用于治疗神经退行性疾病的组合物和方法

专利名称：用于治疗神经退行性疾病的组合物和方法
技术领域：
本发明总体上涉及用于基因传递的组合物和方法。本发明特别涉及用腺伴随病毒作为载体的基因传递系统传递神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)来治疗由神经退行性疾病引起的预先存在的神经元损伤，如帕金森氏病。
背景技术：
中枢神经系统疾病是主要的公共健康问题。帕金森氏病(PD)仅在美国就影响了一百万人以上。PD在临床上表现为自主运动减少、行走困难、姿势不稳定、僵硬和颤动。PD是一种进行性神经变性疾病，主要影响黑质(SN)中的多巴胺能(DA)神经元。目前，多种中枢神经系统疾病是通过系统给予治疗药物来治疗的。但是系统给药经常是无效的，因为药物不能通过血脑屏障。即使这些化合物能成功穿过血脑屏障，他们将导致中枢神经系统副作用。因此，许多可能有效的化合物如蛋白质，不能通过系统给药。
目前可以获得的治疗PD的目标在于替代纹状体中的多巴胺以恢复运动功能。但是，必须开发阻止或减缓持续进行的退化进程的治疗干涉(Dunnett等，Nature(1999)399A32-39)。神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是目前发现的对多巴胺能(DA)神经元最有效的神经营养因子，并经验证在体内和体外都可增强多巴胺能(DA)神经元存活(Bjorklund等，Brain Res.(2000)88682-98；Bohn，M.C.，Mol.Ther.(2000)1494-496；Ozawa等，J.Neural Transm.Suppl.(2000)58181-191)。但是，GDNF蛋白给药到中枢神经系统是成问题的。GDNF仅在很短的时间内保留活性，而且由于GDNF较大，不能穿过血脑屏障，这使直接给药到脑成为仅有的可行的传递方法。这必然要求立体定位注射传递GDNF到脑或脑室内(ICV)，该传递方式严重地限制了它的治疗应用。因此，在体内基因直接转移提供了更有效的传递GDNF的方法。
腺伴随病毒(AAV)曾成功的用于基因治疗的基因传递。腺伴随病毒(AAV)基因组是线性的，包含大约4681个核苷的单链DNA分子。AAV基因组通常在两端各有一个反向末端重复区(ITR)，两端之内为非重复基因组。该ITR的长度大约145bp。该ITR具有多重功能，包括作为DNA复制的起始点，作为病毒基因组的包装信号。基因组内部非重复部分包括两个大的可读框，已知是AAV复制(rep)基因和衣壳(cap)基因。该rep和cap基因编码可使病毒复制并包装成病毒体的病毒蛋白。具体地说，由AAV rep区域表达至少4个病毒蛋白，根据它们的表观分子量命名为Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV cap区域编码至少3个蛋白，VP1、VP2和VP3。
通过去除AAV基因组内非重复部分(即rep和cap基因)并在ITR中间插入外源基因，将AAV改造成传递目的基因。所述外源基因通常功能性连接一个外源启动子(组成型、细胞特异型、或诱导型)，该启动子在适合的条件下可在患者的靶细胞中启动基因表达。还可包括终止信号如多聚腺苷酸化位点。
AAV依赖于辅助病毒，即它需要与一个辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘)共同感染才能形成AAV病毒体。在没有辅助病毒共同感染时，AAV是潜伏状态，病毒基因组插入到宿主细胞染色体中，但是不产生可感染的病毒体。之后通过辅助病毒感染“援助”整合基因组，使它复制并包装其基因组成为感染AAV病毒体。AAV可感染不同种细胞，而辅助病毒必须是与宿主细胞同种的。例如，人AAV在犬科腺病毒共同感染犬科细胞中可以复制。
在啮齿类和灵长类PD模型中，研究表明利用AAV、腺病毒(Ad)或慢病毒载体型系统传递GDNF基因保护黑质DA神经元，如果在注射神经毒素前或刚刚注射后给药则还可恢复黑质纹状体通路(Choi-Lundberg等，Science(1997)275838-841；Mandel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)9414083-14088；Bilang-Bieuel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)948818-8823；Choi-Lundberg等，Exp.Neurol.(1998)154261-275；Mandel等，Exp.Neurol.(1999)160205-214；Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700；Bensadoun等，Exp.Neurol.(2000)16415-24；以及Kordower等，Science(2000)290767-773)。然而以前的研究表明当DA神经元损坏后延迟给予GDNF，剩下的DA神经元是少量和大量的恢复功能反应了仍然存活的DA神经元和保持黑质纹状体的联系的数量(Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700；Connor等，Gene Therapy(1999)61936-1951；Winkler等，J.Neurosci.(1996)167206-7215；Natsume等，Exp.Neurol.(2001)169231-238)。因此，以前没有证明在退化进程的晚期长期利用AAV载体系统传递GDNF的效力。
PD是特征为进行性DA退化的疾病，在明显的症状出现以前DA神经元数就明显减少了。因此，临床上更重要的是弄清楚以延迟的方式传递GDNF基因是否能够挽救在已经存在重度的黑质纹状体DA退化的动物模型的DA神经元和改善行为。此外，还不清楚载体源性GDNF在黑质中能否由轴突末端向DA神经元细胞体逆向转运。
发明概述为了治疗已经存在的神经元损伤，本领域需要替代方法传递GDNF。本发明以下面的发现为基础AAV载体介导GDNF基因传递到重度的黑质纹状体多巴胺能(DA)去神经的患者，促进黑质(SA)中DA神经元的存活，提高酪氨酸羟化酶(TH)-阳性DA纤维的密度，甚至在退化进程发生以后改善行为和生化缺陷。此外转基因产生的GDNF在黑质中由纹状体到DA细胞体逆向转运，甚至在DA细胞大量丧失之后，保持黑质纹状体通路的功能联系。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗已经存在的神经元损伤的哺乳动物患者的方法。该方法包括给予患者中枢神经系统重组AAV病毒体，所述重组AAV病毒体包括有效连接包括启动子的表达控制元件的编码GDNF多肽的多核苷酸，在体内神经细胞中表达该多核苷酸的条件下提供治疗效果。
在某些实施方案中，已经存在的神经元损伤包括中度或重度黑质网状体多巴胺能(DA)去神经。
在另外的实施方案中，神经细胞在体内转导，重组AAV病毒体给药到所述患者的纹状体内。
在其它实施方案中，利用强力输送系统(CED)将重组AAV病毒体给药到纹状体。
在某些实施方案中患者是人。
在其它实施方案中，本发明涉及治疗已经存在的神经元损伤的哺乳动物患者的方法。已经存在的神经元损伤包括中度到重度黑质纹状体DA去神经，该方法包括将包含重组AAV病毒体的组合物给药到患者的纹状体，所述重组AAV病毒体包含有效连接包括启动子的表达控制元件的编码GDNF多肽的多核苷酸，在导致体内神经细胞转导的条件下，通过体内转导神经细胞来表达多核苷酸以达到治疗效果。
此外，所述重组AAV病毒体可以利用CED给药到所述患者的纹状体。
在另外的实施方案中，本发明涉及治疗已经存在的神经元损伤的哺乳动物患者的方法。已经存在的神经元损伤包括中度到重度黑质纹状体DA去神经，该方法包括利用CED将包含重组AAV病毒体的组合物给药到患者的纹状体，所述重组AAV病毒体包含有效连接包括启动子的表达控制元件的编码GDNF多肽的多核苷酸，在导致体内神经细胞转导的条件下，通过体内神经细胞转导来表达多核苷酸以达到治疗效果。
在任何上述方法中，所述启动子可以是病毒启动子，例如，MLP、CMV或RSV LTR启动子。
如果利用CED，则可以用渗透泵或输液泵给药。
在上述任何方法中的多核苷酸还可以包括在5’位置而且符合编码GDNF多肽的序列的读框的分泌序列。此外，所述多核苷酸可以编码人GDNF，例如人pre-pro-GDNF。
本发明还提供了治疗哺乳动物患者上述疾病或紊乱的组合物，该组合物包含重组AAV病毒体，所述重组AAV病毒体包含有效连接包括启动子的表达控制元件的编码GDNF多肽的多核苷酸，在导致体内神经细胞转导的条件下达到治疗效果。本发明的组合物可以是任选包含药学上可接受的载体的药学组合物。
此外，本发明提供1.组合物在治疗已经存在的神经元损伤的哺乳动物患者中的应用，将所述组合物给药到所述患者中枢神经系统，其中所述组合物包含重组腺伴随病毒(AAV)病毒体，其中所述病毒体包含有效连接包括启动子的表达控制元件的编码神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)多肽的多核苷酸。
2.第1项的应用，其中所述患者是人。
3.第1项或第2项任一项的应用，其中所述已经存在的神经元损伤包括中度到重度黑质纹状体多巴胺能(DA)去神经。
4.1-3项任一项的应用，其中所述多核苷酸还包括5’位置分泌序列和可读框中编码GDNF多肽的序列。
5.1-4项任一项的应用，其中所述多核苷酸编码人GDNF。
6.第5项的应用，其中所述多核苷酸编码人pre-pro-GDNF。
7.1-6项任一项的应用，其中所述组合物给药到所述患者的纹状体。
8.上述的任一项的应用，其中所述启动子是病毒启动子。
9.第8项的应用，其中所述启动子是MLP、CMV或RSV LTR启动子。
10.上述的任一项的应用，其中所述重组AAV病毒体给药到所述患者的纹状体。
11.第10项的应用，其中所述重组AAV病毒体通过强力输送系统(CED)给药到纹状体。
12.第11项的应用，其中所述给药是通过渗透泵进行的。
13.第11项的应用，其中所述给药是通过输液泵进行的。
本领域技术人员很容易根据本发明公开内容想到本发明的这些和其它实施方案。
附图简述

图1a和1b为AAV载体示意图。在图1a中，LacZ受CMV启动子的转录控制。在图1b中，小鼠GDNF cDNA在C-末端与FLAG多肽的编码序列融合并受CMV启动子的转录控制。ITR，反向末端重复区；CMV，巨细胞病毒立即早期启动子；内含子，人生长素的第一个内含子；多聚A，SV40多腺苷酸化信号序列。
图2表示用AAV-GDNFflag转导后从293个细胞中提取出的细胞提取物的蛋白质印记分析。用模拟物(1道)或AAV-LacZ(2道)转导的293个细胞作为阴性对照。用AAV-GDNFflag转导(3道)后36个小时，分别用抗-GDNF和抗-FLAG抗体检测到GDNFflag融合蛋白的表达。
图3表示用AAV-GDNFflag转导的培养物中增加的存活的DA神经元。用AAV-GDNFflag、AAV-LacZ或模拟物转导培养9天后的大鼠E14中脑细胞培养物中计数TH-IR(DA)神经元的数目。培养物中加入rhGDNF(10ng/ml)作为阳性对照。误差条图显示s.em.(*P＜0.01)。
图4a-4e描述在纹状体中GDNFflag的表达并逆向转运到SN。AAV-GDNFflag注入到病变纹状体4周后，杀死大鼠，为了进行免疫组织化学而处理通过纹状体和SN的冠状切片。用抗-FLAG抗体检测纹状体中GDNFflag转基因表达(图4a和4b)。通过用多克隆抗-TH抗体(4c)和单克隆抗-FLAG抗体(4d)双免疫荧光染色来确定同侧SN中GDNFflag的逆向转运。4c和4d的覆盖图(4e)表明FLAG和TH-阳性神经元共同定位在SN中。在致密部的广阔区域检测双阳性神经元。该图表明观察到TH和FLAG的最明显的共同定位区域。(a，bar＝100μm；b，bar＝25μm；c-e，bar＝50μm)。
图5a-5e表明AAV-GDNFflag注射对纹状体中TH-IR纤维的效果在AAV-LacZ注射动物的损伤侧的TH-IR纤维的密度明显减少(图5a和5c)。相反，AAV-GDNFflag注射动物证明在处理的纹状体中TH-IR纤维的密度增加(图5b和5d)。图5c和5d分别显示图5a和5b的损伤侧的箭头处的高度放大的观察区域。图5e表明用图5b的完整侧上的箭头显示区域中密集的TH-IR纤维。(图5a-5b，bar＝1mm；图5c-5e，bar＝50μm)。
图6a-6f表明用CTB逆行标记，6-OHDA损伤产生4周后。SN切片用CTB(图6a和6d)和TH(图6b和6e)双重染色。在损伤侧(图6a-6c)和对侧(图6d-6f)两侧的CTB阳性细胞也是TH-IR阳性，代表DA神经元。在损伤侧(图6a-6c)，通过CTB逆行标记TH-阳性神经元表明在损害4周后一些DA神经元保持与纹状体损伤的联系。图6c是图6a和6b的覆盖图。图6f是图6d和6e的覆盖图(bar＝50μm)。
图7a-7f表明在SN中AAV-GDNFflag对TH-和CTB-阳性细胞数目的影响。通过中脑的冠状切片显示AAV载体给药20周后TH-IR(图7a-7c)和CTB-阳性(图7d-7f)黑质神经元。在杀死动物前3天向纹状体两侧注射CTB。分别来自AAV-LacZ注射动物的损伤侧(图7a和7d)和AAV-GDNFflag注射动物的损伤侧(图7b和7e)和完整半球(图7c和7f)的SN实例。(图7a-7c，bar＝200μm；图7d-7f，bar＝100μm)。
图8表明接受AAV-GDNFflag注射的大鼠损伤SN中TH-阳性和CTE-阳性神经元的百分率与用AAV-LacZ注射的动物比较明显增加(n＝8)。用阳性细胞的百分率来表示数据(损伤/未损伤半球，*P＜0.01)。
图9a-9b表明GDNFflag对行为恢复的影响。经脱水吗啡诱导旋转和圆筒实验检查纹状体内注射AAV-GDNFflag(n＝20)、AAV-LacZ(n＝16)或载体(n＝8)的大鼠。接受AAV-GDNFflag的大鼠中观察到脱水吗啡诱导旋转明显减少。相反，用AAV-LacZ注射组或载体注射组的大鼠表现出稳定的旋转。旋转以每60分的转数表示。(图9a)。通过圆筒实验评价6-OHDA损害后的自发前肢使用。在AAV处理前，通过对侧肢使用频率的减少说明大鼠明显地表现为偏向同侧(总接触的23-25％)。20周时AAV-GDNFflag处理的大鼠逐渐地改善达到接近正常(总的47％)。相反，接受AAV-LacZ或载体的大鼠的对侧肢使用频率的减少持续存在。用总数的百分率表示对侧(右)前脚接触(*P＜0.01)。(图9b)。
图10a和10b表明AAV-GDNFflag(n＝8)或AAV-LacZ(n＝8)注射20周后6-OHDA-病变中含有的多巴胺(图10a)和DOPAC和HVA(多巴胺代谢物)(图10b)。数据表示完整纹状体的百分率(P＜0.01)。
图11(SEQ ID NOS1和2)表示人pre-pro-GDNF的核苷酸序列和氨基酸序列。成熟的GDNF分子为氨基酸位置78-211。
图12(SEQ ID NOS3和4)表示大鼠pre-pro-GDNF的核苷酸序列和氨基酸序列。成熟的GDNF分子为氨基酸位置78-211。
图13(SEQ ID NOS6和7)表示小鼠pre-pro-GDNF的核苷酸序列和氨基酸序列。成熟的GDNF分子为氨基酸位置107-240。
发明详述除非另有说明，实施本发明应用本领域技术范围内病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法来进行。所述技术在文献中有充分地解释。参见，例如Sambrook等Molecular CloningALaboratory Manual(最近版本)；DNA CloningA Practical Approach，第I&II卷(D.Glover，编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，编辑，最近版本)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins，编辑，最近版本)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins，编辑，最近版本)；CRC Handbook of Parvoviruses，第I&II卷(P.Tijssen，编辑)；Fundamental Virology，第2版，第I&II卷(B.N.Fields and D.M.Knipe，编辑)；Freshney Culture of Animal Cells，A Manual of BasicTechnique(Wiley-Liss，第3版)；以及Ausubel等(1991)Current Protocolsin Moleular Biology(Wiley Interscience，NY)。
除非本文另有清楚的说明，在本说明书和附件权利要求中所使用的单数形式“一个”“一种”和“其(该，所述)”包括复数含义。
A.定义在本发明的描述中，将使用下列术语，特此简要说明定义如下本文使用的术语“神经胶质细胞源性神经营养因子多肽”或“GDNF多肽”是指任何来源的神经营养因子，是与任何多种已知GDNF基本同源和功能相当。三种哺乳动物有代表性的GDNF示于图11、12和13。大鼠(图12，SEQ ID NO4)和人(图11，SEQ ID NO2)蛋白质之间的同源度是大约93％，所有哺乳动物GDNF具有相似高度同源性。所述GDNF以单体、二聚体或其他多聚体的生物活性形式存在。因此，本文使用的术语“GDNF多肽”包括活性单体GDNF以及活性多聚体GDNF、活性糖基化和非糖基化形式的GDNF和活性截短形式的分子。
本文使用的“功能相当”是指GDNF多肽保留部分或全部神经营养的特性，但是与天然的GDNF分子的程度不一定相同。
“同源”是指两个多核苷酸或两个多肽部分之间相似的百分数。当两个多核苷酸或两个多肽序列至少大约50％相似，优选至少75％，更优选至少80-85％，优选至少90％，更优选至少95-99％或在规定的分子长度内更多序列相似或序列相同，则所述序列彼此“基本同源”。本文使用的基本同源还指与特定的多核苷酸或多肽序列完全相同的序列。
“同一性”通常是指两个多核苷酸或多肽序列分别准确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应。同一性百分率可通过两个分子之间序列信息的直接对比来测定，通过排列序列，计算两列序列之间匹配的准确数，除以最短序列，结果乘以100。
可以应用容易买到的计算机程序帮助分析相似性和同一性，例如ALIGN、Dayhoff，M.O(Atlas of Protein Sequence and Structure，M.O.Dayhoff编辑，5增刊3353-358，国家生物医学研究基金，华盛顿，其修改Smith和Waterman Advances in Appl.Math.2482-489，1981的用于肽分析的局部同源运算法则)。在Wisconsin序列分析包(WisconsinSequence Analysis Package)第8版本中可以获得测定核苷酸序列相似性和同一性的程序(由Genetics Computer Group，Madison，WI获得)，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman运算法则。通过制造商推荐和前面提到Wisconsin序列分析包中所述的默认参数容易使用这些程序。例如，特定核苷酸序列与参考序列的相似性百分比可以利用默认打分表和6个核苷酸位点的空位罚分的Smith和Waterman的同源运算法则来测定。
本

发明内容
中另一个建立相似性百分比的方法是利用爱丁堡大学拥有版权，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行的MPSRCH软件包。这套软件包在默认参数用于记分表中使用Smith和Waterman运算法则(例如，空位开放罚分为12、空位延长罚分为1、一个空位为6)。由该数据产生“匹配”值反应“序列相似性”。本领域通常已知其他计算序列间同一性或相似性百分比的合适的程序，例如，另一种对比程序是BLAST，使用默认参数。例如，BLASTN和BLASTP可应用下列默认参数来使用遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；预期值＝10；矩阵＝BLOSUM62；种类＝50个序列；按...排序＝HIGH SCORE；数据库＝非丰余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank+CDS翻译+Swiss蛋白质+Spupdate+PIP。这些程序的详细内容可在下列网址中找到http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
此外，同源性可通过多核苷酸在下列条件下杂交来测定，所述条件是在同源的区域形成稳定的双链，然后用单链特异性核酸酶消化，消化片段的大小测定。在例如针对特殊系统定义的的严格条件下通过DNA印迹杂交实验来确定DNA序列是基本同源的。定义的适合杂交条件是本领域的技术。参见，例如，Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
“GDNF变体”是指参照GDNF分子有生物活性的衍生物，或所述衍生物保留想要的活性的片段，例如本文所述实验中的神经营养活性。一般地说，术语“变体”指具有天然多肽序列和结构、而相对于天然分子一个或多个氨基酸插入、取代(通常是保守的)和/或缺失的化合物，只要所述改变不破坏神经营养活性。优选所述变体具有至少与天然分子相同的神经营养活性。用于制造编码GDNF变体的多核苷酸的方法是本领域已知的并在下面进一步描述。
对于GDNF缺失变体，通常缺失范围是大约1-30个残基，更通常为大约1-10个残基，典型的是大约1-5个临近的残基，或在所述范围内的任何整数。设想存在N-末端、C-末端和内部缺失。为了保持最大的生物活性，通常将缺失导入到与其它TGF-β超家族成员低同源的区域。通常选择缺失以保持GDNF蛋白产物在受影响的区域的三级结构，例如，半胱氨酸交联。缺失变体的非限制性实施例包括缺失GDNF1-40 N-末端氨基酸的截短的GDNF蛋白质产物，或缺失GDNF C-末端残基的变体或其结合物。
对于GDNF插入变体，氨基酸序列插入通常包括N-和/或C-末端融合，融合范围从一个残基到包含一百个或更多残基的多肽的长度，以及内部加入单个或多个氨基酸残基。内部插入通常范围是大约1-10个残基，更通常为大约1-5个残基，常常是1-3个氨基酸残基，或在所述范围内的任何整数。N-末端插入变体的实例包括异源N-末端信号序列与GDNF N-末端的融合，以及其它神经营养因子序列衍生的氨基酸序列的融合。
GDNF取代变体有至少一个GDNF氢基酸序列的氨基酸残基除去，由一个不同的残基插入到它的位置。所述取代变体包括等位基因的变体，其特征在于在单种种群中自然发生的核苷酸序列的改变，它可能导致或不导致氨基酸改变。特别优选的取代是保守的，即这些取代是在与它们的侧链相关的氨基酸家族内的取代。具体地说，氨基酸通常分为4种(1)酸性的—天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的—赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不带电的极性的—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。例如，可以预见的是用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸、或用结构相关的氨基酸取代相似的保守的氨基酸，这些取代不会对生物活性有大的影响。
例如，该GDNF分子可以包括直至大约5-10个保守的或非保守的氨基酸取代，或甚至大约15-25个保守的或非保守的氨基酸取代，或5-25之间任何整数，只要保持想要的分子功能完整。本领域技术人员应用本领域众所周知的技术可以很容易地测定目的分子允许改变的区域。
GDNF氨基酸序列的特定突变可以包括糖基化位点的修饰(例如，丝氨酸、苏氨酸、或天冬酰胺)。在任何天冬酰胺-连接的糖基化识别位点或通过插入O-联糖类修饰的分子的任何位点的氨基酸取代或缺失导致失去糖基化或部分糖基化。天冬酰胺-连接的糖基化识别位点包括适当的细胞糖基化酶特异性识别的三肽序列。这些三肽序列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是除了Pro外的任何氨基酸。在糖基化识别位点的第一或第三个氨基酸位置的一个或两个位点上的氨基酸取代或缺失的改变(和/或在第二位置上氨基酸缺失)导致在修饰的三肽序列非糖基化。因此适当改变的核苷酸序列的表达产生不在该位点糖基化的变体。或者，GDNF氨基酸序列可以修饰以加上糖基化位点。
识别突变GDNF氨基酸残基或区域的方法是本领域众所周知的。一种已知所述方法是“丙氨酸扫描突变”。参见例如，Cunningham和Wells，Science(1989)2441081-1085。在这个方法中，鉴别氨基酸残基或目标残基组(例如，带电的残基如Arg、Asp、His、Lys以及Glu)并用中性或带负电氨基酸(最优选丙氨酸和多聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与细胞内外周围水环境之间的相互作用。通过在取代的位点引入另外的或替代的残基精确定位对取代敏感的功能的结构域。因此，测定引入氨基酸序列变异的靶位点，在相应的靶密码子或DNA序列的区域上进行丙氨酸扫描或随机诱变，筛选表达的GDNF变体以对需要的活性和活性程度进行最优组合。
诱变最关键的位点包括在侧链体积、电荷、和/或疏水性的方面不同物种GDNF蛋白的氨基酸明显不同的位点。其它的目标位点是那些来自不同物种的在GDNF-样蛋白的特定残基上是同样的位点。所述位置通常对蛋白质的生物活性是重要的。这些位点起初是以相关的保守方式取代的。如果所述取代导致生物活性的改变，那么引入更大改变(典型取代)，和/或制造其它插入或缺失，并筛选所得产物的活性。
GDNF活性的测定是本领域已知的，包括增强中脑神经元培养物中多巴胺的吸收的能力和增强交感神经节神经元的存活的能力。参见例如，美国专利号6,362,319。
“帕金森氏病样症状”包括肌肉颤抖、肌肉无力、僵硬、运动徐缓、姿势和平衡的改变、痴呆和相似症状，通常是帕金森氏病或其它神经变性的疾病伴有的。
“载体”是指任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒体等，当与适当的控制因子连接时它们能够复制并能在细胞之间转运基因序列。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。
“AAV载体”是指由腺伴随病毒血清型衍生的载体，非限制性包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8。AAV载体可以具有全部或部分缺失一个或多个AAV野生型基因，优选rep和/或cap基因，但是保留功能性侧接ITR序列。功能性ITR序列对AAV病毒体的拯救、复制和包装是必须的。因此，本文定义的AAV载体包括至少病毒复制和包装顺式需要的那些序列(例如，功能性ITR)。所述ITR不必是野生型核苷酸序列，可以是经改变的，例如，经过核苷酸的插入、缺失或取代，只要该序列提供功能性拯救、复制和包装。
“AAV辅助功能”是指可以表达提供AAV基因产物的AAV衍生的编码序列，所述产物再对生产性AAV复制反式起作用。因此，AAV辅助功能包括两个主要AAV可读框(ORF)，即rep和cap。所述Rep表达产物经证实具有多种功能，其中包括AAV DNA复制起点的识别、结合和产生切口；DNA解旋酶活性；以及由AAV(或其它异源的)启动子转录的调节。所述Cap表达产物提供必要的包装功能。本文使用AAV辅助功能来补充AAV载体失去的反式AAV功能。
术语“AAV辅助构建物”通常是指包括提供AAV载体缺失的AAV功能的核苷酸序列的核酸分子，它用于产生转导载体来传递目标核苷酸序列。AAV辅助构建物通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达来补充失去的细胞裂解性AAV复制必须的AAV功能；但是辅助构建物缺少AAV ITR并且不能自我复制和自我包装。AAV辅助构建物可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒体。描述了许多AAV辅助构建物，例如常用的编码Rep和Cap表达产物的质粒pAAV/Ad和pIM29+45。参见例如，Samulski等(1989)J.Virol.633822-3828；以及McCarty等(1991)J.Virol.652936-2945。已有许多其它编码Rep和Cap表达产物的载体的介绍。参见例如，美国专利号5,139,941和6,376,237。
术语“附属功能”是指非AAV衍生的病毒和/或细胞的功能(AAV依赖其进行复制)。因此，该术语包括在AAV复制中需要的蛋白和RNA包括那些涉及AAV基因转录活化、时期专一的AAV mRNA剪接、AAVDNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳装配的部分。基于病毒的附属功能可由任何已知的辅助病毒如腺病毒、疱疹病毒(除了1型单纯疱疹病毒)和牛痘病毒衍生。
术语“附属功能载体”通常是指包含提供附属功能的核苷酸的核酸分子。附属功能载体可以转染适合的宿主细胞，然后所述载体在宿主细胞中能够支持AAV病毒体产生。从该术语中特别排除在外的是自然存在的传染性病毒体，例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒体。因此，附属功能载体可以是质粒、噬菌体、转座子或粘粒的形式。
特别证明了完全补充的腺病毒基因不需要附属的辅助功能。具体地说，不能DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体表明是AAV复制许可的。Ito等，(1970)J.Gen.Virol.9243；Ishibashi等，(1971)Virology45317。同样地，E2B和E3区域内的突变体显示出支持AAV复制，说明E2B和E3区域可能不参与提供附属的功能。Carter等，(1983)Virology126505。但是，E1区域缺陷或缺失E4区域的腺病毒不能支持AAV复制。因此，E1A和E4区域可能是AAV复制直接或间接需要的。Laughlin等，(1982)J.Virol.41868；Janik等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA781925；Carter等，(1983)Virology126505。其它特征性Ad突变体包括E1B(Laughlin等，(1982)，同上；Janik等，(1981)，同上；Ostrove等，(1980)Virology104502)；E2A(Handa等，(1975)J.Gen.Virol.29239；Strauss等，(1976)J.Virol.17140；Myers等，(1980)J.Virol.35665；Jay等，(1981)Proc.Aatl.Acad.Sci.USA782927；Myers等，(1981)J.Biol.Chem.256567)；E2B(Carter，腺伴随病毒辅助功能，I CRC Handbook of Parvoviruses(P.Tijssen编辑，1990))；E3(Carter等，(1983)，同上)；以及E4(Carter等，(1983)，同上；Carter(1995))。尽管通过具有E1B编码区域突变的腺病毒提供的附属功能的研究产生不一致的结果，但是Samulski等，(1988)J.Virol.62206-210，最近报道E1B55k是AAV病毒体产生所需要的，而E1B19k不是。此外，国际公开WO97/17458和Matshushita等，(1998)GeneTherapy5938-945描述了编码多种Ad基因的附属功能载体。
特别优选附属功能载体包括腺病毒VARNA编码区域、腺病毒E4 ORF6编码区域、腺病毒E2A 72 kD编码区域、腺病毒E1A编码区域、和缺少完整E1B55k区域的腺病毒E1B编码区域。在国际公开号WO01/83797中描述了所述载体。
“能够支持有效的rAAV病毒体产生”是指附属功能载体或系统在特定的宿主细胞中，能够提供与腺病毒辅助病毒感染该宿主细胞能获得的大体相当的或更高水平的rAAV病毒体产生的辅助功能。因此，附属功能载体或系统支持有效的rAAV病毒体产生的能力可以通过比较应用附加载体或系统获得的rAAV病毒体滴度与应用传染性腺病毒感染获得的滴度来确定。更具体地说，如果相同数量的宿主细胞获得的病毒体量少于用腺病毒感染的量的不大于200倍，更优选不大于100倍，最优选相等或高于用腺病毒感染获得的量，则附属功能载体或系统支持有效的rAAV病毒体产生与用传染性腺病毒获得的大致相当或更高。
“重组病毒”是指经过遗传改变的病毒，例如，通过添加或插入异源核酸构建物到粒子中。
“AAV病毒体”是指完整病毒体，如野生型(wt)AAV病毒体(包括与AAV衣壳蛋白外壳结合的线性单链AAV核酸基因组)。在这点上，任何互补单链AAV核酸分子，例如有意义链或无意义链，都可以包装到任何AAV病毒体中，并且两条链同样地具有传染性。
“重组AAV病毒体”或“rAAV病毒体”本文定义为有传染性的复制缺陷病毒，包括AAV蛋白衣壳，封装着侧接AAV ITR的目的异源核苷酸序列。rAAV病毒体是在具有AAV载体的、AAV辅助功能和引入其中的附属功能合适的宿主细胞中产生的。如此，所述宿主细胞具有编码AAV多肽的能力，为了以后的基因传递，这就需要将AAV载体(包括目的重组核苷酸序列)包装到传染性重组病毒体中。
术语“转染”是用于指细胞吸收外源DNA，当外源DNA导入到细胞膜内时即转染了该细胞。许多转染技术通常是本领域已知的。参见例如，Graham等，(1973)Virology52456，Sambrook等，(1989)Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Davis等，(1986)Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，和Chu等，(1981)Gene13197。所述技术可以用于将一个或多个外源DNA部分(如核苷酸整合载体和其它核酸分子)引入到合适的宿主细胞中。
术语“宿主细胞”表示例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞，它们能够或已经用于接受AAV辅助构建物、AAV载体质粒、附属功能载体、或其它转运DNA。术语包括转染的原始细胞的子代。因此，本文使用的“宿主细胞”通常是指用外源DNA序列转染的细胞。可以理解由于自然、偶然或有目的的突变，单一亲代细胞的子代在形态学或遗传或总DNA互补上与原始的亲代不需要完全一致。
本文使用的术语“细胞系”是指在体外能够继续或延长生长和分裂的细胞群体。通常，细胞系是由单一的祖代细胞衍生的无性(繁殖)系的群体。本领域深知在所述无性(繁殖)系的群体的保存或转运中染色体组型可能发生自发的或诱导的改变。因此，细胞系衍生的细胞是指可以不与祖代细胞或培养物准确一致，所述细胞系包括所述变体。
术语“异源的”涉及核酸序列如编码序列和控制序列，表示通常不连接在一起的序列，和/或通常不是特定的细胞具有的序列。因此，核酸构建物或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子中或与另一个核酸分子相连的核酸节段，而在自然中与所述另外的分子无关。例如，核酸构建物的异源区域可以包括编码序列和非天然的编码序列侧翼序列。异源编码序列的另一个例子是编码序列本身是自然中不存在的构建物(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。同样地，本发明的目的认为用不是细胞中正常存在的构建物转化的细胞是异源的。等位基因的变异或自然发生的突变事件不会产生本文使用的异源DNA。
“编码序列”或“编码”特定蛋白的序列是，当处于合适的调节序列的控制下在体外或体内转录(在DNA的情况)和翻译(在mRNA的情况)成多肽的核酸序列。编码序列的边界是由5’末端(氨基)的起始密码子和3’末端(羧基)的终止密码子决定的。编码序列可以包括，但不限于，来自原核的或真核的mRNA的cDNA、来自原核的或真核的DNA的基因组DNA序列、甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常是位于编码序列的3’端。
“核酸”序列是指DNA或RNA序列。该术语包括含任何已知DNA和RNA碱基类似物的序列，例如，但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧基甲基-氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2.2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基乌嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基乌嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5’-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。
术语DNA“控制序列”是指启动子序列、多聚腺苷酸信号、转录终止序列、上游调节区域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等的集合，它们共同提供在受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。不是所有的这些控制序列都需要存在，只要选定的编码序列在合适的宿主细胞中能够复制、转录并翻译。
本文使用的术语“启动子”通常意义是指包括DNA调节序列的核苷酸区域，其中所述调节序列是由能够结合RNA聚合酶和启动子下游(3’-方向)编码序列的转录的基因衍生来的。转录启动子包括“诱导型启动子”(有效连接启动子的多核苷酸序列表达是通过分析物、辅因子、调节蛋白等诱导的)和“组成型启动子”。
“有效连接”是指元件的排列，其中所描述的成分配置成得以执行它们通常的功能。因此，控制序列可操作地连接到编码序列能影响编码序列的表达。控制序列不需要与编码序列邻近，只要它们能控制编码序列的表达。因此例如，间插不可翻译但可转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，仍然可以认为启动子序列是“有效连接”到编码序列。
“分离(的)”当就核苷酸序列而言，是指所述分子在基本上没有其它同型的生物学大分子的情况下存在。因此，“编码特定的多肽的分离的核酸分子”是指基本没有其它不编码所述多肽的核酸分子的核酸分子；但是所述分子可以包括一些对所述组分基本特征没有有害影响的其它碱基或部分。
在整个申请中描述特定核酸分子中核苷酸序列的相应位置时，例如，当特定核苷酸序列描述成位于相对于另一序列的“上游”、“下游”、“3’”或“5’”时，可以理解成所述序列在DNA分子的“有义链”或“编码”链中的位置，这是本领域通用的。
特定AAV多肽的“功能同系物”或“功能等同物”包括由天然多肽序列衍生的分子，以及以与参考AAV分子相似的方式发挥作用以达到需要结果的重组产生或化学合成的多肽。因此，AAV Rep 68或Rep 78功能同系物包括那些多肽的衍生物和类似物—包含内部或其氨基或羰基末端的单一或多个氢基酸添加、取代和/或缺失，只要保留完整的活性。
特定腺病毒核苷酸区域“功能同系物”或“功能等同物”包括由异源腺病毒血清型衍生的相似的区域、由另一个病毒或细胞来源的核苷酸区域、以及以与参考核苷酸区域相似方式发挥作用以达到预期结果的重组产生或化学合成的多核苷酸。因此，腺病毒VA RNA基因区域或腺病毒E2a基因区域的功能同系物包含所述基因区域的衍生物和类似物—包括在该区域内单一的或多个核苷酸碱基的添加、取代和/或缺失，只要同系物保留以背景以上可检测到的水平提供其固有的支持AAV病毒体产生的附属功能。
“强力输送系统”是指药物的任何非手动传递。本发明中，AAV的强力输送系统(CED)的实例可以通过输液泵或渗透泵来实现。下面有CED的更详细的描述。
术语“中枢神经系统”或“CNS”包括脊椎动物的大脑和脊髓的所有细胞和组织。因此，该术语包括但不限于神经元细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、脑脊髓液(CSF)、胞间隙、骨、软骨等。CNS的各区域与不同行为和/或功能相关。例如，大脑的基底神经节与运动功能，尤其是自主运动有关。基底神经节是由6对神经核组成尾状核、壳核、苍白球、伏隔核、丘脑底部的核、以及黑质。尽管被内囊分开，但尾状核和壳核共有细胞结构学、化学和生理学特性，通常是称为纹状体。在帕金森氏患者中退化的黑质提供主要的多巴胺能的输入基底神经节。
本文可交换的使用术语“对象”、“个体”或“患者”是指脊椎动物，优选哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于鼠科动物、猿、人、畜牧动物、运动动物和宠物。
“有效量”是足够起到有益的或需要作用的剂量。有效量可以一次或多次给药、应用或剂量。
B.常规方法本发明的基础是意外发现AAV载体介导的GDNF基因传递以延迟方式逆转多巴胺能(DA)神经元的进行性退化，同时保存功能性黑质纹状体的通路。如在实施例中特别描述，帕金森氏病的可接受的动物模型接受表达FLAG肽标记的GDNF(AAV-GDNFflag)或β-半乳糖苷酶(AAV-LacZ)的AAV载体注射到病变纹状体中。FLAG免疫染色证明GDNFflag的逆向转运到黑质(SN)。在AAV-GDNFflag组中，纹状体中酪氨酸羟化酶(TH)-阳性DA纤维的密度和SN中的TH-阳性或霍乱毒素B亚单位(CTB，神经元示踪物)-标记的神经元的数量比AAV-LacZ组明显的增加。与对照组相比，AAV-GDNFflag组纹状体中多巴胺水平及其代谢物显著高于对照组。AAV-GDNFflag注射后观察到一致的解剖学的和生物化学的改变，显著的行为恢复。这些数据出乎意料地显示应用以AAV为基础的传递系统延迟传递的GDNF基因即使是在进行性退化开始以后也是有效的。
因此，本发明提供治疗神经退行性疾病和其它神经损伤已经发生后的神经疾病的方法。在优选实施方案中，神经损伤是由于帕金森氏病或损害或非正常功能的多巴胺能的神经细胞。
因此，本发明可以用于将编码GDNF多肽的多核苷酸传递给患有任何严重神经退行性疾病的患者，包括但不限于，帕金森氏病(PD)、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(ALS)、癫痫症、阿尔茨海默氏病等。此外，本发明可以用于将GDNF传递给以下疾病患者由于暂时的或永久的血流向部分神经系统的停止引起的神经损伤，如中风；或由于接触神经毒素引起的神经损伤，如癌症的化疗剂紫杉醇、顺式铂氨或长春花新碱和AIDS化疗剂ddI或ddC，以及慢性代谢性疾病引起的神经损伤，如糖尿病或肾功能疾病。
如上解释，GDNF是可以由神经胶质细胞鉴别出或获得的蛋白质并具有神经营养的活性。更详细地说，GDNF是多巴胺能的神经营养蛋白质，其特征部分在于它能增加黑质多巴胺能神经元的胚胎前体吸收多巴胺，此外它能促进副交感神经和交感神经细胞的存活。
GDNF是大约39kD糖基化蛋白质，天然形式以同型二聚体存在。GDNF最初翻译成pre-pro-GDNF多肽、蛋白水解处理的信号序列，分子的“前”部分导致产生GDNF的成熟形式。人和啮齿类动物中，单一基因产生可变剪接的形式。参见例如，美国专利号6,362,319。两种形式包含一致的信号肽序列和一致的蛋白水解处理序列。蛋白水解裂解产生相同成熟的134氨基酸残基形式。因此，用于本发明AAV载体的GDNF多核苷酸可以编码任一或两种形式，可以编码完整的pre-pro-分子、pre-分子、pro-分子、成熟的GDNF多肽、或这些形式如上定义的生物学活性变体。
已知许多GDNF多核苷酸和氨基酸序列。三种有代表性的哺乳动物GDNF序列描述于本文的图11、12和13。人GDNF核苷酸和氨基酸序列特别表示于图11(SEQ ID NO1和2)。大鼠GDNF核苷酸和氨基酸序列表示于图12(SEQ ID NO3和4)，小鼠GDNF核苷酸和氨基酸序列表示于图13(SEQ ID NO6和7)。大鼠和人蛋白质之间的同源度是大约93％，所有哺乳动物GDNF具有相似的高度同源度。本领域已知另外的GDNF核苷酸和氨基酸序列。参见例如，美国专利号6,221,376和6,363,319，和Lin等，Science(1993)2601130-1132(大鼠和人的序列)，以及NCBI登录号AY052832、AJ001896、AF053748、AF063586和L19063(人序列)；NCBI登录号AF184922、AF497634、X92495、NM019139(大鼠序列)；NCBI登录号AF516767(大熊猫序列)；NCBI登录号XM122804、NM010275、D88351S1、D49921、U36449、U37459、U66195(小鼠序列)；NCBI登录号AF469665(日本(NipponiaNippon)序列)；NCBI登录号AF106678(Macaca mulatta序列)；以及NCBI登录号NM131732和AF329853(斑马鱼(zebrafish)序列)。如上解释，任何这些序列及其变体(如和这些序列基本同源的和功能相当的序列)可用于本发明方法。
AAV-传递GDNF多核苷酸的功效可以用任何本领域已知的多种上述疾病的动物模型测试。例如，帕金森氏病的最广泛应用的动物模型通常通过给予毒素来复制多巴胺能神经元的神经退行性病变。单侧注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)到小鼠或大鼠的黑质中导致同侧纹状体和黑质致密部神经元损失，对侧半球很少改变。同样地，脱氧麻黄碱诱导的神经毒素导致多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元的神经退行性病变，本领域技术人员认为它与人类疾病紧密相连。治疗药物的功效可以通过应用脱水吗啡诱导旋转行为的行为结果来评价。
另一个帕金森氏病模型是用神经毒素N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)来构建。MPTP给予哺乳动物，如小鼠、大鼠和猴。将MPTP给予猴的结果是不仅损失黑质致密部和纹状体中的多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元，还在行为上与人帕金森氏病患者表现相似，如运动不能和姿势僵硬。参见例如，美国专利号6,362,319。
对比上述帕金森氏病的动物模型，许多近交品系小鼠的获得证明多巴胺能细胞数量是逐步下降的。例如，D2受体缺陷小鼠可以通过同源重组产生，其行为特征类似其患有帕金森氏病患者。Fitzgerald等，(1993)Brain Res.608247-258。第二个实施例是振动(weaver)突变小鼠中脑的多巴胺能神经元的数量随时间逐步下降直到40％。Verina等，(1997)Exp.Brain Res.1135-12；Adelbrecht等，(1996)Mol.Brain Res.43291-300；Mitsumoto等，(1994)Science2651107-1110。
本实施例应用了Sauer和Oertel部分PD模型(Sauer和Oertel，Neuroscience(1994)59401-415)。在这个模型中，层内注射6-OHDA诱导开始于损害后1-2周的DA神经元进行性逆行性变性并持续8-16周。这种正在进行的DA神经元的损耗与PD的病程更相似，并且作为用于治疗的研究的动物模型比完全模型更适合，其构建破坏中前脑内侧束，因此引起DA神经元的迅速退化。在下面详细的实验中，在载体注射前大鼠表现出一致的行为缺陷。脱水吗啡诱导旋转的外观通常是在纹状体多巴胺量消耗≥90％才表现出来(Hudson等，Brain Res.(1993)626167-174)。但是，对PD患者和动物模型的研究表明可能存在比多巴胺暗示的水平更多的存活的DA神经元(Javoy-Agid等，Neuroscience(1990)38245-253；Fearnley和Lees，Brain(1991)1142283-2301；Schulzer等，Brain(1994)117509-516)。在本文使用的模型中，CTB-阳性神经元在SN损伤侧的数量在损伤4周后是对侧值的28.9％。这与以前用荧光金(FG)-逆行标记证明的28.8％(损伤35天后)(Kozlowski等，Exp.Neurol.(2000)1661-15)或34％(损伤4周后)(Sauer和Oertel，Neuroscience(1994)59401-415)的损伤的SN中FG-阳性细胞的研究是一致的。此外，大部分CTB-标记的神经元是TH-阳性，表明黑质纹状体投射的部分在AAV载体注射时保持完整的。尽管不希望受特定理论的限制，还是认为完整的黑质纹状体投射和DA神经元的残余部分可以作为GDNF基因传递后再生和功能恢复的基础。
描述了其它神经退行性疾病的动物模型，其可用于在除了PD外的神经退行性疾病的治疗中评价AAV传递GDNF多核苷酸的治疗功效。例如，Martin等，(1995)Brain Res.683172-178描述了癫痫症的动物模型，Matheson等，(1997)NeuroReport81739-1742和Oppenheim等，(1995)Nature373344-346描述了由物理性损伤导致的神经退行性病变的模型，以及Sagot等，(1996)J.Neurosci.162335-2341描述了运动神经元退化的动物模型。
包含GDNF编码序列的重组AAV病毒体可以应用以下充分描述的本领域公认的技术产生。野生型AAV和辅助病毒可以用于提供产生rAAV病毒体的必要的复制功能(参见例如，美国专利号5,139,941)。或者，包含辅助功能基因的质粒结合一个众所周知的辅助病毒感染可用作复制功能来源(参见例如，美国专利号5,622,856和美国专利号5,139,941)。同样地，包含附属功能基因的质粒可以结合野生型AAV感染使用，以提供必要的复制功能。当与rAAV病毒体联合应用时，这三种方法都足以产生rAAV病毒体。本领域众所周知的其它方法也可以由技术人员用来产生rAAV病毒体。
在本发明的优选实施方案中，三重转染方法(详细描述于美国专利号6,001,650)用于产生rAAV病毒体，因为该方法不需要应用传染性辅助病毒，在没有任何可检测的辅助病毒存在下，启动rAAV病毒体产生。这是通过三种载体用于rAAV病毒体的产生来实现AAV辅助功能载体、附属功能载体、以及rAAV表达载体。但是本领域的技术人员意识到，这些载体编码的核酸序列可以以不同结合的两个或多个载体提供。
如本文解释，AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即rep和cap)，其反式作用用于生产性AAV复制和包衣壳。优选AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体产生，不产生任何可检测的wtAAV病毒体(即，AAV病毒体包括功能性rep和cap基因)。所述载体的一个实例pHLP19描述于美国专利号6,001,650。AAV辅助功能载体的rep和cap基因可以由任何已知AAV血清型衍生，如上述解释。例如，AAV辅助功能载体可以具有由AAV-2衍生的rep基因和由AAV-6衍生的cap基因；本领域的技术人员可以意识到可能有其它rep和cap基因组合，限定特征是有能力支持rAAV病毒体产生。
附属功能载体编码核苷酸序列用于AAV赖以复制的非AAV衍生病毒和/或细胞功能(即“附属功能”)。附属功能包括AAV复制需要的功能，包括但不限于与AAV基因转录活化有关的部分、时期专一的AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成、以及AAV衣壳的组装。以病毒为基础的附属功能可由任何众所周知的辅助病毒如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和牛痘病毒衍生。在优选实施方案中，使用附属功能质粒pLadeno5(关于pLadeno5详述于美国专利号6,004,797)。该质粒提供用于AAV载体产生的全套腺病毒附属功能，但是缺少形成能复制的腺病毒必须的成分。
为了更进一步理解本发明，下面提供了关于重组AAV表达载体、AAV辅助和附属功能、包含AAV病毒体的组合物、以及病毒体的传递的更详细的讨论。
重组AAV表达载体重组AAV(rAAV)表达载体应用已知技术构建，以便至少提供在转录方向上有效连接成分、控制元件(包括转录起始区域)、目的GDNF多核苷酸以及转录终止区域。控制元件选择在哺乳动物肌肉细胞中有功能的。包含有效连接成分的最终构建物以功能性AAV ITR序列为边界(5’和3’)。
AAV ITR区域的核苷酸序列是已知的。参见例如，Kotin，R.M(1994)Human Gene Therapy5793-801；K.I.“细小病毒及其复制”Fundamental Virology，第2版，(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑)(AAV-2序列)。用于本发明载体的AAV ITR不需要有野生型核苷酸序列，并且是可以改变的，例如，核苷酸的插入、缺失或取代。此外，AAV ITR可由任何多种AAV血清型衍生，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8等。此外，AAV表达载体侧接选择核苷酸序列的5’和3’ITR的不必一致或由相同的AAV血清型分离株衍生，只要它们功能是想要的，即允许由宿主细胞基因组或载体切除和挽救在目的序列，并且当AAV Rep基因产物存在于细胞中时允许整合DNA分子进入到受体细胞基因组。
用于AAV载体的合适的GDNF多核苷酸分子的大小是小于大约5kb。选定的多核苷酸序列与指导在患者体内转录或其表达的控制元件有效连接。所述控制元件可以包括通常与选择基因连接的控制序列。或者，可以使用异源控制序列。可用的异源控制序列通常包括那些由哺乳动物或病毒基因的编码序列衍生的。实例包括，但不限于，神经元-特异性烯醇化酶启动子、GFAP启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，本文也使用由非病毒基因衍生的序列，如鼠科的金属硫蛋白基因。所述启动子序列可由例如Stratagene市售获得(San Diego，CA)。
具有以AAV ITR为边界的目的GDNF多核苷酸分子的AAV表达载体可以通过直接插入选定的序列到从其切除AAV主要可读框(ORF)处的AAV基因组中。AAV基因组的其它部分也可以缺失，只要保留足够部分ITR以允许复制和包装功能。所述构建物可以应用本领域众所周知的技术来设计。参见例如，美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公开号WO92/01070(1992年1月23日公开)和WO93/03769(1993年3月4日公开)；Lebkowski等，(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等，(1990)Vaccines 90(Cold Spring HarborLaboratory Press)；Carter(1992)Current Opinion in Biotechnology3533-539；Muzyczka(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol15897-129；Kotin(1994)Human Gene Therapy5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy1165-169；以及Zhou等，(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
或者，AAV ITR可以由病毒基因组或由包含它的AAV载体切出获得，所述AAV载体包含相同的和应用标准连接技术将其与存在于另一个载体的选定核酸构建物的5’和3’端融合，例如那些描述于Sambrook等，同上的技术。例如，可在20mM Tris-Cl pH7.5、10mMMgCl2、10mM DDT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl，和40μMATP、0.01-0.02(Weiss)单位T4 DNA连接酶在0℃(用于“粘性末端”连接)或1μM ATP、0.3-0.6(Weiss)单位T4 DNA连接酶在14℃(用于“平端”连接)下完成连接。分子间的“粘性末端”连接通常是在30-100μg/ml总DNA浓度(5-100nM总的终浓度)下进行。包含ITR的AAV载体描述于例如，美国专利号5,139,941。其中特别介绍了几种AAV载体，其可从美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)中可获得，保藏号为53222、53223、53224、53225和53226。
此外，嵌合基因可以合成产生，包括安排一个或多个选定的核酸序列5’和3’端的AAV ITR序列。可以使用哺乳动物肌肉细胞中用于表达嵌合基因序列的优选密码子。完全嵌合序列由通过标准方法制备的重叠寡聚核苷酸装配。参见例如，Edge(1981)Nature292756；Nambair等，(1984)Science2231299；Jay等，(1984)J.Biol.Chem(1984)2596311。
关于本发明的目的，用于从AAV表达载体产生rAAV病毒体的合适的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，它们可以是或已经是用作异源DNA分子的受体并能够在悬浮培养生长。该术语包括已经转染的原始细胞的子代。因此，本文使用的“宿主细胞”通常是指经外源DNA序列转染的细胞。稳定的人细胞系的细胞293(通过例如美国典型培养物保藏中心保藏号ATCC CRL1573容易获得)是本发明的实践中优选的。详细地说，人细胞系293是用腺病毒5型DNA片段(Graham等，(1977)J.Gen.Virol.3659)转化的人胚肾细胞系，并表达腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等，(1979)Virology94460)。所述293细胞系是容易转染的，并提供特别方便的产生rAAV病毒体的平台。
AAV辅助功能包含上述AAV表达载体的宿主细胞必须有能力提供AAV辅助功能，为了复制和使侧接AAV ITR的核苷酸序列包衣壳以产生rAAV病毒体。AAV辅助功能通常是可以表达产生AAV基因产物的AAV-衍生的编码序列，AAV基因产物再反式作用用于生产性AAV复制。本文使用AAV辅助功能以补充AAV表达载体失去的必要的AAV功能。因此，AAV辅助功能包括一个或两个AAV主要ORF，称作rep和cap编码区域，或其功能性同系物。
“AAV rep编码区域”是指本领域公认的编码复制蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV基因组的区域。这些Rep表达产物拥有多种功能，包括识别、结合并切断AAV DNA复制的起始点、DNA解旋酶活性和调节AAV(或其它异源的)启动子转录。Rep表达产物共同需要用于复制AAV基因组。AAV rep编码区域的描述参见例如，Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.15897-129；和Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy5793-801。AAV rep编码区域的合适同系物包括也是已知的介导AAV-2DNA复制的人疱疹病毒6(HHV-6)rep基因(Thomson等，(1994)Virology204304-311)。
“AAV cap编码区域”是指本领域意公认的编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3或其功能性同系物的AAV基因组的区域。这些Cap表达产物提供用于包装病毒基因组共同需要的包装功能。关于AAV cap编码区域的描述参见例如，Muzyczka，N.和Kotin，R.M.(同上)。
AAV辅助功能通过用AAV辅助构建物在用AAV表达载体转染宿主细胞之前或同时导入宿主细胞。因此，AAV辅助构建物提供至少瞬时表达AAV rep和/或cap基因以补充失去的生产性AAV感染必须的AAV功能。AAV辅助构建物缺少AAV ITR并且不能自我复制和包装。
这些构建物可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒体的形式。参见例如，Samulski等，(1989)J.Virol.633822-3828；以及McCarty等，(1991)J.Virol.652936-2945中，描述了许多AAV辅助构建物，例如通常使用的编码Rep和Cap表达产物的质粒pAAV/Ad和pIM29+45。参见例如，美国专利号5,139,941中描述了编码Rep和Cap表达产物的许多其它载体。
AAV表达载体和AAV辅助构建物可以构建成包含一个或多个可随意选择的标记。合适的标记包括当细胞培养在合适的选择性培养基中，使用包含可选择标记的核酸构建物转染的细胞赋予抗生素抗性或敏感性、赋予颜色或改变其抗原特性的基因。在本发明的实践中可用的多种可选择的标记基因包括潮霉素B抗性基因(编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH))，通过赋予抗G418抗性可以筛选哺乳动物细胞(可由Sigma获得，St.Louis，Mo.)。本领域的技术人员知道其它合适的标记。
AAV附属功能宿主细胞(或包装细胞)必须也是具有提供非AAV-衍生功能或“附属功能”的能力，生产rAAV病毒体。附属功能是非AAV-衍生的病毒和/或细胞的功能，依靠该功能AAV可以复制。因此，附属功能至少包括那些AAV复制需要的非AAV蛋白质和RNA，包括那些涉及AAV基因转录的活化、时期专一的AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳装配。以病毒为基础的附属功能可以由任何已知的辅助病毒衍生的。
具体地说，附属功能可以通过本领域技术人员已知的方法导入并继而在宿主细胞中表达。通常，附属功能通过用无关的辅助病毒感染宿主细胞来提供。已知许多合适的辅助病毒，包括腺病毒；疱疹病毒如单纯疱疹病毒1和2型；和牛痘病毒。本文还使用非病毒附属功能，例如通过应用任何不同的已知因子使细胞同步提供的那些。参见例如，Buller等，(1981)J. Virol.40241-247；McPherson等，(1985)Virology147217-222；Schlehofer等，(1986)Virology152110-117。
或者，附属功能可以应用以上定义的附属功能载体提供。参见例如，美国专利号6,004,797和国际公开号WO01/83797。提供附属功能的核酸序列可以由天然来源获得，如由腺病毒体的基因组获得，或应用本领域已知的重组或合成方法来构建。如上解释，证明附属辅助功能不需要完全补充腺病毒基因。具体地说，没有DNA复制和晚期基因合成能力的腺病毒突变体证明允许AAV复制。Ito等，(1970)J.Gen.Virol.9243；Ishibashi等，(1971)Virology45317。同样，在E2B和E3区域内的突变证明支持AAV复制，表明E2B和E3区域可能不涉及提供附属功能。Carter等，(1983)Virology126505。但是，E1区域缺陷或E4区域缺失的腺病毒不能支持AAV复制。因此，E1A和E4区域可能是AAV复制直接或间接需要的。Laughlin等，(1982)J.Virol.41868；Janik等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA781925；Carter等，(1983)Virology126505。其它特征性Ad突变体包括E1B(Laughlin等，(1982)，同上；Janik等，(1981)，同上；Ostrove等，(1980)Virology104502)；E2A(Handa等，(1975)J.Gen.Virol.29239；Strauss等，(1976)J.Virol.17140；Myers等，(1980)J.Virol.35665；Jay等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA782927；Myers等，(1981)J.Biol.Chem.256567)；E2B(Carter，腺病毒相关病毒辅助功能，I CRC Handbook ofParvoviruses(P.Tijssen编辑，1990))；E3(Carter等，(1983)，同上)；以及E4(Carter等，(1983)，同上；Carter(1995))。尽管通过具有E1B编码区域突变的腺病毒提供的附属功能的研究产生不一致的结果，但是Samulski等，(1988)J.Virol.62206-210最近报道E1B55k是AAV病毒体产生所需要的，而E1B19k不是。此外，国际公开WO97/17458和Matshushita等，(1998)Gene Therapy5938-945描述了编码不同Ad基因的附属功能载体。
特别优选的附属功能载体包括腺病毒VARNA编码区域、腺病毒E4 ORF6编码区域、腺病毒E2A 72 kD编码区域、腺病毒E1A编码区域、缺少完整的E1B55k编码区域的腺病毒E1B区域。所述载体描述于国际公开号WO01/83797。
作为用辅助病毒感染宿主细胞或用附属功能载体转染宿主细胞的结果，附属功能表达反式激活AAV辅助构建物以产生AAV Rep或Cap蛋白。Rep表达产物从AAV表达载体中除去重组DNA(包括目的DNA)。Rep蛋白还用于复制AAV基因组。表达的Cap蛋白组装成衣壳，并将重组AAV基因组包装到所述衣壳中。因此，接着生产性AAV复制，并将DNA包装成rAAV病毒体。
重组AAV复制后，rAAV病毒体可用多种常规的纯化方法从宿主细胞中纯化，例如，柱层析、CsCl梯度等。例如，可以使用多个柱纯化步骤，如通过阴离子交换柱、亲合柱和/或阳离子交换柱纯化。参见例如，国际公开号WO02/12455。此外，如果用感染来表达附属功能，那么残余的辅助病毒可用已知方法灭活。例如，腺病毒可通过加热到大约60℃如20分钟或更长时间来灭活。由于AAV是对热非常稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的，所以这样的处理仅对辅助病毒有效的灭活。
所得的包括目的GDNF核苷酸序列的rAAV病毒体之后可以利用下述技术用于基因传递。
组合物组合物包括足够的遗传物质以生产治疗有效量的目的GDNF，即足够减少或改善所述疾病的症状的量或足够获得想要的益处的量。该组合物也包含药学上可接受的赋形剂。所述赋形剂包括任何其本身对接受所述组合物的个体不产生有害抗体的药用物质，并且使用时可以没有不适当的毒性。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，山梨糖醇、任何不同TWEEN化合物、液体例如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可以包括，例如无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；有机酸盐如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物等，可以存在于所述介质中。药学上可接受的赋形剂彻底的讨论可在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中获得。
一个特别有用的制剂包括重组AAV病毒体和一个或多个二羟基的或多羟基的醇，以及任选去污剂如山梨聚糖酯。参见例如，国际公开号WO00/32233。
根据本说明书的教导，本领域技术人员是显而易见的是，可以经验性确定必须加入的病毒载体的有效量。有代表性的剂量在下面详述。在治疗过程中可以一剂性、连续或间断地给药。测定最有效的平均值和给药剂量的方法是本领域技术人员众所周知的，并随病毒载体、治疗的组合物、靶细胞、以及患者而改变。可以用治疗医师选择的剂量水平和模式来完成单次或多次给药。
可以理解通过传递重组病毒体表达一个以上转基因。或者，如本文描述也可以将分别表达一个或多个不同转基因的载体传递到CNS。此外，还企图通过本发明的方法传递所述病毒载体联合其它合适的组合物和疗法。例如，可以通过共同给予表达GDNF到CNS(例如，到纹状体尾状核或壳核)中的重组AAV病毒体和其它药物如AADC、多巴胺前体(例如，左旋多巴)、多巴胺合成抑制剂(例如，卡比多巴)、多巴胺代谢抑制剂(例如，MaOB抑制剂)、多巴胺兴奋剂或拮抗剂可以先于或接着或同时与编码GDNF的重组病毒体给药来治疗帕金森氏病。例如，编码AADC的基因可以与编码GDNF的基因一起给药到CNS。同样，左旋多巴和任选的卡比多巴可系统给药。这样，显然通过能将左旋多巴转换成多巴胺的AADC可恢复PD患者中自然失去的多巴胺。转基因在诱导启动子的控制下，为了调节所述转基因的表达可以给予某些系统传递的化合物如幕黎甾酮、松甾酮、四环素或aufin。
AAV病毒体的传递应用体内或体外(也称活体外)转导技术可以将重组AAV病毒体导入CNS细胞以治疗已经存在的神经元损伤。如果在体外转导，想要的受体细胞可以从患者中取出，用rAAV病毒体转导并再引入到患者。或者，可以使用同系或异种细胞，那些细胞在患者中不会产生不适当的免疫反应。此外，神经祖细胞可以在体外转导并随后传递到CNS。
描述了合适的转导细胞传递和导入到患者的方法。例如，通过混合重组AAV病毒体与细胞以在合适的介质中转导，细胞可在体外转导，包含目的DNA的那些细胞可以应用常规技术如DNA印迹和/或PCR，或应用可检测的标记来筛选。然后可以将转导细胞配制到药用组合物中，如上所述，通过如下所述的多种技术将所述组合物以一个剂量或多剂量导入到患者中。
对于体内传递，可将rAAV病毒体配制到药用组合物中，并且可以直接以规定方式给予一个剂量或多个剂量。治疗有效量可包括大约从106到1015的rAAV病毒体，更优选107到1012，甚至更优选大约108到1010的rAAV病毒体(或病毒基因组，也称“vg”)，或在这些范围内的任何值。通常，可传递0.01-1ml的组合物，优选0.01-约.5ml，优选大约0.05-0.3ml，如0.08、0.09、0.1、0.2等，在这些范围内的任何整数的组合物都可传递。
体外转导的重组AAV病毒体或细胞可通过应用本领域已知的神经外科学的技术如立体定位注射(参见例如，Stein等，J.Virol 733424-3429，1999；Davidson等，PNAS 973428-3432，2000；Davidson等，Nat.Genet.3219-223，1993；以及Alisky和Davidson，Hum.GeneTher.112315-2329)，用针、导管或相关的装置注射直接传递到CNS或大脑，例如脑室区，以及纹状体(例如，纹状体的尾状核或壳核)，脊髓和神经肌肉连接，或小脑小叶。由于事实上立体定位坐标不能正好对准注射位点，所以小脑注射是复杂的；在小脑小叶的大小以及它们的完全三维方向上存在着动物与动物的变异。因此，霍乱毒素亚单位b(CTb)可以用于确定注射的精确位置，并揭示注射位点可转导的神经元的集合体。可注射到分子层，浦肯野细胞层，颗粒细胞层和小脑活树的白质，但是不延伸到深层小脑核。
给药到CNS的一种模式使用强力输送系统(CED)。这样，可将重组病毒体传递到大脑大区域的许多细胞。此外，传递的载体有效地在CNS细胞(例如，神经元或神经胶质细胞)中表达转基因。任何强力输送装置可适用于病毒载体的传递。在优选实施方案中，该装置是渗透泵或输液泵。渗透泵和输液泵可由多个供应商处市售获得，(例如Alzet公司、Hamilton公司、Alza，Inc.、Palo Alto、California)。病毒载体通常通过下面的CED装置传递。将导管、套管或其它注射装置插入到选定患者的CNS组织中。本领域的技术人员可以容易地测定适合作为靶的CNS的常规区域。例如，当传递AAV-GDNF来治疗PD时，纹状体是大脑的靶合适区域。例如从ASI Instruments，Warren，MI可获得立体定位图和定位装置。也可用由患者大脑的CT和/或MRI成像获得的解剖图来完成定位，以帮助操纵注射装置到选定的靶位点。此外，因为本文描述的方法可以实施使得相关的较大大脑区域接受病毒载体，需要较少的灌输套管。因此外科的并发症与穿入次数有关，这个模式的传递系统比常规传递技术所见的副作用减少。关于CED传递的详细描述参见美国专利号6,309,634。
在PD的情况下，传递给证明存在黑质纹状体多巴胺能(DA)去神经的患者，例如中度到重度去神经。通常当患者表现出可见的PD症状时，就发生了中度到重度去神经，至少大约60％-70％到超过90％的现有的神经元已经失去。因此，“中度”去神经是指失去至少大约60％-70％的神经元，而“重度”去神经是指失去至少大约90％的神经元。
一种神经元失去的测量是通过CNS中多巴胺活性的水平。因此，“中度”去神经是指一个或两个纹状体半球中失去至少大约60％-70％的多巴胺含量，而“重度”去神经的反应是一个或两个纹状体半球中至少失去大约90％。为了测量多巴胺量，给予患者标记的示踪物。标记的探测说明多巴胺的活性。标记的示踪物优选可在整体动物的大脑中体内观察到的，例如，正电子放射X光断层(PET)扫描或其它CNS成像技术。用于选择示踪物的合适的标记包括任何可由光谱、光化学、免疫化学、电、光学或化学方法检测的组分。本发明有用的标记包括放射标记(例如，18F、3H、125I、35S、32p等)、酶、比色标记、荧光染色等。在优选实施方案中，标记18F和DOPA用于多巴胺活性的量化。因此，在这个实施方案中，神经元丢失程度用[18F]-氟-DOPA作为示踪物来测量。另一个多巴胺活性的测量应用标记示踪物6-[18F]-氟-L-m-酪氨酸(18F-FMT)。FMT与利用多巴胺的细胞结合。参见例如，美国专利号6,309,634测量体内多巴胺含量的方法。
神经元的再生和由此疾病的治疗也可以通过如上所述测量多巴胺的水平来监测。本文使用的疾病的治疗是指减轻或消除所述疾病的症状，以及神经元的再生。因此，可以由比较治疗前后的多巴胺的水平来衡量神经元再生。或者，用可以看到的疾病症状作为治疗的测量指标。
神经组织分析和生化分析组织可由治疗的患者获得，并用常规的程序来处理评价神经元退化、再生和分化。在本发明中，它可用于评价例如，多种纹状体和黑质(SN)的细胞，例如检测纹状体和SN的冠状切片。随着时间的过去进行测量可以表明远离载体给药位点的细胞改正的增加。
多巴胺及其代谢物HVA和DOPAC的水平可以应用以前描述的高压液相层析法(HPLC)来测定(Shen，Y.，Hum.Gene Ther.(2000)111509-1519)。尤其是如果载体编码可分泌型GDNF，也可收集CSF并用于评价蛋白质水平或酶活性。
也可通过腹膜内注射脱水吗啡-HCl测试患者的周期性转动行为。
C.实验下面是实施本发明的具体实施方案的实施例。该实施例仅提供例证性说明目的，并不是企图以任何方式来限制本发明的范围。
努力确保使用的有关数据(例如，量、温度等)的精确，但是当然允许一些实验误差和偏差。
材料和方法动物和外科准备成年雄性Wistar大鼠(重200-250g)以12h光照/黑暗循环养在随意使用食物和水的笼子内。实验依照Jichi Medical School的动物实验指导进行。按照Sauer和Oertel，Neuroscience(1994)59401-415中的描述来制备大鼠局部PD模型。简要地说，大鼠接受在左侧纹状体中立体定位注射溶于4μl的抗坏血酸盐(0.05％)中的20μg6-羟基多巴胺(6-OHDA；以游离碱计算；Sigma，St.Louis MO)，以下列坐标前后(AP)+1.0mm，中间-侧面(ML)3.0mm，背腹(DV)-4.5mm。相对于前囱和硬脑膜表面计算该立体定位坐标。4周后，动物进行脱水吗啡诱导的旋转的测试(0.1mg/kg腹膜内给药)，并且在进一步的研究中仅包括在60分钟内表现7次/分钟或更多对侧旋转的那些动物。为了评定黑质纹状体的退化程度，死前3天将神经示踪物CTB(1％蒸馏水溶液，1μl；List Bidogical Laboratories，Campbell，CA，USA)注射到纹状体两侧(n＝5，AP＝+1mm，ML＝3.0mm，DV＝-4.5mm)。这可进行反向标记6-OHDA损害后4周的SN中保持功能性投射纹状体的DA神经元亚群。PD动物模型随意接受AAV-GDNFflag(n＝32)，AAV-LacZ(n＝2)，或介质(0.1M PBS；n＝8)在三个不同位点(每个位点2μl，1013载体基因拷贝/ml)注射到左侧纹状体，应用下列坐标(AP＝+1.5mm，+1.0mm和+0.5mm；ML＝2.6mm，3.0mm和3.2mm；DV＝-4.5mm)。注射速度设定在1μl/分，在缓慢抽出前将针多停留在该处7分钟。为了评价逆向转运的GDNFflag蛋白，将一些大鼠(在每个时间点AAV-GDNFflag注射组，n＝4；AAV-LacZ注射组，n＝2)分别在AAV注射后2、4和8周处死用于组织学。载体注射后20周，大鼠随意分组并处死用于生化分析或免疫组织化学分析。在8只大鼠中，死前3天两侧注射CTB到纹状体。
行为测试AAV载体注射后，每2周通过腹膜内注射脱水吗啡-HCl(0.1mg/kg)来测定大鼠旋转行为。如以前所述(Shen，Y.，Hum.Gene Ther.(2000)111509-1519)，在观察期≥60分钟期间计算完全身体转动的总数。自发的肢体使用每4周应用圆筒实验方法评价(Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700)。将大鼠置于一个足够自由运动的大的透明玻璃筒内。当它们用后腿站起10次以后，期间至少一只爪子在圆筒壁上，计算两只前爪接触圆筒壁的数目至少20次。对侧的前爪接触的数据用总数的百分比表示。
生化分析在戊巴比妥钠麻醉下杀死大鼠，立即将脑解剖并置于干冰上。用锋利的不锈钢管在纹状体两侧打孔。湿的组织样品称重并贮藏于-80℃直到后面分析使用。用如以前所述(Shen，Y.，Hum.Gene Ther.(2000)111509-1519)的高压液相层析(HPLC)来评价多巴胺及其代谢物HVA和DOPAC的水平。
免疫组织化学在深度麻醉下用PBS灌输大鼠接着用冰冷的4％PEA。解剖大脑，然后在4％PEA中后-固定4小时。纹状体和SN的冠状切片(30μm)在0.3％H2O2的PBS中处理30分钟，并用3％胎牛血清(FBS)的PBS/0.1％Triton X-100封闭1小时。然后将切片用TH(1∶1000，小鼠抗-TH单克隆抗体；Chemicon，Temecula，CA，USA)，CTB(1∶10000，山羊抗CTB抗血清；List Biologic，Campbell，CA，USA)或FLAG(1∶1000，抗-FLAGM2抗体，Sigma，St.Louis，MO)的第一抗体在4℃孵育过夜。接着用生物素酰化的第二抗体(抗第一抗体)在室温下孵育1小时(1∶400，SantaCruz，CA)。用抗生物素蛋白-生物素酰化的过氧(化)物酶复合物方法(Vectastain ABC试剂盒；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)以3，3-二氨基联苯胺(DAB)作为色素原来显色切片。
对于FLAG/TH双重免疫荧光染色，切片继续在包含5％正常山羊血清的PBS封闭溶液中在室温下孵育1小时，单克隆小鼠抗-FLAG抗体(1∶250，Sigma)和多克隆兔抗-TH抗体(1∶500)在4℃过夜，罗丹明-偶联的山羊抗-小鼠IgG(1∶200；Santa Cruz，Santa Cruz，CA)和FITC-偶联的山羊抗-兔IgG(1∶200；Santa Cruz，Santa Cruz，CA)在室温下2小时。检测切片并在聚焦扫描激光显微镜下观察(TCS NT；Leica，Heidelberg，Germany)。对于CTB/TH双重免疫荧光染色，使用抗-CTB(1∶5000，抗CTB山羊抗血清)和小鼠抗-TH(1∶500)抗体。
用于TH-阳性神经元和CTB-标记神经元的定量分析，计算300-μm间隔贯穿SN两侧的切片。用NIH Image 1.59软件来测量在每隔300μm贯穿纹状体的嘴尾切片上TH-IR纤维的光密度(Kozlowski等，Exp.Neurol.(2000)1661-15)。
统计学分析结果表示为平均值±s.e.m.。应用重复-测量方差分析(ANOVA)接着Tukey真实差异显著性(HSD)测验(StatView 5.0软件)进行数据的统计学分析。
实施例1重组AAV载体的构建表达FLAG-标记的GDNF(AAV-GDNFflag，图1a)或β-半乳糖苷酶(AAV-LacZ，图1b)的重组AAV载体如下构建。6-OHDA病变或注射脱水吗啡引起内源表达GDNF(Ohta等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)27218-22；Zhou等，Neuroreport(2000)113289-3293)，区别转基因衍生的GDNF和内源GDNF对评价基因传递的作用是必要的。因此，构建了表达FLAG-标记的GDNF的AAV载体。
AAV载体质粒pAAV-GDNFflag是由以前描述的pAAV-GDNF质粒衍生的(Fan等，Neurosci.Lett.(1998)24861-64)。这个质粒包含FLAG序列(DYKDDDDK(SEQ ID NO5))羧基末端标记的小鼠GDNFcDNA(Matsushita等，Gene(1997)203149-157)，在人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子下，在AAV-2基因组的反向末端重复区(ITR)之间的人促生长素的第一个内含子和猿病毒40(SV40)多腺苷酸化信号序列。
以前描述了(Fan等，Neurosci.Lett.(1998)24861-64)AAV载体质粒pAAV-LacZ，辅助质粒pHLP19和pladenol。Pladeno5描述于美国专利号6,004,797。应用磷酸钙共沉淀法将载体质粒和辅助质粒瞬时转染接近融合的人293细胞。转染72小时后，收获细胞并通过三次冷冻和解冻循环使细胞溶解。用如以前所述的(Masushita等，GeneTherapy(1998)5938-945)两次CsCl顺序连续梯度来提纯AAV载体(AAV-GDNFflag和AAV-LacZ)。通过定量DNA斑点杂交分析来评价，AAV-GDNFflag的最终粒子滴度是1.6×1013载体基因组拷贝数/ml，AAV-LacZ的最终粒子滴度是2.1×1013载体基因组拷贝数/ml。
实施例2
体外表达AAV-GDNFflag为了检测体外表达的GDNFflag融合蛋白，将293细胞用AAV-GDNFflag或AAV-LacZ转导(5000载体基因组拷贝数/细胞)。转导后36小时，通过15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞溶解产物并转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Bedford，MA，USA)。剩余的蛋白质-结合位点用5％脱脂奶粉TBS在室温下封闭1小时。将膜用小鼠抗-FLAG M2抗体(1∶1000，Sigma，St Louis，MO)或兔抗-GDNF抗体(1∶2000，SantaCruz，Santa Cruz，CA)在4℃孵育过夜，接着用缀合辣根过氧化物酶的第二抗-小鼠或抗-兔抗体(1∶2500，Amersham，Arliongton Heights，IL)在室温下孵育2小时。用ECL系统来检测化学发光的信号(Amersham)。
在蛋白质印迹分析上，通过抗-GDNF和抗-FLAG抗体在AAV-GDNFflag-转导的293细胞的溶解产物中检测GDNFflag融合蛋白。在AAV-LacZ转导的细胞的溶解产物中没有检测到信号(图2)。
为了鉴定AAV-载体衍生的GDNFflag融合蛋白的生物活性，制备了大鼠胎儿DA神经元的原代培养物。简单地说，从14天Wistar大鼠胚胎中解剖出腹侧中脑，切碎并用0.25％胰酶的PBS孵育15分钟。将分离的细胞以初始密度为105个细胞/皿铺到35mm多聚-L-赖氨酸预包被的平皿中，并用补充B27(Gibco BRL)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、25mM KCl和2mM谷氨酰胺的神经基本-SFM培养基(Gibco BRL)在37℃孵育。在AAV载体处理平皿中，用AAV-GDNFflag或AAV-LacZ(5000载体基因组拷贝数/细胞)感染培养物。阳性对照皿或阴性对照皿中，向培养物加入终浓度为10ng/ml的重组人GDNF(rhGDNF，Santa Cruz)或BSA。培养基每隔3天更换一半新鲜的培养基，rhGDNF或BSA保持相同浓度。9天后，用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞30分钟，并进行免疫细胞化学染色以检测GDNFflag和TH的表达。如描述(Sawada等，J.Neurochem.(2000)741175-1184)计算TH-IR细胞存在的数目。
酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色显示在AAV-GDNFflag转导的培养物中存活的TH-免疫反应性(TH-IR)的细胞比在AAV-LacZ转导的培养物中多两倍(图3)。这些结果证实AAV-GDNFflag能推动生物活性GDNFflag融合蛋白体外产生，FLAG肽的添加不能改变GDNF对DA神经元的神经营养性效应，允许通过抗-FLAG抗体鉴定外源表达GDNFflag融合蛋白。
实施例3在纹状体中表达GDNFflag并逆向转运到SN用抗-FLAG抗体在AAV-GDNFflag注射2、4、8和20周后检测纹状体中GDNFflag转基因的表达。在贯穿纹状体的注射位点周围检测FLAG免疫反应性(FLAG-IR)细胞。这些细胞显示出典型形态学的中等刺状神经元(图4a和4b)。此外，在纹状体内注射AAV-GDNFflag 4周和8周后在同侧SN的致密部用抗-TH和抗-FLAG抗体双重免疫荧光染色检测双重阳性细胞(图4c-4e)。注射AAV载体8周后，13.1±2.4％(n＝4)的TH-IR细胞重叠分散在SN的FLAG-IR细胞，表明有些转基因GDNFflag得以进入到DA神经元。在纹状体或SN的对侧没有观察到FLAG-IR细胞，在AAV-LacZ或载体注射的大鼠中的这些区域也没有。在AAV-LacZ注射的大鼠中，尽管在注射后2-20周在纹状体中检测到X-gal阳性细胞，但是没能在SN中发现β-半乳糖苷酶信号。
这些结果表明AAV-GDNFflag能够促进GDNFflag融合蛋白在纹状体中的表达，并且GDNFflag融合蛋白而不是AAV载体本身能从纹状体末端逆向转运到SN中的DA神经元。
实施例4恢复纹状体中DA神经支配为了测定AAV-GDNFflag能否恢复病变纹状体中DA神经元支配，注射20周后在300-μm间隔贯穿纹状体切片上检查TH-IR纤维末端的程度。在AAV-LacZ注射的大鼠中，病变纹状体中TH-IR纤维的密度显著减少至仅仅13.5±3.0％的完整侧(图5a和5c)。相反，注射AAV-GDNFflag的大鼠中，TH-IR纤维的密度显著增加，达到接近48.7±7.3％的完整侧(图5b、5d和5e)。保持的TH-IR纤维分布在注射位点周围，说明TH-IR纤维的神经支配通过GDNFflag在纹状体中表达而恢复。
CTB反向-标记在评价黑质纹状体的功能上比单独用抗-TH免疫染色更精确，因为只有CTB标记的SN神经元保持功能性黑质纹状体投射，而抗-TH免疫染色只证明在神经元体中存在TH酶。在AAV-GDNFflag组，比SN中存在更多的CTB标记的DA神经元，说明在纹状体中表达的GDNFflag能够恢复DA神经元并促进纹状体的功能性投射。此外，纹状体中高水平的多巴胺及其代谢物支持通过纹状体内注射AAV-GDNFflag成功的恢复黑质纹状体系统，说明在黑质纹状体系统中长期保持多巴胺的活性。
实施例5黑质纹状体投射的保持霍乱毒素亚单位B(CTB，神经元示踪物)(Leman等，Brain Res.Brain Res.Protoc.(2000)5298-304)注射到纹状体的两侧以评价剩余的黑质纹状体通路的程度。死前3天注射同样坐标的6-OHDA，逆向标记DA神经元亚群保持纹状体投射。在AAV载体处理的时间点，即6-OHDA注射后4周，受损SN中CTB-阳性神经元的数目是28.9±3.7％的完整的对侧(n＝5)。用抗-CTB和抗-TH抗体双重免疫荧光染色说明SN中大部分CTB-阳性神经元也是TH-阳性(图6)。受损侧上TH-IR神经元的百分比是34.9±2.6％(n＝4)的完整侧。这些结果说明一些部分黑质纹状体连接在受损后4周仍然保持。AAV载体注射后20周，在注射AAV-LacZ的大鼠中观察到广泛地失去TH-IR细胞(19.5±2.0％的完整侧)和CTB-阳性细胞(17.9±1.6％的完整侧)。相反，注射AAV-GDNFflag导致TH-IR神经元和CTB-阳性细胞显著增加，分别达到57.3±6.2％和50.8±8.5％的对侧(图7和8，P＜0.01)。
这些结果证明在损伤后4周纹状体内注射AAV-GDNFflag使SN中DA神经元恢复存活并促进保持黑质纹状体投射。
实施例6纹状体内注射AAV-GDNFflag后行为的恢复6-OHDA给药后4周，三组所有大鼠(AAV-GDNFflag，n＝20；AAV-lacZ，n＝16；载体；n＝8)证明在脱水吗啡诱导旋转实验和圆筒实验中相同的损害程度，说明DA损耗的水平相当。
在接受AAV-GDNFflag的大鼠中观察到脱水吗啡诱导的旋转在载体注射后4周开始减少(图9a)。该减少是逐渐进行并持续整个实验(20周)。相反，AAV-LacZ或载体注射组的大鼠在相同时期表现出相当稳定的旋转速度。
圆筒实验用于测定受损大鼠的自发的前肢使用(图9b)。AAV处理前，6-OHDA损伤后每组大鼠表现出相同显著的偏向同侧，在这个实验根据减少对侧肢的使用频率(23％-25％的总接触数)。从注射后4周观察到接受AAV-GDNFflag的大鼠显著的改进，逐渐地进步并在20周达到接近正常的水平(47％的总接触数)。相反，在接受AAV-LacZ或载体的大鼠在20周内保持相同水平的对侧肢使用。AAV-GDNFflag注射的大鼠与AAV-LacZ或载体注射的大鼠在脱水吗啡诱导旋转实验和圆筒实验上的统计学分析显示出显著的差异(P＜0.01)。
实施例7病变纹状体的多巴胺含量的保存为了检测AAV-GDNFflag注射后行为的恢复与黑质纹状体多巴胺产生是否相关，在注射后20周测定纹状体中多巴胺及其代谢物的水平，高香草酸(HVA)和3，4-二羟基苯乙酸(DOPAC)。在AAV-GDNFflag注射组(n＝8)中，纹状体受损侧的多巴胺水平是50.9±7.7％的对侧完整侧，而在AAV-LacZ注射组(n＝8)保持在11.5±4.8％的对侧(图10，P＜0.01)。此外，在AAV-GDNFflag注射组中HVA和DOPAC的水平更高。在两组之间的纹状体完整侧上没有观察到多巴胺或其代谢物的水平有显著差异。
上述实施例表明AAV载体介导的GDNF基因传递到可接受PD动物模型的纹状体中保护更晚期退化的SN神经元，并保持它们与纹状体的连接。
在本研究中，从注射后4-8周检测与AAV-GDNFflag注射侧同侧的SN细胞中的GDNFflag。应用抗-FLAG和抗-TH抗体双重免疫荧光染色确定这些SN细胞是DA细胞。AAV载体处理后8周在致密部的广泛区域观察到FLAG-IR细胞，尽管FLAG-IR细胞的百分比似乎是低的(13.1％TH-IR细胞)。GDNF表现为对DA神经元在皮摩尔范围内非常有效的作用，所以小量的GDNFflag蛋白质瞬时转运并且在死的时候通过免疫组织化学检测不到，可以保护对毒素-诱导的细胞死亡的黑质DA神经元。相反，纹状体中注射AAV-LacZ的大鼠证明在SN中没有β-半乳糖苷酶信号。与以前研究一致(Chamberlin等，Brain Res.(1998)793169-175)，AAV载体本身在中枢神经系统中不是逆向转运的，但是GDNFflag蛋白是从纹状体到在SN中DA神经元逆向转运的。GDNFflag蛋白在纹状体中的显著表达也在注射后20周检测到。GDNFflag产生的持续提供了在单独AAV载体注射后黑质纹状体系统的长期恢复。AAV-GDNFflag注射后病变纹状体中保持TH-IR的密度。
因此，纹状体中AAV-介导的GDNF基因传递作为PD和其它CNS退化疾病的神经保护的基因治疗是有效的。
因此，提供治疗神经退化疾病的新方法。尽管已经在某种程度上详细的描述了本发明的优选实施方案，但是应该理解可以进行不背离本发明权利要求定义的精神和范围的明显改变。
工业适用性本发明公开了治疗已经存在神经元损伤的患者的组合物和方法。所述组合物和方法使用以腺伴随病毒为基础的基因传递系统来传递神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)到患有神经退行性疾病如帕金森氏病患者。
序列表<110>0ZAWA，KeiyaMURAMATSU，Shin-ichi<120>用于治疗神经变性疾病的组合物和方法<130>0800-0028.40<140>未给定<141>2002-08-28<150>60/315,838<151>2001-08-29<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>633<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(633)<220>
<223>人工序列的描述人GDNF<400>1atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ctg ctc cac acc 48Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15gcg tcc gcc ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg cct ccc gag gcg ccc 96
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权利要求
1.一种组合物在治疗已经存在神经元损伤的哺乳动物患者中的应用，该应用将所述组合物给予到所述患者的中枢神经系统，其中所述组合物包含重组腺伴随病毒(AAV)病毒体，其中所述病毒体包含编码神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)多肽的多核苷酸，该多核苷酸与包括启动子的表达控制元件有效连接。
2.权利要求1的应用，其中所述患者是人。
3.权利要求1或2的应用，其中所述已经存在的神经元损伤包括中度到重度黑质纹状体多巴胺能(DA)去神经。
4.权利要求1-3任一项的应用，其中所述多核苷酸还包括位于5’位而且符合编码GDNF多肽的序列的读框的分泌序列。
5.权利要求1-4任一项的应用，其中所述多核苷酸编码人GDNF。
6.权利要求5的应用，其中所述多核苷酸编码人pre-pro-GDNF。
7.权利要求1-6任一项的应用，其中所述组合物给到所述患者的纹状体中。
8.任一项前述权利要求的应用，其中所述启动子是病毒启动子。
9.权利要求8的应用，其中所述启动子是MLP、CMV或RSV LTR启动子。
10.任一项前述权利要求的应用，其中所述重组AAV病毒体给药到所述患者的纹状体中。
11.权利要求10的应用，其中所述重组AAV病毒体利用强力输送系统(CED)给药到纹状体。
12.权利要求11的应用，其中所述给药用渗透泵完成。
13.权利要求11的应用，其中所述给药用输液泵完成。
全文摘要
本发明公开了用于治疗已经存在神经元损伤的患者的组合物和方法。所述组合物和方法使用以腺伴随病毒(AAV)为基础的基因传递系统来传递神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)到患有神经退行性病症(例如帕金森氏病)的患者。
文档编号C07K14/475GK1575340SQ0282132
公开日2005年2月2日 申请日期2002年8月29日 优先权日2001年8月29日
发明者小泽敬也, 村松慎一, 池口邦彦, 中野今治 申请人:田边制药株式会社