模块式肽基试剂的制作方法

文档序号:3552282阅读:639来源:国知局
专利名称:模块式肽基试剂的制作方法
技术领域
本发明涉及具有稳定骨架的肽,该稳定骨架易于修饰以提供多个相互作用的结构域例如抑制或结合结构域。
背景技术
基于免疫学的诊断分析的一个缺点是其依赖于抗体的使用。这些试剂,无论单克隆或多克隆,都是大型大分子多肽,它们制备昂贵且因常在保存期间变得不稳定而使许多诊断产品的保存期很短。此外,一个典型的免疫球蛋白(例如IgG)含有大量在生理学上重要但在抗原识别中却不起作用的物质(Fc区域)。这样的附加物质对许多应用都是非必需的,并会增加背景噪音、抑制扩散以及引起副反应。此外,将抗体重链和轻链结合在一起的二硫键是潜在不稳定的。这样,抗体结构(和物质)的只有一小部分是直接涉及抗原识别的,然而抗原整体却常常被制备并用于传感器或诊断装置中。
从完整抗体生产较小的Fab区域是可能的,但是Fab生产需要若干化学或酶加工步骤以及额外的蛋白纯化程序。这些加工程序会增加诊断产品的成本。
所需要的是易于合成、稳定的抗原识别元素,其涉及抗原识别的分子质量比例更高。
发明概述本发明提供易于合成的、易于修饰以包括结合结构域、抑制剂结构域、接头、标记、试剂、反应位点、催化位点的肽骨架,或试剂以及其它化学实体。
在一种实施方式中,本发明提供包含与SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的稳定分离肽。这样的稳定分离肽可以具有聚脯氨酸螺旋、短环区以及α螺旋,其中肽发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。本发明的肽是衍生自鸟胰多肽的小肽,它常比具SEQ ID NO1的肽更稳定。本发明的其它肽不如具SEQ ID NO1的肽稳定。理想的肽包括与SEQ IDNO11或14具有至少90%同一性的氨基酸序列。具有SEQ ID NO11或14的肽如上所述发生折叠,并经二硫键进一步稳定。
本发明还提供分离的编码稳定肽的核酸,该稳定肽包含与SEQ IDNO2~6、8~11或14之中任一序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。优选地,该分离的核酸编码与SEQ ID NO11或14中任一具有至少90%同一性的氨基酸序列。这样的核酸例子包括SEQ ID NO12或13。
在另一实施方式中,本发明提供包含肽骨架和相互作用的结构域的肽基试剂,其中肽骨架包含与SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。理想的肽基试剂具有肽骨架和相互作用的结构域,其中肽骨架包含与SEQ ID NO11或14具有至少90%同一性的氨基酸序列。该肽骨架可以具有聚脯氨酸螺旋、短环区和α螺旋,其中肽骨架发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。理想的肽骨架比具有SEQ ID NO1的肽更稳定。理想的肽基试剂比不具有相互作用的结构域的肽骨架更稳定。然而,某些相互作用的结构域的插入会使得肽骨架不稳定,对本领域技术人员来说这些去稳定化的肽基试剂仍然是有用的。
用于附着在,或插入,肽骨架的相互作用的结构域可以是由本领域技术人员选择的任何有用的肽或分子。相互作用的结构域的例子包括结合结构域、抑制剂结构域、抗原识别肽、接头、标记、固相支持物、和酶活性位点。本发明的一种肽基试剂具有相互作用的结构域,此处该肽包含SEQ ID NO18。
本发明还提供一种方法,包括定义含有靶蛋白上的相互作用位点的搜索范围,该肽可与靶蛋白相互作用;为该肽定义大小;为该肽的氨基酸序列中各位置定义氨基酸类别;用已定义的氨基酸类别中的各成员取代该肽序列氨基酸序列的各位置以生成包括输出肽序列集合(plurality)的输出文库文档;将输出文库文档传输给分子对接程序以使各输出肽序列集合成员与搜索范围拟合并产生靶蛋白质-肽序列拟合得分(fit score);
根据靶蛋白质-肽序列拟合得分将输出肽序列集合分级;以及展示各输出肽序列集合成员及其关联靶蛋白质-肽序列拟合得分;其中一部分输出肽序列集合能够与靶蛋白质稳定相互作用。
搜索范围可以包括靶蛋白质中各非氢原子的x-、y-、和z-坐标。具有较高靶蛋白质-肽序列拟合得分的输出肽序列常能以较高的亲和力与靶蛋白质结合。该方法可进一步包括接受输入百分数选择以将输出肽序列集合限制在一个确定的百分数;其中输入百分数选择可以限制输出文库文档的大小和文库的复杂性。各氨基酸类别可各自包括任一遗传编码的L-氨基酸、天然存在的非遗传编码L-氨基酸、合成的L-氨基酸、遗传编码氨基酸的D-对映异构体、天然存在的非遗传编码氨基酸的D-对映异构体、或合成的D-氨基酸。各氨基酸类别也可各自包括任一亲水氨基酸、疏水氨基酸、类半胱氨酸氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、极性氨基酸、芳香族氨基酸、非极性氨基酸或脂肪族氨基酸。在一种实施方式中,靶蛋白质为牛胰蛋白酶且输出肽序列之一为YKLKY(SEQ ID NO18)。
本发明还指向产生肽序列的系统,包括处理器;与处理器相连的存储器;与处理器相连的显示器;能够在处理器上执行以产生肽序列的肽序列制备组件;能够在处理器上执行以显示肽序列制备组件所用的各氨基酸残基的类别输出组件;和能够在处理器上执行以展示肽序列的肽序列输出组件。一个显示器的例子是打印机。输出类别组件能显示肽序列制备组件所用的各氨基酸残基类别。
本发明进一步提供带有与能指导机器完成某方法相关内容的机读介质,该方法包括接收包含靶位上原子坐标集合的搜索范围,肽集合能以不同的亲和力与该靶位结合;接收包括很多氨基酸的肽长度参数;接收定义的、用于沿肽长各位置拟合分析的氨基酸结构类别;生成含有输出肽序列集合的输出文库文档,该输出肽序列集合包括定义的、沿肽长各位置的氨基酸结构类别的每个氨基酸;继而翻译和旋转与搜索范围相关的肽内各位置上的氨基酸结构类别中的各成员,以随之产生带有靶位-肽序列拟合得分的肽序列;根据靶位-肽序列拟合得分将肽序列分级;以及显示具有相关肽序列的所选择的靶位-肽序列拟合得分百分比;由机读介质完成的该方法可进一步包括显示输出肽序列标记和储存搜索范围。


附图1提供SAP肽的DNA和氨基酸序列。星号表示终止密码子。密码子选择偏好E.coli。如果SAP分子由重组方法产生则使用起始甲硫氨酸。如果肽分子由化学方法产生,则可省略甲硫氨酸残基。
附图2提供最终的SAP DNA序列。为便于克隆,为附图1所示DNA序列添加了侧翼核苷酸。5′Nde I位点以下划线表示,3′Bam HI和内部Sma I位点以相同方式表示。
附图3提供SAP肽的带状图。链从左侧的末端甲硫氨酸开始,且序列延伸进入聚脯氨酸螺旋、短环结构域,并最终进入右侧的α螺旋区。肽以末端半胱氨酸为终点。
附图4提供与附图3相同视角的SAP肽分子结构,但是显示了氨基酸侧链。
附图5突出显示SAP分子中三个半胱氨酸残基的位置。可以形成二硫键使SAP肽几乎环化。末端半胱氨酸对将肽锚定在诊断装置中的固体基质上有用。
附图6提供SAP和牛胰蛋白酶间相互作用的ITC分析。SAP溶于20mM二甲基胂酸盐(pH 7.0)、20mM NaCl,终浓度为2mM。将胰蛋白酶透析至相同的缓冲液中,并以20μM的浓度用于量热计中。整个滴定过程中无明显结合。温度保持在30℃。采用每5μL注射40次,两次注射间重新平衡240秒。
附图7提供SAP-1和牛胰蛋白酶间相互作用的ITC分析。SAP-1溶于20mM二甲基胂酸盐(pH 7.0)、20mM NaCl,终浓度为1mM。将胰蛋白酶透析至相同的缓冲液中,并以20μM的浓度用于量热计中。温度保持在20℃。采用每5μL注射40次,两次注射间重新平衡240秒。
附图8提供SAP-2和牛胰蛋白酶间相互作用的ITC分析。上栏25℃下,SAP-2(1.0mM)滴定至溶于20mM、pH 7.0二甲基胂酸盐中的胰蛋白酶(20μM)的原始ITC数据。各峰显示注射产生的热量以及随后的结合反应。下栏通过相对时间来整合各注射峰产生的结合等温线。
附图9图示SAP在尿素中的解折叠。
附图10图示SAP-1在尿素中的解折叠。
附图11图示SAP-2在尿素中的解折叠。
附图12提供牛胰蛋白酶与SAP-1(实线)和SAP-2(虚线)结合(0至500秒)与解离(500至700秒)的表面等离子结合等温线。
附图13是本发明方法实施方式的流程图。
附图14是本发明方法作为产肽系统的实施方式的板块图。
附图15是本发明方法另一实施方式的流程图。
发明详述本发明提供可以向其中引入一个或多个相互作用的结构域的稳定肽骨架。这样的相互作用的结构域可以是特异结合结构域、抑制剂结构域、接头、标记、固相支持物、反应位点、催化位点、有用的化学实体及试剂。相互作用的结构域向肽骨架的附着或引入产生肽基试剂。
本发明还提供产生可用作相互作用的结构域的肽文库的方法。这些文库的范围可以从完全随机和完全指定,到靶向和部分指定,和到高度靶向和最低程度指定。
定义术语“氨基酸序列”是指肽、多肽或蛋白质分子中的氨基酸位置排列和同一性。术语“氨基酸序列”的使用并不意味着将氨基酸序列限制为肽、多肽或蛋白质的完整、天然氨基酸序列。
“嵌合”用于表示由多于一个核酸片段组成且至少两个核酸片段来源不同的核酸,例如载体或基因。这样的核酸片段是经重组技术融合而成、天然不存在的核酸序列。
术语“编码区”是指编码感兴趣肽、多肽或蛋白质的核苷酸序列。蛋白质编码区以5′端编码起始蛋氨酸的核苷酸三联体“ATG”以及3′端的三个特异终止密码子三联体(即TAA、TAG、TGA)之一为界。
“组成型表达”是指用组成型启动子进行的表达。
“组成型启动子”是指能够表达控制细胞生命周期所有或几乎所有阶段的基因的启动子。
“互补的”或“互补性”用于定义核酸间碱基配对或杂交程度。例如,如本领域技术人员公知的,腺嘌呤(A)可与胸腺嘧啶(T)形成氢键或碱基对,鸟嘌呤(G)可与胞嘧啶(C)形成氢键或碱基对。由是,A是与T互补的,且G是与C互补的。互补性可能是完全的,此时双链核酸中的所有碱基都是碱基配对的。或者,互补性可能是“部分的”,此时核酸中只有某些碱基是根据碱基配对原则进行配对的。核酸链间的互补性程度影响核酸链间杂交的效率和强度。
参比核酸、蛋白质、多肽或肽的“衍生物”分别为具有与各自参比核酸、蛋白质、多肽或肽相关但不相同的序列或化学结构的核酸、蛋白质、多肽或肽。核酸、蛋白质、多肽或肽的衍生物通常是有目的地增强或引入一些在参比核酸、蛋白质、多肽或肽中没有或很弱的化学、物理或功能特性。核酸的衍生物与参比核酸的核苷酸序列不同,而蛋白质、多肽或肽的衍生物分别与参比蛋白质、多肽或肽的氨基酸序列不同。这种序列差异包括一个或多个取代、插入、增加、缺失、融合和截断,它们可以任一组合出现。差异可以是微小的(例如,一个核苷酸或氨基酸的差异)或者更实质性的。然而,衍生物序列与参比物不会差异到使得本领域技术人员无法识别该衍生物与参比物是结构和/或功能相关的程度。通常,差异是有限的以使参比物与衍生物整体上非常相似,并且在许多区域是相同的。“突变体”与“衍生的”核酸、蛋白质、多肽或肽不同,因为突变体可以带有不显著改变参比核酸、蛋白质、多肽或肽的化学、物理或功能特性的沉默结构差异。相反,参比物与衍生的核酸、蛋白质、多肽或肽之间的差异在于为改良参比核酸、蛋白质、多肽或肽的一种或多种化学、物理或功能特性而制造的有意的改变。
“表达”是指微生物中内源或外源核酸的转录和/或翻译。表达通常是指mRNA的转录和稳定累积。表达也可以指蛋白质生产。
“表达盒”意指能指导特定核苷酸序列表达的核酸序列。表达盒通常包含与所要表达的核苷酸序列(例如,编码区)可操作性连接的启动子,该核苷酸序列与终止信号可操作性连接。表达盒也典型包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。含有感兴趣核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的,这意味着其至少一个成分与其剩余至少一个其它成分是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可受组成型启动子或仅当宿主细胞被暴露于某些特定外源刺激物时才引发转录的诱导型启动子的控制。对于多细胞生物,启动子也可以特异于特定的组织或器官或发展阶段。
术语“同源性”是指核酸与参比核酸间或多肽与参比多肽间的相似程度。这样的同源性可以是部分的或完全的。完全同源性是指核酸或氨基酸序列是相同的。部分同源的核酸或氨基酸序列是指一条与参比核酸或氨基酸序列不相同的核酸或氨基酸序列。因此,部分同源的核酸相对于其所比较的核酸来说在其序列中具有一个或多个核苷酸差异。同源性程度可通过序列比较来检测。或者,如本领域技术人员所理解的,不同杂交条件下DNA-DNA或DNA-RNA的杂交可提供核酸间同源性程度的估计(参见,例如,Haines和Higgins(eds.),核酸杂交,IRL Press,Oxford,U.K.)。
“杂交”是指通过在互补核酸链上的核苷酸碱基间形成氢键使互补核酸链退火的方法。杂交,以及核酸间的结合强度,受例如所杂交核酸间互补程度、所用条件的严紧性、形成的杂交体的Tm值、核酸内的G∶C比率之类因素的影响。
“诱导型启动子”是指在一种或多种细胞类型中可被外源刺激物,例如化学制品、光、激素、应力、温度或病原体,开启的可调型启动子。
“起始位点”是指围绕作为所转录序列一部分的第一个核苷酸,其被定义为位置+1,位置的区域。基因的所有核苷酸位置参照位于起始位点内的所转录序列的第一个核苷酸进行编号。下游序列(即,3′方向序列)命名为正,上游序列(即,5′方向序列)命名为负。
“分离的”或“纯化的”核酸或“分离的”或“纯化的”多肽是指借助人的力量存在于其天然环境之外的核酸或多肽,因而其不再是天然产物。分离的核酸或多肽可以纯化形式存在或存在于非天然环境例如转基因宿主细胞中。
术语“标记”是指可用于提供可检测(优选可定量的)信号、以及可附着于核酸、肽或蛋白质的任一原子或分子。标记可通过荧光、放射性、比色法、重量分析法、X-射线衍射或吸收、磁性、酶活力等方式提供可检测信号。
术语“核酸”是指由含有蔗糖、磷酸和嘌呤碱或嘧啶碱的碱基的单体(核苷酸)组成的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单或双链形式的聚合物。除非特别限定,该术语包括含有天然核苷酸已知类似物的核酸,它与参比核酸具有类似的结合特性并以与天然形成核苷酸类似的方式代谢。另外除非指明,特定的核酸序列还暗含其保守修饰突变体(例如,简并密码子取代)和其互补序列、以及明确指出的其参比序列。
术语“开放阅读框”和“ORF”是指编码序列的翻译起始和终止密码子之间所编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”是指编码序列中的一个由三个相邻核苷酸组成的单位(‘密码子’),它们分别特异指导蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止。
“可操作性连接”意指结合成为同一核酸的分子的一部分,以使一部分的功能受另一部分的影响。通常,“可操作性连接”也指,两个或更多个核酸适于定位或定向以使它们能够共同发挥功能。常将核酸可操作性连接以允许从启动子引发编码区转录。例如,调控序列被称作“可操作性连接于”或“结合于”编码RNA或多肽的核酸序列,如果这两条序列以使调控序列影响RNA或编码区的表达(即,编码序列或功能RNA受启动子的转录控制)的方式定位。
“启动子”是指通过为RNA聚合酶或其它正确转录所需因子提供识别位点来控制编码区表达的核苷酸序列,通常位于编码区上游(5′)。“启动子”包括但不限于最小启动子——它是由TATA盒组成的短DNA序列。因此,启动子包括其它特异服务于转录起始以及控制或调控表达的序列,例如增强子。相应地,“增强子”是指能够促进启动子活性的DNA片段,它可以是启动子的内在元件或为增强启动子水平或组织特异性而插入的异源元件。它在两个方向都能操作(正向或反向),并且甚至无论被移至启动子的上游或下游都能起作用。启动子可以整个源自某一天然基因,或者由源自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成,或者甚至由合成的DNA片段组成。启动子也可以含有结合根据生理或发育条件控制转录起始效果的蛋白质因子中所涉及的DNA片段。
此处术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用。
“调控序列”和“调控元件”指控制核酸序列表达的某些方面的核苷酸序列。这样的序列或元件可以位于编码序列的上游(5′非编码序列)、内部、或下游(3′非编码序列)。“调控序列”和“调控元件”影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译。调控序列包括增强子、内含子、启动子、多腺苷酸化信号序列、拼接信号、终止信号、和翻译前导序列。它们包括天然的和合成的序列。
如此处所使用的,术语“选择性标记”是指编码可观察或可选择性状的基因,这些性状在具有该基因的生物中得以表达并能够被检测。选择性标记常与不编码可观察性状的感兴趣核酸连接,以追踪或选择感兴趣核酸的出现。任何本领域技术人员已知的选择性标记都可用于本发明的核酸。某些可选择性标记允许在不带该标记时会死亡的宿主存活。可选择性标记的例子包括抗生素抗性,例如,四环素或氨苄青霉素抗性。
如此处所使用的,术语“严紧性”用于定义核酸杂交时温度、离子强度、及含有其它化合物例如有机溶剂的条件。高“严紧条件”下,核酸碱基配对只出现在具有高频互补碱基序列的核酸之间。在“弱”或“低”严紧条件下,核酸的互补序列频率通常较低,从而能够检测和/或分离具有不同序列的核酸。
术语“实质上相似”和“实质上同源”是指代表与当前发明序列功能等价物的核苷酸和氨基酸序列。例如,单纯表现遗传密码简并但编码与本发明的氨基酸序列相同的氨基酸序列的改变核苷酸序列是与本发明序列实质上相似的序列。此外,与当前序列实质上相似的氨基酸序列是那些整体氨基酸同一性足以提供稳定肽骨架的氨基酸序列。例如,与本发明序列实质上相似的氨基酸序列是那些与本发明的氨基酸序列相比整体氨基酸同一性为80%或更高,优选90%或更高,例如91%,92%,93%或94%,甚至更优选95%或更高,例如96%,97%,98%或99%。
参比核酸、蛋白质、多肽或肽的“突变体”,分别是具有与各自的参比核酸、蛋白质、多肽或肽相关但不同的序列的核酸、蛋白质、多肽或肽。突变体与参比核酸、蛋白质、多肽或肽的差异是沉默或保守差异。突变体核酸与参比核酸的核苷酸序列不同,而突变体核酸、蛋白质、多肽或肽分别与参比蛋白质、多肽或肽的氨基酸序列不同。突变体与参比核酸、蛋白质、多肽或肽可能区别于序列中的一个或多个取代、插入、增加、缺失、融合和截断,它们可以任一组合出现。差异可以是微小的(例如,一个核苷酸或氨基酸的差异)或者更实质性的。然而,突变体与参比物的结构和功能不会差异到使得本领域技术人员无法识别该突变体与参比物在结构和/或功能上是相关的。通常,差异是有限的以使参比物与突变体整体上非常相似,并且在许多区域是相同的。
术语“载体”用来指可将另一个或多个核酸片段转移入细胞的核酸。“载体”包括可以自我转移或移动的任一双或单链、线性或环状形式的质粒、粘粒、噬菌体或核酸。它可以通过整合进入细胞基因组或存在于染色体外(例如,具有复制原点的自主复制质粒)转化原核或真核宿主细胞。细菌系统中使用的载体常包含允许载体独立于细菌染色体复制的复制源。术语“表达载体”是指含有表达盒的载体。
术语“野生型”是指具有自天然来源分离的该基因或基因产物特征的基因或基因产物。野生型基因是指在群体中最常观察到的基因形式,且因此其被专门定为基因的“正常”或“野生型”形式。相反,术语“突变体”或“衍生物”是指与野生型基因或基因产物相比在序列和/或功能特性上呈现修饰的基因或基因产物(即,改变了的特征)。可以分离天然产生的衍生物。根据与相比野生型基因或基因产物它们具有改变了的特征这一事实来鉴定它们。
肽骨架本发明肽骨架其序列涉及称作鸟胰多肽(Avian PancreaticPolypeptide)的小而稳定的肽。APP是通过其N-和C-末端与其受体结合的胰腺激素(Gehlert等人,1996;Gingerich等人,1991;Fuhlendorf等人,1990)。APP有三十六个氨基酸,形成一级结构与众不同的肽。(Hazelwood,1990,reviewed by Cerda-Reverter和Larhammar,2000)。通常,具三十六个氨基酸的肽会因太短而不能提供足够稳定特有构象的堆积能。然而,APP肽却由于结合二级和三级相互作用而非常稳定(Bjornholm和Jorgensen,1993;Kruger等人,1985)。该肽起始于伸出的聚脯氨酸螺旋,接着是短环区,长α螺旋,并终止于一段无序短链。聚脯氨酸螺旋和α螺旋平行导致螺旋间接触区域内形成显著的范德华力和疏水相互作用(Blundell等人,1981)。该相互作用稳定折叠的肽结构。APP已被那些对分子动力学模拟及蛋白质折叠预测感兴趣的研究人员用作模型系统(参见,例如,Alexander和MacKerell,1991)。
野生型APP序列如下列SEQ ID NO1)所示GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY与APP序列相反,本发明肽骨架经过修饰以改造成更适于诊断应用的分子。为形成本发明肽骨架的一个实例而改变的残基以粗体字示于上述SEQ ID NO1中。在一种实施方式中,Tyr27被Trp取代(SEQID NO2,GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQWLNV VTRHRY)。此氨基酸取代改善疏水核心内的堆积并提供有用的内源光谱探针。在另一实施方式中,将Glyl变成Met-Cys(SEQ ID NO3,MCPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY)。这一改变使分子能够通过重组方法制备,其中在大肠杆菌中转录和翻译需要起始Met。在另一实施方式中,在位置30添加半胱氨酸残基(替换Val30)以与在N-末端添加的半胱氨酸形成稳定二硫键(SEQ ID NO4,MCPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNC VTRHRY)。在另一实施方式中,用Pro替换Asp11以形成对螺旋间环结构域更稳定的纽结,并作为向肽骨架编码的核酸中导入特异Sma I位点的途径(SEQ ID NO5,GPSQPTYPGD PAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY)。类似地,可以将Ala12改成Gly以提供肽骨架编码的核酸内的Sma I位点(SEQ ID NO6,GPSQPTYPGD DGPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY)。可以将序列RHRY(SEQID NO7)从SEQ ID NO1中除去,因为该序列涉及APP受体结合。除去RHRY(SEQ ID NO7)后,可以添加两个丙氨酸残基以正确间隔并定向末端半胱氨酸残基(SEQ ID NO8,GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTAA)。可以添加C-末端Cys以使肽骨架螯合并正确定向于形成诊断仪器一部分的金或其它固相支持物或表面(SEQ ID NO9,GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRYC;或(SEQ ID NO10,GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTC)。
这样的序列变化已被用于产生具氨基酸序列SEQ IDNO11(MCPSQPTYPGD PGPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)所示的35氨基酸肽骨架。在另一本发明实施方式中,肽骨架不带起始蛋氨酸。相反,该肽具有SEQ ID NO14(CPSQPTYPGD PGPVEDLIRF YDNLQQWLNC VTAAC)。
核苷酸序列SEQ ID NO12是可编码SEQ ID NO11的核酸的一个例子。
M C P S Q P T Y P G D P G PATG TGC CCG AGC CAG CCG ACC TAT CCG GGC GAT CCC GGG CCGV E D L I R F Y D N L Q Q WGTG GAA GAT CTG ATC CGC TTT TAT GAT AAC CTG CAG CAG TGGL N C V T A A C *CTG AAC TGC GTG ACC GCC GCC TGC TAG核苷酸序列SEQ ID NO13是可编码SEQ ID NO11的核酸的另一个例子。
1 11 21 31 41ACACACCATATGTGCCCGAG CCAGCCGACC TATCCGGGCG ATCCCGGGCCTGTGTGGTAT ACACGGGCTC GGTCGGCTGG ATAGGCCCGC TAGGGCCCGG51 61 71 81 91GGTGGAAGAT CTGATCCGCT TTTATGATAA CCTGCAGCAG TGGCTGAACTCCACCTTCTA GACTAGGCGA AAATACTATT GGACGTCGTC ACCGACTTGA101111121131GCGTGACCGC CGCCTGCTAGGGATCCACAC ACCGCACTGGCG GCGGACGATC CCTAGGTGTG TG以下给出野生型APP(SEQ ID NO1)与本发明肽骨架SEQ IDNO14的比较。
SEQ ID NO1 GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRYSEQ ID NO14CPSQPTYPGD PGPVEDLIRF YDNLQQWLNC VTAAC可在具有SEQ ID NO2~6或SEQ ID NO8~11或SEQ ID NO14之任一序列的肽骨架上进行插入。这种插入的一个常规位置是在环区中心附近的脯氨酸-11残基和甘氨酸-12残基之间。若用具SEQ IDNO12的核酸产生具脯氨酸-11残基和甘氨酸-12残基间插入的肽基试剂,则插入应当在SEQ ID NO12的核苷酸36和37之间。
许多由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2~6、8~11或14共有的氨基酸在肽内形成重要的分子内接触并在保持肽中的稳定及构象中起作用。然而,骨架序列的某些可变性并不对肽骨架稳定性产生不利影响。因此,本发明还指向本发明肽骨架的突变体和衍生物,例如,SEQ IDNO2~6、8~11或14的突变体和衍生物。
本发明肽骨架的衍生物和突变体经在参比肽骨架的N-末端和/或C-末端缺失或添加一个或多个氨基酸;在参比肽骨架内在一个或多个位点上缺失或添加一个或多个氨基酸;或在参比肽骨架内在一个或多个位点上取代一个或多个氨基酸而衍生自参比肽骨架。因此,本发明肽骨架可经包括氨基酸取代、缺失、截断和插入的不同途径进行改变。
这样的突变体和衍生物肽可经,例如人工操作,产生。这样的操作方法是本领域公知的。例如,肽的氨基酸序列突变体可由DNA中突变制备。诱变方法和核苷酸序列改变也是本领域公知的。参见,例如,Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985);Kunkel等人,Methods in Enzymol.,154,367(1987);美国专利No.4,873,192;Walker和Gaastra,eds.,Techniques in Molecular Biology,MacMillanPublishing Company,New York(1983)以及其中所引用文献。有关不会不利影响感兴趣肽的结构完整性和/或生物活性的适宜氨基酸取代的指导可获自Dayhoff等人的模型,Atlas of Protein Sequence and Structure,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,C.D(1978),在此引作参考。
本发明肽骨架衍生物和突变体其部分与SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一序列的氨基酸位置具有至少约90%、91%、92%、93%或94%的同一性,且这样的部分通常具有与具SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一的肽骨架相似的稳定性和整体三维结构。在一个理想的实施方式中,肽骨架衍生物和突变体其部分与SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一序列的氨基酸位置具有至少约95%或96%的同一性,且这样的部分通常具有与具SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一的肽骨架相似的稳定性和整体三维结构。在一个更理想的实施方式中,肽骨架衍生物和突变体其部分与SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一序列的氨基酸位置具有至少约97%或98%的同一性,且这样的部分通常具有与具SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一的肽骨架相似的稳定性和整体三维结构。
肽骨架及肽骨架衍生物和突变体的氨基酸残基可以是遗传编码L-氨基酸、天然存在的非遗传编码L-氨基酸、合成的L-氨基酸或上述任一的D-对映异构体。此处所用的二十个遗传编码L-氨基酸和常见非编码氨基酸的氨基酸符号是依据惯例的,示于表1。
表1


包含在本发明范围内的肽突变体可以带有由具有相似化学和/或物理特性的氨基酸取代的一个或多个氨基酸,只要这些突变体肽的骨架部分保持与具SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一的肽骨架相似的稳定性和整体三维结构。肽骨架衍生物可以带有附加的肽或化学成分以及由具有不同的化学和/或物理特性的氨基酸取代的一个或多个氨基酸,只要这些肽骨架衍生物具有与具SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一的肽骨架相似的稳定性和整体三维结构。
可相互取代以形成本发明突变体肽的氨基酸通常属于相似的类或亚类。正如本领域技术人员公知的,可主要依据氨基酸侧链特征将氨基酸分为三个主要类别亲水氨基酸、疏水氨基酸和类半胱氨酸氨基酸。这些主要类别可进一步分作亚类。亲水氨基酸包括带有酸性、碱性或极性侧链的氨基酸,疏水氨基酸包括带有芳香或非极性侧链的氨基酸。非极性氨基酸可进一步细分为包括,在其中,脂肪族氨基酸。此处所使用的氨基酸类别定义如下“疏水氨基酸”是指带有在生理pH下不带电荷并被水溶液排斥侧链的氨基酸。遗传编码的疏水氨基酸例子包括Ile、Leu和Val。非遗传编码的疏水氨基酸例子包括t-BuA。
“芳香族氨基酸”是指带有包含至少一个带共轭π-电子系统环(芳香基团)侧链的疏水氨基酸。芳香基团可进一步用取代基例如烷基、链烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基或氨基基团以及其它基团取代。遗传编码的芳香族氨基酸例子包括苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常见的非遗传编码芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。
“非极性氨基酸”是指带有在生理pH下通常不带电荷的侧链且为非极性的疏水氨基酸。遗传编码的非极性氨基酸例子包括甘氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。非遗传编码的非极性氨基酸例子包括Cha。
“脂肪族氨基酸”是指带有饱和或不饱和直链、支链或环烃侧链的非极性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非遗传编码的脂肪族氨基酸包括Nle。
“亲水氨基酸”是指带有被水溶液吸引的侧链的氨基酸。遗传编码的亲水氨基酸例子包括Ser和Lys。非遗传编码的亲水氨基酸例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”是指带有pK值小于7的侧链的亲水氨基酸。生理pH下由于氢离子的丢失酸性氨基酸通常带有负电荷侧链。遗传编码的酸性氨基酸例子包括天冬氨酸(aspartate)和谷氨酸(glutamate)。
“碱性氨基酸”是指带有pK值大于7的侧链的亲水氨基酸。生理pH下由于结合水合氢离子碱性氨基酸通常带有正电荷侧链。遗传编码的碱性氨基酸例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非遗传编码的碱性氨基酸的例子包括非环状氨基酸鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“极性氨基酸”是指带有在生理pH下不带电荷的具有侧链的亲水氨基酸,但该侧链带有一个其两个原子的共用电子对离一个原子更近的键。遗传编码的极性氨基酸例子包括天冬酰胺和谷氨酰胺。非遗传编码的极性氨基酸例子包括瓜氨酸、N-乙酰基赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
“类半胱氨酸氨基酸”是指带有能与另一氨基酸残基侧链形成共价键,例如二硫键,的侧链的氨基酸。典型地,类半胱氨酸氨基酸通常带有包含至少一个巯基(SH)基团的侧链。遗传编的类半胱氨酸氨基酸例子包括半胱氨酸。非遗传编码的类半胱氨酸氨基酸例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
正如本领域技术人员所理解的,上述分类并不是绝对的。有几种氨基酸表现多于一种特性,因而可被包括在多于一种类别中。例如,酪氨酸同时具有芳香环和极性羟基基团。因此,酪氨酸具有双重特性,可以被同时包括在芳香和极性类别中。类似地,半胱氨酸能形成二硫键外还具有非极性特征。因此,尽管半胱氨酸并不是严格地被分为疏水或非极性氨基酸,它在许多物质中可被用来赋予多肽以疏水性。
几个常见的非遗传编码可存在于本发明多肽突变体中、或可取代本发明多肽突变体中的氨基酸的氨基酸包括但不限于,β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-氨基酸例如3-氨基丙酸(Dap)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸,等等;α-氨基异丁酸(Aib);ε-氨基己酸(Aha);δ-氨基戊酸(Ava);N-甲基甘氨酸(MeGly);鸟氨酸(Orn);瓜氨酸(Cit);t-丁基丙氨酸(t-BuA);t-丁基甘氨酸(t-BuG);N-甲基异亮氨酸(MeIle);苯基甘氨酸(Phg);环己基丙氨酸(Cha);正亮氨酸(Nle);2-萘基丙氨酸(2-Nal);4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl));2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F));3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F));4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F));青霉胺(Pen);1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic);β-2-噻吩基丙氨酸(Thi);甲硫氨酸亚砜(MSO);高精氨酸(hArg);N-乙酰基赖氨酸(AcLys);2,3-二氨基丁酸(Dab);2,4-二氨基丁酸(Dbu);p-氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2));N-甲基缬氨酸(MeVal);高半胱氨酸(hCys)和高丝氨酸(hSer)。这些氨基酸也落入上述定义的类别。
上述遗传编码和非编码氨基酸的分类概括于下表2中。应当理解,表2的目的仅仅是列举而不是一个对此处所述突变体和衍生物多肽中可能含有的氨基酸的穷举。可用于产生此处所述突变体和衍生物多肽的其它氨基酸残基可得自,例如,Fasman,1989,CRC PracticalHandbook of Biochemistry and Molecular Biology,CRC Press,Inc..,以及其中所引用的文献。此处未明确提及的氨基酸可依据已知性状和/或它们与已明确鉴定氨基酸相比的特征性化学和/或物理特性方便地归类于上述类别中。
表2


本发明肽骨架可具有由任一类似分类氨基酸取代的氨基酸来产生突变体肽,只要肽突变体具有与具SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一的肽骨架相似的稳定性和整体三维结构。
尽管本发明的肽骨架可具有可变区,本领域技术人员仍可以根据既定目的选择不变的骨架结构。因此,本领域技术人员可利用不变的骨架结构形成肽基试剂库或肽文库。不变骨架结构的化学和物理特性将保持不变,且任何结合、溶解度、稳定性或其它生物学、化学或物理特性的变化都是由附着于肽骨架的化学或肽部分引起的。
本发明的肽骨架是比较小的。这意味着为预期目的使用了引入肽骨架的肽基试剂的高比率的分子物质。因此,例如,当抗原识别位点附着于或引入肽骨架时,就产生一个很小的肽基试剂,它模拟大很多的抗体的结合特性。
这样的肽基“抗体”试剂比抗体更稳定,具有较少的抗原表位且易于人工制备和生产。
相互作用的结构域根据本发明,相互作用的结构域可被附着于或引入本发明的肽骨架,例如,SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一。这样的相互作用的结构域可以是任何由本领域技术人员选择的分子或部分。有用的相互作用的结构域包括,例如,特异结合结构域、抑制剂结构域、接头、标记、固相支持物、酶活性位点、催化位点、有用的化学实体和试剂等。
本发明提供的相互作用的结构域的例子还包括编码牛胰蛋白酶抑制剂部分识别序列的肽(PYRIRF,分子中残基561至566,SEQ IDNO15)和用此处所述文库搜索程序以牛胰蛋白酶作为靶蛋白质鉴定的肽(YKLKY,SEQ ID NO18)。一种将SEQ ID NO15的相互作用的结构域与SEQ ID NO11的肽骨架结合的肽基试剂具有SEQ ID NO21(CPSQPTYPGDPPYRIRFGPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)。一种将SEQ ID NO18的相互作用的结构域与SEQ ID NO11的肽骨架结合的肽基试剂具有SEQ ID NO22(CPSQPTYPGDPYKLKYGPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)。
可产生肽文库以提供大量的相互作用的结构域。例如,可产生肽文库以用作受体的抑制剂、结合剂、配体和抗原识别位点。在一种实施方式中,肽被设计用于与靶蛋白质、核酸或抗原相互作用。靶蛋白质、核酸或抗原内的特异位点或序列可用于靶向与文库所提供肽的相互作用。被鉴定具适宜特性的肽之后可用于引入或附着于本发明的肽骨架。
通常,选择输入或靶蛋白质或核酸与文库肽相互作用。本领域技术人员可以选择任何感兴趣的靶蛋白质或核酸。例如,靶蛋白质可以是抗原、抗体、酶、激素、受体、配体、DNA-结合蛋白、膜关联蛋白、或任何结构蛋白。输入或文库肽可以结合靶核酸位点的例子包括启动子、增强子、多聚腺苷酸化位点、内含子、拼接信号、终止信号、和翻译前导序列。
定义了输入或靶蛋白质或核酸的搜索范围。这一搜索范围定义肽将与之相互作用或结合的位点的物理和化学特性。例如,搜索范围可以包含蛋白质或核酸上肽相互作用位点中所有非氢原子的x、y和z坐标。定义该搜索范围可能考虑的其它参数包括电荷、亲水性、疏水性、距离和输入或靶蛋白质或核酸内原子的方向。
本领域技术人员可以选择文库肽的长度。例如,理想的文库中肽可以是约1至约30个氨基酸长度。更理想的文库中肽可以是约1至约25个氨基酸长度。甚至更理想的文库中肽可以是约1至约20个氨基酸长度。甚至更理想的文库中肽可以是约2至约15个氨基酸长度。甚至更理想的文库中肽可以是约2至约10个氨基酸长度。特别理想的文库中肽可以是约2至约8个氨基酸长度。
在一种实施方式中,肽长度约为一至六个氨基酸长。最初的建模研究,包括长程分子动力学模拟,表明可将多达六个氨基酸残基插入环部分的中心而不会对分子稳定性产生消极影响。这六个氨基酸可能编码对靶蛋白质或核酸具有结合亲和力和特异性的相互作用的结构域。
本领域技术人员可以选择在文库内的肽中各位置上发生多少氨基酸取代。类似地,使用者可以选择任一氨基酸组合将其置于文库肽中的给定位置。例如,熟练技术人员可以选择将任何类别或类型的氨基酸置于给定位置。这样的一类氨基酸可以,例如,是一类遗传编码的L-氨基酸、天然存在的非遗传编码L-氨基酸、合成的L-氨基酸、遗传编码氨基酸的D-对映异构体、天然存在的非遗传编码氨基酸的D-对映异构体、或合成的D-氨基酸。其它的氨基酸类别包括亲水氨基酸、疏水氨基酸、类半胱氨酸氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、极性氨基酸、芳香族氨基酸、非极性氨基酸或脂肪族氨基酸。上文给出了氨基酸类别及类型的进一步例子。
之后将所选择的肽文库文档用作向对接程序的输入,该对接程序(docking program)将各肽与靶蛋白质或核酸上的搜索范围拟合。可用一些分子对接程序,例如,Molecular Simulations Inc(MSI)的程序LigandFitTM。该对接程序提供为各种肽类型提供拟合得分。输出文档可以根据肽拟合得分分级排序。最高得分肽是潜在最适于与输入靶蛋白质或核酸相互作用的。
在一种实施方式中,该方法包括附图13中所概括的几个步骤。一个步骤是定义一个搜索范围1302。这一搜索范围是所选择的位于靶蛋白质上肽可与之相互作用的相互作用位点。本发明的相互作用肽结构域可与搜索范围相互作用。搜索范围可以是,例如,结合位点、抗原识别位点、活性位点、抑制剂结合位点等。
该方法中可以包括的另一个步骤是定义肽的大小1304。如此处所述,肽可以具有各种长度。例如,肽可以是约1至约30个氨基酸长。
该方法中可以包括的附加步骤是为肽的氨基酸序列中各位置定义氨基酸类别1306。如此处所提供的,本领域技术人员肽的氨基酸序列各位置可以具有独特的化学和物理特性。因此,具有相关物理结构、或具有特定化学特性、或具有特定溶解特性的氨基酸可形成该类别。
在另一步骤中,氨基酸的每个成员可以被重复取代或置于肽中指定位置以产生一个输出文库文档1308。这一输出文库文档包含输出肽序列集合,每个都具有一个独特肽序列。
该方法中可以包括的附加步骤是将输出文库文档传输给分子对接程序1310。该分子对接程序能将输出肽序列集合各成员与搜索范围拟合并随之产生靶蛋白质-肽序列拟合得分。这样的靶蛋白质-肽序列拟合得分是对给定肽将与该搜索范围内发生多好的相互作用、结合或拟合的一个度量。具有高靶蛋白质-肽序列拟合得分的肽通常将很好地与靶蛋白质或靶核酸中所选择位点发生相互作用、结合或拟合。
在该方法的另一步骤中,输出肽序列集合可根据靶蛋白质-肽序列拟合得分进行分级1312。这一分级允许对哪个肽将最有效地与靶蛋白质或靶核酸上的所选择位点发生相互作用、结合或拟合作出即时的评估。
该方法中可以包括的附加步骤是展示输出肽序列集合各成员及其关联靶蛋白质-肽序列拟合得分1314。输出肽序列集合中至少一部分能够与靶蛋白质稳定相互作用。因此,本领域技术人员可以选择列出所有输出肽序列。
或者,除了列出所有可能的肽序列及其关联拟合得分,当输入百分比时可以只显示高端得分值肽的百分数。或者,程序可以随机选择所有可能肽的某个特定百分比以写出最终的结构文档。这一百分数的选择可以限制输出文库文档的大小和/或文库复杂性。
在另一实施方式中,本发明提供用于产生肽序列的系统(参见附图14)。这一系统可以包括处理器1402。处理器可以连接存储器1404和/或显示器1406。该系统还可包括能够在处理器上执行以产生肽序列的肽序列制备组件1408。输出标签或类别组件1410能在处理器上执行以显示肽序列制备组件所用的各氨基酸残基类别。该系统还可包括能够在处理器上执行以展示肽序列的输出肽序列组件1412。
个人计算机(PC)中的处理器,例如微处理器是响应并处理驱动计算装置基本指令的逻辑电路。计算装置包括个人计算机、膝上型电脑、通常用途的计算机等。存储器电子储存计算装置可理解的指令和数据的地方。常规操作中,存储器通常包含操作系统、应用程序和数据。存储器的种类包括随机存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可编程存储器(PROM)和可擦可编程ROM(EPROM)以及储存设备例如硬盘驱动器和软盘。显示器是计算机向计算机使用者显示文本以及常显示图形的输出装置。显示器的例子包括打印机、显示器等。
在一种实施方式中,类别输出组件能显示肽序列制备组件所用的各氨基酸类别残基。
在另一实施方式中,本发明提供一种带有与能指导机械完成某方法相关内容的机读介质。该方法可以是上述方法之一。
在机读介质上完成的方法也可以是附图15中阐明的包括下述步骤的方法。在该方法的一个步骤中包括接收搜索范围1502。如上所述,搜索范围可以为靶位上的原子提供坐标集合,肽集合能以不同亲和力与该靶位结合。
在另一步骤中,该方法可以包括接收肽长度参数的步骤1504。这一肽长度参数可以是对肽中所含氨基酸数量的定义。
一个可被包括的附加步骤涉及接收定义的、用于沿肽长各位置拟合分析的氨基酸结构类别1506。该步骤中,使用者可以定义将何种氨基酸类型和类别置于肽序列的预期位置。
在另一步骤中,该方法可以包括生成包括输出肽序列集合的输出文库文档1508。该输出肽序列是含有来自各定义的沿肽长各位置氨基酸结构类别的的肽序列集合。
可包括在该方法中的一个附加步骤包括随后的翻译和旋转肽内各位置氨基酸结构类别1510的各成员。该翻译和旋转的完成与搜索范围有关以随之产生带有靶位-肽序列拟合得分的肽序列。
在另一步骤中,该方法可以包括根据靶位-肽序列拟合得分将肽序列分级1512。如上所述,这一分级允许对哪个肽将最有效地与靶蛋白质或靶核酸上的所选择位点发生相互作用、结合或拟合作出即时的评估。
可包括在该方法中的一个附加步骤包括显示一个选择的靶位-肽序列拟合得分百分比和关联肽序列1514。
该方法还可包括用靶位-肽序列拟合得分和关联肽序列构建理想的肽结构1516。
可包括在该方法中的一个附加步骤包括显示用于输出肽序列的标记和/或储存搜索范围。
一个用此处所述的筛选程序以牛胰蛋白酶作为靶蛋白质而选择出的肽相互作用的结构域例子是YKLKY(SEQ ID NO18)。该相互作用的结构域肽被置于SEQ ID NO11肽骨架中以产生一个具有SEQ IDNO22(CPSQPTYPGDPYKLKY GPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)的肽(也叫做SAP-2)。该文库程序选择出的肽与牛胰蛋白酶结合良好。作为比较,将来自牛胰蛋白酶抑制剂的天然肽(PYRIRF,分子中残基561至566,SEQ ID NO15)插入SEQ ID NO11肽骨架以产生SEQ IDNO21(CPSQPTYPGDPPYRIRFGPVEDLIRFYDNLQQWLN CVTAAC)(也叫做SAP-1)。该具有SEQ ID NO22的文库选择肽与具有SEQ ID NO21的天然选择肽相比具有略低的牛胰蛋白酶结合亲和力。然而,将肽SEQ IDNO15或18插入SEQ ID NO11肽骨架产生比不带插入的肽骨架更稳定的肽基试剂。因此,本发明的方法也可用于产生非常稳定的肽基试剂。
在一种实施方式中,肽相互作用的结构域具有抗原识别特异性。这一抗原识别肽相互作用的结构域可被构建进或附着于肽骨架上以产生具抗原识别能力的肽基试剂。含有肽相互作用的结构域的抗原识别元素是插入肽骨架中选择性插入位点的短肽。以肽骨架不会丧失稳定性来选择该插入位点。由于这样的肽相互作用的结构域的稳定插入使抗原识别肽的构型熵相对于自由肽来说降低了,从而对抗原识别肽的结合特异性和亲和力产生积极影响。肽骨架内的一个适宜插入位点的例子是具SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一序列肽的环部分中。一个理想的插入位点位于脯氨酸-11残基和甘氨酸-12残基之间。
本发明的抗原识别肽相互作用的结构域可用本发明的肽文库搜索程序或通过鉴定现有抗体的抗原结合结构域进行鉴定。也可通过常规方法制备抗体以鉴定有用的抗原结合肽相互作用的结构域。
多克隆抗体的制备是本领域技术人员熟知的。参见,例如,Green等人在ImmunochemicalProtocols(Manson,ed.)中第1~5页(HumanaPress)的Production of Polyclonal Antisera;Coligan等人在CurrentProtocols in Immunology,2.4.1部分中的Production of PolyclonalAntisera in Rabbits,Rats Mice and Hamsters,它们在此引做参考。
同样地,单克隆抗体的制备也是常规的。参见,例如,Kohler &Milstein,Nature,256495(1975);Coligan等人,sections 2.5.1~2.6.7;和Harlow等人,AtibodiesA Laboratory Manual中第726页(Cold Spring Harbor Pub.(1988)),它们在此引做参考。单克隆抗体可通过多种已经良好建立的技术自杂交瘤中分离和纯化。这样的分离技术包括蛋白质-A琼脂糖亲和层析、大小排阻层析、和离子交换层析。参见,例如,Coligan等人,2.7.1~2.7.12部分和2.9.1~2.9.3部分;Barnes等人,在Methods in Molecular Biology,第10卷第79~104页(Humana Press(1992)的Purification of Immunoglobulin G(IgG)。
编码肽基试剂的重组表达编码本发明的肽骨架、肽基试剂和抗原识别肽的核酸可用于这些肽的重组表达。一般,可通过将核酸导入适宜在特定类型宿主细胞中使用的表达载体中进行本发明肽编码核酸的重组表达。
可将本发明的核酸导入并在任一宿主生物中表达,例如,在原核或真核宿主细胞中都可以。宿主细胞的例子包括细菌细胞、酵母细胞、培养的昆虫细胞系、以及培养的哺乳动物细胞系。优选,选择以本领域技术人员想要的方式加工和翻译后修饰初生肽的重组宿主细胞系统。如果翻译后处理不挑剔的话,则可以选择任一便利的宿主生物。为了表达并分离大量的本发明肽骨架、肽基试剂和抗原识别肽,理想的是使用原核生物,例如,大肠杆菌。因此,本发明提供含有本发明表达载体的宿主细胞。
可将要导入的核酸置于表达盒内在感兴趣生物体中表达。该表达盒含有与本发明核酸连接的转录起始区。表达盒优选还带有多个用于将核酸插入使其在不同转录调控元件控制下的限制位点。该表达盒此外还包含选择性标记基因。若需要正确起始转录和/或对初级RNA转录物进行正确加工可将合适的控制元件例如增强子/启动子、拼接点、多腺苷酸化信号等放在基因编码附近。或者,本发明表达载体中所用编码区可包含内源性增强子/启动子、拼接点、插入序列、多腺苷酸化信号等、或内源与外源控制元件的组合。
优选载体中的核酸受适宜启动子或宿主细胞中用于转录的调控元件的控制并与之可操作性连接。载体可以是在多个宿主中有功能的双功能表达载体。转录盒通常包括在生物体中有功能的5′-3′转录方向、启动子、转录和翻译起始区、感兴趣的DNA序列、以及转录和翻译终止区。终止区可以是天然对应转录起始区的、可以是天然对应感兴趣DNA序列的、或可以是衍生自其它来源的。
重组核酸在原核和真核细胞中的有效表达通常需要指导得到的转录物的有效终止和多聚酰苷酸化的调控元件。转录终止信号通常位于多腺苷酸化信号下游且长数百个核苷酸。此处所用术语“多聚A位点”或“多聚A序列”表示指导转录终止和初始RNA转录物多聚酰苷酸化的核酸序列。由于不带多聚A尾巴的转录物不稳定并迅速被降解,重组转录物需要进行有效的多聚酰苷酸化。
可用本领域技术人员已知的方法将编码本发明肽骨架、肽基试剂和抗原识别肽的核酸导入细菌宿主细胞中。例如,可通过常用的转化方法,例如用氯化钙或电击处理,将这样的核酸导入细菌细胞。如果要在真核宿主细胞中表达本发明的肽骨架、肽基试剂和抗原识别肽,则可通过许多方法将编码这些肽的核酸导入真核细胞,包括磷酸钙共沉淀、原生质体融合、电击法等方法。当真核宿主细胞为酵母细胞时,可通过醋酸锂或电击处理宿主细胞来影响转化。
因此,本发明的一个方面是提供含有编码本发明肽骨架、肽基试剂和抗原识别肽的核酸的表达载体和宿主细胞。本领域可获得的表达载体范围广泛。可以在其它地方找到有关不同表达载体及其使用方法的说明,美国专利No.5,604,118、5,583,023、5,432,082、5,266,490、5,063,158、4,966,841、4,806,472、4,801,537和Goedel等人,GeneExpression Technology,Methods of Enzymology,第185卷,AcademicPress,San Diego(1989)。可辅助用于本发明制备及用途方面的重组DNA和分子克隆技术描述于Sambrook等人,Molecular CloningALaboratory Manual Vol.1-3,Cold Spring Harbor laboratory,ColdSpring Harbor,N.Y.(2001);Ausubel(ed.),Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley和Sons,Inc..(1994);T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular CloningA LaboratoryManual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);和by T.J.Silhavy,M.L.Berman,and L.W.Enquist的Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,N.Y.(1984)。
诊断和治疗方法本发明的肽基试剂可用作治疗方法或诊断方法或仪器的基础。该具有抗原识别相互作用的结构域的肽基试剂可替代抗体。具有酶催化位点或酶活性位点为相互作用的结构域的肽基试剂可替代酶。具有抑制剂为相互作用的结构域的肽基试剂可替代抑制剂使用。因此,本发明所提供的肽基试剂其利用是非常广泛的。
尤其可将这样的肽基试剂用于任一本领域技术人员已知的检测感兴趣核酸或蛋白质的步骤。例如,本发明的肽基试剂可用于任意分子生物学检测步骤,包括任何酶检测、抑制检测或免疫检测。生物物理检测步骤可与这些步骤结合使用,或根据本领域技术人员的指示分别使用。这样的步骤包括,例如,表明等离子共振技术、荧光、侧流技术。这些步骤形成检测和鉴定测试样品中靶蛋白质和核酸的强劲有效方法。
在一种实施方式中,本发明提供一种检测测试样品中靶蛋白质或核酸的方法,包括将肽基试剂与测试样品接触并检测肽基试剂是否与测试样品中的靶蛋白质或核酸结合。当肽基试剂具有抗原识别肽为其相互作用的结构域时,在某温度及足以发生抗原-抗体相互反应的条件下实施检测方法一段时间。这样的温度、时间和条件可由本领域技术人员很容易的决定。例如,可在约4℃至42℃下将肽基试剂与含有蛋白质或核酸提取物的样品在适宜的缓冲液中温育约5分钟至24小时。之后测定或检测肽基试剂与蛋白质或核酸之间所形成的复合物的存在及量,例如,通过测定或检测与肽基试剂附着的标记。
本发明的肽基试剂可适应任何本领域技术人员已知的免疫检测。例如,可将肽基试剂用于例如那些涉及放射免疫检测、ELISA、或免疫荧光检测的方法。因此,例如,适于使用本发明肽基试剂的免疫检测包括那些在美国专利No.3,791,932;3,817837;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;和4,098,876中所述的。
在肽基试剂与蛋白质或核酸之间的复合物形成的检测或测定包括检测标记、报告分子或其它可检测部分。这样的标记、报告分子或可检测部分可与肽基试剂或靶蛋白质或核酸的池结合。
可用于当前方法的测试样品包括,例如,来人体或动物的生理液体和样品、食物样、水、土壤、以及采自工作区、工作台、架、食品储存区、动物或禽类围栏、或采自皮肤、毛发或动物体表面的样品。这样的应用包括人体疾病状态检测。
本发明的检测仪器包括与固相支持物稳定结合或连接的肽基试剂。该固体可以是本领域技术人员已知的任何应用支持物。例如,该固相支持物可以是珠粒、过滤器、微量滴定盘、或生物感应芯片。
本发明还包括含有带有一种本肽基试剂的装置或容器的试剂和试剂盒。试剂或试剂盒可以包括带有肽基试剂的生物传感器、或试管、微量滴定板或其它用于实施检测方法的物体。为便于测试或使方法或装置更加便利,试剂盒可设计包含与测试、方法或装置相关的对照样品。试剂盒还可包含实施本发明方法的溶液,例如,稀释测试样品的溶液、温育测试样品与生物传感器或检测装置的溶液、以及将未结合的测试样品洗涤除去的溶液。试剂盒还可含有在与样品接触前或接触中用于与生物传感器或检测装置接触的阻断剂。理想的对照物和其它溶液是无菌的,且不含对与肽基试剂结合产生干扰的物质。
本发明试剂盒中还可提供检测形成于肽基试剂与靶蛋白质或核酸之间的复合物的标记或报告分子。这样的标记或报告分子可与生物传感器、检测装置或肽基试剂分开包装。
标记的肽基试剂本发明还提供标记的肽基试剂。可使用的标记包括放射性核、荧光标记、化学发光标记、比色染料、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、酶亚单位、金属离子、颗粒等。常用作报告分子或标记的放射性同位素包括32P、125I及131I。常用作报告分子或标记的酶包括,例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶和葡糖氧化酶。常用的荧光报告分子或标记包括,例如,染料例如异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、罗丹明、异硫氰酸罗丹明B(RITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、4,4′-二异硫氰基茋-2,2′-二磺酸(DIDS)。参见,例如,美国专利No.3,766,162、3,791,932、3,817,837、和4,233,402。其它的常用标记或报告分子类型包括德克萨斯红(Texas red)、藻红素、7-羟基香豆素、鲁米诺、NADPH等。
可用于检测和定量标记存在的各种的技术依赖于标记的性质。对于荧光标记,可以得到大量不同的荧光计和荧光显微镜。对于化学发光标记,可以得到发光计或薄膜。产生荧光、化学发光或有色产物的酶可用于荧光、发光、分光光度或可视化检测。这样的标记可用于此处所述的免疫检测和杂交检测。
将标记附着于肽和/或核酸的许多方法都是本领域技术人员已知的。已报道的将标记附着于核酸的方法的例子,例如,Leary等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1983)804045;Renz和Kurz,Nucl.AcidRes.(1984)123435;Richardson和Gumport,Nucl.Acid Res.(1983)116167;Smith等人,Nucl.Acid Res.(1985)132399;和Meinkoth和Wahl,Anal,Biochem.(1984)138267。可经羧基、巯基、氨基、或肼其它官能度将标记结合于肽基试剂而不会对肽的功能或肽与靶的结合产生有害影响。
通过以下实施例得以进一步描述本发明。
实施例该实施例描述肽骨架自一个称作鸟胰多肽的小而稳定肽的产生,以及设计和构建DNA序列以制备该新肽。还描述了用于发现可插入亲体肽骨架以产生特异抗原结合元件的肽序列的计算机程序。提供了一个实施例显示可以制备与牛胰蛋白酶结合的重组模块式抗原识别分子。
材料和方法细菌生长条件及培养根据Miller(1972)所述完成。除非另外指明,本研究中完成的所有方法都根据Maniatis等人(1982)或Sambrook等人(1989)所述进行;包琼脂糖凝胶电泳和限制性内切酶消化。所有PCR反应中所用的VentTMDNA聚合酶购自New England Biolabs,并与所提供的缓冲液使用。由Genosys,Inc.用Applied Biosystems,Inc.的自动测序仪完成DNA测序(Sanger等人,1977)。由Genosys,Inc.合成DNA寡核苷酸。根据Bradford的方法(1976)用牛血清清蛋白(BSA)为标准测定蛋白质浓度。根据Siegel和Monty(1966)用BioRad,Inc.的7×250mm BioSelect SEC-125柱完成分析凝胶过滤试验。所有细菌菌株均购自New England Biolabs,Inc.。蛋白质SDS PAGE凝胶根据Laemmli(1970)进行制备、运行和处理。除特别指明外,化学试剂和层析树脂来自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。
分子建模分子建模用了两个可视化程序,Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch,1997)和Rasmol(Sayle和Milner-White,1995)。用CompaqPC,Windows 2000以及Silicon Graphics,Inc.的Octane UNIX工作站完成模型工作。此外,在Octane上使用Molecular Simulations,Inc.的Cerius2分子堆积。用于起始建模研究的三维结构文档下载自蛋白质数据库(Protein Databank)(文档1PPT.ENT)。进行几轮连续的氨基酸缺失和取代以将野生型APP分子转化为适合诊断应用的模块肽。
之后用GROMOS 96力场将最终模型能量最低化,以及用SYBYL力场进行几轮分子力学几何优化(Clark等人,1989)。之后对最终最低化/优化的模型进行不良相互作用和扭力几何学分析。最终定下来的蛋白质以及三维模型命名为SAP。对于合成的(基于同源性建模)抗体肽来说这是短的。SAP是可向其中插入特异性的6-mer结合序列的亲体分子。
基因设计、构建及克隆用标准遗传密码反向翻译最终的SAP氨基酸序列。根据大肠杆菌偏好选择密码子,这意味着为某一特定氨基酸所选择的最终密码子是大肠杆菌中该氨基酸最常、或第二常用的密码子。全长结构基因为111bp(包括终止密码子)。为建立该基因序列,合成了10个跨越编码区的单链寡核苷酸。寡核苷酸长度范围是18至28个核苷酸。每个寡核苷酸相互互补,这样当与结合伴侣杂交时,所获得的片段含有中央双链区,其各末端为一段单链8核苷酸区。寡核苷酸序列示于表3。
基因构建包括三个独立步骤。首先,将5μg各寡核苷酸及其互补结合伴侣(对于5个独立的反应)混合于10mM Tris-HCl(pH7.2)、10mM NaCl中,终体积为10μL。特异寡核苷酸杂交是(参见表3)(1a和1b)、(2a和2b)、(3a和3b)、(4a和4b)、和(5a和5b)。95℃水浴加热混合物10分钟。关闭热源,让整个水浴经5小时冷却至室温。其次,混合这五个“慢速冷却”反应各自的等分量(10μL)(终体积50μL)。将试管于45℃加热10分钟,之后置于冰浴中。将T4 DNA连接酶和缓冲液(New England Biolabs)加入试管,于16℃温育反应(终体积60μL)20小时。第三,用两个与结构基因5′和3′最末端互补的PCR引物(表3、6a和6b)从片段混合物中选择全长结构基因。这确保只有全长基因产物能被扩增。用1μL连接混合物完成如下PCR反应95℃1分钟;49℃1分钟;72℃30秒。于Techne Progene PCR仪中完成30个该程序循环。最后一个PCR循环之后再于72℃温育10分钟。用DNA琼脂糖凝胶电泳验证PCR反应产物。
PCR反应产物经Promega的DNA Wizard PCR纯化试剂盒纯化制备用于克隆。首先,在ATP存在下用T4 DNA聚合酶处理DNA片段以确保形成完全双链末端。根据New England Biolabs,Inc.的用法说明书完成该反应。用Promega的DNA Wizard PCR纯化试剂盒再次纯化DNA。其次,DNA用Nde I和Bam HI消化并经乙醇沉淀纯化。将最终的DNA重悬于少量10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA中。
克隆载体,pET11a(Novagen),经Nde I和Bam HI消化并用Promega的DNA纯化试剂盒纯化。该消化产生包含与DNA片段适合的末端的线性载体。该组合确保片段定向、符合读框的克隆。将载体与插入物以大约1∶15的摩尔比混合并于16℃在T4 DNA连接酶存在下连接20小时(总反应体积为20μL)。用5μL连接反应物转化感受态JM109细菌。在LB/60μg/mL氨苄青霉素琼脂平板上生长后,选择单个克隆,用Promega的小量制备DNA分离试剂盒经小量制备方法从克隆纯化质粒DNA。经DNA凝胶电泳、限制性内切酶消化、以及最后的DNA测序评估分离的质粒。质粒结构命名为pSAPe。
纯化SAP表达策略在整个表达系统中使用Novagen的T7 RNA聚合酶。包含表达质粒结构的BL21(DE3)细胞37℃下于补加有0.5%葡萄糖和自1%接种物的60μg/mL氨苄青霉素的Luria液体培养基中生长。细胞A595值达0.8时(接种后大约3小时内)加入IPTG至终浓度为0.5mM。细胞在收获前再生长5个小时。典型地,每升得到5g细胞。
细胞于10,000×g下离心10分钟成块并重悬于一体积的10mMTris-HCl,pH8.0。将细胞如上述再次离心并于-70℃冷冻至少2小时。将冷冻块重悬于二倍体积的10mM Tris-HCI,pH8.0。于French Press(一次,20,000psi)中裂解混合物。获得的抽提物经12,000×g下离心20分钟而澄清,于20mM Tris-HCl(pH7.4)、100mM NaCl、1mM EDTA(缓冲液I)中透析上清液。透析物用缓冲液I稀释至终浓度2.5mg/mL,称作级分I。随后的所有层析步骤于室温下10mMTris-HCl(pH8.0),1mM EDTA中完成。
将级分I加于5cm×1.8cc2Mono-Q离子交换柱。结合材料使用如下梯度仅缓冲液,40mLs;接着是100mM NaCl,40mLs;和由100mM至500mM NaCl的线性梯度,200mLs。约50%APP肽(及突变体)经梯度从柱中洗脱出来。级分中的蛋白质含量用SDS PAGE可视化,并集中含APP的级分,于10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA中透析,并经半透膜(Amicon)压力过滤浓缩至10mg/mL。最终的浓缩收集物称作级分II。
将级分II加于Sephadex G-75柱(110cm×7.6cc2)。收集经SDSPAGE可视化鉴定的峰级分。G75收集物称作级分III。该级分包含同源APP肽并被用于下述试验。
生产SAP-2
以大肠杆菌密码子用法将牛胰蛋白酶抑制剂识别序列的一部分(PYRIRF,分子中残基561至566,SEQ ID NO15)转换成DNA序列5′-CCGTATCGCATCCGCTTT(SEQ ID NO16)。用上述方法产生带有Sma I位点侧翼的双链序列5′-CCCGGGCCGTATCGCATCCGCTTTCCCGGGSEQID NO17GGGCCCGGCATAGCGTAGGCGAAAGGGCCC-5′SEQ ID NO17双链DNA用Sma I消化并克隆进经Sma I消化的去磷酸化pSAPe。DNA测序验证重组克隆。如上所述表达纯化SAP-2(SEQ ID NO21)肽。
新肽发现编写FORTRAN 90程序以产生退化肽文库。该编码允许使用者选择肽长度(1~6氨基酸)、各位置可发生多少氨基酸取代(0至20)、以及使用者是否想随机选择所有可能肽的某个确定百分数以写出最终的结构文档。这一最终特征用于限制文档大小和文库复杂性。程序,称作MKPEPS,输出的是单一文档,它包含蛋白质中所有非氢原子的XYZ坐标。之后将肽文库文档作为向对接程序的输入(使用MSI程序LigandFit,尽管任何可获得的分子对接程序都可以)。对接程序将各肽与基于靶蛋白质的搜索范围进行拟合并输出拟合得分。输出文档是分级排序的,且最高得分肽潜在为最强的结合物。对牛胰蛋白酶运行一个这样的肽文库。将最高得分肽,YKLKY(SEQ ID NO18),转换成DNA序列TATAAACTGAAGTAT(SEQ ID NO19)。添加Sma I侧翼序列,并如上所述制备得到具下述结构的双链。
5′-CCCGGGTATAAACTGAAGTATCCCGGGSEQ ID NO20GGGCCCATATTTGACTTCATAGGGCCC-5′将插入物经Sma I消化后克隆进经Sma I消化的去磷酸化pSAPe。DNA测序证实克隆。如上所述表达纯化SAP-3。
热量测定用MicroCal,Inc.的VP-ITC仪器完成等温滴定量热(ITC)。向1.4mL搅拌反应细胞注射5μL抑制剂溶液(在浓度范围0.5mM至2.0mM下)实施滴定。APP和APP衍生物在细胞中的浓度范围是50至80μM。抑制剂和酶都溶于20mM二甲基胂酸钠(pH 5.5-7.0)、40mMNaCl,或20mM Tris-HCl(pH 7.0-7.5)、40mM NaCl。滴定在20℃和40℃下进行。滴定的典型试验条件是持续注射10秒、注射间歇240秒,共注射40次。为校准稀释热和混合热,进行抑制剂向缓冲液的空白滴定。
独立的一套多个结合位点是最常见的结合试验评估模型。根据(Freire等人,1990)检测总热量分析液Q=VΔH[[L]+1+[M]nK-(1+[M]nK-[L]K)2+4K[L]2K]]]>其中Q为总热量,V为细胞体积,ΔH为焓,M为大分子浓度(细胞中的结合伴侣),n为结合化学计量,L为配体浓度(注射器中的结合伴侣),以及K为结合常数。用Origin version 5(MieroCal,Inc.)将数据与该模型拟合。
结合常数以下列关系式与van′t Hoff焓相关(∂lnK∂T)P=ΔHVHRT2]]>其中定义,K=e-ΔGRT]]>结合自由能以下式与结合焓相关ΔG=ΔH-TΔS或根据Gibbs-Helmholtz方程引入热容数据
ΔGbind(T0)=ΔH(T0)-T0[(ΔH(T)-ΔG(T))T+ΔGpln(T0T)]]]>其中ΔG为Gibbs结合自由能,T0为参比温度,以及ΔCp为热容。根据两个不同稳定下的量热测定焓算出ΔCp值ΔGP=ΔHT2-ΔHT1T2-T1=ΔST2-ΔST1ln(T2T1)]]>通过测定两种已知电离焓的不同缓冲液中的结合表观焓,可以测定结合事件中转化的净质子数ΔHapp=ΔHcor+nΔHlonlz其中ΔHcor是所测pH下的实际结合热。其符号表示质子的转移方向。
表面等离子共振用BiaCore,Inc.的BiaCore-X表面等离子共振(SPR)仪测定牛胰蛋白酶和SAP-1或SAP-2间相互作用。以10μl每分钟的流速用50mM N-羟基琥珀酰亚胺、0.2M N-乙基-N′-(二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺激活羧甲基葡聚糖传感器芯片(CM-5)10分钟。巯基偶联剂PDEA(2-(2-pyridinyldithio)ethaneamine hydrochloride)以80mM浓度、10μl每分钟的流速通过激活表面5分钟。浓度为50ng/μL的SAP-1或SAP-2以10μl每分钟的流速与激活表面偶联10分钟。50mM l-半胱氨酸、1M NaCl以10μl每分钟的流速流过传感器表面5分钟使最终表面失活。缓冲液改为磷酸缓冲盐溶液(PBS)且浓度范围为1至100nM的牛胰蛋白酶以20μl每分钟的流速流过传感器表面。
对于这一类型的反应,A+B←→AB,其中A为自由流动的配体以及B为固定配体,SPR信号(R)的改变是与复合物AB的形成(结合相)或解离(解离相)成比例的。因此对于结合相传感器反应为(Morton等人,1995)
R(t)=ckacka+kdRmax(1-e-(cka+kd)t)+Rb]]>如果结合物质中的所有结合位点被占用,Rmax是测量的应答,c为配体浓度,Rb为配体注射的基线信号的改变。解离相可根据下式计算R(t)=R0e-kdt]]>其中R0为解离开始时的SPR信号。FFT惯例分别使结合等温线中的结合与解离部分变得平滑。用Microcal,Inc.的Origin完成最终的动力学分析(O′Shannessy等人,1993)。
化学变性通过在尿素存在下在Shimadzu RF5301荧光计中经内源色氨酸荧光(Lakowicz,1983)测定蛋白质的解折叠完成对蛋白质稳定性的测定。激发和发射波长分别为295nm和340nm。激发和发射单色计缝隙都设为1.5nm。将持续增加量的尿素(浓度范围为0至6.8M)与蛋白质(20μM)混合,将样品于室温下温育10小时以确保达到解折叠平衡。根据下述关系式(Pace等人,1989)将相对荧光转换为自由能值ΔG=-RTln[(yf-yiyi-yu)]]]>其中yf和yu分别为完全折叠和完全解折叠DST的相对荧光值,yi为解折叠中间产物的相对荧光值,T为绝对温度,以及R为气体常数。将关系式ΔG对[尿素]的线性回归和外推用于检测无变性剂存在下的自由能值(ΔGH20)。类似地,解折叠蛋白质(Fu)级分可以根据以下关系式从荧光数据算出(Pace等人,1989)FU=(yf-yiyf-yu)]]>结果为以人工改造(engineer)可用于诊断应用的分子,SAP建模产生若干个氨基酸改变。产生的第一个改变是用Trp取代Tyr27。这可以帮助重新堆积疏水核心并提供一个有用的内源光谱探针。将Gly1变成Met-Cys。这一变化使分子得以经重组方法产生,其中必需一个起始Met以在大肠杆菌中进行转录/翻译。人工产生Cys残基以与添加于位置30的第二个Cys(替换Val30)形成一个稳定的二硫键。用Pro替换Asp11以形成一个对螺旋间环结构域更稳定的纽结,并作为向DNA序列中导入特异Sma I位点的一个途径。类似地,可以将Alal2改成Gly以使DNA序列内的Sma I位点完整。删除序列RHRY,因为该序列涉及APP受体结合。在序列末端添加两个丙氨酸以正确间隔并定向末端半胱氨酸残基。这一最后的Cys用于将SAP肽螯合并正确定向于作为诊断仪器一部分的金或其它固相支持物或表面。
原来的野生型APP序列和最终的SAP氨基酸序列如下所示。改变的残基以粗体字显示。SAP长为35个残基。
SEQ ID NO1 -Wt APPGPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRYSEQ ID NO14 -SAP CPSQPTYPGD PGPVEDLIRF YDNLQQWLNC VTAAC保留的氨基酸中有许多形成与肽的关键接触并在保持肽的稳定性和构象中起作用。附图1示出SAP氨基酸序列以及大肠杆菌密码子偏好的DNA序列。在位于环区中心的残基P11和G12间产生所有插入。这与在核苷酸36和37间的插入对应。
为合成该结构基因,制备一双链DNA序列。为便于克隆进表达载体,将侧翼限制性酶切位点引入到DNA序列中。最终的SAP结构基因双链DNA序列示于附图2。表3所示的寡核苷酸1~6用于构建附图2所示的DNA序列,其中各寡核苷酸对各有一个A和B成员。
表3用于基因构建和PCR反应的寡核苷酸对1~6

SAP的最终GROMOS能量最低化结构示于附图3~5。氨基酸变化未导致结构不稳定,增加的色氨酸加强了螺旋界面核心的疏水性。附图5以空间填充形式示出三个半胱氨酸。Cys2和Cys31之间形成一个二硫键。如将在以下显示的,该二硫键大大提高SAP相对于野生型APP的稳定性。SAP肽,以及SAP-1和SAP-2突变体有效表达并纯化自大肠杆菌。典型的产量(未优化)约为15~25mg/L。
用等温滴定量热法(ITC)测定了SAP、SAP-1、和SAP-2结合牛胰蛋白酶的能力。附图6清楚表明,SAP不具备对胰蛋白酶的天然结合亲和力。在所有试验条件下,未检测到结合。而另一方面如附图7所示,SAP-1显示出对胰蛋白酶的显著结合特异性。
分析附图7的结合等温线得到以下热动力学参数化学计量0.975+/-0.02ΔH(kcal/mol) -26.1+/-1.45ΔS(cal mol-1K-1) -11.6+/-2.2Ka(M-1) 1.65×106+/-4.5×104温度(K) 293
该结果表明,SAP-1和胰蛋白酶间的相互作用是由焓驱动的,也即,ΔH为负。正如ΔS为负值所证明的,该反应不是由熵促成的。然而,由于焓项的数量级大于熵项,TΔS,因此整体自由能(ΔG)为负。在更高的温度下进行结合反应得到以下热动力学参数化学计量0.99+/-0.03ΔH(kcal/mol) -15.4+/-2.05ΔS(cal mol-1K-1) -21.1+/-1.8Ka(M-1) 2.40×106+/-3.7×104温度(K) 303该结合反应由焓促成,不由熵促成,以及由总体能量促成。这使ΔCp为-0.51kcal/mol K,表明结合反应燃烧少量的可靠近表面区域(ΔASA)。这些结果显示,可单纯通过在环区结构域中央插入六个氨基酸来使SAP分子成为有功能的结合试剂。从任意肽组合都可用于改变或变更结合特异性这一意义上来说,SAP试剂是模块式的。试剂的整体结构不改变(亲体骨架),这使它成为广泛诊断检测中的一个相当有用的组分。SAP结构的保守性对于纯化也是一个帮助,它将保存期、以及与在侧流诊断检测中将材料与支持物和珠粒表面相连有关的化学特性标准化。
牛胰蛋白酶和SAP-2间的相互作用示于附图8。插入肽,YKLKYSEQ ID NO18),显示与胰蛋白酶的结合,尽管其亲和力略低于衍生自牛胰蛋白酶抑制剂的肽。仍可用MKPEPS计算机程序(生成由使用者定义的肽文库结构文档)和自动分子对接重新设计结合序列。因此可结合SAP肽与建模软件得到无限数量的新颖抗原(或分析物)结合试剂。图8所示的ITC等温线可用于得到以下SAP-2和胰蛋白酶结合的热动力学参数。
化学计量0.995+/-0.06ΔH(kcal/mol) -31.2+/-2.30ΔS(cal mol-1K-1) -16.2+/-1.22Ka(M-1) 6.4×105+/-5.3×103
概念的验证是用MKPEPS-SAP系统、以适度高的亲和常数、不经任何对插入肽序列的任何优化就可以产生焓驱动的结合反应。通过用MKPEPS产生的簇集于YKLKY(SEQ ID NO18)(或其它前导肽插入序列)周围的序列完成靶向对接反应有可能提高平衡亲和常数。也可能利用对于出自科技或专利文献的肽的SAP系统,或使用象噬菌体展示这样的分子技术。
不同缓冲液中SAP-1和SAP-2与牛胰蛋白酶抑制剂结合的量热分析表明,对于SAP-1未发生质子转移而导致结合(n=0.01),对于SAP-2结合从蛋白质向肽转移了一个质子(n=1.12)。
在含尿素的情况下检测SAP的稳定性,如附图9所示。解折叠曲线对应-3.1kcal/mol的天然自由能以及2.5M尿素的m1/2值。这些数字将用作与SAP环插入突变体的比较依据。解折叠曲线显示,未发生如许多胰多肽所证实的二聚化现象(例如-Kanazawa和Hamaguchi,1986;Chang等人,1980;Noelken等人,1980)。因此,有可能野生型肽中的一个或若干个突变导致产生完全单体的肽。对有用的类抗体诊断试剂来说,这是一个重要的观测现象和必需要求。类抗体试剂与聚苯乙烯或金珠或侧流检测中的捕捉带偶联是单体的并不是倾向于多聚化的,这很重要。
令人惊奇的是,SAP-1比SAP稳定2.0kcal/mol。建模不立即显示自由能变化的结构原因。为了完全理解这一现象,现在正在对该肽进行结晶尝试(Wood等人,1977)。但是,由环插入提供的稳定性使SAP-1更适宜作诊断工作。如附图10所示,SAP-1具有-5.1kcal/mol的天然自由能和和4.0M尿素中相应的m1/2值。
当尿素存在时SAP-2发生解折叠这证明了类似的稳定化现象。附图11示出受尿素浓度影响产生的解折叠级分。等温线分析再次表明SAP-2以相对SAP(0.1kcal/mol相对SAP-1)为2.1kcal/mol的天然状态稳定的。SAP-2解折叠反应的m1/2是4.05M尿素。试验参照的自由能关系式在SAP、SAP-1和SAP-2建模中仅得到定性反映。插入序列中的六个氨基酸出现在上限。分子建模中不明显的短期效应例如溶解反应或许促进肽的稳定性。这样的稳定性在如此大小的肽中是不常见。
SAP-1和SAP-2与结合牛胰蛋白酶的结合动力学反映出ITC试验所阐述的热动力学关系。附图12示出牛胰蛋白酶结合于SAP-1或SAP-2表面的结合等温线。SAP-1/胰蛋白酶反应的动力学速率常数为1.3×105(ka)和1.7×10-2(kd)。SAP-2和胰蛋白酶相互作用的动力学速率常数为8.2×104(ka)和6.9×10-2(kd)。结合等温线清楚的显示,SAP-1和SAP-2可经C-末端半胱氨酸巯基以仍可影响结合的方式被正确导向于某个表面。
肽文库MKPEPS程序在生成用作分子对接程序输入的肽文库方面是非常多样的。该文库的范围可以从完全随机和完全指定,到靶向和部分指定。该随机因素允许试验人员对所有或选定的肽序列空间区域进行采样。该指定因素通过从全部生成的文库(选择因素)中取每个第i个(ith)肽来减少最终文库中的肽总数挑选因素。这减少了对接计算时间。对MKPEPS文库的仔细筛选和对自动对接搜索范围标准的选择是有利的i)缩减整体计算时间,ii)提高得到有意义目标的可能性(也就是,提高对接得分与试验平衡亲和常数的相关性),以及iii)降低对象噬菌体展示这样的大量劳动的依赖性。
MKPEPS程序的设计标准和流程示于表4。
表4.
MKPEPS程序流程图。
1)主程序是一个称作mkpeps的shell脚本。它可以用几个分类符(specifiers)运行。它们都和以下4个版本匹配i)mkpeps Runs @mkpepsii)mkpeps class Runs @outtagsiii)mkpeps peps Runs @outpepsiv)mkpeps help 输出帮助信息2)有三个用Fortran代码程序编译的主程序@mkpeps 根据使用者说明生成一个csd肽文档@outtags 输出@mkpeps所用残基的可能标签/类别@outpeps 输出所有20个氨基酸的简写
3)代码目录包含以下文档(第一栏列出各程序行数)59 classtags.f233 initaa.f101 initpeps.f101 libpeps.f23 mkpeps.f42 outaa.f229 outpep.f12 outpeps.f12 outtags.f46 ran3.f403 setup.f24 aa.h9 peps.h4 tags.h12 98==TOTAL4)@mkpeps流程图表mkpeps----initpeps [在共用模块中将肽初始化]--initaa [从etc/aa20.sd读取aa结构;鉴定 骨架原子并保存于共用模块; 翻译和旋转aa′s s.t.并以N为原 点、NCC在x-z平面内; 在共用模块中将信息初始化]--setup-- | [提供aa使用者界面以设置aa文 | 库] | --classtags [在共用模块中设置aa标记]--outaa [输出outaa.sd,其包含已翻译和旋 转的aa′s]--libpeps | [构建文库并将其输出至一个输出 | 文档]
 | --outpep [构建既定序列的肽结构]5)@outtags流程图表outtags----classtags [在共用模块中建立aa标记]->outtags输出aa标记6)@outpeps流程图表Outpeps----initpeps[在共用模块中将肽初始化]->Outpeps 输出类别7)所有程序的共用模块为aaI(在aa.h中) 包括aa残基的所有整数变量aaC(在aa.h中) 包括aa残基的所有特征变量aaR(在aa.h中) 包括aa原子的三维位置pepback(在aa.h中) 包括aa残基的骨架信息peps(在peps.h中) 包括所有aa’s的单字母名称、三字母名称及全称8)在tags.h中发布与类别/标签相关的变量,尽管为了确保阵列大小一致而将变量通过子程序。
结论该项工作已经表明,有可能人工重造鸟胰多肽以生产可作为潜在的抗体替代物而用于免疫组织化学诊断检测的模块式结合试剂。向结构中引入氨基酸改变以提高分子稳定性并提供附加功能。设计、合成了该新肽的基因序列,并将其在大肠杆菌表达系统中使用以生产肽。产生了SAP系统的两个突变体。第一个突变体包含衍生自牛胰蛋白酶抑制剂的六个氨基酸插入。该分子与牛胰蛋白酶结合。第二个突变体包含用自动肽文库结构形成和分子对接的重新发现的五氨基酸序列。该分子也与牛胰蛋白酶结合。SAP分子非常稳定,这是部分因为重堆积的疏水核心和增加的二硫键。因此,由于可将多至六个氨基酸插入亲体分子的柔性环部分,可用SAP系统生成无限数量的结合试剂。
参考文献Blundell,TL.,Pitts,JE.,Tickle,IJ.,Wood,SP.,和Wu,CW.,(1981),X-ray analysis(1.4 A resolution)of avian pancreatic polypeptideSmall globular protein hormone.Proc.Nat.Acad.Sci.USA.784175-79.
Bjornholm,B.,和Jorgensen,FS.,(1993),Conservation of a helix stabilizing dipolemoment in the PP-fold family of regulatory peptides.Biochem.322954-59.
Bradford,M.M.(1976).A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of dye binding.Anal.Biochem.72,248-254.
Cerda-Reverter,J.M.,和Larhammar,D.,2000,Neuropeptide Y family of peptidesstructure,anatomical expression,function,and molecular evolution,Biochem CellBiol 78(3)371-92.
Clark,M.,Cramer,R.D.,和van Opdensch,N.(1989).J.Computational Chem.10,982-986.
Chang,PJ.,Noelken,ME.,和Kimmel,JR.,(1980),Reversible dimerization of avianpancreatic polypeptide.Biochem.191844-49.
Freire,E.,van Osdol,WW.,Mayorga,OL,和Sanchez-Ruiz,JM.(1990).Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions inproteins.Annu Rev Biophys Biophys Chem.19,159-88.
Fuhlendorff,J.,Johansen,NL.,Melberg,SG.,Thogersen,H.,和Schwartz,TW.(1990),The antiparallel pancreatic polypeptide fold in the binding ofneuropeptide Y to Y1 and Y2 receptors.J.Biol.Chem.26511706-11712.
Gehlert,DR.,Schober,DA.,Beavers,L.,Gadski,R.,Hoffman,JA.,Smiley,DL.,Chance,RE.,Lundell,I.,Larhammar,D.(1996),Characterization of the peptidebinding requirements for the cloned human pancreatic polypeptide-preferringreceptor.Molec.Pharmacol.50112-118.
Gingerich,RL.,Akpan,JO.,Gilbert,WR.,Leith,KM.,Hoffman,JA.,和Chance,RE.(1991),Structural requirements of pancreatic polypeptide receptorbinding.Am J Physiol.261(3 Pt 1)E319-24.
Glover,I.,Haneef,I.,Pitts,J.,Wood,S.,Moss,D.,Tickle,I.,和Blundell,T.,1983,Conformational flexibility in a small globular hormonex-ray analysis of avianpancreatic polypeptide at 0.98-A resolution,Biopolymers 22(1)293-304.
Griko,YV,和Kapanadze,MD.(1995),Purification and characterization of humanpancreatic polypeptide expressed in E.coli.Biochem.And Biophys.Res.Commun.213239-248.
Guex,N.和Peitsch,M.C.(1997).Swiss Model and the Swiss-Pdb Viewer.Anenvironment for comparative protein modeling.Electrophoresis 18,2714-2723.
Hazelwood,RL.,(1990),Pancreatic polyeptide(PP)and its relevant relatives,inProg.Comparat.Endocrinol.Wiley and Sons,p.250-56.
Kanazawa,I.,和Hamaguchi,K.,(1986),Unfolding by temperature and guanidinehydrochloride of chicken pancreatic polypeptide.J.Biochem.100207-212.
Karlsson,R.,和Falt,A.(1997).Experimental design for kinetic analysis of protein-protein interactions with surface plasmon resonance biosensors.J.Immunol.Meths.200,121-33.
Kruger,P.,Strassburger,W.,Wollmer,A.,和van Gunsteren,W.F.,1985,Acomparison of the structure and dynamics of avian pancreatic polypeptide hormonein solution and in the crystal,Eur Biophys J 13(2)77-88.
Laemmli,U.K.(1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4.Nature(London)227,680-685.
MacKerell,AD,(1991),Molecular Modeling and dynamics of biologically activepeptidesApplication to Neuropeptide Y.Methods in Enzymol.202449-470.
Maniatis,T.,Fritch,E.F.,和Sambrook,J.(1981).Molecular CloningA LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.
Miller,J.H.(1972).Experiments in Molecular Genetics.Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.
Noelken,ME.,Chang,PJ.,和Kimmel,JR.,(1980),Conformation and association ofpancreatic polypeptide from three species.Biochem.191838-1843.
O’Shannessy,D.J.,Brigham-Burke,M.,Soneson,K.K,Hensley,P.,和Brooks,I.(1993).Determination of rate and equilibrium biuding constants formacromolecular interactions using surface plasmon resonanceuse of nonlinear least squares analysis methods.Anal.Biochem.212,457-468.
pace,C.N.,Shirley,B.A.,和Thomson,J.A.(1989).In Protein Structure a practicalapproach(T.E.Creighton,Ed.),pp.311-330.IRL Press,Oxford,UK.
Sambrook,J.,Fritch,EF.,和Maniatis,T.(1989).Molecular CloningA LaboratoryManual,2nded.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.
Sanger,F.,Nicklen,S.,和Coulson,A.R.(1977).DNA sequencing with chainterminating inhibitors.Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.74,5643-5647.
Sayle,R.A.和Milner-White,E.J.(1995).RasMolBiomolecular graphics for all.Trends in Biochemical Sciences 20,374-376.
Siegel,LM.,和Monty,KJ.(1966).Determination of molecular weights andfrictional ratios of proteins in impure systems by the use of gel filtration anddensity gradient centrifugation.Application to crude preparations of sulfiteand hydroxylamine reductases.Biochim.Biophys.Acta 112,346-362.
Wood,SP.,Pitts,JE.,Blundell,TL.,Tickle,IJ.,和Jenkins,JA.,(1977),Purification,crystallization and preliminary X-ray studies on avian pancreatic polypeptide.Eur.J.Biochem.78119-26.
Zondlo,NJ,和Schepartz,A.(1999),Highly specific DNA recognition by adesigned miniature protein.J.Am.Chem.Soc.1216938-39.
权利要求
1.稳定的分离肽,其含有与SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一具有至少90%同一性的氨基酸序列。
2.稳定的分离肽,其含有SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一序列。
3.权利要求1或2的稳定分离肽,其中肽具有聚脯氨酸螺旋、短环区以及α螺旋,且其中肽发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。
4.权利要求1或2的稳定分离肽,其中肽比具有SEQ ID NO1的肽更稳定。
5.权利要求1或2的稳定分离肽,其中肽含有与SEQ ID NO11或14具有至少90%同一性的氨基酸序列。
6.稳定的分离肽,其含有SEQ ID NO11或14。
7.权利要求6的稳定分离肽,其中肽具有聚脯氨酸螺旋、短环区以及α螺旋,且其中肽发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。
8.权利要求6的稳定分离肽,其中肽发生折叠并经二硫键进一步稳定。
9.权利要求6的稳定分离肽,其中肽比具有SEQ ID NO1的肽更稳定。
10.分离的核酸,其编码含有与SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一具有至少90%同一性的氨基酸序列的稳定肽。
11.权利要求10的分离的核酸,其中肽含有与SEQ ID NO11或14具有至少90%同一性的氨基酸序列。
12.分离的核酸,其编码含有氨基酸序列SEQ ID NO11或14的稳定肽。
13.权利要求12的核酸,其中核酸含有SEQ ID NO12或13。
14.含有肽骨架和相互作用的结构域的肽基试剂,其中肽骨架含有与SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一具有至少90%同一性的氨基酸序列。
15.含有肽骨架和相互作用的结构域的肽基试剂,其中肽骨架含有SEQ ID NO2~6、8~11或14之中任一序列。
16.权利要求14或15的肽基试剂,其中肽骨架具有聚脯氨酸螺旋、短环区和α螺旋,且其中肽骨架发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。
17.权利要求14或15的肽基试剂,其中肽骨架比具有SEQ IDNO1的肽更稳定。
18.权利要求14或15的肽基试剂,其中肽基试剂比不具有相互作用的结构域的肽骨架更稳定。
19.权利要求14或15的肽基试剂,其中相互作用的结构域是结合结构域、抑制剂结构域、抗原识别肽、接头、标记、固相支持物或酶活性位点。
20.权利要求14或15的肽基试剂,其中相互作用的结构域是含有SEQ ID NO18的肽。
21.权利要求14或15的肽基试剂,其中肽骨架含有与SEQ IDNO11或14具有至少90%同一性的氨基酸序列。
22.含有肽骨架和相互作用的结构域的肽基试剂,其中肽骨架含有SEQ ID NO11或14。
23.权利要求22的肽基试剂,其中肽骨架具有聚脯氨酸螺旋、短环区和α螺旋,且其中肽骨架发生折叠以使聚脯氨酸螺旋与α螺旋产生疏水相互作用。
24.权利要求22的肽基试剂,其中肽骨架发生折叠并经二硫键进一步稳定。
25.权利要求22的肽基试剂,其中肽骨架比具有SEQ ID NO1的肽更稳定。
26.权利要求22的肽基试剂,其中肽基试剂比不具有相互作用的结构域的肽骨架更稳定。
27.权利要求22的肽基试剂,其中相互作用的结构域是结合结构域、抑制剂结构域、抗原识别肽、接头、标记、固相支持物或酶活性位点。
28.权利要求22的肽基试剂,其中相互作用的结构域是含有SEQID NO18的肽。
29.一种方法,包括(a)定义搜索范围,它含有靶蛋白上肽可与之相互作用的相互作用位点;(b)为该肽定义大小;(c)为该肽的氨基酸序列中各位置定义氨基酸类别;(d)用已定义的氨基酸类别中的各成员取代该肽序列氨基酸序列的各位置以生成包括输出肽序列集合的输出文库文档;(e)将输出文库文档传输给分子对接程序以使各输出肽序列集合成员与搜索范围拟合并产生靶蛋白质-肽序列拟合得分;(f)根据靶蛋白质-肽序列拟合得分将输出肽序列集合分级;(g)展示各输出肽序列集合及其关联的靶蛋白质-肽序列拟合得分;其中,一部分输出肽序列集合能够与靶蛋白质稳定相互作用。
30.权利要求29的方法,其中搜索范围含有靶蛋白质中各非氢原子的x-、y-、和z-坐标。
31.权利要求29的方法,其中具有较高靶蛋白质-肽序列拟合得分的输出肽序列能潜在地以较高的亲和力与靶蛋白质结合。
32.权利要求29的方法,其进一步包括接受输入百分数选择以将输出肽序列集合限制在一个确定的百分数;其中输入百分数选择可以限制输出文库文档的大小和文库的复杂性。
33.权利要求29的方法,其中各氨基酸类别各自包括任一遗传编码的L-氨基酸、天然存在的非遗传编码L-氨基酸、合成的L-氨基酸、遗传编码氨基酸的D-对映异构体、天然存在的非遗传编码氨基酸的D-对映异构体、或合成的D-氨基酸。
34.权利要求29的方法,其中各氨基酸类别各自包括任一亲水氨基酸、疏水氨基酸、类半胱氨酸氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、极性氨基酸、芳香族氨基酸、非极性氨基酸或脂肪族氨基酸。
35.权利要求29的方法,其中靶蛋白质为牛胰蛋白酶且输出肽序列之一为YKLKY(SEQ ID NO18)。
36.产生肽序列的系统,包括(a)处理器;(b)与处理器相连的存储器;(c)与处理器相连的显示器;(d)能够在处理器上执行以产生肽序列的肽序列制备组件;(e)能够在处理器上执行以展示肽序列制备组件所用的备氨基酸残基类别的类别输出组件;和(f)能够在处理器上执行以展示肽序列的肽序列输出组件。
37.如权利要求36中所述的系统,其中显示器是打印机。
38.如权利要求36中所述的系统,其中类别输出组件能显示肽序列制备组件所用的各氨基酸残基类别。
39.一种机读介质,它带有与能够指导机器完成方法的相关的内容,该方法包括(a)接收包含靶位上原子坐标集合的搜索范围,肽集合能以不同的亲和力与该靶位结合;(b)接收包括许多氨基酸的肽长度参数;(c)接收定义的、用于沿肽长各位置的拟合的待分析的氨基酸结构类别;(d)生成含有输出肽序列集合的输出文库文档,该输出肽序列集合,其包括定义的、沿肽长各位置的氨基酸结构类别的各氨基酸;(e)继而翻译和旋转与搜索范围相关的肽内各位置上的氨基酸结构类别中的各成员,以随之产生带有靶位-肽序列拟合得分的肽序列;(f)根据靶位-肽序列拟合得分将肽序列分级;和(g)显示所选择的具有相关肽序列的靶位-肽序列拟合得分百分比。
40.如权利要求39所述的机读介质,进一步包括显示输出肽序列的标记。
41.如权利要求39所述的机读介质,进一步包括储存搜索范围。
全文摘要
本发明提供可以向其中引入一个或若干个相互作用的结构域的稳定肽骨架。这样的相互作用的结构域可以是特异结合结构域、抑制剂结构域、接头、标记、固相支持物、反应位点、催化位点、有用的化学实体、及试剂。相互作用的结构域向肽骨架的附着或整合产生肽基试剂。本发明还提供产生可用作相互作用的结构域的肽文库的方法。
文档编号C07K14/435GK1606564SQ02825658
公开日2005年4月13日 申请日期2002年9月13日 优先权日2001年12月20日
发明者S·奎尔克 申请人:金伯利-克拉克环球有限公司
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