专利名称：鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因及其克隆和鉴别方法
技术领域：
本发明属于动物生物工程领域，具体为动物重要功能性基因的克隆。
背景技术：
脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein，FABP)属于脂类结合蛋白超家族的成员，存在于动物体的细胞内，是一类分子量为14-15KD的蛋白。FABP对长链脂肪酸具有很强的结合能力，其主要功能是运输细胞内的长链脂肪酸、调节细胞的生长及分化、细胞的信号传导、基因转录和保护游离脂肪酸的酶解。在哺乳动物中至少有9种FABP已经被分离出来，它们分别是肝脏(L-)FABP、小肠(I-)FABP、心脏(H-)FABP、脂肪(A-)FABP、表皮(E-)FABP、回肠(IL-)FABP、脑(B-)FABP、髓磷脂(M-)FABP和睾丸(T-)FABP。在禽类有至少5种FABP被分离出来，它们分别是肝脏(L-)FABP、小肠(I-)FABP、脂肪(A-)FABP、肌肉(M-)FABP和视网膜(R-)FABP。这些蛋白由126-134个氨基酸组成，并且由第一个被分离的组织而命名。编码这些蛋白的基因具有相同的结构，都是由4个外显子和3个内含子构成，并且外显子的长度基本相同或相近，但内含子的长度变异很大。
哺乳动物脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因在人、小鼠和猪等物种中已经被克隆并且分别被定位到不同的染色体上。人的A-FABP被定位在8q21上；小鼠的A-FABP被定位在3号染色体上；猪的A-FABP被定位在4号染色体上。Gerbens(1998)等研究发现A-FABP基因的多态性与杜洛克猪的肌肉内脂肪含量显著相关。截止到本发明完成并申请时，鸡A-FABP基因的序列未见报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因，本发明的目的还在于提供这种鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因的克隆方法以及鉴别方法，为进一步研究该基因序列的变异与鸡重要经济性状间的关联奠定基础。
本发明的鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因由4个外显子、3个内含子构成。
其基因序列为1 GATCCTCACA GCTTCTGTTT CTGCTTGATC CTGTGAAAGA CTGCTACCTG GCCTGACAAA61 ATGTGCGACC AGTTTGTGGG CACCTGGAAG CTCCTTTCTA GTGAAAACTT CGAGGACTAT121ATGAAAGAGC TGGGTGAGAA ATGTTACCTG AAATTATTGT GTCTGGGGAA GGGAGGGAAT181GCTGAACTTG AGCTCTATTC CTTACTTGCT TTTTCAGTCT ATGCTGTTTA CCAAGGTCTT241TTTAGTCCAA CTACTTTTAT TAAATAGTTC TAAACTGGAA AACTTGGCTG TTTGGATTAG301CGTTGTCACA TTCCTATAAC ATAGGAAAGC TTGACTGGGA GGAATAGTTT CAGGTAGGCC361AAGTCTATGC ATGCCTAACT GCTAGTGCTA TAAATGAAAG TAAACACTTT GCTGCAGTAT421TTTATGTGAA TTTGCTTTTA AACTTTTGGA AGTACAAAGT GATGTAATGC TAGAATGCAG481GAAGCTTCTC TGTGTCTATG AGCAACACAC CTAAATTTGC TCTTGGACTA GGACACTGAT541TAATTGTCAT GGCTATTATA GTAAGTGAAT GAAACTCTGC GATTGCCTCC AGTGAATATT601AACAAAGAAA GTTGCACAGA TTCATGACAG GTACTGCAGT ATACCTGCAA AAGTATTCAA661GGAATAACAC TCTAAAGGTG TTGACTTCTC ACTTAGAATT AAATCTGGGC TTTAAAATTT721TCCGTATTCC AGTAGGATGG GGGAAGTATG GGGTAACTTG TACTGTTTGG ATCAATCCAG781GGAGTTATTT GGAGATTAAG GGTAAAACAC TCACTGAAAG TTCTGCAGCA TGCATTCAGA841TGGCTTTCAG TGAGATTCTT GCACTCTTCA TCTTTACCCC AGATTCTACT CAGGACATAA901GAGTTGCCAG CTATTTCTTA ATCATTTCCT TTCATTCAGC CTAGCCACCG ATAAATATAT961CTGCAATTTA AGTGATTTTT TATTTGTTTG TTTTTGTGGC TTACAAACTG TTGTACGTTT1021 CTGCTTATTT ATTTTTAGAT ATAGTTAGCA CACAAGTTAG GGCATAAATC ACTGCGGTTG1081 TCTGGAGCAA GTACATATGC AAATATCTGG CACTGAAACT TTGTCTCAGT CTTCAAAATG1141 TTGCTTTTGC TACTCCAACA ACAGAGCATG CAATTGCCTT GTCTCATCCC ATCTGGCTTG1201GTCGATAGAC ATACTAGCTA ATGAGATGCT ACAACAGAAC CTCTACTACA TAGTATTAAT1261AACAAAAATA AATAAATAAA TAAATAGAAA GTGATGGGGA GAGTCTCTTA TTTTCCCCAG1321ATAAGAGAAA ATCATGGAGA TAAAACTTTC ATAGTGTCCT TTTTTATTTA CAGGTGTGGG1381GTTTGCTACC AGGAAGATGG CTGGTGTGGC CAAGCCTAAT TTAACTATCA GCATCAATGG1441TGATGTGATA ACCATCAGAT CAGAAAGTAC CTTCAAAAAT ACAGAGATCT CTTTCAAGCT1501GGGTGAAGAG TTTGATGAGA CCACAGCAGA TGACAGAAAA ACAAAGGTGA GTCCAAAAAT1561GGCATTTTCC AACTGTATAT ATTTCAAAAA GATTGTCGGA TAAGGAGGGC AGAGTTGCTG1621TTTTGACATC CACTCTTGAA ATGCTGCCTT CAAAGGTAAA CGTGCTCAGA TTGTTTTTTG1681CTTCAGCACT TTTTGGACAT GGAGACAGTC TCCTCTTTGG TCCAAAGCAC CCTGATGAAA1741TAGTCATGCT TTGCTTTTTT CCTCTGCAGA ATGTCATAAC CCTAGACAGT GGCACACTGA1801AGCAGGTGCA GAAGTGGGAT GGCAAAGAGA CCGTTATCAA GAGAAAAGTG GTGGATGGGA1861ACCTGCTGGT GGTGAGTTCT TTTTTGCTAA TCACAGAACT CACTGTGCAG AATGCTGTTT1921TGATGGATGT ATTACACTGG ATTCAAACAC GGGGAATAAA AACATCTGAA AAGACTAGGC1981ACTGAGTAAG AAGTCTTTCT GGAAAAGTCT GGAGCATGTA TTAAAACTGA AAGGATCTTA2041TACTTATGGA ATGGTATAGA GGTATCTGCA TTCCATCCAT AACAAGAAAT GGTTAGGAAG2101GAATAGGGTG AAATATAATC TCAATAAGGG AAATGTTTAA ATTTTATAAT CTTAAAGTCC2161TGGACAGGAT AGAGGATGCA TTAACAAAGT CCATGTTAGG TGTACCCTCT CTGACACAAA2221ATACTTCTGT TCATCTCCAG TATACCCCCC ATAGCAATGT CTGAGGGCCA TGTTGCAGAC2281TACCAGTAAC CATGTCAGTG CTATGATGCT ATGATGTAGC AAATAAAATA AAAAGAAAAA2341AAAAAGTAAT CTGTATCTGA TCCCCTTTGA TTGATGTTAT CTGGGCAGAC AGCACTGTGC2401TTGACTGGGT ACCAGTGAGG CTCAGCTGCA GTTTGGGGTT TCCCAATTTG CTCTCCAGTT2461TAAGGAAAAA CACTTTGAAA TACCTGGGGG AGAACTAATG ATGTCTTTGT AAAAGGCAGC2521TGGGATTCCT ACATGCTAGA AAATGATACA CACACATTAA ATTCTTGTAG AGTTCTGCCT2581TCCCTAGAGG AAATGATGTG TCTACAAATT TAGTACTTAA ATTTATTTGG ATGAAGACCA2641GAGGAGAATA AATAAAAAGT AGTTTTTAAT AACAACTTCA TTAGAAAAGA CTGAAGAAAA2701CAGAATTTGA TCTAGCAGAA AAATAGATGA AGACAGAGCC TAAAATGCAG AGGATGACAC2761ATGCAGCTGG AAGTTGTGTA GGACTCCGTG TATGTGTTAT ACACTCATAT GGAGAAGATG2821AGCCACAGAT GGAGAAGGTG AGGGGACAAG AGACAACTGC CTAGTTCCAA AATGCTCCTT2881GGGTGTTCCA GAAGCCTTCT TTAAGAGACT AGAGATCTTC TGGGGAGGCC AAAGCAGTCC2941TTTGATGTTG CTTTAGTCCT ACGCTTCTAT GAATATTTTA GACTTTTATT TTTGAAGCTT3001CCAACATTGA GTTTCACCGT TTTGGCAATT GTTCTTGAAA GAGGAGAAAT GCAAATTCTT3061TCTTGCATTG GCTCCCAGTG CATAAGTAGT TCTCTACCTT CTAACTCACA AATATGCAGT3121GAGACTTAAA AGCTGATTAA ATTTGCATTT CTTTCCAGGA ATGCACCATG AATAATGTTA3181CCAGCAAAAG AGTTTACGAA AGAGCATGAG GAAGCCGTCT TCATGTGGGA CTGATGCTGA3241AGGCTGAACA AAAACAACTT CACTGAAGGA GAAAGACTCC ACAAATACAT TTTGAACAGA3301ACTGCACTTT TTACAGATGT ATTCCCTCAA AATTACATGC AACTAGCCTA ATTTGTTGTG3361GCTATTCAAT AAACGATTCT GCTTTCTAC本发明的鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因的克隆方法是取鸡腹部脂肪组织，利用TRIZOL试剂盒提取总RNA。用反转录试剂盒将脂肪组织总RNA反转录为cDNA第一条链，反转录反应体系为反应体系中包含1μl脂肪组织总RNA、1×反转录反应缓冲液、2.5pmol oligo dT-adaptor引物、0.2mM dNTP、1U/μl RNase抑制剂、5U禽源反转录酶，加水至总体积为20ul。反应条件为42℃时温育60分钟，99℃时5分钟。根据哺乳动物A-FABP基因序列的保守区设计一对引物MF和MR，对脂肪组织cDNA第一条链进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含cDNA模板1μl、1×PCR反应缓冲液、引物MF和MR各5pmol、0.16mM dNTP和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul。PCR反应条件为94℃预变性5分钟、94℃50秒、55℃1分钟、72℃1分钟共30个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，有一条大约160bp的特异性片段，将特异性片段回收并连接到PMD18-T载体上，之后转化到大肠杆菌DH5α菌株中，筛选出阳性克隆，测序后得到一条163bp的核苷酸序列，将其编号为MFMR；利用3’RACE方法获得MFMR核苷酸序列3’方向序列。根据MFMR核苷酸序列再设计一条上游引物AFF2，利用反转录引物oligo dT-adaptor上的M4序列作为下游引物，用这对引物对脂肪组织cDNA第一条链进行PCR扩增，反应体系中包含cDNA模板1μl、1×PCR反应缓冲液、引物MF和MR各5pmol、0.16mM dNTP和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul。PCR反应条件为94℃预变性5分钟、94℃30秒、50℃30秒、72℃1分钟共35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，有一条大约500bp的特异性片段，将该片段回收并测序，得到一条541bp的核苷酸序列，编号为AFF2M4。
利用5’RACE方法获得MFMR核苷酸序列5’方向序列，根据MFMR和AFF2M4核苷酸序列再设计三条引物，分别为AF5’F、AF5’R和AFR3，利用这三条引物将MFMR序列的5’端扩增出来。第1步，将AFR3引物5’端磷酸化，其方法为向20ul反应液中加入2ul 10×T4多聚核酸激酶缓冲液、50pmol去磷酸化引物、1nmol ATP、1ul(10U/ul)T4多聚核酸激酶，加水至20ul。将上述的反应液置于37℃中温育30分钟后用无水乙醇沉淀，溶于5ul去离子水中备用；第2步，用5’端磷酸化AFR3引物代替oligo dT-adaptor反转录引物将鸡脂肪组织RNA反转录为cDNA第一条链，反转录之后向反应液加入1μl RNase H在37℃温育60分钟，然后用无水乙醇沉淀备用；第3步，环化cDNA第一条链，在已沉淀的cDNA第一条链的管中加入5μl 10×连接缓冲液、31μl 40％的PEG6000、1μl(40U)T4连接酶，加水至50μl，将混合液置于16℃温育24小时，然后取出备用或-20℃保存；第4步，用AF5’F、AF5’R引物对环化的cDNA第一条链进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含环化的cDNA混合液2μl，1×PCR反应缓冲液，引物AF5’F和AF5’R各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul。PCR反应条件为94℃预变性5分钟、94℃30秒、52℃30秒、72℃1分钟共35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，有一条大约350bp的特异性片段。将该片段利用上述的方法回收并测序，得到一条342bp的核苷酸序列，编号为AF5’FAF5’R将上述3个片段的核苷酸序列拼接起来，得到一条完整的mRNA序列。
本发明的鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因可以通过检测其是否在鸡的基因组中存在、组织特异性表达及在不同品种和周龄间的表达差异来鉴别。
鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因是否在鸡的基因组中存在采用如下方法来鉴别为了验证上述序列确实存在于鸡的基因组中，本发明利用MFMR序列与鸡基因组DNA的Southern杂交来加以证实。将鸡的基因组30ug平均分成3管，分别用限制性内切酶Bgl II单酶切，EcoR I单酶切，BamH I和Hind III双酶切，酶切体系均为100ul，其中包含限制性内切酶10ul、10×酶切缓冲液10ul和去离子水，酶切反应条件为37℃12小时，反应结束后用无水乙醇沉淀，之后溶于30ul去离子水中备用，将酶切之后的DNA在0.8％琼脂糖凝胶电泳后转移到尼龙膜上，具体操作参考《分子克隆第二版》的说明。用DIG标记与检测试剂盒将MFMR序列标记成探针，并与含有鸡基因组的尼龙膜进行杂交，然后检测杂交信号，具体操作参考DIG标记与检测试剂盒的说明书。Southern Blot结果如图4所示，在BamH I和Hind III双酶切的泳道上杂出一条大约2.7kb的信号带，在EcoR I单酶切的泳道上杂出一条大于10kb的信号带，在Bgl II单酶切的泳道上有两条大约2.2kb和4.5kb的信号带，原因是探针序列中有一个Bgl II酶切位点，而没有BamH I、Hind III和EcoR I酶切位点，结果表明鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因序列存在于鸡的基因组中。
鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因的组织特异性表达采用如下方法来家别1.RT-PCR方法取8周龄肉鸡的心脏、肝脏、脾、肺、肾脏、胃、小肠、脑、胸肌、腹脂10种组织，分别提取总RNA，具体方法参照TRIZOL试剂盒说明书。用反转录试剂盒将分别将上述10种组织总RNA反转录为cDNA第一条链，反转录引物为oligo dT-adaptor。然后用AFF0和AFR3引物对上述10种组织的cDNA第一条链进行PCR扩增，扩增片断长度358bp，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含cDNA模板1μl，1×PCR反应缓冲液，引物各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul，PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟共30个循环，最后72℃延伸7分钟，根据鸡的GAPDH基因序列设计并合成引物GF和GR，同时对上述10种组织的cDNA第一条链进行PCR扩增，扩增片段长度为491bp左右，作为PCR扩增时的阳性对照，PCR反应体系及反应条件与上同，PCR结束后进行1％的琼脂糖凝胶电泳，并将同一组织的两种PCR产物置于同一胶孔中同时电泳，结果如图5所示，鸡GAPDH基因在10种组织中都有扩增产物，而鸡A-FABP基因只在腹脂中有扩增产物，表明鸡A-FABP基因只在脂肪组织中表达。
2.Northern Blot方法为了证实鸡A-FABP基因确实只在脂肪组织中表达，再通过NorthernBlot进行验证。取8周龄肉鸡的脑、胸肌、肝脏、腹脂、肾脏、心脏和肺7种组织，分别提取总RNA，在1％甲醛凝胶上电泳(图6)，之后转到尼龙膜上，具体操作参考《分子克隆第二版》的说明。用32P-dCTP将MFMR片段标记成探针，具体操作参考随机引物标记探针试剂盒说明书，之后与尼龙膜杂交、洗膜、压片、显影和定影，具体操作参考《分子克隆第二版》的说明。NorthernBlot结果如图7所示，结果显示只在腹脂上有杂交信号，证明该基因只在脂肪组织中表达。
鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因在不同品种和周龄间的表达差异采用如下方法来鉴别为了进一步了解鸡A-FABP基因的表达规律，本发明通过半定量RT-PCR法检测该基因在6、8周龄蛋鸡和肉鸡脂肪组织中的表达。分别取6周龄、8周龄的蛋鸡和肉鸡各两只，提取脂肪组织总RNA，反转录之后作为PCR的模板(反转录引物为oligo dT-adaptor)。用鸡A-FABP基因的AFF0和AFR3引物和GAPDH基因的GF和GR引物对反转录产物分别在同等条件下进行扩增，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含cDNA模板2μl(相当于100ng总RNA)，1×PCR反应缓冲液，引物各5pmol，0.16mM dNTP和1 U Taq polymerase，加水至总体积为25ul，PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟共26个循环，最后72℃延伸7分钟，取5ulPCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示。将凝胶上的条带根据亮度和面积进行量化分析，结果如图9所示，该结果未见到鸡A-FABP基因在不同品种和周龄间有明显的差异和规律，将cDNA模板10倍稀释之后继续用鸡A-FABP基因的AFF0和AFR3引物及GAPDH基因的GF和GR引物对反转录产物进行扩增，PCR反应体系及反应条件同上。取5ulPCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图10所示，将凝胶上的条带根据亮度和面积进行量化分析，结果如图11所示。结果显示该基因在8周龄肉鸡脂肪组织中的表达量显著高于同周龄时的蛋鸡和6周龄时肉鸡的表达量。
本发明在于提供一种鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein，A-FABP)基因全序列，其中包括部分5’侧翼区、4个外显子、3个内含子和部分3’侧翼区。基因序列如列在后面的序列表(序列标识号2)所示。本项发明的关键在于提取高质量的组织总RNA，并且有效的实施了3’RACE和5’RACE的方法获得鸡A-FABP基因全长cds，进而获得鸡A-FABP的基因组序列。
本发明还涉及到A-FABP基因在不同品种、周龄鸡间的表达特点和规律，该基因只在鸡的脂肪组织中表达，并且该基因在8周龄肉鸡的表达量高于同周龄的蛋鸡和6周龄肉鸡的表达量。获得本项发明的关键在于选择合适的基因作为参照，本项发明选用鸡GAPDH基因作为对照基因，该基因在不同品种和不同时期鸡的各种组织中基本恒定表达。另外有效的控制PCR体系和扩增条件也是取得本项发明的关键之处，通过控制PCR的循环次数可以将PCR产物控制在指数增长期，这样就保证了PCR产物能有效地反映模板中目的基因的含量。
本发明克隆了鸡A-FABP基因，并研究了该基因在不同组织中的表达特点和在不同品种、周龄间的表达规律，为进一步研究该基因序列的变异与鸡重要经济性状间的关联奠定了基础，同时对研究该基因的体外表达、蛋白结构及功能具有重要意义。
图1是实施例1中所述的PCR产物1％琼脂糖电泳分析结果。
第1泳道为回收的PCR产物；第2-4泳道为PCR扩增产物；第5泳道为阴性对照；第6泳道为分子量标准(pBR322/HaeIII).
图2是实施例1中所述3’RACE的PCR产物1％琼脂糖电泳分析结果。
第1泳道为DL2000marker；第2泳道为空白对照；第3-7泳道为PCR产物。
图3是实施例1中所述5’RACE的PCR产物1％琼脂糖电泳分析结果。
第1泳道为DL2000 marker；第2泳道为空白对照；第3-7泳道为PCR产物。
图4是鸡A-FABP基因与鸡基因组的Southern杂交结果。
第1泳道为BamH I和HindIII双酶切的结果；第2泳道为EcoR I酶切基因组的杂交结果；第3泳道为Bgl II酶切基因组的杂交结果.
图5是鸡A-FABP基因在10种组织中的RT-PCR结果。
第1泳道为DL2000marker.第2-11泳道依次为心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、胸肌、腹脂。
图6是鸡7种组织总RNA的甲醛变性凝胶电泳结果。
1脑；2胸肌；3肝脏；4腹脂；5肾脏；6心脏；7肺图7是鸡A-FABP基因与7种组织总RNA的Northern杂交结果。
1脑；2胸肌；3肝脏；4腹脂；5肾脏；6心脏；7肺图8是鸡A-FABP基因在不同品种、周龄鸡脂肪组织中的RT-PCR检测结果。模板浓度为100ng/25ul时的结果。1.DL2000marker；2.阴性对照；3. 6周龄肉鸡；4. 6周龄蛋鸡；5.8周龄肉鸡；6. 8周龄蛋鸡图9模板浓度为100ng/25ul时的量化分析结果。
图10是鸡A-FABP基因在不同品种、周龄鸡脂肪组织中的RT-PCR检测结果。模板浓变为10ng/25ul时的结果。1.DL2000marker；2.阴性对照；3. 6周龄肉鸡；4. 6周龄蛋鸡；5.8周龄肉鸡；6. 8周龄蛋鸡图11模板浓度为10ng/25ul时的量化分析结果。
(五)具体实施方案下面举例对本发明作更详细的描述以下为实施例1、2中所用的实验材料菌种、质粒和工具酶DH5α其基因型为supE44 ΔLac169(Ф80 LacZ ΔM15)hsdR17 RecA endA1 gyrA98 thi-1 recA1PMD18-T载体试剂盒内含PMD18-T质粒、Solution I和Control DNA。购自大连宝生物有限公司。DNA聚合酶及dNTP购自Promega Corporation，USA。蛋白酶K购自美国BRL公司。反转录试剂盒(TaKaRa RNA PCR Kit Ver.2.1)及限制性内切酶购自大连宝生物有限公司。T4多聚核酸激酶及单链RNA连接酶购自Promega Corporation，USA。化学试剂三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸钠(EDTA)、Tris饱和酚、琼脂糖(Agrose)、十二烷基磺酸钠(SDS)购自北京鼎国生物技术发展中心。三氯甲烷、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、乙酸、硼酸北京化工厂生产。酵母浸出物、胰蛋白胨英国Oxoid公司产品。IPTG、X-gal、Ampr购自华美生物工程公司。DNA Marker(DL2000，pBR322/HaeIII)购自大连宝生物有限公司。胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海华舜生物公司。鲑鱼精子DNA、随机引物标记探针试剂盒、TRIZOL试剂盒购自GIBICOL公司。地高锌标记与检测试剂盒、ExpressHsyb杂交液、探针纯化试剂盒和核酸杂交尼龙膜AmershamPharmcia公司产品。32P同位素，北京亚辉公司。鸡血样、组织样和寡核苷酸引物以AA肉鸡、海兰蛋鸡各2只为实验材料，分别于6周龄和8周龄时采脑、胸肌、肝脏、腹脂、肾脏、心脏、肺、脾、小肠和肌胃10种组织，-70℃保存；同时翅静脉采血，EDTA钠抗凝，提取基因组DNA之后，TE溶解，-20℃保存。以下引物由上海博亚生物公司合成MF5’-CTGGTGTGGGTTTTGCTACC-3’；MR5’-TCATCTGCTGTTGTCTCATC-3’AFF25’-TGGGTGTGGGGTTTGCTACC-3’M45′-TCATCTGCTGTTGTCTCATC-3′AF5’F5’-ACTGAAGCAGGTGCAGAA-3’AF5’R5’-TGCTGTGGTCTCATCAAACT-3’AFR35’-CCATCCACCACTTTCCTCTT-3’AFF05’-AGACTGCTACCTGGCCTGACA-3’AFF3 5’-GGTCCA AAGCACCCTGATGA-3’AFR4(5’-TTGTTCGCCTTCGGATCAG-3’GF5’-TGACGTGCAGCAGGAACAC-3’，GR5’-CAGTTGGTGGTGCACGATG-3’实施例1鸡A-FABP基因的克隆取鸡腹部脂肪组织，利用TRIZOL试剂盒提取总RNA，具体方法参照TRIZOL试剂盒说明书。用反转录试剂盒将脂肪组织总RNA反转录为cDNA第一条链。反转录反应体系为反应体系中包含1μl脂肪组织总RNA、1×反转录反应缓冲液、2.5pmol oligo dT-adaptor引物、0.2mM dNTP、1U/μl RNase抑制剂、5 U禽源反转录酶，加水至总体积为20ul。反应条件为42℃时温育60分钟；99℃时5分钟以灭活反转录酶。根据哺乳动物A-FABP基因序列的保守区设计一对引物MF和MR，对脂肪组织cDNA第一条链进行PCR扩增。PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含cDNA模板1μl，1×PCR反应缓冲液，引物MF和MR各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul。PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃，50秒；55℃，1分钟；72℃，1分钟共30个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图1所示，有一条大约160bp的特异性片段。将特异性片段回收并连接到PMD18-T载体上，之后转化到大肠杆菌DH5α菌株中，筛选出阳性克隆，由上海联合基因有限公司测序，得到一条163bp的核苷酸序列，将其编号为MFMR。该序列与猪的心脏脂肪酸结合蛋白基因有68％的同源性，与猪的脂肪型脂肪酸结合蛋白基因有75％的同源性。
利用3’RACE方法获得MFMR核苷酸序列3’方向序列。根据上述获得的MFMR核苷酸序列再设计一条上游引物AFF2，利用反转录引物oligo dT-adaptor上的M4序列作为下游引物。用这对引物对脂肪组织cDNA第一条链进行PCR扩增。PCR反应体系同上，PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟共35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图2所示，有一条大约500bp的特异性片段。将该片段利用上述的方法回收并测序，得到一条541bp的核苷酸序列，编号为AFF2M4。分析这段核苷酸序列得知，该序列与MFMR序列为同一基因序列，并且是MFMR序列在3’方向的继续延伸。
利用5’RACE方法获得MFMR核苷酸序列5’方向序列。根据上述获得的MFMR和AFF2M4核苷酸序列再设计三条引物，分别为AF5’F、AF5’R和AFR3，利用这三条引物将MFMR序列的5’端扩增出来。第1步，将AFR3引物5’端磷酸化，其方法为向20ul反应液中加入2ul 10×T4多聚核酸激酶缓冲液、50pmol去磷酸化引物、1nmol ATP、1ul(10U/ul)T4多聚核酸激酶，加水至20ul，将上述的反应液置于37℃中温育30分钟后用无水乙醇沉淀，溶于5ul去离子水中备用。第2步，用5’端磷酸化AFR3作为反转录引物将鸡脂肪组织RNA反转录为cDNA第一条链，反应体系与反应条件除用AFR3代替oligo dT-adaptor外，其它均同上.反转录之后向反应液加入1μlRNase H在37℃温育60分钟，然后用无水乙醇沉淀备用。第3步，环化cDNA第一条链，在已沉淀的cDNA第一条链的管中加入5μl 10×连接缓冲液、31μl 40％的PEG6000、1μl(40U)T4连接酶，加水至50μl，将混合液置于16℃温育24小时，然后取出备用或-20℃保存。第4步，用AF5’F、AF5’R引物对环化的cDNA第一条链进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含环化的cDNA混合液2μl，1×PCR反应缓冲液，引物AF5’F和AF5’R各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul。PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃，30秒；52℃，30秒；72℃，1分钟共35个循环，最后72℃延伸7分钟。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，结果如图3所示，有一条大约350bp的特异性片段。将该片段利用上述的方法回收并测序，得到一条342bp的核苷酸序列，编号为AF5’FAF5’R。分析这段核苷酸序列得知，该序列与MFMR序列为同一基因序列，并且是MFMR序列在5’方向的继续延伸。
将上述3个片段的核苷酸序列拼接起来，得到一条完整的mRNA序列，如序列表中序列标识号1所示，该序列中包含一个399bp的基因开放阅读框，分析该开放阅读框，与猪和人的脂肪型脂肪酸结合蛋白的编码区序列同源性分别为73.68％和73.43％，因此将该序列命名为鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因。
为了验证上述序列确实存在于鸡的基因组中，本发明利用MFMR序列与鸡基因组DNA的Southern杂交来加以证实。将鸡的基因组30ug平均分成3管，分别用限制性内切酶Bgl II单酶切，EcoR I单酶切，BamH I和HindIII双酶切.酶切体系均为100ul，其中包含限制性内切酶10ul、10×酶切缓冲液10ul和去离子水。酶切反应条件为37℃12小时。反应结束后用无水乙醇沉淀，之后溶于30ul去离子水中备用。将酶切之后的DNA在0.8％琼脂糖凝胶电泳后转移到尼龙膜上，具体操作参考《分子克隆第二版》的说明。用DIG标记与检测试剂盒将MFMR序列标记成探针，并与含有鸡基因组的尼龙膜进行杂交，然后检测杂交信号，具体操作参考DIG标记与检测试剂盒的说明书。Southern Blot结果如图4所示，在BamH I和HindIII双酶切的泳道上杂出一条大约2.7kb的信号带，在EcoR I单酶切的泳道上杂出一条大于10kb的信号带，在Bgl II单酶切的泳道上有两条大约2.2kb和4.5kb的信号带，原因是探针序列中有一个Bgl II酶切位点，而没有BamH I、Hind III和EcoR I酶切位点。该结果表明上述基因序列存在于鸡的基因组中。
为了获得鸡A-FABP基因的内含子序列，本发明根据鸡A-FABP基因mRNA序列又设计了AFF0、AFF3和AFR4引物。AFF0与AF5’R配对使用扩增第1内含子，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含鸡基因组DNA(50ng/ul)1μl，1×PCR反应缓冲液，引物各5pmol，0.16mMdNTP，和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul。PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃，30秒；56℃，40秒；72℃，2分钟共35个循环，最后72℃延伸7分钟。AFF2与AFR3配对使用扩增第2内含子，PCR反应体系及反应条件除引物和退火温度为60℃外，其它与扩增第1内含子相同。AFF3和AFR4配对使用扩增第3内含子，PCR反应体系及反应条件除引物和退火温度为54℃外，其它与扩增第1内含子相同。将上述3个PCR产物回收并测序，方法与上同。将这3个核苷酸序列与鸡A-FABP的mRNA序列拼接起来构成鸡A-FABP基因组基因序列，如序列表中序列标识号2所示。
实施例2鸡A-FABP基因的表达规律及特点取8周龄肉鸡的10种组织(心脏、肝脏、脾、肺、肾脏、胃、小肠、脑、胸肌、腹脂)，分别提取总RNA，具体方法参照TRIZOL试剂盒说明书。用反转录试剂盒将分别将上述10种组织总RNA反转录为cDNA第一条链，反转录引物为oligo dT-adaptor，方法与实施例1中同。然后用AFF0和AFR3引物对上述10种组织的cDNA第一条链进行PCR扩增，扩增片断长度358bp，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含cDNA模板1μl，1×PCR反应缓冲液，引物各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul。PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟共30个循环，最后72℃延伸7分钟。根据鸡的GAPDH基因序列设计并合成引物GF和GR，同时对上述10种组织的cDNA第一条链进行PCR扩增，扩增片段长度为491bp左右，作为PCR扩增时的阳性对照，PCR反应体系及反应条件与上同。PCR结束后进行1％的琼脂糖凝胶电泳，并将同一组织的两种PCR产物置于同一胶孔中同时电泳，结果如图5所示，鸡GAPDH基因在10种组织中都有扩增产物，而鸡A-FABP基因只在腹脂中有扩增产物，该结果表明鸡A-FABP基因只在脂肪组织中表达。
为了证实鸡A-FABP基因确实只在脂肪组织中表达，再通过Northern Blot进行验证。取8周龄肉鸡的7种组织(脑、胸肌、肝脏、腹脂、肾脏、心脏和肺)，分别提取总RNA，方法同上，在1％甲醛凝胶上电泳(图6)，之后转到尼龙膜上，具体操作参考《分子克隆第二版》的说明。用32P-dCTP将MFMR片段标记成探针，具体操作参考随机引物标记探针试剂盒说明书，之后与尼龙膜杂交、洗膜、压片、显影和定影，具体操作参考《分子克隆第二版》的说明。Northern Blot结果如图7所示，结果显示只在腹脂上有杂交信号，因此证明该基因只在脂肪组织中表达。
为了进一步了解鸡A-FABP基因的表达规律，本发明通过半定量RT-PCR法检测该基因在6、8周龄蛋鸡和肉鸡脂肪组织中的表达。分别取6周龄、8周龄的蛋鸡和肉鸡各两只，提取脂肪组织总RNA，反转录之后作为PCR的模板。RNA提取及反转录反应与上同(反转录引物为oligodT-adaptor)。用鸡A-FABP基因的AFF0和AFR3引物和GAPDH基因的GF和GR引物对反转录产物分别在同等条件下进行扩增，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含cDNA模板2μl(相当于100ng总RNA)，1×PCR反应缓冲液，引物各5pmol，0.16mM dNTP和1U Taqpolymerase，加水至总体积为25ul。PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟共26个循环，最后72℃延伸7分钟。取5ulPCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示。将凝胶上的条带根据亮度和面积进行量化分析，结果如图9所示，该结果未见到鸡A-FABP基因在不同品种和周龄间有明显的差异和规律。将cDNA模板10倍稀释之后继续用鸡A-FABP基因的AFF0和AFR3引物及GAPDH基因的GF和GR引物对反转录产物进行扩增，PCR反应体系及反应条件同上。取5ulPCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图10所示，将凝胶上的条带根据亮度和面积进行量化分析，结果如图11所示。结果显示该基因在8周龄肉鸡脂肪组织中的表达量显著高于同周龄时的蛋鸡和6周龄时肉鸡的表达量。
序列表序列标识号1序列类型核苷酸序列长度654bp链数单链分 子 型mRNA-cDNA特征从1bp至60bp为5’UTR，从61bp至459bp为编码区，从460bp至639bp为3’UTR，从639p以后为polyA。来源鸡脂肪组织性质鸡A-FABP基因mRNA序列1GATCCTCACA GCTTCTGTTT CTGCTTGATC CTGTGAAAGA CTGCTACCTG GCCTGACAAA61 ATGTGCGACC AGTTTGTGGG CACCTGGAAG CTCCTTTCTA GTGAAAACTT TGAGGACTAT121 ATGAAAGAGC TGGGTGTGGG GTTTGCTACC AGGAAGATGG CTGGTGTGGC CAAGCCTAAT181 TTAACTATCA GCATCAATGG TGATGTGATA ACCATCAGAT CAGAAAGTAC CTTCAAAAAT241 ACAGAGATCT CTTTCAAGCT GGGTGAAGAG TTTGATGAGA CCACAGCAGA TGACAGAAAA301 ACAAAGAATG TCATAACCCT AGACAGTGGC ACACTGAAGC AGGTGCAGAA GTGGGATGGC361 AAAGAGACTG TTATCAAGAG AAAAGTGGTG GATGGGAACC TGCTGGTGGA ATGCACCATG421 AATAATGTTA CCAGCAAAAG AGTTTACGAA AGAGCATGAG GAAGCCGTCT TCATGTGGGA481 CTGATGCTGA AGGCTGAACA AAAACAACTT CACTGAAGGA GAAAGACTCC ACAAATACAT541 TTTGAACAGA ACTGCACTTT TTACAGATGT ATTCCCTCAA AATTACATGC AACTAGCCTA601 ATTTGTTGTG GCTATTCAAT AAACGATTCT GCTTTCTACA AAAAAAAAAA AAAA序列标识号2序列类型核苷酸序列长度3389bp链数单链分 子 型基因组DNA特征从1bp至60bp为5’侧翼区，从61bp至133bp为外显子1，从134bp至1373bp为内含子1，从1374bp至1546bp为外显子2，从1547bp至1769bp为内含子2，从1770bp至1871bp为外显子3，从1872bp至3158bp为内含子3，
从3159bp至3209bp为外显子4，从3210bp至3389bp为3’侧翼区。来源鸡血液DNA性质鸡A-FABP基因序列1 GATCCTCACA GCTTCTGTTT CTGCTTGATC CTGTGAAAGA CTGCTACCTG GCCTGACAAA61 ATGTGCGACC AGTTTGTGGG CACCTGGAAG CTCCTTTCTA GTGAAAACTT CGAGGACTAT121ATGAAAGAGC TGGGTGAGAA ATGTTACCTG AAATTATTGT GTCTGGGGAA GGGAGGGAAT181GCTGAACTTG AGCTCTATTC CTTACTTGCT TTTTCAGTCT ATGCTGTTTA CCAAGGTCTT241TTTAGTCCAA CTACTTTTAT TAAATAGTTC TAAACTGGAA AACTTGGCTG TTTGGATTAG301CGTTGTCACA TTCCTATAAC ATAGGAAAGC TTGACTGGGA GGAATAGTTT CAGGTAGGCC361AAGTCTATGC ATGCCTAACT GCTAGTGCTA TAAATGAAAG TAAACACTTT GCTGCAGTAT421TTTATGTGAA TTTGCTTTTA AACTTTTGGA AGTACAAAGT GATGTAATGC TAGAATGCAG481GAAGCTTCTC TGTGTCTATG AGCAACACAC CTAAATTTGC TCTTGGACTA GGACACTGAT541TAATTGTCAT GGCTATTATA GTAAGTGAAT GAAACTCTGC GATTGCCTCC AGTGAATATT601AACAAAGAAA GTTGCACAGA TTCATGACAG GTACTGCAGT ATACCTGCAA AAGTATTCAA661GGAATAACAC TCTAAAGGTG TTGACTTCTC ACTTAGAATT AAATCTGGGC TTTAAAATTT721TCCGTATTCC AGTAGGATGG GGGAAGTATG GGGTAACTTG TACTGTTTGG ATCAATCCAG781GGAGTTATTT GGAGATTAAG GGTAAAACAC TCACTGAAAG TTCTGCAGCA TGCATTCAGA841TGGCTTTCAG TGAGATTCTT GCACTCTTCA TCTTTACCCC AGATTCTACT CAGGACATAA901GAGTTGCCAG CTATTTCTTA ATCATTTCCT TTCATTCAGC CTAGCCACCG ATAAATATAT961CTGCAATTTA AGTGATTTTT TATTTGTTTG TTTTTGTGGC TTACAAACTG TTGTACGTTT1021 CTGCTTATTT ATTTTTAGAT ATAGTTAGCA CACAAGTTAG GGCATAAATC ACTGCGGTTG1081 TCTGGAGCAA GTACATATGC AAATATCTGG CACTGAAACT TTGTCTCAGT CTTCAAAATG1141 TTGCTTTTGC TACTCCAACA ACAGAGCATG CAATTGCCTT GTCTCATCCC ATCTGGCTTG1201 GTCGATAGAC ATACTAGCTA ATGAGATGCT ACAACAGAAC CTCTACTACA TAGTATTAAT1261 AACAAAAATA AATAAATAAA TAAATAGAAA GTGATGGGGA GAGTCTCTTA TTTTCCCCAG1321 ATAAGAGAAA ATCATGGAGA TAAAACTTTC ATAGTGTCCT TTTTTATTTA CAGGTGTGGG1381 GTTTGCTACC AGGAAGATGG CTGGTGTGGC CAAGCCTAAT TTAACTATCA GCATCAATGG1441 TGATGTGATA ACCATCAGAT CAGAAAGTAC CTTCAAAAAT ACAGAGATCT CTTTCAAGCT1501 GGGTGAAGAG TTTGATGAGA CCACAGCAGA TGACAGAAAA ACAAAGGTGA GTCCAAAAAT1561 GGCATTTTCC AACTGTATAT ATTTCAAAAA GATTGTCGGA TAAGGAGGGC AGAGTTGCTG1621 TTTTGACATC CACTCTTGAA ATGCTGCCTT CAAAGGTAAA CGTGCTCAGA TTGTTTTTTG1681 CTTCAGCACT TTTTGGACAT GGAGACAGTC TCCTCTTTGG TCCAAAGCAC CCTGATGAAA1741 TAGTCATGCT TTGCTTTTTT CCTCTGCAGA ATGTCATAAC CCTAGACAGT GGCACACTGA1801 AGCAGGTGCA GAAGTGGGAT GGCAAAGAGA CCGTTATCAA GAGAAAAGTG GTGGATGGGA1861 ACCTGCTGGT GGTGAGTTCT TTTTTGCTAA TCACAGAACT CACTGTGCAG AATGCTGTTT1921 TGATGGATGT ATTACACTGG ATTCAAACAC GGGGAATAAA AACATCTGAA AAGACTAGGC1981 ACTGAGTAAG AAGTCTTTCT GGAAAAGTCT GGAGCATGTA TTAAAACTGA AAGGATCTTA2041 TACTTATGGA ATGGTATAGA GGTATCTGCA TTCCATCCAT AACAAGAAAT GGTTAGGAAG2101 GAATAGGGTG AAATATAATC TCAATAAGGG AAATGTTTAA ATTTTATAAT CTTAAAGTCC2161 TGGACAGGAT AGAGGATGCA TTAACAAAGT CCATGTTAGG TGTACCCTCT CTGACACAAA2221 ATACTTCTGT TCATCTCCAG TATACCCCCC ATAGCAATGT CTGAGGGCCA TGTTGCAGAC2281 TACCAGTAAC CATGTCAGTG CTATGATGCT ATGATGTAGC AAATAAAATA AAAAGAAAAA2341 AAAAAGTAAT CTGTATCTGA TCCCCTTTGA TTGATGTTAT CTGGGCAGAC AGCACTGTGC2401 TTGACTGGGT ACCAGTGAGG CTCAGCTGCA GTTTGGGGTT TCCCAATTTG CTCTCCAGTT2461 TAAGGAAAAA CACTTTGAAA TACCTGGGGG AGAACTAATG ATGTCTTTGT AAAAGGCAGC2521 TGGGATTCCT ACATGCTAGA AAATGATACA CACACATTAA ATTCTTGTAG AGTTCTGCCT2581 TCCCTAGAGG AAATGATGTG TCTACAAATT TAGTACTTAA ATTTATTTGG ATGAAGACCA2641 GAGGAGAATA AATAAAAAGT AGTTTTTAAT AACAACTTCA TTAGAAAAGA CTGAAGAAAA2701 CAGAATTTGA TCTAGCAGAA AAATAGATGA AGACAGAGCC TAAAATGCAG AGGATGACAC2761 ATGCAGCTGG AAGTTGTGTA GGACTCCGTG TATGTGTTAT ACACTCATAT GGAGAAGATG2821AGCCACAGAT GGAGAAGGTG AGGGGACAAG AGACAACTGC CTAGTTCCAA AATGCTCCTT2881GGGTGTTCCA GAAGCCTTCT TTAAGAGACT AGAGATCTTC TGGGGAGGCC AAAGCAGTCC2941TTTGATGTTG CTTTAGTCCT ACGCTTCTAT GAATATTTTA GACTTTTATT TTTGAAGCTT3001CCAACATTGA GTTTCACCGT TTTGGCAATT GTTCTTGAAA GAGGAGAAAT GCAAATTCTT3061TCTTGCATTG GCTCCCAGTG CATAAGTAGT TCTCTACCTT CTAACTCACA AATATGCAGT3121GAGACTTAAA AGCTGATTAA ATTTGCATTT CTTTCCAGGA ATGCACCATG AATAATGTTA3181CCAGCAAAAG AGTTTACGAA AGAGCATGAG GAAGCCGTCT TCATGTGGGA CTGATGCTGA3241AGGCTGAACA AAAACAACTT CACTGAAGGA GAAAGACTCC ACAAATACAT TTTGAACAGA3301ACTGCACTTT TTACAGATGT ATTCCCTCAA AATTACATGC AACTAGCCTA ATTTGTTGTC3361GCTATTCAAT AAACGATTCT GCTTTCTAC
权利要求
1.一种鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因，其特征是它由4个外显子、3个内含子构成。
2.根据权利要求1所述的鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因，其特征是基因序列为1 GATCCTCACA GCTTCTGTTT CTGCTTGATC CTGTGAAAGA CTGCTACCTG GCCTGACAAA61 ATGTGCGACC AGTTTGTGGG CACCTGGAAG CTCCTTTCTA GTGAAAACTT CGAGGACTAT121ATGAAAGAGC TGGGTGAGAA ATGTTACCTG AAATTATTGT GTCTGGGGAA GGGAGGGAAT181GCTGAACTTG AGCTCTATTC CTTACTTGCT TTTTCAGTCT ATGCTGTTTA CCAAGGTCTT241TTTAGTCCAA CTACTTTTAT TAAATAGTTC TAAACTGGAA AACTTGGCTG TTTGGATTAG301CGTTGTCACA TTCCTATAAC ATAGGAAAGC TTGACTGGGA GGAATAGTTT CAGGTAGGCC361AAGTCTATGC ATGCCTAACT GCTAGTGCTA TAAATGAAAG TAAACACTTT GCTGCAGTAT421TTTATGTGAA TTTGCTTTTA AACTTTTGGA AGTACAAAGT GATGTAATGC TAGAATGCAG481GAAGCTTCTC TGTGTCTATG AGCAACACAC CTAAATTTGC TCTTGGACTA GGACACTGAT541TAATTGTCAT GGCTATTATA GTAAGTGAAT GAAACTCTGC GATTGCCTCC AGTGAATATT601AACAAAGAAA GTTGCACAGA TTCATGACAG GTACTGCAGT ATACCTGCAA AAGTATTCAA661GGAATAACAC TCTAAAGGTG TTGACTTCTC ACTTAGAATT AAATCTGGGC TTTAAAATTT721TCCGTATTCC AGTAGGATGG GGGAAGTATG GGGTAACTTG TACTGTTTGG ATCAATCCAG781GGAGTTATTT GGAGATTAAG GGTAAAACAC TCACTGAAAG TTCTGCAGCA TGCATTCAGA841TGGCTTTCAG TGAGATTCTT GCACTCTTCA TCTTTACCCC AGATTCTACT CAGGACATAA901GAGTTGCCAG CTATTTCTTA ATCATTTCCT TTCATTCAGC CTAGCCACCG ATAAATATAT961CTGCAATTTA AGTGATTTTT TATTTGTTTG TTTTTGTGGC TTACAAACTG TTGTACGTTT1021 CTGCTTATTT ATTTTTAGAT ATAGTTAGCA CACAAGTTAG GGCATAAATC ACTGCGGTTG1081 TCTGGAGCAA GTACATATGC AAATATCTGG CACTGAAACT TTGTCTCAGT CTTCAAAATG1141 TTGCTTTTGC TACTCCAACA ACAGAGCATG CAATTGCCTT GTCTCATCCC ATCTGGCTTG1201 GTCGATAGAC ATACTAGCTA ATGAGATGCT ACAACAGAAC CTCTACTACA TAGTATTAAT1261 AACAAAAATA AATAAATAAA TAAATAGAAA GTGATGGGGA GAGTCTCTTA TTTTCCCCAG1321 ATAAGAGAAA ATCATGGAGA TAAAACTTTC ATAGTGTCCT TTTTTATTTA CAGGTGTGGG1381 GTTTGCTACC AGGAAGATGG CTGGTGTGGC CAAGCCTAAT TTAACTATCA GCATCAATGG1441 TGATGTGATA ACCATCAGAT CAGAAAGTAC CTTCAAAAAT ACAGAGATCT CTTTCAAGCT1501 GGGTGAAGAG TTTGATGAGA CCACAGCAGA TGACAGAAAA ACAAAGGTGA GTCCAAAAAT1561 GGCATTTTCC AACTGTATAT ATTTCAAAAA GATTGTCGGA TAAGGAGGGC AGAGTTGCTG1621 TTTTGACATC CACTCTTGAA ATGCTGCCTT CAAAGGTAAA CGTGCTCAGA TTGTTTTTTG1681 CTTCAGCACT TTTTGGACAT GGAGACAGTC TCCTCTTTGG TCCAAAGCAC CCTGATGAAA1741 TAGTCATGCT TTGCTTTTTT CCTCTGCAGA ATGTCATAAC CCTAGACAGT GGCACACTGA1801 AGCAGGTGCA GAAGTGGGAT GGCAAAGAGA CCGTTATCAA GAGAAAAGTG GTGGATGGGA1861 ACCTGCTGGT GGTGAGTTCT TTTTTGCTAA TCACAGAACT CACTGTGCAG AATGCTGTTT1921 TGATGGATGT ATTACACTGG ATTCAAACAC GGGGAATAAA AACATCTGAA AAGACTAGGC1981 ACTGAGTAAG AAGTCTTTCT GGAAAAGTCT GGAGCATGTA TTAAAACTGA AAGGATCTTA2041 TACTTATGGA ATGGTATAGA GGTATCTGCA TTCCATCCAT AACAAGAAAT GGTTAGGAAG2101 GAATAGGGTG AAATATAATC TCAATAAGGG AAATGTTTAA ATTTTATAAT CTTAAAGTCC2161 TGGACAGGAT AGAGGATGCA TTAACAAAGT CCATGTTAGG TGTACCCTCT CTGACACAAA2221 ATACTTCTGT TCATCTCCAG TATACCCCCC ATAGCAATGT CTGAGGGCCA TGTTGCAGAC2281 TACCAGTAAC CATGTCAGTG CTATGATGCT ATGATGTAGC AAATAAAATA AAAAGAAAAA2341 AAAAAGTAAT CTGTATCTGA TCCCCTTTGA TTGATGTTAT CTGGGCAGAC AGCACTGTGC2401 TTGACTGGGT ACCAGTGAGG CTCAGCTGCA GTTTGGGGTT TCCCAATTTG CTCTCCAGTT2461TAAGGAAAAA CACTTTGAAA TACCTGGGGG AGAACTAATG ATGTCTTTGT AAAAGGCAGC2521TGGGATTCCT ACATGCTAGA AAATGATACA CACACATTAA ATTCTTGTAG AGTTCTGCCT2581TCCCTAGAGG AAATGATGTG TCTACAAATT TAGTACTTAA ATTTATTTGG ATGAAGACCA2641GAGGAGAATA AATAAAAAGT AGTTTTTAAT AACAACTTCA TTAGAAAAGA CTGAAGAAAA2701CAGAATTTGA TCTAGCAGAA AAATAGATGA AGACAGAGCC TAAAATGCAG AGGATGACAC2761ATGCAGCTGG AAGTTGTGTA GGACTCCGTG TATGTGTTAT ACACTCATAT GGAGAAGATG2821AGCCACAGAT GGAGAAGGTG AGGGGACAAG AGACAACTGC CTAGTTCCAA AATGCTCCTT2881GGGTGTTCCA GAAGCCTTCT TTAAGAGACT AGAGATCTTC TGGGGAGGCC AAAGCAGTCC2941TTTGATGTTG CTTTAGTCCT ACGCTTCTAT GAATATTTTA GACTTTTATT TTTGAAGCTT3001CCAACATTGA GTTTCACCGT TTTGGCAATT GTTCTTGAAA GAGGAGAAAT GCAAATTCTT3061TCTTGCATTG GCTCCCAGTG CATAAGTAGT TCTCTACCTT CTAACTCACA AATATGCAGT3121GAGACTTAAA AGCTGATTAA ATTTGCATTT CTTTCCAGGA ATGCACCATG AATAATGTTA3181CCAGCAAAAG AGTTTACGAA AGAGCATGAG GAAGCCGTCT TCATGTGGGA CTGATGCTGA3241AGGCTGAACA AAAACAACTT CACTGAAGGA GAAAGACTCC ACAAATACAT TTTGAACAGA3301ACTGCACTTT TTACAGATGT ATTCCCTCAA AATTACATGC AACTAGCCTA ATTTGTTGTG3361GCTATTCAAT AAACGATTCT GCTTTCTAC
3.鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因的克隆，其特征是取鸡腹部脂肪组织，利用TRIZOL试剂盒提取总RNA，用反转录试剂盒将脂肪组织总RNA反转录为cDNA第一条链，反转录反应体系为反应体系中包含1μl脂肪组织总RNA、1×反转录反应缓冲液、2.5pmol oligo dT-adaptor引物、0.2mM dNTP、1U/μl RNase抑制剂、5U禽源反转录酶，加水至总体积为20ul，反应条件为42℃时温育60分钟，99℃时5分钟；根据哺乳动物A-FABP基因序列的保守区设计一对引物MF和MR，对脂肪组织cDNA第一条链进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含cDNA模板1μl、1×PCR反应缓冲液、引物MF和MR各5pmol、0.16mM dNTP和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul，PCR反应条件为94℃预变性5分钟、94℃50秒、55℃1分钟、72℃1分钟共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，将特异性片段回收并连接到PMD18-T载体上，之后转化到大肠杆菌DH5α菌株中，筛选出阳性克隆，测序后得到一条163bp的核苷酸序列，将其编号为MFMR；利用3’RACE方法获得MFMR核苷酸序列3’方向序列，根据MFMR核苷酸序列再设计一条上游引物AFF2，利用反转录引物oligo dT-adaptor上的M4序列作为下游引物，用这对引物对脂肪组织cDNA第一条链进行PCR扩增，反应体系中包含cDNA模板1μl、1×PCR反应缓冲液、引物MF和MR各5pmol、0.16mM dNTP和1 U Taq polymerase，加水至总体积为25ul，PCR反应条件为94℃预变性5分钟、94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃1分钟共35个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，回收特异性片段并测序，得到一条541bp的核苷酸序列，编号为AFF2M4；利用5’RACE方法获得MFMR核苷酸序列5’方向序列，根据MFMR和AFF2M4核苷酸序列再设计三条引物，分别为AF5’F、AF5’R和AFR3，利用这三条引物将MFMR序列的5’端扩增出来；第1步，将AFR3引物5’端磷酸化，其方法为向20ul反应液中加入2ul10×T4多聚核酸激酶缓冲液、50pmol去磷酸化引物、1nmol ATP、1ul(10U/ul)T4多聚核酸激酶，加水至20ul，将上述的反应液置于37℃中温育30分钟后用无水乙醇沉淀，溶于5ul去离子水中备用；第2步，用5’端磷酸化AFR3引物代替oligo dT-adaptor反转录引物将鸡脂肪组织RNA反转录为cDNA第一条链，反转录之后向反应液加入1μl RNa se H在37℃温育60分钟，然后用无水乙醇沉淀备用；第3步，环化cDNA第一条链，在已沉淀的cDNA第一条链的管中加入5μl 10×连接缓冲液、31μl 40％的PEG6000、1μl(40U)T4连接酶，加水至50μl，将混合液置于16℃温育24小时，然后取出备用或-20℃保存；第4步，用AF5’F、AF5’R引物对环化的cDNA第一条链进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含环化的cDNA混合液2μl，1×PCR反应缓冲液，引物AF5’F和AF5’R各5pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul，PCR反应条件为94℃预变性5分钟、94℃ 30秒、52℃ 30秒、72℃ 1分钟共35个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，回收特异性片段并测序，得到一条342bp的核苷酸序列，编号为AF5’FAF5’R；将上述3个片段的核苷酸序列拼接起来，得到一条完整的mRNA序列。
4.鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因的鉴别方法，其特征是将鸡的基因组30ug平均分成3管，分别用限制性内切酶Bgl II单酶切，EcoR I单酶切，BamH I和HindIII双酶切.酶切体系均为100ul，其中包含限制性内切酶10ul、10×酶切缓冲液10ul和去离子水，酶切反应条件为37℃12小时，反应结束后用无水乙醇沉淀，之后溶于30ul去离子水中备用；将酶切之后的DNA在0.8％琼脂糖凝胶电泳后转移到尼龙膜上，用DIG标记与检测试剂盒将MFMR序列标记成探针，并与含有鸡基因组的尼龙膜进行杂交，然后检测杂交信号。
5.鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因的鉴别方法，其特征是取8周龄肉鸡的心脏、肝脏、脾、肺、肾脏、胃、小肠、脑、胸肌、腹脂10种组织，分别提取总RNA，用反转录试剂盒将分别将上述10种组织总RNA反转录为cDNA第一条链，反转录引物为oligo dT-adaptor，然后用AFF0和AFR3引物对上述10种组织的cDNA第一条链进行PCR扩增，扩增片断长度358bp，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含cDNA模板1μl，1×PCR反应缓冲液，引物各5 pmol，0.16mM dNTP，和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul，PCR反应条件为94℃预变性5分钟、94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟共30个循环，最后72℃延伸7分钟；根据鸡的GAPDH基因序列设计并合成引物GF和GR，同时对上述10种组织的cDNA第一条链在相同条件下进行PCR扩增，扩增片段长度为491bp，作为PCR扩增时的阳性对照，PCR结束后进行1％的琼脂糖凝胶电泳，并将同一组织的两种PCR产物置于同一胶孔中同时电泳。
6.根据权利要求5所述的鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因的鉴别方法，其特征是取8周龄肉鸡的脑、胸肌、肝脏、腹脂、肾脏、心脏和肺7种组织，分别提取总RNA，在1％甲醛凝胶上电泳，之后转到尼龙膜上，用32P-dCTP将MFMR片段标记成探针，之后与尼龙膜杂交、洗膜、压片、显影和定影。
7.鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因的鉴别方法，其特征是分别取6周龄、8周龄的蛋鸡和肉鸡脂肪组织，提取总RNA，反转录之后作为PCR的模板，用鸡A-FABP基因的AFF0和AFR3引物和GAPDH基因的GF和GR引物对反转录产物分别在同等条件下进行扩增，PCR反应体系及反应条件如下反应体系中包含相当于100ng总RNA的cDNA模板2μl，1×PCR反应缓冲液，引物各5pmol，0.16mM dNTP和1U Taq polymerase，加水至总体积为25ul，PCR反应条件为94℃预变性5分钟、94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟共26个循环，最后72℃延伸7分钟，取5ulPCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将凝胶上的条带根据亮度和面积进行量化分析；将cDNA模板10倍稀释之后继续用鸡A-FABP基因的AFF0和AFR3引物及GAPDH基因的GF和GR引物对反转录产物在相同条件下进行扩增，取5ulPCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，进行量化分析。
全文摘要
本发明涉及的是一种涉及的是一种鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白基因、这种基因的克隆及鉴定方法。本发明提供了一种鸡A－FABP基因序列，该基因与其家族的其它基因同样由4个外显子和3个内含子组成。本发明还涉及到A－FABP基因在不同品种、周龄鸡间的表达特点和规律，该基因只在鸡的脂肪组织中表达，并且该基因在8周龄肉鸡的表达量高于同周龄的蛋鸡和6周龄肉鸡的表达量。本发明克隆了鸡A－FABP基因，并研究了该基因在不同组织中的表达特点和在不同品种、周龄间的表达规律，为进一步研究该基因序列的变异与鸡重要经济性状间的关联奠定了基础，同时对研究该基因的体外表达、蛋白结构及功能具有重要意义。
文档编号C07H21/04GK1453357SQ03111389
公开日2003年11月5日 申请日期2003年4月7日 优先权日2003年4月7日
发明者李辉, 王启贵 申请人:东北农业大学