaaaagaatggggattatca616 to 639Cry1Ic FEKNGGLS 206 to 213tttgaaaagaatgggggattatca616 to 639Cry1Id FGKEWGLS 206 to 213tttggaaaagaatggggattgtca616 to 639Cry1Ie FGKEWGLS 206 to 213tttggaaaagagtggggattatct616 to 639Cry1Ja FGERWGLT 177 to 184tttggagagagatggggattgacg529 to 552Cry1Jb FGERWGLT 177 to 184ttcggagagagatggggattgacg529 to 552Cry1Ka FGSEWGMS 203 to 210tttggtagtgaatgggggatgtca607 to 630
表10.Cry1蛋白中α6-α7间-螺旋环的定位和序列蛋白质 氨基酸序列 在蛋白质上 核苷酸序列 在基因上的位置的位置Cry1AaVWGPD218 to 222gtatggggaccggat652 to 666Cry1AbVWGPD218 to 222gtatggggaccggat652 to 666Cry1AcVWGPD218 to 222gtatggggaccggat652 to 666Cry1AdVWGPD218 to 222gtatggggaccggat652 to 666Cry1AeVWGPD218 to 222gtatggggaccggat652 to 666Cry1AfVWGPD215 to 219gtatggggaccggat643 to 657Cry1AgVWGPD218 to 222gtatggggaccggat652 to 666Cry1BaLRGTN237 to 241ttgagagggacaaat709 to 723Cry1BbLRGTN242 to 246ttaagagggacaaat724 to 738Cry1BcLRGTN242 to 246ttaagagggacaaat724 to 738Cry1BdLRGTN242 to 246ttaagagggacaaat724 to 738Cry1CaLPKST217 to 221ttaccgaaatctacg649 to 663Cry1CbLPKST217 to 221ttaccaaaatctacg649 to 663Cry1DaLEGRF217 to 221ttggaaggtcgtttt649 to 663Cry1DbLEGSR217 to 221ttagagggatctcga649 to 663Cry1EaLPRTGG 216 to 221ttaccacgaactggtggg 646 to 663Cry1EbLPRNEG 215 to 220ttaccacgtaatgaaggg 643 to 660Cry1FaLRGTNT 216 to 221ttaagaggtactaatact 646 to 663Cry1FbLRGTNT 216 to 221ttaagaggtactaatact 646 to 663Cry1GaIGGIS216 to 220attggagggataagt646 to 660Cry1GbLNVIR216 to 220ttaaatgttataaga646 to 660Cry1HaFGGVS220 to 224tttggtggtgtgtca658 to 672Cry1HbFGVVT219 to 223tttggtgttgtaaca655 to 669Cry1IaLRGTN246 to 250ttgaggggtacaaat736 to 750Cry1IbLRGTN246 to 250ttgaggggtacaaat736 to 750Cry1IcLRATN246 to 250ttgagggctacaaat736 to 750Cry1IdLRGTN246 to 250ttgaggggaacaaat736 to 750Cry1IeLRGTN246 to 250ttgagaggtacaaat736 to 750CryIJaLGFRS217 to 221ctagggtttagatct649 to 663Cry1JbLGFTS217 to 221ctagggtttacttct649 to 663Cry1KaLRGTT243 to 247ttaagagggacaact727 to 741
表11.Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白中α3-α4间-螺旋环的定位和序列蛋白质氨基酸序列 在蛋白质上 核苷酸序列 在基因上的位置的位置Cry3Aa NPVSSRN 153 to 159 aatcctgtgagttcacgaaat 457 to 177Cry3Ba APVNLRS 154 to 160 gcgcctgtaaatttacgaagt 460 to 180Cry3Bb TPLSLRS 154 to 160 acacctttaagtttgcgaagt 460 to 180Cry3Ca TPLTLRD 151 to 157 actcctttgactttacgagat 451 to 471Cry4Aa NNPNPQNTQD 160 to 169 aataatccaaacccacaaaatactcaggat478 to 507Cry4Ba EPNNQSYRTA 136 to 145 gagcctaataaccagtcctatagaacagca406 to 435Cry7Aa KQDDPEAILS 147 to 156 aaacaagatgatccagaagctatactttct439 to 468Cry7Ab NPDDPATITR 147 to 156 aatcctgatgatccagcaactataacacga439 to 468Cry8Aa NRNDARTRSV 158 to 167 aatcgcaatgatgcaagaactagaagtgtt472 to 501Cry8Ba NPNGSRALRD 159 to 168 aatccaaatggttcaagagccttacgagat475 to 504Cry8Ca NPHSTRSAAL 159 to 168 aacccacacagtacacgaagcgcagcactt475 to 504Cry9Aa NPNSASAEEL 146 to 155 aatcctaattctgcttctgctgaagaactc436 to 465Cry9Ba RPNGVRANLV 134 to 143 agaccaaacggcgtaagagcaaacttagtt400 to 429Cry9Ca DRNDTRNLSV 159 to 168 gatcgaaatgatacacgaaatttaagtgtt475 to 504Cry9Da RPNGARASLV 159 to 168 agaccaaatggcgcaagggcatccttagtt475 to 504Cry9Ea RPNGARANLV 159 to 168 agaccgaacggagcaagagctaacttagtt475 to 504Cry10AaARTHANAKAV 162 to 171 gcacgtacacacgctaatgctaaagcagta484 to 513Cry16AaNYNPTSIDDV 109 to 118 aattataatccaacttctatagacgatgta325 to 354Cry17AaNKDDPLAIAEL 127 to 137 aataaagatgaccccttggctatagctgaatta 379 to 411Cry19AaDPKSTGNLSTL 159 to 169 gatccaaaatctacaggtaatttaagcacctta 475 to 507Cry19BaNKNNFASGEL 151 to 160 aataaaaataatttcgcaagtggtgaactt451 to 480Cry20AaERNRTRENGQ 141 to 150 gaacgtaatagaactcgtgaaaacggacaa421 to 450
表12.Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白中α4-α5间-螺旋环的定位和序列蛋白质 氨基酸序列在蛋白质上 核苷酸序列 在基因上的位置的位置Cry3AaISGYEVL 186 to 192 atttctggatacgaggttcta 556 to 576Cry3BaVSKFEVL 187 to 193 gtttccaaattcgaagttctg 559 to 579Cry3BbVSKFEVL 187 to 193 gtttccaaattcgaagtgctg 559 to 579Cry3CaVSGYEVL 184 to 190 gtctctggatacgaagttcta 550 to 570Cry4AaLVNSCPPNPSDCDYYNILVL188 to 207cttgtaaactcttgtcctcctaatcctagtgattgcgattactataacatactagtatta 562 to 621Cry4BaFSNLVGYFLLL 164 to 175 tttagcaacttagtaggttagaattattgttatta 490 to 525Cry7AaFKVTGYEIPLL 175 to 185 tttaaggttactggatatgaaataccattacta 523 to 555Cry7AbFRVAGYELPLL 175 to 185 tttagggttgctggatatgaaataccattacta 523 to 555Cry8AaFAVSGHEVLLL 186 to 196 tttgcagtatccggacacgaagtactattatta 556 to 588Cry8BaFRVTNFEVPFL 187 to 197 tttcgagtgacaaattttgaagtaccattcctt 559 to 591Cry8CaFSQTNYETPLL 187 to 197 ttttctcaaacgaattatgagactccactctta 559 to 591Cry9AaLTNGGSLARQNAQILLL 175 to 191 ttaacgaatggtggctcgttagctagacaaaatgcccaaatattattatta 523 to 571Cry9BaFGSGPGSQRFQAQLL 161 to 175 tttggtagtggccctggaagtcaaaggtttcaggcacaattgttg 481 to 525Cry9CaFAVNGQQVPLL 187 to 197 tttgcagtaaatggacagcaggttccattactg 559 to 591Cry9DaFGSGPGSQNYATILL 186 to 200 tttggctctggtcctggaagtcaaaattagtcaactatattactt 556 to 600Cry9EaFGTGPGSQRDAVALL 186 to 200 tttggtacgggtcctggtagtcaaagagatgcggtagcgttgttg 556 to 600Cry10Aa LKNNASYRIPTL189 to 200 ttaaaaaataatgctagctatcgaataccaacactc 565 to 600Cry16Aa FKVKNYEVTVL 136 to 146 tttaaggttaaaaattatgaagtaacagtgtta 406 to 438Cty17Aa FKRANYEVLLL 155 to 165 tttaaaagggcgaattatgaagtcttactatta 463 to 495Cry19Aa VNNQGSPGYELLLL 187 to 200 gttaataatcaggggagtccaggttatgagttacttttattg559 to 600Cry19Ba FSLGGYETVLL 180 to 190 ttctcattaggaggttatgaaacagtattatta 538 to 570Cry20Aa LSRRGFETLLL 173 to 183 ctttctcgcagaggattcgaaactctttatta 517 to 549
表13.Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白中α5-α6间-螺旋环的定位和序列蛋白质 氨基酸序列 在蛋白质上核苷酸序列 在基因上的位置的位置Cry3Aa GEEWGYE 215 to 221 ggagaagaatggggatacgaa 643 to 663Cry3Ba GEEWGYS 216 to 222 ggagaagaatggggatattct 646 to 666Cry3Bb GEEWGYS 216 to 222 ggagaagaatggggatattct 646 to 666Cry3Ca GTDWGYS 213 to 219 ggaacggattggggatattct 637 to 657Cry4Aa FEAYLKNNRQFDYLE 227 to 241tttgaagcgtatttaaaaaacaatcgacaattcgattatttagag 679 to 723Cry4Ba LINAQEWSL 193 to 201 ctcataaatgcacaagaatggtcttta 577 to 603PHKCTRMVY 193 0 201 cctcataaatgcacaagaatggtctat 577 to 603Cry7Aa GDKWGF206 to 211 ggagataaatggggattc616 to 633GDKWEF206 to 211 ggagataaatgggaattc616 to 633Cry7Ab GDKWGF206 to 211 ggagataaatggggattc616 to 633Crt8Aa GEEWGF217 to 222 ggagaagagtggggattt649 to 666Cry8Ba GEEWGL218 to 223 ggagaagaatggggattg652 to 669Cry8Ca GKEWGY218 to 223 gggaaggaatggggatat652 to 669Cry9Aa RYGTNWGL 210 to 217 agatatggcaccaattgggggcta 628 to 651Cry9Ba1 KYGARWGL 194 to 201 aagtatggggcaagatggggactc 580 to 603Cry9Ca LFGEGWGF 216 to 223 ctttttggagaaggatggggattc 646 to 669Cry9Da IYGARWGL 219 to 226 atttatggagctagatgggggctg 655 to 678Cry9Ea IYGARWGL 219 to 226 atctatggggcaagatggggactt 655 to 678Cry10Aa TYYNIWLQ 219 to 226 acctattacaatatatggctgcaa 655 to 678Cry16Aa IYGDAWNLYRELGP165 to 178 atttatggagatgcatggaatttatatagagaattaggattt493 to 534Cry17Aa LLNKVIDNF 184 to 192 cttttaaataaagttatagataatttt 550 to 576Cry19Aa IYGDKWWSA 219 to 227 atttatggagataaatggtggagcgca 655 to 681Cry19Ba IYGKELG 209 to 215 atttacggaaaagaattagga 625 to 645Cry20Aa LYRNQWL 202 to 208 ctttatagaaatcaatggtta 604 to 624
表14.Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白中α6-α7间-螺旋环的定位和序列蛋白质 氨基酸序列 在蛋白质上核苷酸序列 在基因上的位置的位置Cry3Aa RGSS 255 to 258 agaggttcatct763 to 774Cry3Ba RGST 256 to 259 agaggttcaact766 to 777Cry3Bb RGST 256 to 259 agaggttcaact766 to 777Cry3Ca RGST 253 to 256 agaggttcgact757 to 768Cry4Aa LIKTTPD 274 to 280 ttaattaaaacgacgcctgat 820 to 840Cry4Ba LRNKS 235 to 239 cttagaaataaatct 703 to 717Cry4Aa LNGST 245 to 249 ttgaacggttccact 433 to 747Cry7Ab LNGST 245 to 249 ttgaacggttccact 733 to 747Cry8Aa LKGTT 256 to 260 ttgaaaggtaccact 766 to 780Cry8Ba LKGSS 257 to 261 ttaaaaggctcgagc 769 to 783Cry8Ca LRGTG 257 to 261 ttaagaggaacgggt 769 to 783Cry9Aa LRQRGTS 252 to 258 ctaagacaacgaggcactagt 754 to 774Cry9Ba1 LRGTS 236 to 240 ttacgaggaacgagc 706 to 720Cry9Ca LRGTN 257 to 261 ttaagaggaacaaat 769 to 783Cry9Da LRGTT 260 to 264 ttaagaggcacaacc 778 to 792Cry9Ea VRGTN 260 to 264 gtaagaggaacaaat 778 to 792Cry10Aa IRTNT 267 to 271 attagaactaatact 799 to 813Cry16Aa LKLDPN210 to 215 ttaaaactagatccgaat 628 to 645Cry17Aa IKNKTRDF 224 to 231 ataaaaaataaaactagggatttt670 to 693Cry19Aa FRTAG 261 to 265 tttagaacagcaggt 781 to 795Cry19Ba KKQIG 250 to 254 aaaaaacaaatagga 748 to 762Cry20Aa DRSS 245 to 248 gatcgttcaagt733 to 744基于实施例1、2和3的模型，可制备该实施例提到的各个cry基因的突变体。用来进行诱变的技术方法与实施例1、2和3给出的方法相似。
实施例5整体增加Cry蛋白中亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的含量下面描述了对Cry9Ca1毒素整体增加Cry蛋白中亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的含量。尽管该实施例是对Cry9Ca1蛋白和cry9Ca1基因进行的，它也可用于所有的Cry毒素和所有的cry基因。该技术特别适用于所有的Cry毒素，其序列是已知的并可在Genbank数据库中找到http//www.ncbi.nlm.bih.gov/Genbank/index.html。
cry基因的Genbank登录号可从以下地址获得
http//www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html该技术还可用于所有的Cry毒素和cry基因，其序列未在Genbank中揭示。
不同于实施例1-4中所述的方法，其目的不是要修饰该毒素的精确区域以整合被胃蛋白酶识别的氨基酸，而是要通过增加亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸在所述毒素中的数量来整体增加这些位点的数量。该策略通过增加胃蛋白酶识别的残基的百分比能够使Cry毒素对胃蛋白酶更加敏感。谷氨酸(E-Glu)优选替代天冬氨酸(D-Asp)，苯丙氨酸(F-Phe)优选替代色氨酸(W-Trp)，亮氨酸(L-Leu)优选替代缬氨酸(V-Val)或异亮氨酸(I-Ile)。该策略需要产生活化的Cry9Ca1毒素的三维模型，这是通过与CrylAa1和Cry3Aa1的三维结构进行对比从该蛋白的一级序列产生的。该模型是用Swiss型蛋白模拟服务器(Swis-Model Protein ModellingServer)(Peitsch，1995；Peitsch，1996；Guex和Peitsch，1997)产生的。服务器地址如下(http//www.expasy.ch/swissmod/swiss-model.html)。
优选地，取代的最大水平为25％。活化的Cry9Ca1毒素含有31个天冬氨酸，9个色氨酸和47个缬氨酸。有天然的26个谷氨酸，35个苯丙氨酸和62个亮氨酸。考虑各个氨基酸的最大取代为25％，相对比例如下氨基酸 天然Cry9Ca1中的残基数 修饰的Cry9Ca1中的残基数Asp(D) 31 24Glu(E) 26 33Trp(W) 9 7Phe(F) 35 37Val(V) 47 36Leu(L) 61 72还可设想用亮氨酸取代异亮氨酸(I-Ile)来代替用亮氨酸取代缬氨酸，或者除用亮氨酸取代缬氨酸外。在Cry9Ca1毒素中有天然的27异亮氨酸。考虑到优选地取代程度为25％，则足以用亮氨酸取代6异亮氨酸残基。
可按如下所示修饰cry9Ca1基因的序列。以下实验的唯一目的就是例证该实施例，而不是要限制本发明的范围。该例证涉及天冬氨酸，苯丙氨酸和缬氨酸残基的替代。那些精通此领域的技术人员能够很容易地将此方法用于任何其它cry基因，序列或许已知，尤其是获自Genbank的序列，其登录号如下http//www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html通常在转基因植物中表达的cry基因是截短的基因，即只有编码活化的毒素的基因序列被引入这些植物。在此实施例中所给的序列相应于此截短的形式，并且，根据它是基因还是蛋白，从起始密码子或从第一个甲硫氨酸第15个密码子或保守性嵌段5的氨基酸下游，该嵌段限制活化的毒素。
天然的和截短的cry9Ca1基因的序列列于SEQ ID No.1中。
天然的和截短的Cry9Ca1蛋白的序列列于SEQ ID No.2中。
在

图1(SEQ ID No.9)中给出了修饰的cry9Ca1基因的序列，其中所有编码缬氨酸，谷氨酸和苯丙氨酸残基的密码子都被修饰。这种修饰的序列可作为基础以定义可使用的各种诱变寡核苷酸。被修饰的碱基以黑体表示。
在图2(SEQ ID No.10)中给出了修饰的Cry9Ca1蛋白的序列，其中所有缬氨酸，谷氨酸和苯丙氨酸残基都被修饰，被修饰的氨基酸以黑体表示。
所有可进行缬氨酸，苯丙氨酸和谷氨酸残基取代的诱变寡核苷酸列在图3(SEQID No.94-160)中。被修饰的碱基以黑体表示。
用某些寡核苷酸产生修饰的cry9Ca1基因，其中根据编码缬氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的密码子进行取代的可能性达25％，这是以例举的方式说明的。这种例举的目的只是要例证所开发的方案而不是限制本发明的范围。根据该实施例和图1-3(SEQ ID Nos.9和10)，那些精通此领域的技术人员能够修改图5(SEQ IDNos.94-160)所示寡核苷酸的其它组合或按相同原则制备的其它寡核苷酸，尤其是替代异亮氨酸残基。
通过用多达25％的编码缬氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的密码子取代修饰cry9Ca1基因的序列列于图4(SEQ ID No.11)。被修饰的碱基用黑体表示。
通过用多达25％的编码缬氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的密码子取代修饰Cry9Ca1蛋白的序列列于图5(SEQ ID No.12)。被修饰的氨基酸用黑体表示。
在图4(SEQ ID No.11)中给出了修饰的cry9Ca1基因的产生，其中25％的缬氨酸苯丙氨酸和谷氨酸密码子被修饰，并在图5(SEQ ID Nos.94-160)给出的序列中用以下寡核苷酸进行修饰寡核苷酸No.60寡核苷酸No.62寡核苷酸No.67寡核苷酸No.72寡核苷酸No.77寡核苷酸No.78寡核苷酸No.80
寡核苷酸No.82寡核苷酸No.83寡核苷酸No.88寡核苷酸No.90寡核苷酸No.92寡核苷酸No.96寡核苷酸No.97寡核苷酸No.103寡核苷酸No.111优选使用的方法是用上面提到的寡核苷酸的混合物进行多诱变。定点诱变方法与实施例1的描述类似，唯一的不同在于在此实施例中使用了诱变寡核苷酸的混合物，而在实施例1中使用了单个诱变寡核苷酸。所用方法描述在实施例1-4中。通常对每个诱变系列而言，只有抑制/恢复抗生素抗性的诱变寡核苷酸和寡核苷酸发生了变化。
实施例6在苏云金芽孢杆菌中产生修饰的Cry蛋白和纯化天然和修饰的基因以及它们的启动子和终止子序列被插入大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌pHT3101穿梭载体(Lereclus等，1989)。
质粒DNA是按照碱裂解技术(Birboim和Doly，1979)用小量制备(minipreparation)制备的。每个细菌集落于37℃在添加有适当抗生素的2ml LB培养基中振荡培养过夜(200rpm)。然后将培养物转移到微量管中，然后在13500g离心5分钟。除去上清后，将细菌重悬于100μl 25mM Tris-HCl(pH 8)和10mM EDTA的溶液中，该溶液含有最终浓度为100μg/ml的Rnase A。加入200μl含有1％SDS的0.2M的NaOH溶液，并通过颠倒微量管混合悬液再次。加入150μl 2.55M的乙酸钾溶液(pH 4.5)并将悬液在冰中培育5分钟。在13500g离心15分钟后，将上清转移到含有1ml冷乙醇的微量管中。在13500g离心30分钟后，除去上清并用1ml 70％乙醇洗涤沉淀。在真空下将含有DNA的沉淀干燥数分钟，然后加到50μl无菌蒸馏水中。然后将样品置于65℃ 30分钟。
对最终体积为20μl的1μg DNA进行限制性内切酶消化，对每种酶供应商建议在占终体积的10X缓冲液的十分之一的情况下，并使用5个单位的酶。对酶在最佳温度下反应2-3小时。
用小牛肠碱性磷酸酶作为限制性酶进行5’末端的去磷酸化。在50μl的终体积中，每μg DNA用5μl 10X去磷酸化缓冲液(500mM Tris-Hcl，pH 9.3，10mM MgCl2，1mM ZnCl2和10mM亚精胺)和1单位酶进行反应。在突出5’末端情况下反应在37℃进行1小时，在平端或3’突出端情况下则在55℃进行1小时。去磷酸化后，然后在65℃将酶钝化30分钟，然后对每体积提取物用两体积苯-氯仿-异戊醇(25-24-1)的混合物除去。然后用T4噬菌体DNA连接酶形成连接。它们是用相当于100ng的载体量进行的，且插入片段/载体的摩尔比在5和10之间。反应物的最终体积为30μl，并含有3μl 10X连接缓冲液(300mM Tris-Hcl，pH 7.8，100mMMgCl2，100mM DTT和10mM ATP)和3单位的酶。反应物在14℃培育过夜。
按照Lereclus等在1989年描述的方法将此构建物插入苏云金芽孢杆菌的acrystalliferous菌株，该方法在其它地方也有描述(Rang等，1999，2000)。将acrystalliferous苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki)HD-1的预培养物于37℃ 10ml BHI培养基(Difco)中振荡培养过夜。然后将5ml预培养物接种在250ml BHI培养基中并于37℃振荡培养，直到培养物在600nm的OD值达到0.3。然后将培养物在4℃以1000g离心10分钟。除去上清并用50ml冷的无菌蒸馏水洗涤细菌沉淀。然后在4℃再以1000g离心细菌10分钟。取出沉淀放在4ml冷的无菌40％PEG-6000溶液中，该溶液置于冰中。然后将200μl细菌与5μg质粒混合，然后放置在直径为0.2cm的电穿孔小池中。然后将小池放在电穿孔室中，并使用相当于以下参数的电流2.5kV，1000Ω，25μF。然后回收细菌，将其在冰中放置10分钟，然后加到2ml BHI培养基中并于37℃振荡培养90分钟。然后将200μl培养物铺在培养皿中，该培养皿中含有常规的添加有终浓度为25μg/ml的红霉素的固体培养基(IEBC，1994)，并在28℃培育过夜。
将表达天然基因或突变基因的苏云金芽孢杆菌的重组菌株培养在250ml常规的培养基中，该培养基中含有25μg/ml红霉素，并在28℃振荡。用相差光学显微镜观察细菌生长的变化。让细菌生长到孢子形成后细菌溶胞。然后将培养物在5000g离心10分钟。用25ml 1M NaCl洗涤沉淀，悬液在5000g再离心10分钟。然后取出沉淀放入15ml含有1mM PMSF的无菌蒸馏水中，在冰中培育，并用超声波(100W)处理1分钟，以分散孢子和晶体之间的聚集物。然后将悬液加到不连续的NaBr梯度中，该梯度是由4ml浓度为38.5％的一个层，6ml浓度为41.9％、45.3％，48.9％和52.7％的四个层以及3ml浓度为56.3％一个层构成的。然后将此梯度在20℃以20000g离心90分钟。根据密度不同，悬液的各种组分(孢子、细胞碎片、伴孢体)在此梯度中处于不同水平。回收各条带并用一体积无菌蒸馏水洗涤三次。用相差光学显微镜观察各条带。将含有包含体的部分以含有1mM PMSF的无菌蒸馏水形式贮存于-20℃供以后分析。
实施例7该蛋白对蛋白酶的稳定性分析所进行的第一个稳定性分析是确定对胰蛋白酶的稳定性。将伴孢包含体中存在的蛋白于37℃在溶解缓冲液(50mM Na2CO3，pH 10.8，14.6mM 2-巯基乙醇)中增溶1小时。然后将悬液在14000g离心10分钟以除去不溶物。然后在上清液中加入占总体积十分之一0.05％的胰蛋白酶，并将混合物在37℃培育2小时。按照Laemmli法(1970)，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析确定胰蛋白酶处理后蛋白质的状况。由于SDS的存在，它使所有的蛋白质都带上了负电荷，该技术使得蛋白质根据其分子量被分离。首先通过加入一体积2X处理液(125mM Tris-HCl，20％甘油，4％SDS，10％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)处理样品，然后在沸水中变性5分钟。然后将样品置于凝胶上并首先通过第一浓缩胶，浓缩胶是由4％丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物，0.1％SDS和125mM Tris-HCl，pH 6.8构成的。然后样品通过分离胶，分离胶是由12％丙烯酰胺-双丙烯酰胺，0.1％SDS和375mM Tris-HCl，pH 8.8构成的，它可将各种蛋白质按照其大小分离。然后在迁移缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 8.3，192mM甘氨酸，0.1％SDS)中在100V下进行电穿孔，直到溴酚蓝离开凝胶。然后凝胶用含有0.025％考马斯蓝的40％甲醇-7％乙酸的溶液染色1小时，再用50％甲醇-10％乙酸溶液褪色。最终将凝胶固定在5％甲醇-7％乙酸溶液中。
第二次分析是确定对昆虫消化液的稳定性。用阴离子交换柱(Q-Sepharose)通过FPLC(Pharmacia)纯化胰蛋白酶-稳定的毒素，该柱用40mM Na2CO3溶液，pH 10.7平衡。然后用50-500mM的NaCl溶液进行梯度洗脱。测量组分在280nm的OD值，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析含有蛋白质的组分。将含有毒素的组分合并并在4℃用蒸馏水透析约48小时，直至蛋白质沉淀。然后将蛋白质悬液在4℃以8000g离心30分钟。将沉淀中含有的毒素重悬于蒸馏水中并按Bradford(1976)的方法分析。然后将它们等分成100μg，冻干并贮存于4℃。在使用前，将毒素溶解并用25mM Tris，pH 9.5使其浓度达到10mg/ml，以测试它们对玉米螟(Ostrinianubilalis)幼虫消化液的稳定性。玉米螟幼虫的消化液可用Ogiwara等(1992)的方法通过电击诱导反胃而获得，或按照Baines等(1994)所述的方法通过解剖幼虫并用移液管收集肠液获得。这两种情况都需要100-200只幼虫来收集消化液。使用前，将收集的液体在4℃以15000g离心15分钟。用Bradford法(BioRad)测定消化液的蛋白质浓度。以毒素与消化液为1∶1的比例(基于消化液的蛋白质浓度)在37℃反应15分钟。用混有等体积2X处理液(125mM Tris-HCl，20％甘油，4％SDS，10％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)的蛋白酶抑制剂(Protease InhibitorsSet，Roche Diagnostics)的混合物终止反应，然后在沸水中培育5分钟。然后按照上述方法通过SDS-PAGE分析蛋白质，以确定它们对幼虫消化液的抗性和它们可能的降解状态。
所进行的最后类型的稳定性分析是对胃蛋白酶的稳定性。冻干的天然毒素和修饰的毒素被溶解于模拟哺乳动物胃液并含有0.32％胃蛋白酶的胃缓冲液(0.5mgNaCl，1.75ml 1M HCl，于250ml水中，pH 2.0)。在37℃培育0，5，15，60和240分钟后移去样品，然后如上所述用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。这些情况与EPA(美国环保署)No.4458108所描述的情况相同。
通过这一系列分析可以知道天然和突变蛋白的保存状态，因此可知道它们对昆虫中存在的各种蛋白酶(胰蛋白酶和消化液)的稳定性，从而确定突变的蛋白在昆虫中可有效保存其稳定性。这些分析还可以证明，突变的蛋白在与哺乳动物的胃类似的条件下可被胃蛋白酶有效地降解。
实施例8杀虫特性的分析对杀虫特性的分析是通过两种类型的实验进行的，以测试昆虫中毒性处理的两个步骤受体位点识别和体内毒性评价。
毒素对受体位点亲和性的分析是用以碘125(125I)放射性标记的毒素进行的。将FPLC纯化并冻干的活化毒素置于存储缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.6)，然后通过SDS-PAGE分析以确定其状况。用Bradford法(1976)分析等分的部分。然后用氯胺-T法(Markwell，1982)将毒素碘化。将25μg毒素和0.25mCi Na-125以及溶于50μl碳酸钠缓冲液(50mM Na2CO3，pH 10)的“碘珠”(Iodo-bead)(Pierce)在室温培育5分钟。然后在用CBS缓冲液(50mM Na2CO3，pH 10.8，150mM NaCl)平衡的葡聚糖脱盐柱(Pierce)的表面进行碘化反应以除去游离的碘。通过SDS-PAGE和放射自显影鉴定标记和蛋白质的量。标记的毒素的平均比活度为100000cpm/pmol。
为制备刷状缘膜小泡(BBMV)，进行了毒素对受体的亲和性的研究，让昆虫生长到最后幼虫阶段。所用昆虫是玉米螟，但此方法可用于任何昆虫种类。使用其它昆虫需要生产条件和营养培养基适合各个品种，这可由精通此领域的技术人员简单完成。在部分化学的人工营养培养基上产生玉米螟(Lewis和Lynch，1969；Reed等，1972；Ostlie等，1984)。用来产生玉米螟幼虫的方法如Huang等(1997)描述。在128孔平板(Bio-Ba-128，C-D International)上单独产生幼虫。各个孔含有2ml人工培养基。10天后，将幼虫转移到大的平皿(直径18.4cm，高7.6cm)，其中含有300ml人工营养培养基。放入褶皱的纸板内以便于蛹化。在幼虫阶段，产生细胞的温度为用恒定光(24小时)保持在25℃。将含有蛹的纸板放到屏蔽笼子中以便于产生成虫。放入蜡纸以接收卵。取出卵并保存在15℃。在25℃和75％相对湿度下产生成虫，光照期为14小时。
为测试毒素对受体位点的亲和性，在5龄幼虫阶段的开始收集幼虫，并将其禁食6小时。然后将它们在冰中放置5分钟。解剖幼虫并取出消化管。将解剖的消化管每组分20个，置于含有MET缓冲液(300mM甘露醇，5mM EGTA，17mM Tris-HCl，pH 7.5)的冷冻管中，在液氮中冷冻并贮存于-80℃。
根据差异的镁沉淀法(Wolfersberger等，1987；Nielsen-LeRoux和Charles，1992)制备BBMV。将BBMV放入TBS缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.5，150mM NaCl)，并通过Bradford法用Biorad试剂盒测定总蛋白浓度，用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品(Bradford，1976)。
在1.5ml聚乙烯微量管中进行体外受体识别测定，其中装有20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4，含有0.15M NaCl和0.1％牛血清白蛋白(PBS/BSA)。测定进行两份，在室温，总体积为100μl，用10μg BBMV蛋白。在室温以14000g离心10分钟将附着于BBMV的毒素分离。各样品的沉淀，含有附着于膜的毒素，用200μl冷的PBS/BSA缓冲液(20mM Tris/HCl，150mM NaCl，0.1％BSA，pH 8.5)洗涤两次，然后离心。将沉淀最终重悬于200μl PBS/BSA缓冲液，并加到3ml装在闪烁瓶中的HiSafe 3闪烁混合物(scintillant cocktail)(Pharmacia)中。用液体闪烁计数器进行计数。
按Nielsen-LeRoux和Charles(1992)的方法进行直接结合测定。将每个微量管中30μg BBMV和一系列浓度为1-100mM的毒素一起培养，毒素用125I-碘标记并溶于Tris/BSA缓冲液(20mM Tris/HCl，150mM NaCl，0.1％BSA，pH 8.5)。在过量300倍的未标记的毒素情况下进行平行实验以确定非特异性附着的量。在室温培养90分钟后，根据在4℃以14000g离心10分钟。沉淀用冷的Tris/BSA缓冲液洗涤两次，将沉淀最终重悬于150μl同样的缓冲液，并加到3ml装在闪烁瓶中的HiSafe 3闪烁混合物(Pharmacia)中。每个实验都进行两份，且在液体闪烁计数器中对各个实验点都计算两次。用Biosoft公司销售的LIGAND软件(Munson和Rodbard，1980)分析数据。
如上所述进行同源竞争实验以进行直接结合实验，用总体积为100μl的10μgBBMV，在室温90分钟。将BBMV培养在在固定浓度的10nM毒素中，毒素用125I-碘标记并以一系列浓度(从0.1到300倍标记的毒素浓度)存在于Tris/BSA缓冲液中。从总的计算值中减去非特异性结合值(结合总在有过量300倍的未标记毒素存在时)。每个实验都进行两份，且在液体闪烁计数器中对各个实验点都计算两次。用Biosoft公司销售的LIGAND软件(Munson和Rodbard，1980)分析数据。
按照Lambert等(1996)描述的方法进行体内毒性测定。在营养培养基中以各种浓度掺入活化和溶解的毒素，每边有对玉米螟50％致死剂量(LD50)的Cry9Cal，即每平方厘米的培养基表面积有96.6ng毒素。用六种剂量0.1ng/cm2，1ng/cm2，10ng/cm2，100ng/cm2，1000ng/cm2和10000ng/cm2来评估天然毒素和修饰的毒素的LD50值。对24孔平板上新生的幼虫进行毒性测定，孔的大小为2cm2(24-孔平板，Corning Costar公司)。将50μl各种毒素的稀释液铺在培养基上并在通风橱下干燥。在每个孔中放一只幼虫，对每个剂量共使用24只幼虫(每个平板一种剂量)。对每个剂量至少重复测定三次。用蒸馏水进行对照。将平板覆盖并置于25℃，相对湿度70％，光照期为16小时。在7天后对照死亡率，并用概率方法(Finney，1971)计算LD50。
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序列表<110>阿方蒂农科股份有限公司(AVENTIS CROPSCIENCE S.A.)<120>胃蛋白酶敏感经过修饰的苏云金芽孢杆菌杀虫毒素<130>PM 01008<140>
<141>
<160>160<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2019<212>DNA<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(2019)<400>1atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gat gcc ccc cat 48Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His1 5 10 15tgt ggg tgt cca tca gat gac gat gtg agg tat cct ttg gca agt gac 96Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp20 25 30cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gat tac tta caa atg 144Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met35 40 45aca gat gag gac tac act gat tct tat ata aat cct agt tta tct att 192Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile50 55 60agt ggt aga gat gca gtt cag act gcg ctt act gtt gtt ggg aga ata 240Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile65 70 75 80ctc ggg gct tta ggt gtt ccg ttt tct gga caa ata gtg agt ttt tat 288Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr85 90 95caa ttc ctt tta aat aca ctg tgg cca gtt aat gat aca gct ata tgg 336Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp100 105 110gaa gct ttc atg cga cag gtg gag gaa ctt gtc aat caa caa ata aca 384Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr
115 120 125gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gac432Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp130 135 140tct ttt aat gta tat caa cgt tcc ctt caa aat tgg ttg gct gat cga480Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg145 150 155 160aat gat aca cga aat tta agt gtt gtt cgt gct caa ttt ata gct tta528Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu165 170 175gac ctt gat ttt gtt aat gct att cca ttg ttt gca gta aat gga cag576Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln180 185 190cag gtt cca tta ctg tca gta tat gca caa gct gtg aat tta cat ttg624Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu195 200 205tta tta tta aaa gat gca tct ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc aca672Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr210 215 220cag ggg gaa att tcc aca tat tat gac cgt caa ttg gaa cta acc gct720Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala225 230 235 240aag tac act aat tac tgt gaa act tgg tat aat aca ggt tta gat cgt768Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg245 250 255tta aga gga aca aat act gaa agt tgg tta aga tat cat caa ttc cgt816Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg260 265 270aga gaa atg act tta gtg gta tta gat gtt gtg gcg cta ttt cca tat864Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr275 280 285tat gat gta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt912Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg290 295 300gag gta tat aca gat ccg att gta ttt aat cca cca gct aat gtt gga960Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly305 310 315 320ctt tgc cga cgt tgg ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc1008Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu325 330 335gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gat agg ctg aat agc1056
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<210>3<211>2019<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Cry9Ca1 Leu-164<220>
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Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln180 185 190cag gtt cca tta ctg tca gta tat gca caa gct gtg aat tta cat ttg624Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu195 200 205tta tta tta aaa gat gca tct ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc aca672Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr210 215 220cag ggg gaa att tcc aca tat tat gac cgt caa ttg gaa cta acc gct720Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala225 230 235 240aag tac act aat tac tgt gaa act tgg tat aat aca ggt tta gat cgt768Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg245 250 255tta aga gga aca aat act gaa agt tgg tta aga tat cat caa ttc cgt816Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg260 265 270aga gaa atg act tta gtg gta tta gat gtt gtg gcg cta ttt cca tat864Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr275 280 285tat gat gta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt912Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg290 295 300gag gta tat aca gat ccg att gta ttt aat cca cca gct aat gtt gga960Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly305 310 315 320ctt tgc cga cgt tgg ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc1008Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu325 330 335gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gat agg ctg aat agc1056Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser340 345 350tta aca atc agc agt aat cga ttt cca gtt tca tct aat ttt atg gat1104Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp355 360 365tat tgg tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gat tca gca1152Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala370 375 380gta caa gaa gat agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att1200Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile385 390 395 400
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<222>(1)..(2019)<400>7atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gat gcc ccc cat48Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His1 5 l0 15tgt ggg tgt cca tca gat gac gat gtg agg tat cct ttg gca agt gac96Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp20 25 30cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gat tac tta caa atg144Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met35 40 45aca gat gag gac tac act gat tct tat ata aat cct agt tta tct att192Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile50 55 60agt ggt aga gat gca gtt cag act gcg ctt act gtt gtt ggg aga ata240Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile65 70 75 80ctc ggg gct tta ggt gtt ccg ttt tct gga caa ata gtg agt ttt tat288Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr85 90 95caa ttc ctt tta aat aca ctg tgg cca gtt aat gat aca gct ata tgg336Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp100 105 110gaa gct ttc atg cga cag gtg gag gaa ctt gtc aat caa caa ata aca384Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr115 120 125gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gac432Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp130 135 140tct ttt aat gta tat caa cgt tcc ctt caa aat tgg ttg gct gat cga480Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg145 150 155 160aat gat aca gaa aat tta agt gtt gtt cgt gct caa ttt ata gct tta528Asn Asp Thr Glu Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu165 170 175gac ctt gat ttt gtt aat gct att cca ttg ttt gca gta aat gga cag576Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln180 185 190cag gtt cca tta ctg tca gta tat gca caa gct gtg aat tta cat ttg624Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu195 200 205
tta tta tta aaa gat gca tct ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc aca672Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr210 215 220cag ggg gaa att tcc aca tat tat gac cgt caa ttg gaa cta acc gct720Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala225 230 235 240aag tac act aat tac tgt gaa act tgg tat aat aca ggt tta gat cgt768Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg245 250 255tta aga gga aca aat act gaa agt tgg tta aga tat cat caa ttc cgt816Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg260 265 270aga gaa atg act tta gtg gta tta gat gtt gtg gcg cta ttt cca tat864Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr275 280 285tat gat gta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt912Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg290 295 300gag gta tat aca gat ccg att gta ttt aat cca cca gct aat gtt gga960Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly305 310 315 320ctt tgc cga cgt tgg ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc1008Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu325 330 335gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gat agg ctg aat agc1056Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser340 345 350tta aca atc agc agt aat cga ttt cca gtt tca tct aat ttt atg gat1104Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp355 360 365tat tgg tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gat tca gca1152Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala370 375 380gta caa gaa gat agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att1200Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile385 390 395 400aat ccc gga gtt gat gga aca aac cgc ata gag tca acg gca gta gat1248Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp405 410 415ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc gtg aat aga gct tct ttt1296Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe420 425 430
gtc cca gga ggc ttg ttt aat ggt acg act tct cct gct aat gga gga1344Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly435 440 445tgt aga gat ctc tat gat aca aat gat gaa tta cca cca gat gaa agt1392Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser450 455 460acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat gtt acc ttt ttt agc ttt1440Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe465 470 475 480caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt gta cct act1488Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr485 490 495tat gtt tgg acc cgt cgt gat gtg gac ctt aat aat acg att acc cca1536Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro500 505 510aat aga att aca caa tta cca ttg gta aag gca tct gca cct gtt tcg1584Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser515 520 525ggt act acg gtc tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc1632Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu530 535 540cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga gta acg gtt aat1680Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn545 550 555 560tca cca tta aca caa caa tat cgc cta aga gtt cgt ttt gcc tca aca1728Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr565 570 575gga aat ttc agt ata agg gta ctc cgt gga ggg gtt tct atc ggt gat1776Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp580 585 590gtt aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa1824Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu595 600 605tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct1872Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro610 615 620ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca gtg aat gca gaa ggt1920Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly625 630 635 640gtt agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gat aga att gaa att gtc cct1968Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro
645 650 655gtg aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gat tta gaa gcg gcg aag aaa 2016Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys660 665 670gcg 2019Ala<210>8<211>673<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述Cry9Ca1 Glu-164<400>8Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His1 5 10 15Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp20 25 30Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met35 40 45Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile50 55 60Ser Gly Arg Asp Ala Val Gln Thr Ala Leu Thr Val Val Gly Arg Ile65 70 75 80Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Val Ser Phe Tyr85 90 95Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp100 105 110Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr115 120 125Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Asp130 135 140Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg145 150 155 160Asn Asp Thr Glu Asn Leu Ser Val Val Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu165 170 175Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln180 185 190Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Val Asn Leu His Leu195 200 205
Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr210 215 220Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Asp Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala225 230 235 240Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Asp Arg245 250 255Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg260 265 270Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr275 280 285Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg290 295 300Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Val Gly305 310 315 320Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu325 330 335Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser340 345 350Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Asp355 360 365Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala370 375 380Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile385 390 395 400Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp405 410 415Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe420 425 430Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly435 440 445Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser450 455 460Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Val Thr Phe Phe Ser Phe465 470 475 480Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr485 490 495
Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro500 505 510Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser515 520 525Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu530 535 540Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn545 550 555 560Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Val Arg Phe Ala Ser Thr565 570 575Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp580 585 590Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu595 600 605Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro610 615 620Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly625 630 635 640Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro645 650 655Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys660 665 670Ala<210>9<211>2019<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Cry9Ca1-100％<220>
<221>CDS<222>(1)..(2019)<400>9atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gaa gcc ccc cat 48Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Glu Ala Pro His1 5 10 15tgt ggg tgt cca tca gaa gaa gaa tta agg tat cct ttg gca agt gaa 96
Cys Gly Cys Pro Ser Glu Glu Glu Leu Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Glu20 25 30cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gaa tac tta caa atg 144Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Glu Tyr Leu Gln Met35 40 45aca gaa gag gaa tac act gaa tct tat ata aat cct agt tta tct att 192Thr Glu Glu Glu Tyr Thr Glu Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile50 55 60agt ggt aga gaa gca tta cag act gcg ctt act gtt att agg aga ata 240Ser Gly Arg Glu Ala Leu Gln Thr Ala Leu Thr Val Ile Arg Arg Ile65 70 75 80ctc ggg gct tta ggt tta ccg ttt tct gga caa ata tta agt ttt tat 288Leu Gly Ala Leu Gly Leu Pro Phe Ser Gly Gln Ile Leu Ser Phe Tyr85 90 95caa ttc ctt tta aat aca ctg ttt cca tta aat gaa aca gct ata ttt 336Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Phe Pro Leu Asn Glu Thr Ala Ile Phe100 105 110gaa gct ttc atg cga cag tta gag gaa ctt tta aat caa caa ata aca 384Glu Ala Phe Met Arg Gln Leu Glu Glu Leu Leu Asn Gln Gln Ile Thr115 120 125gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gaa 432Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Glu130 135 140tct ttt aat tta tat caa cgt tcc ctt caa aat ttt ttg gct gaa cga 480Ser Phe Asn Leu Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Phe Leu Ala Glu Arg145 150 155 160aat gaa aca cga aat tta agt tta tta cgt gct caa ttt ata gct tta 528Asn Glu Thr Arg Asn Leu Ser Leu Leu Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu165 170 175gaa ctt gaa ttt tta aat gct att cca ttg ttt gca tta aat gga cag 576Glu Leu Glu Phe Leu Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Leu Asn Gly Gln180 185 190cag tta cca tta ctg tca tta tat gca caa gct tta aat tta cat ttg 624Gln Leu Pro Leu Leu Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Leu Asn Leu His Leu195 200 205tta tta tta aaa gaa gca tct ctt ttt gga gaa gga ttt gga ttc aca 672Leu Leu Leu Lys Glu Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Phe Gly Phe Thr210 215 220cag ggg gaa att tcc aca tat tat gaa cgt caa ttg gaa cta acc gct 720Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Glu Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala225 230 235 240
aag tac act aat tac tgt gaa act ttt tat aat aca ggt tta gaa cgt768Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Phe Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg245 250 255tta aga gga aca aat act gaa agt ttt tta aga tat cat caa ttc cgt816Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Phe Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg260 265 270aga gaa atg act tta tta tta tta gaa tta tta gcg cta ttt cca tat864Arg Glu Met Thr Leu Leu Leu Leu Glu Leu Leu Ala Leu Phe Pro Tyr275 280 285tat gaa tta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt912Tyr Glu Leu Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg290 295 300gag tta tat aca gaa ccg att tta ttt aat cca cca gct aat tta gga960Glu Leu Tyr Thr Glu Pro Ile Leu Phe Asn Pro Pro Ala Asn Leu Gly305 310 315 320ctt tgc cga cgt ttt ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc1008Leu Cys Arg Arg Phe Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu325 330 335gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gaa agg ctg aat agc1056Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Ser340 345 350tta aca atc agc agt aat cga ttt cca tta tca tct aat ttt atg gaa1104Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Leu Ser Ser Asn Phe Met Glu355 360 365tat ttt tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gaa tca gca1152Tyr Phe Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Glu Ser Ala370 375 380tta caa gaa gaa agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att1200Leu Gln Glu Glu Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile385 390 395 400aat ccc gga tta gaa gga aca aac cgc ata gag tca acg gca tta gaa1248Asn Pro Gly Leu Glu Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Leu Glu405 410 415ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc tta aat aga gct tct ttt1296Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Leu Asn Arg Ala Ser Phe420 425 430tta cca gga ggc ttg ttt aat ggt acg act tct cct gct aat gga gga1344Leu Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly435 440 445tgt aga gaa ctc tat gaa aca aat gaa gaa tta cca cca gaa gaa agt1392Cys Arg Glu Leu Tyr Glu Thr Asn Glu Glu Leu Pro Pro Glu Glu Ser450 455 460
acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat tta acc ttt ttt agc ttt1440Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Leu Thr Phe Phe Ser Phe465 470 475 480caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt tta cct act1488Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Leu Pro Thr485 490 495tat tta ttt acc cgt cgt gaa tta gaa ctt aat aat acg att acc cca1536Tyr Leu Phe Thr Arg Arg Glu Leu Glu Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro500 505 510aat aga att aca caa tta cca ttg tta aag gca tct gca cct tta tcg1584Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Leu Lys Ala Ser Ala Pro Leu Ser515 520 525ggt act acg tta tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc1632Gly Thr Thr Leu Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu530 535 540cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga tta acg tta aat1680Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Leu Thr Leu Asn545 550 555 560tca cca tta aca caa caa tat cgc cta aga tta cgt ttt gcc tca aca1728Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Leu Arg Phe Ala Ser Thr565 570 575gga aat ttc agt ata agg tta ctc cgt gga ggg tta tct atc ggt gaa1776Gly Asn Phe Ser Ile Arg Leu Leu Arg Gly Gly Leu Ser Ile Gly Glu580 585 590tta aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa1824Leu Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu595 600 605tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct1872Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro610 615 620ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca tta aat gca gaa ggt1920Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Leu Asn Ala Glu Gly625 630 635 640tta agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gaa aga att gaa att tta cct1968Leu Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Glu Arg Ile Glu Ile Leu Pro645 650 655tta aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gaa tta gaa gcg gcg aag aaa2016Leu Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ala Ala Lys Lys660 665 670gcg2019Ala
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Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Leu Thr Leu Asn545 550 555 560Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Leu Arg Phe Ala Ser Thr565 570 575Gly Asn Phe Ser Ile Arg Leu Leu Arg Gly Gly Leu Ser Ile Gly Glu580 585 590Leu Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu595 600 605Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro610 615 620Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Leu Asn Ala Glu Gly625 630 635 640Leu Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Glu Arg Ile Glu Ile Leu Pro645 650 655Leu Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ala Ala Lys Lys660 665 670Ala<210>11<211>2019<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Cry9Ca1-25％<220>
<221>CDS<222>(1)..(2019)<400>11atg aat cga aat aat caa aat gaa tat gaa att att gat gcc ccc cat 48Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His1 5 10 15tgt ggg tgt cca tca gat gac gat gtg agg tat cct ttg gca agt gac 96Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp20 25 30cca aat gca gcg tta caa aat atg aac tat aaa gat tac tta caa atg 144Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met35 40 45
aca gat gag gac tac act gat tct tat ata aat cct agt tta tct att192Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile50 55 60agt ggt aga gaa gca tta cag act gcg ctt acg tta tta ggg aga ata240Ser Gly Arg Glu Ala Leu Gln Thr Ala Leu Thr Leu Leu Gly Arg Ile65 70 75 80ctc ggg gct tta ggt gtt ccg ttt tct gga caa ata tta agt ttt tat288Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Leu Ser Phe Tyr85 90 95caa ttc ctt tta aat aca ctg tgg cca gtt aat gat aca gct ata tgg336Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp100 105 110gaa gct ttc atg cga cag gtg gag gaa ctt gtc aat caa caa ata aca384Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr115 120 125gaa ttt gca aga aat cag gca ctt gca aga ttg caa gga tta gga gaa432Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Glu130 135 140tct ttt aat gta tat caa cgt tcc ctt caa aat tgg ttg gct gat cga480Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg145 150 155 160aat gat aca cga aat tta agt tta tta cgt gct caa ttt ata gct tta528Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Leu Leu Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu165 170 175gac ctt gat ttt gtt aat gct att cca ttg ttt gca gta aat gga cag576Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln180 185 190cag gtt cca tta ctg tca gta tat gca caa gct tta aat tta cat ttg624Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Leu Asn Leu His Leu195 200 205tta tta tta aaa gaa gca tct ctt ttt gga gaa gga tgg gga ttc aca672Leu Leu Leu Lys Glu Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr210 215 220cag ggg gaa att tcc aca tat tat gaa cgt caa ttg gaa cta acc gct720Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Glu Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala225 230 235 240aag tac act aat tac tgt gaa act tgg tat aat aca ggt tta gaa cgt768Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg245 250 255tta aga gga aca aat act gaa agt ttt tta aga tat cat caa ttc cgt816Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Phe Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg260 265 270
aga gaa atg act tta gtg gta tta gat gtt gtg gcg cta ttt cca tat864Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr275 280 285tat gat gta cga ctt tat cca acg gga tca aac cca cag ctt aca cgt912Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg290 295 300gag gta tat aca gat ccg att gta ttt aat cca cca gct aat tta gga960Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Leu Gly305 310 315 320ctt tgc cga cgt tgg ggt act aat ccc tat aat act ttt tct gag ctc1008Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu325 330 335gaa aat gcc ttc att cgc cca cca cat ctt ttt gaa agg ctg aat agc1056Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Ser340 345 350tta aca atc agc agt aat cga ttt cca gtt tca tct aat ttt atg gaa1104Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Glu355 360 365tat ttt tca gga cat acg tta cgc cgt agt tat ctg aac gat tca gca1152Tyr Phe Ser Gly His ThT Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala370 375 380gta caa gaa gat agt tat ggc cta att aca acc aca aga gca aca att1200Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile385 390 395 400aat ccc gga gtt gat gga aca aac cgc ata gag tca acg gca gta gat1248Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp405 410 415ttt cgt tct gca ttg ata ggt ata tat ggc gtg aat aga gct tct ttt1296Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe420 425 430gtc cca gga ggc ttg ttt aat ggt acg act tct cct gct aat gga gga1344Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly435 440 445tgt aga gat ctc tat gat aca aat gat gaa tta cca cca gat gaa agt1392Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser450 455 460acc gga agt tca acc cat aga cta tct cat tta acc ttt ttt agc ttt1440Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Leu Thr Phe Phe Ser Phe465 470 475 480caa act aat cag gct gga tct ata gct aat gca gga agt gta cct act1488Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr
485 490 495tat gtt tgg acc cgt cgt gat gtg gac ctt aat aat acg att acc cca 1536Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro500 505 510aat aga att aca caa tta cca ttg gta aag gca tct gca cct gtt tcg 1584Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser515 520 525ggt act acg gtc tta aaa ggt cca gga ttt aca gga ggg ggt ata ctc 1632Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu530 535 540cga aga aca act aat ggc aca ttt gga acg tta aga gta acg gtt aat 1680Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn545 550 555 560tca cca tta aca caa caa tat cgc cra aga tta cgt ttt gcc rca aca 1728Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Leu Arg Phe Ala Ser Thr565 570 575gga aat ttc agt ata agg gta ctc cgt gga ggg gtt tct atc ggt gat 1776Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp580 585 590gtt aga tta ggg agc aca atg aac aga ggg cag gaa cta act tac gaa 1824Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu595 600 605tcc ttt ttc aca aga gag ttt act act act ggt ccg ttc aat ccg cct 1872Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro610 615 620ttt aca ttt aca caa gct caa gag att cta aca gtg aat gca gaa ggt 1920Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly625 630 635 640gtt agc acc ggt ggt gaa tat tat ata gat aga att gaa att gtc cct 1968Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro645 650 655gtg aat ccg gca cga gaa gcg gaa gag gat tta gaa gcg gcg aag aaa 2016Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys660 665 670gcg 2019Ala<210>12<211>673<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述Cry9Ca1-25％
<400>12Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Pro His1 5 10 15Cys Gly Cys Pro Ser Asp Asp Asp Val Arg Tyr Pro Leu Ala Ser Asp20 25 30Pro Asn Ala Ala Leu Gln Asn Met Asn Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Met35 40 45Thr Asp Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Leu Ser Ile50 55 60Ser Gly Arg Glu Ala Leu Gln Thr Ala Leu Thr Leu Leu Gly Arg Ile65 70 75 80Leu Gly Ala Leu Gly Val Pro Phe Ser Gly Gln Ile Leu Ser Phe Tyr85 90 95Gln Phe Leu Leu Asn Thr Leu Trp Pro Val Asn Asp Thr Ala Ile Trp100 105 110Glu Ala Phe Met Arg Gln Val Glu Glu Leu Val Asn Gln Gln Ile Thr115 120 125Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Leu Gly Glu130 135 140Ser Phe Asn Val Tyr Gln Arg Ser Leu Gln Asn Trp Leu Ala Asp Arg145 150 155 160Asn Asp Thr Arg Asn Leu Ser Leu Leu Arg Ala Gln Phe Ile Ala Leu165 170 175Asp Leu Asp Phe Val Asn Ala Ile Pro Leu Phe Ala Val Asn Gly Gln180 185 190Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Leu Asn Leu His Leu195 200 205Leu Leu Leu Lys Glu Ala Ser Leu Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Thr210 215 220Gln Gly Glu Ile Ser Thr Tyr Tyr Glu Arg Gln Leu Glu Leu Thr Ala225 230 235 240Lys Tyr Thr Asn Tyr Cys Glu Thr Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg245 250 255Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Phe Leu Arg Tyr His Gln Phe Arg260 265 270Arg Glu Met Thr Leu Val Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Tyr275 280 285
Tyr Asp Val Arg Leu Tyr Pro Thr Gly Ser Asn Pro Gln Leu Thr Arg290 295 300Glu Val Tyr Thr Asp Pro Ile Val Phe Asn Pro Pro Ala Asn Leu Gly305 310 315 320Leu Cys Arg Arg Trp Gly Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Phe Ser Glu Leu325 330 335Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Glu Arg Leu Asn Ser340 345 350Leu Thr Ile Ser Ser Asn Arg Phe Pro Val Ser Ser Asn Phe Met Glu355 360 365Tyr Phe Ser Gly His Thr Leu Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ala370 375 380Val Gln Glu Asp Ser Tyr Gly Leu Ile Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ile385 390 395 400Asn Pro Gly Val Asp Gly Thr Asn Arg Ile Glu Ser Thr Ala Val Asp405 410 415Phe Arg Ser Ala Leu Ile Gly Ile Tyr Gly Val Asn Arg Ala Ser Phe420 425 430Val Pro Gly Gly Leu Phe Asn Gly Thr Thr Ser Pro Ala Asn Gly Gly435 440 445Cys Arg Asp Leu Tyr Asp Thr Asn Asp Glu Leu Pro Pro Asp Glu Ser450 455 460Thr Gly Ser Ser Thr His Arg Leu Ser His Leu Thr Phe Phe Ser Phe465 470 475 480Gln Thr Asn Gln Ala Gly Ser Ile Ala Asn Ala Gly Ser Val Pro Thr485 490 495Tyr Val Trp Thr Arg Arg Asp Val Asp Leu Asn Asn Thr Ile Thr Pro500 505 510Asn Arg Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Ser Ala Pro Val Ser515 520 525Gly Thr Thr Val Leu Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Leu530 535 540Arg Arg Thr Thr Asn Gly Thr Phe Gly Thr Leu Arg Val Thr Val Asn545 550 555 560Ser Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Arg Leu Arg Phe Ala Ser Thr565 570 575
Gly Asn Phe Ser Ile Arg Val Leu Arg Gly Gly Val Ser Ile Gly Asp580 585 590Val Arg Leu Gly Ser Thr Met Asn Arg Gly Gln Glu Leu Thr Tyr Glu595 600 605Ser Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr Thr Thr Gly Pro Phe Asn Pro Pro610 615 620Phe Thr Phe Thr Gln Ala Gln Glu Ile Leu Thr Val Asn Ala Glu Gly625 630 635 640Val Ser Thr Gly Gly Glu Tyr Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Ile Val Pro645 650 655Val Asn Pro Ala Arg Glu Ala Glu Glu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys660 665 670Ala<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体1<400>13gaattaaatg aatttttaaa tttaagtgtt 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体2<400>14gaattaaatg aattattaaa tttaagtgtt 30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体3
<400>15gaattattag aatttttatt attaagtgtt 30<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体4<400>16gaattattag aattattatt attaagtgtt 30<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体5<400>17gaattattag aagaattatt attaagtgtt 30<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体6<400>18gaacgattag aatttttatt attaagtgtt 30<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体7<400>19gaacgattag aattattatt attaagtgtt 30<210>20<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体8<400>20gaattagaag aattattatt attaagtgtt 30<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体9<400>21gaattattag aagaagaaga attaagtgtt 30<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体10<400>22tttttattaa atttattttt tttaccatta ctg 33<210>23<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述mutant11<400>23tttttattaa atttagaaga attaccatta ctg 33<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体12<400>24tttgaagaaa atttagaaga attaccatta ctg 33
<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体13<400>25tttgaagaaa attttttatt atttccatta ctg 33<210>26<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体14<400>26tttgaagaaa attttgaaga atttccatta ctg 33<210>27<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体15<400>27tttttattaa attttgaaga atttccatta ctg 33<210>28<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体16<400>28tttttattaa atgaattttt tgaaccatta ctg 33<210>29<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述突变体17<400>29ctttttttag aattattttt attc 24<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体18<400>30ctttttttat tattattttt attc 24<210>31<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体19<400>31ctttttttag aagaatttga atta 24<210>32<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体20<400>32ctttttgaag aagaatttga atta 24<210>33<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体21<400>33ctttttgaag aattatttga agaa 24
<210>34<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体22<400>34ttattagaat taaat 15<210>35<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体23<400>35ttattatttt taaat 15<210>36<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体24<400>36ttagaattat taaat 15<210>37<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体25<400>37ttattatttt ttaat 15<210>38<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体26
<400>38ttagaagaat taaat 15<210>39<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体27<400>39ttagaatttt taaat 15<210>40<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体28<400>40ttagaatttg aaaat 15<210>41<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突变体29<400>41ttagaagaag aaaat 15<210>42<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸1<400>42gatcgaaatg atacattaaa tttaagtgtt gtt 33<210>43<211>33
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸2<400>43gatcgaaatg atacatttaa tttaagtgtt gtt 33<210>44<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸3<400>44gatcgaaatg atacagaaaa tttaagtgtt gtt 33<210>45<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸4<400>45cgaaatgata cacgattatt aagtgttgtt cgt 33<210>46<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸5<400>46cgaaatgata cacgagaatt aagtgttgtt cgt 33<210>47<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸6<400>47
ttggctgatc gaaatgaatt tttaaattta agtgttgtt 39<210>48<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸7<400>48ttggctgatc gaaatgaatt tttattatta agtgttgtt 39<210>49<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸8<400>49ttggctgatc gaaatgaatt attaaattta agtgttgtt 39<210>50<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸9<400>50ttggctgatc gaaatgaatt attattatta agtgttgtt 39<210>51<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸10<400>51ttggctgatc gaaatgaaga agaagaatta agtgttgtt 39<210>52<211>39<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸11<400>52ttggctgatc gaaatgaaga attattatta agtgttgtt 39<210>53<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸12<400>53caaaattggt tggctgaatt aaatgaatta ttaaat36<210>54<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸13<400>54caaaattggt tggctgaatt aaatgaattt ttaaat36<210>55<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸14<400>55caaaattggt tggctgaatt attagaattt ttattatta 39<210>56<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸15<400>56caaaattggt tggctgaatt attagaatta ttattatta 39
<210>57<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸16<400>57caaaattggt tggctgaatt attagaagaa ttattatta 39<210>58<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸17<400>58caaaattggt tggctgaacg attagaattt ttattatta 39<210>59<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸18<400>59caaaattggt tggctgaacg attagaatta ttattatta 39<210>60<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸19<400>60caaaattggt tggctgaatt agaagaatta ttattatta 39<210>61<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸20<400>61caaaattggt tggctgaatt attagaagaa gaagaatta 39<210>62<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸21<400>62gctattccat tgtttttatt aaatggacag caggtt36<210>63<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸22<400>63gctattccat tgtttgaaga aaatggacag caggtt36<210>64<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸23<400>64ttattaaatg gacagcagtt accattactg tcagta36<210>65<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸24<400>65ttattaaatg gacagcagtt tccattactg tcagta36<210>66
<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸25<400>66ttattaaatg gacagcagga accattactg tcagta36<210>67<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸26<400>67gaagaaaatg gacagcagtt accattactg tcagta36<210>68<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸27<400>68gaagaaaatg gacagcagtt tccattactg tcagta36<210>69<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸28<400>69ccattgtttt tattaaattt atttttttta ccattactgt cagta 45<210>70<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸29
<400>70ccattgtttt tattaaattt agaagaatta ccattactgt cagta 45<210>71<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸30<400>71ccattgtttg aagaaaattt agaagaatta ccattactgt cagta 45<210>72<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸31<400>72ccattgtttg aagaaaattt tttattattt ccattactgt cagta 45<210>73<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸32<400>73ccattgtttg aagaaaattt tgaagaattt ccattactgt cagta 45<210>74<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸33<400>74ccattgtttt tattaaattt tgaagaattt ccattactgt cagta 45<210>75<211>45<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸34<400>75ccattgtttt tattaaatga attttttgaa ccattactgt cagta 45<210>76<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸35<400>76gatgcatctc tttttttaga aggatgggga ttc 33<210>77<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸36<400>77gatgcatctc tttttttatt aggatgggga ttcaca36<210>78<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸37<400>78gatgcatctc tttttgaaga aggatgggga ttc 33<210>79<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸38<400>79ttagaaggat ggggattaac acagggggaa att 33
<210>80<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸39<400>80gaagaaggat ggggagaaac acagggggaa att 33<210>81<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸40<400>81gcatctcttt ttttagaatt atttttattc acacaggggg aaatt 45<210>82<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸41<400>82gcatctcttt ttttattatt atttttattc acacaggggg aaatt 45<210>83<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸42<400>83gcatctcttt ttttagaatt atttttattc acacaggggg aaatt 45<210>84<211>45<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸43<400>84gcatctcttt ttgaagaatt atttttattc acacaggggg aaatt 45<210>85<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸44<400>85gcatctcttt ttgaagaatt atttttagaa acacaggggg aaatt 45<210>86<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸45<400>86ggtttagatc gtttattaga attaaatact gaaagttgg 39<210>87<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸46<400>87ggtttagatc gtttattatt tttaaatact gaaagttgg 39<210>88<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸47<400>88ggtttagatc gtttagaatt attaaatact gaaagttgg 39
<210>89<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸48<400>89ggtttagatc gtttattatt ttttaatact gaaagttgg 39<210>90<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸49<400>90ggtttagatc gtttagaaga attaaatact gaaagttgg 39<210>91<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸50<400>91ggtttagatc gtttagaatt tttaaatact gaaagttgg 39<210>92<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸51<400>92ggtttagatc gtttagaatt tgaaaatact gaaagttgg 39<210>93<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸52
<400>93ggtttagatc gtttagaaga agaaaatact gaaagttgg 39<210>94<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸53<400>94tgaatatgaa attattgaag ccccccattg 30<210>95<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸54<400>95tgggtgtcca tcagaagaag aattaaggta tcctttggca40<210>96<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸55<400>96tcctttggca agtgaaccaa atgcagc 27<210>97<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸56<400>97gaactataaa gaatacttac aaatg25<210>98<211>26
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸57<400>98caaatgacag aagaggaata cactga 26<210>99<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸58<400>99tacactgaat cttatataaa 20<210>100<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸59<400>100tattagtggt agagaagcat tacagactgc gcttac36<210>101<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸60<400>101cagactgcgc ttactgttat tagggagaat actcggg 37<210>102<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸61<400>102
gggctttagg tttaccgttt tctgg25<210>103<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸62<400>103ttctggacaa atattaagtt tttatcaa 28<210>104<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸63<400>104cttttaaata cactgtttcc attaaatgaa acagctatat40<210>105<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸64<400>105acagctatat ttgaagcttt catg 24<210>106<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸65<400>106ctttcatgcg acagttagag gaactt 26<210>107<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸66<400>107gaggaacttt taaatcaaca aataac 26<210>108<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸67<400>108ggattaggag aatcttttaa t21<210>109<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸68<400>109tcttttaatt tatatcaacg ttc 23<210>110<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸69<400>110ccttcaaaat tttttggctg a21<210>111<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸70<400>111ttggctgaac gaaatga 17
<210>112<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸71<400>112cgaaatgaaa cacgaaattt aag 23<210>113<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸72<400>113acacgaaatt taagtttatt acgtgctcaa tttatag 37<210>114<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸73<400>114gctcaattta tagctttaga acttgaattt ttaaatgcta ttccattg 48<210>115<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸74<400>115ccattgtttg cattaaatgg acagcag 27<210>116<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸75<400>116ccattgtttg cattaaatgg acagcag 27<210>117<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸76<400>117ccattactgt cattatatgc acaagct 27<210>118<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸77<400>118tatgcacaag ctttaaattt acatttg 27<210>119<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸78<400>119ttattaaaag aagcatctct ttt 23<210>120<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸79<400>120tggagaagga tttggattca cacag25<210>121
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸80<400>121cacatattat gaacgtcaat tgga 24<210>122<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸81<400>122tactgtgaaa ctttttataa tacaggtt 28<210>123<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸82<400>123tacaggttta gaacgtttaa gagga25<210>124<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸83<400>124aatactgaaa gttttttaag atatcatc 28<210>125<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸84
<400>125gtagagaaat gactttatta ttattagaat tattagcgct atttccatat t 51<210>126<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸85<400>126atattatgaa ttacgacttt atccaac 27<210>127<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸86<400>127cttacacgtg agttatatac aga 23<210>128<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸87<400>128tatacagaac cgattttatt taatccacc29<210>129<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸88<400>129ccaccagcta atttaggact ttgccgac 28<210>130<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸89<400>130ctttgccgac gttttggtac taatccc 27<210>131<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸90<400>131catctttttg aaaggctgaa tag 23<210>132<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸91<400>132taatcgattt ccattatcat ctaattttat 30<210>133<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸92<400>133ctaattttat ggaatatttt tcaggacata cgttac36<210>134<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸93<400>134tagttatctg aacgaatcag cattacaaga aga 33
<210>135<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸94<400>135caagaagaaa gttatggcct 20<210>136<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸95<400>136caattaatcc cggattagaa ggaacaaacc gcata 35<210>137<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸96<400>137gagtcaacgg cattagaatt tcgttctgca 30<210>138<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸97<400>138ggtatatatg gcttaaatag agcttc 26<210>139<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸98<400>139tagagcttct tttttaccag gaggcttgtt 30<210>140<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸99<400>140ctgctaatgg aggatgtaga gaactctatg a 31<210>141<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸100<400>141ctctatgaaa caaatga 17<210>142<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸101<400>142acaaatgaag aattaccacc 20<210>143<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸102<400>143attaccacca gaagaaagta ccggaag 27
<210>144<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸103<400>144agactatctc atttaacctt ttttagcttt 30<210>145<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸104<400>145gctaatgcag gaagtttacc tacttat 27<210>146<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸105<400>146cctacttatt tatttacccg tcgtga 26<210>147<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸106<400>147acccgtcgtg aattagaact taataatacg att 33<210>148<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸107
<400>148attaccattg ttaaaggcat ctgc 24<210>149<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸108<400>149aaggcatctg cacctttatc gggtactacg 30<210>150<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸109<400>150tcgggtacta cgttattaaa aggtccagg29<210>151<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸110<400>151acatttggaa cgttaagatt aacgttaaat tcaccattaa40<210>152<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸111<400>152cacaacaata tcgcctaaga ttacgttttg cctcaac 37<210>153<211>31
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸112<400>153aaatttcagt ataaggttac tccgtggagg g 31<210>154<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸113<400>154ataagggtac tccgtggagg gttatctatc ggtga 35<210>155<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸114<400>155tctatcggtg aattaagatt agggagcac29<210>156<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸115<400>156caagagattc taacattaaa tgcagaaggt 30<210>157<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸116<400>157
aatgcagaag gtttaagcac cggtggtgaa ta32<210>158<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸117<400>158gtggtgaata ttatatagaa agaattgaaa tt32<210>159<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸118<400>159agaattgaaa ttttaccttt aaatccggca cgagaag 37<210>160<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸1 19<400>160cgagaagcgg aagaggaatt agaagcggcg 30
权利要求
1.一种胃蛋白酶敏感的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述蛋白有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。
2.如权利要求1所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点以选自亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸残基表示。
3.如权利要求1或2所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它选自Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。
4.如权利要求3所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它是Cry9C蛋白。
5.如权利要求4所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它是Cry9Ca1蛋白。
6.如权利要求1-5中任一项所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它在至少一个域I的间-α-螺旋环中有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。
7.如权利要求1-6中任一项所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它在至少一个域I的连接α3和α4螺旋的间-α-螺旋环中有至少一个额外的胃蛋白酶切割位点。
8.如权利要求5-7中任一项所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它在164位有额外的胃蛋白酶切割位点。
9.如权利要求8所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，它选自Cry蛋白，其序列以标识符SEQ ID No.4，SEQ ID No.6或SEQ ID No.8表示。
10.如权利要求1-5中任一项所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点是通过用谷氨酸残基取代天冬氨酸残基，苯丙氨酸残基取代色氨酸残基和亮氨酸残基取代缬氨酸或异亮氨酸残基引入的。
11.如权利要求11所述的修饰的Cry蛋白，其特征在于，所述Cry蛋白的取代程度为25％。
12.增加Cry蛋白胃蛋白酶敏感性的方法，其特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶或切割位点被引入所述Cry蛋白。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述被引入的额外的胃蛋白酶切割位点以选自亮氨酸，苯丙氨酸和谷氨酸残基的氨基酸表示。
14.如权利要求12和13所述的方法，其特征在于，它被用于选自Cry1，Cry3，Cry4，Cry7，Cry8，Cry9，Cry10，Cry16，Cry17，Cry19和Cry20蛋白。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，它被用于Cry9C蛋白。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，它被用于Cry9Ca1蛋白。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶切割位点被引入所述Cry蛋白和至少一个域I的间-α-螺旋环。
18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个额外的胃蛋白酶切割位点被引入至少一个域I的连接α和α4螺旋的间-α-螺旋环。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其特征在于，额外的胃蛋白酶切割位点被引入164位。
20.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述额外的胃蛋白酶切割位点是通过用谷氨酸残基取代天冬氨酸残基，苯丙氨酸残基取代色氨酸残基和亮氨酸残基取代缬氨酸或异亮氨酸残基引入的。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述Cry蛋白的取代程度为25％。
22.一种编码如权利要求1-11中任一项所述的修饰的Cry蛋白的多核苷酸。
23.一种嵌合基因，其特征在于，它至少含有功能性相互连接的以下成分(a)在宿主生物中有功能的一个启动子(b)如权利要求22所述的多核苷酸(c)在宿主生物中有功能的终止子元件。
24.如权利要求23所述的嵌合基因，其特征在于，所述启动子和终止子元件在植物中有功能。
25.含有权利要求23或24所述的嵌合基因的表达载体或转化载体。
26.如权利要求27所述的载体，其特征在于，它是质粒、噬菌体或病毒。
27.扩被权利要求25或26所述载体转化的宿主生物。
28.如权利要求27所述的宿主生物，其特征在于，它是植物。
29.如权利要求28所述的植物，其特征在于，除权利要求23或24所述的嵌合基因外，它还含有至少一个其它的嵌合基因，所述嵌合基因含有编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸。
30.如权利要求29所述的植物部分。
31.来自如权利要求29所述植物的种子。
32.产生如权利要求1-11中任一项所述修饰的Cry蛋白的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤(a)将本发明的转化的宿主生物培养在适合所述生物生长和繁殖的培养基中，(b)提取由步骤(a)中培养的转化的生物产生的Cry蛋白。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，它包括纯化步骤(b)中提取的Cry蛋白的纯化步骤(c)。
34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述宿主生物是微生物。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述宿主生物苏云金芽孢杆菌。
36.单克隆或多克隆载体，其特征在于，它抗权利要求1-11中任一项所述的修饰的Cry蛋白。
全文摘要
本发明涉及苏云金芽孢杆菌(Bacillasthyringiensis)Cry蛋白在哺乳动物消化道中的降解。具有肽序列已被修饰的苏云金芽孢杆菌Cry蛋白使所述蛋白对哺乳动物消化道中的特定酶尤其是胃蛋白酶敏感。根据本发明，通过将胃蛋白酶切割位点插入其序列中来修饰Cry蛋白。本发明还涉及表达所述修饰的Cry蛋白的转化植物。
文档编号C07K14/325GK1610744SQ02810205
公开日2005年4月27日 申请日期2002年3月4日 优先权日2001年3月19日
发明者G·弗雷西内, C·让, R·弗鲁托斯 申请人:拜尔农科股份有限公司