与sars相关的冠状病毒全基因组芯片及其用途的制作方法

专利名称：与sars相关的冠状病毒全基因组芯片及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及与SARS相关的冠状病毒全基因组芯片及其构建策略、方法及用途。
背景技术：
病毒检测基因芯片背景。基因芯片，简单地说就是在一块特殊处理过的玻璃片或其它固相支持物(如硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)上，将基因探针以大规模阵列的形式排布，形成可与目的分子(如病毒基因组)相互作用的固相表面。分子杂交后的探针阵列因为探针上结合目的分子的不同而在激光的顺序激发下分别呈现不同的荧光发射谱征，根据其波长及波幅特征收集信号，作出比较分析从而得到所要的信息。
基因芯片现今的应用主要有以下方面基因表达时空特征分析；基因差异表达检测；新基因的发现；大规模DNA测序；基因型、基因突变和多态性分析；遗传病相关基因的定位；肿瘤相关基因的检测；单一或少量感染性疾病的诊断以及药物研究等。
病毒检测芯片具有以下特点1、高通量每平方厘米上可以结合5000～10000个核酸探针，也就是说可以同时平行地进行上万个分子杂交反应。现今基因序列已知的上千种病毒仅通过一张芯片就可以完全容纳。
2、高精确度、灵敏度通过分子杂交来检测病毒的存在是当前应用的技术中精确性和特异性最高的，据报道中表明，应用基因芯片技术进行临床诊断，准确度可达到98％-100％。
3、组合性现在开发出的可以检测病毒的基因芯片产品均只能单一性检测一种或少量几种病毒，如此则不能发挥基因芯片最大的技术优势。我们的病毒组合检测芯片将几乎全部已知病毒的检测组合在一张芯片上，最大程度地利用芯片技术的潜力，提高时效性的同时降低成本。病毒的组合检测对于环境监控和质量监督等方面则具有划时代的意义。
4、周期短、低成本、低工作量通过常规方法对病毒进行分子检测通常至少需要一周时间，且对于多种病毒则需要相同的工作重复进行。病毒组合检测芯片可以在4～5小时的自动化过程中一次性检测所有病毒，大大降低工作时耗、强度和试验成本。
SARS冠状病毒相关背景及SARS冠状病毒全基因组芯片的
背景技术：
从2002年11月到现在，世界范围内的急性呼吸窘迫综合症(severe acute respiratorysyndrome，SARS)的爆发和流行被证明与一种新型变异的冠状病毒相关，目前国际上将这种病毒叫做SARS相关冠状病毒(SARS related virus)或SARS病毒(SARS virus)，在本发明中我们称之为“与SARS相关的冠状病毒”。在中国将这种急性呼吸窘迫综合症也称做非典型性肺炎。3月23日，亚特兰大的美国疾病预防控制中心寄往UCSF Dr.Deresi教授的标本经过其对包含1000种病毒的芯片测试，首次证实造成这种大规模流行的病因是一种冠状病毒。继之，加拿大BCCA基因组科学中心4月13日首次发布了SARS冠状病毒(Genbank序列号AY274119)全序列，4月15日Genbank加以注释再次发布(Genbank序列号NC_004718)。4月16日给猴子单独接种这种从临床确诊病人身上分离的SARS冠状病毒，发现在猴子身上引起的症状与SARS病人极其相似。WHO的SARS多中心协作研究成员在WHO多国协作研究基础上基本确定一种新型冠状病毒是这种急性呼吸道症状SARS的病原，衣原体等其它可疑病原仍需进一步评估。
所报道的目前认为是SARS的发病原因的冠状病毒，是一种变异程度非常大的冠状病毒。它属于冠状病毒科(来自拉丁语corona，象皇冠的)，是一种RNA病毒，病毒体含有单链正链线性RNA分子，感染脊椎动物，尤其是温血动物，包括一些哺乳类(比如人、牛、猫、猪和鼠)，以及几种禽类(比如火鸡和鸡)。该科病毒基因组由RNA组成，具有29,000个到31,000个碱基。
香港大学最新发现，感染人类的“非典”病毒成员最少有6个。这项发现，可为近日部分患者药物无效、病情反复之谜，提供破解的线索。然而，从卫生防疫角度看，“非典”病毒数目繁多，短期内逐一击破，会非常困难。港大医学院微生物学系将多个来自世界各地的“非典”病毒样本作比较，竟发现当中6个病毒样本，某一段基因出现不相同的组合，包括两个来自香港本地、两个来自广州、一个来自加拿大和一个来自美国的，就是说6个病毒是家族中不同的成员。不过，目前尚不知哪个样本的病毒是“母体”，研究人员倾向于来自香港的一个样本与来自加拿大和美国的相似；而来自香港的另一个样本，则与广州的两个样本相似。暂时未知这些非典型肺炎病毒家族成员是本已存在，还是由其中一种非典型肺炎病毒变种衍生出来的。而各家族成员之间的关系，以至病征上的异同都尚未清楚。不过，这发现可能有助解答一系列患者感染后出现病情极大差异之谜。
香港大学的研究结果，证实一直以米不少人“非典”病毒不只一种的担忧，是正确的。虽然未知这六个病毒成员之间的关系，但由于成员有六个之多，有关专家由此推断，非典型肺炎的康复者有可能在康复后，再受另一种病毒成员侵袭，身体并没有相应抗体下而受感染，造成重复感染的现象。另一方面，若病毒有6个成员，部分病患者体内可能同时有两个以上不同病毒成员，令医护人员更难制订有效的治疗方案。医护人员必须知道病人身上的病毒是哪一个成员，才可以采取最有效的治疗方案，而测试方法亦因此受到限制。这无疑对防治及康复等工作倍添困难。
历史上，标准病毒检测技术依赖于病毒分离和体外病毒培养或者免疫检测。当前SARS冠状病毒的抗体和抗原标准还未建立，并且免疫检测主要依赖于抗体的质量和可获得性，SARS冠状病毒单克隆抗体和ELISA的IgM抗体研究还正在进行。SARS标准化细胞株也未建立，SARS冠状病毒体外培养较难，SARS冠状病毒代谢模式和抗体动力学研究仍不清楚，已经开发出的SARS冠状病毒诊断ELISA试剂盒的敏感性及特异性还有待进一步确认。甚至是目前最好的方法学的缺陷也变得明显。我们研制的SARS冠状病毒全基因组芯片除了在诊断上具有绝对优势，对基因多样性数据库的建立；人群中SARS冠状病毒全基因组序列变异的监控以及环境中SARS冠状病毒污染的监控有特别重要的意义。目前针对冠状病毒的实验室检测存在着局限性，因此SARS冠状病毒全基因组芯片的应用是十分必须的。下面将就三个方面阐述SARS冠状病毒全基因组芯片的重要意义(1)SARS冠状病毒全基因组芯片对于“超级传染源”的早期发现以及愈后病人对环境污染的监控有重要意义。PCR检测具有很好的特异性，但是无法检测出所有分泌冠状病毒的病人。尽早并可靠地检测出SARS冠状病毒可以帮助医生识别当病人出现发烧和其他可疑症状时是否感染了SARS，同时将其及时隔离并严格实施控制感染的措施。这将大大降低SARS病人将疾病继续传播的危险。
超级传染源”一词用以描述一名感染SARS的病人将疾病传染给很多人。“超级传染源”的现象出现在疾病暴发的早期，当时对这种现象没有足够的认识和了解。最初人们只知道SARS是一种新型疾病，认为很多患有非典型性肺炎的病人是由其他原因造成的，因此并没有对感染者实施隔离和严格的控制措施。因此疾病暴发的早期没有实行严格的感染控制措施。在缺乏保护措施的情况下，很多医务工作者，病人亲属以及前往医院的探视者都暴露于SARS冠状病毒之下，随后也都发展为SARS病患。有专家指出SARS病人出院后在一段时间内都有可能对环境造成潜在的SARS冠状病毒威胁。
(2)SARS冠状病毒全基因组芯片对于追踪并确定SARS冠状病毒的动物来源有重要意义。已有报道狗的主人中一人因感染“非典”后死亡，家中其他成员也根据防治“非典”的有关措施予以隔离。家人养的这只宠物狗，也在此期间死亡，有关部门还没有确定其是否是因为感染“非典”而死。荷兰Utrecht大学的Peter Rottier研究小组通过对传染性猫腹脑炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus，FIPV)导入小鼠冠状病毒的一个基因片段，猫FIPV就可以感染小鼠细胞了，这项研究证明冠状病毒能够通过基因改组轻易的改变宿主，进而推断SARS冠状病毒可能是现有的动物及人类冠状病毒突变成一种更致命的形式造成的。如果另外的证据支持这种动物性感染，通过对动物身上分离得到的SARS冠状病毒进行全基因组芯片分析可以轻易分析证实这种种系间传播的分子依据。
(3)SARS冠状病毒全基因组芯片对于SARS冠状病毒基因多样化数据库的建立有重要意义。有报道说从台湾两个人分离到SARS冠状病毒其并不出现SARS相关临床症状，对这种分离到的SARS冠状病毒进行全基因组芯片分析有助于对SARS冠状病毒遗传抗性的认识。当然SARS冠状病毒可能存在的天然遗传抗性不是由单一因素决定的，但是仅仅依靠血清学以及PCR的方法不能确定SARS冠状病毒相关具体基因的多样性以及可能发生的微小改变，当RNA病毒(比如HIV病毒和流行性感冒病毒)在活细胞内迅速增殖(基因组复制和病毒体装配)时，它们可以在短期内较容易地在不同组织中改变其遗传结构。因此，专家认为研究SARS冠状病毒的突变范围对病毒感染的诊断和治疗是非常必要的。SARS冠状病毒全基因组芯片可以方便快捷地达到这一目的，对病毒毒株的变异以及分子流行病学调查有重要意义。
我们设计的SARS冠状病毒全基因组芯片主要根据GenBank公布的SARS相关冠状病毒全基因组序列(GenBank序列号NC_004718)以及迄今GenBank公布的所有SARS冠状病毒全基因组序列(包括1、SARS冠状病毒HKU-39849，GenBank序列号AY278491；2、SARS冠状病毒Urbani，GenBank序列号AY278741；3、SARS冠状病毒CUHK-W1，GenBank序列号AY278554；以及GenBank已公布了部分基因组序列的SARS冠状病毒1、SARS冠状病毒BJ04，GenBank序列号AY279354；2、SARS冠状病毒BJ03，GenBank序列号AY278490；3、SARS冠状病毒GZ01，GenBank序列号AY278489；4、SARS冠状病毒BJ01，GenBank序列号AY278488；5、SARS冠状病毒BJ02，GerBank序列号AY278487；6、SARS冠状病毒Taiwan RNA-directed RNA多聚酶(pol)基因部分编码区，GenBank序列号AY268049；7、SARS冠状病毒Vietnam200300592多聚酶基因部分编码区，GenBank序列号AY269391)。它与现在已有的冠状病毒比较结果显示，其核苷酸水平的相似性极差。其中我国测完SARS冠状病毒全基因组序列的五株SARS相关冠状病毒分别分离自广州和北京地区的患者及死亡病例中。其中两株分别来源于不同地区死亡病例的尸解肺组织标本；一株来源于北京尸解肝和淋巴结组织混合物；还有一株则来源于北京患者鼻咽拭子标本。
与加拿大与美国发布的冠状病毒序列的比较显示，该病毒的变异能力极强，在很短的几代内有多处碱基突变。包括进这些不同来源的所有标本全基因组序列，将使我们的芯片覆盖了所有已知的变异并将十分准确地确定标本是否被SARS冠状病毒感染，并有助于了解病毒的突变机制，及时掌握病毒在各地区的分布情况，提高检测的准确性。
我们的选择策略是，从待选基因组序列的5’端开始，以40-80个碱基为探针标准长度，相邻探针重叠5-30个碱基，选出的探针序列完全覆盖了整个基因组序列。与存放小量的PCR扩增基因策略不同，这使我们能够靶向基因的最大独特性区域，得以在保留敏感性的同时消除交叉杂交的问题。而且它不需要昂贵的和费时的酶扩增以及证实上千条DNA模板的过程。这对冠状病毒特别重要，因为其基因组A/T含量比较高，约60％，使用较长的合成的寡核苷酸解决了这一问题。
根据同样的选择策略，我们设计了针对猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)以及禽传染性气管炎病毒(Avian infectious bronchitisvirus)的40-80碱基对长的病毒最保守序列的特异性寡核苷酸探针，这样在快速排查SARS冠状病毒的基础上可以进一步排查是否还有其它动物类型冠状病毒的感染。冠状病毒在人以及家畜和实验动物上引起的许多疾病都有重要经济价值，经常导致动物严重的肠道或者呼吸道感染。猪传染性胃肠炎是由冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒引起的一种急性、高度接触性的传染病。病猪和带毒猪是本病的主要传染来源。目前尚无特效的药物可供治疗，此病发病率很高，传播快，一旦发病，采取隔离、消毒措施效果不大。禽传染性支气管炎，通常可根据发病情况，解剖所见作出诊断。目前尚无特效药物。
本芯片还包含从烟草花叶病毒全基因组序列以及人基因组中10000个已知基因和7000多个EST片段选出的40-80个碱基对长的寡核苷酸的阴性探针，共计有数十个至一百个芯片扫描的阴性对照点。将杂交完毕的芯片置于激光共聚焦芯片扫描仪中进行图像数据的转换，以激光作为激发光源进行扫描，采集各个杂交点荧光信号的位置、荧光强度等信息，运用专业分析软件例如AMAD(Analysis of Microarray Data的缩写)对所采集的数据进行数据转换，主要组成分析、各种簇的分析，进而确定样品是否有SARS感染。本芯片将仔细选择的病毒序列与随机扩增步骤组合，克服了以往基于RT-PCR检测策略的局限，使得检测范围更广，检测结果更为公正。
冠状病毒在人以及家畜和实验动物上引起的许多疾病都有重要经济价值，经常导致动物严重的肠道或者呼吸道感染。
猪传染性胃肠炎是由冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒引起的一种急性、高度接触性的传染病。病猪和带毒猪是本病的主要传染来源。目前尚无特效的药物可供治疗，此病发病率很高，传播快，一旦发病，采取隔离、消毒措施效果不大。禽传染性支气管炎，通常可根据发病情况，解剖所见作出诊断。目前尚无特效药物。
我们在国际互联网上查获，国际上只有Combimatrix公司宣布在SARS病毒全序列发布48小时之内研发出了诊断SARS相关冠状病毒的芯片。本发明的与SARS相关的冠状病毒全基因组芯片包括进刚刚测完序的全基因组序列信息，并立足于现有的芯片开发及病毒背景资源丰富的优势，将不断完成的其它SARS病毒变异序列有效地包括进去。下面是目前已知的所有冠状病毒分离株+---Corona_S2 (130)+---Viruses(130)+---ssrna positive-strand viruses-no dna stage(130)+---nidovirales(130)+---coronaviridae (130)+---coronavirus transmissible (5)+---coronavirus enteric (2)+---coronavirus epidemic (4)+---coronavirus coronavirus (37)+---coronavirus sialodacryoadenitis (1)+---coronavirus gastroenteritis (5)+---coronavirus hepatitis (9)+---coronavirus infectious (61)+---coronavirushemagglutinating (1)+---coronavirus respiratory (5)下面是目前已经得到全基因组序列的冠状病毒·Avian infectious bronchitis virus.Avian infectious bronchitis virus(strain 6/82).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette CK).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette M42).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette US).Avian infectious bronchitis virus(strain Beaudette)
.Avian infectious bronchitis virus(strain D274).Avian infectious bronchitis virus(strain D3896).Avian infectious bronchitis virus(strain Gray).Avian infectious bronchitis virus(strain KB8523).Avian infectious bronchitis virus(strain M41).Avian infectious bronchitis virus(strain Portugal/322/82).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/123/82).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/142/86).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/167/84).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/183/66).Avian infectious bronchitis virus(strain UK/68/84)·Avian infectious laryngotracheitis virus·Enteric coronavirus·Equine coronavirus·Group 1 speciesCanine coronavirusFeline coronavirusHuman coronavirus(strain 229E)Porcine epidemic diarrhea virusTransmissible gastroenteritis virus·Group 2 speciesBovine coronavirusHuman coronavirus(strain OC43)Murine hepatitis virusPorcine hemagglutinating encephalomyelitis virusRat coronavirus·Group 3 speciesTurkey enteric coronavirus·Human enteric coronavirus 4408
发明内容
本发明中，我们的芯片设计的策略是以SARS冠状病毒TOR2株全基因组序列(NC_004718)为检测对象，设计相应的探针和芯片。我们以SARS冠状病毒全基因组中的每40-80个碱基序列作为一个探针序列，相邻探针序列重复5-30个碱基，特别是以70个碱基序列作为一个探针序列，相邻探针序列重复25个碱基作为首选的选择模式，从而覆盖整个SARS冠状病毒的基因组。合成好的探针利用基因芯片点样仪点制于固相载体表面，固相载体可以包括玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等材料制成的片基。
利用逆转录及聚合酶链反应技术，我们将来自人体的血液及分泌物等临床样品以及相关病毒的标准样品等中提取的总体RNA进行逆转录和扩增，在扩增的过程中掺入荧光标记。扩增标记产物与芯片进行杂交反应后，荧光信号通过基因芯片扫描仪扫描分析处理，最终得到全基因组探针的阴阳性结果。经过与标准毒株杂交结果的对比可以得到检测样品的带毒情况。
本发明的技术路线是探针设计、探针合成、芯片点制、样本处理与标记、芯片杂交、结果分析。
本发明描述了一种基因芯片，其特征是固定在基片上的探针矩阵覆盖了SARS冠状病毒的全基因组序列，所描述的SARS冠状病毒的全基因组序列是指GenBank已公布的SARS冠状病毒毒株或亚型的全基因组序列，所描述的SARS冠状病毒毒株或亚型包括SARScoronavirus TOR2(GenBank序列号NC 004718/AY274119)，SARS coronavirus HKU-39849(GenBank序列号AY278491)，SARS coronavirus CUHK-W1(GenBank序列号AY278554)，SARS coronavirus Urbani(GenBank序列号AY278741)，SARS coronavirns BJ01(GenBank序列号AY278488)，SARS coronavirns BJ02(GenBank序列号AY278487)，SARS coronavirusBJ03(GenBank序列号AY278490)，SARS coronavirus BJ04(GenBank序列号AY279354)，SARS coronavirus GZ01(GenBank序列号AY278489)。
本发明所描述的基因芯片上的探针特征是从SARS冠状病毒全基因组中的每40-80个碱基序列作为一个探针序列，相邻探针序列重复5-30个碱基，所描述的基因芯片上的探针特征特别是指以70个碱基序列作为一个探针序列，相邻探针序列重复25个碱基的模式。
根据同样的选择策略，我们还设计了针对猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)以及禽传染性气管炎病毒(Avian infectious bronchitisvirus)的40-100碱基对长的病毒特异性寡核苷酸探针。这样的设计策略的目的是，在快速排查SARS冠状病毒的基础上可以进一步排查是否还有其它动物类型冠状病毒的感染。
本发明所描述的基因芯片的用途之一是用于检测SARS冠状病毒，所描述的检测对象可以包括来自人体的血液及分泌物等临床样品、动植物样品、食品水源样品以及水环境和大气环境样品等等，所描述的基因芯片的用途之二是用于监测SARS冠状病毒的变异和亚型，所描述的监测对象可以包括来自人体的血液及分泌物等临床样品、动植物样品、食品水源样品以及水环境和大气环境样品等等。
本发明所描述的基因芯片的用途之三是用于鉴别SARS冠状病毒和其它冠状病毒，所描述的鉴别对象可以包括来自人体的血液及分泌物等临床样品、动植物样品、食品水源样品以及水环境和大气环境样品等等。


说明书附图中图1所示为与SARS相关的冠状病毒全基因组芯片点样示意图，点制规则为每条探针重复三个点，分为5个矩阵，每个矩阵136条探针，每个矩阵包括38个阳性坐标点，形成25列×14行的点阵。每组三联点为一条探针。图中的A所示的灰色点为阳性坐标点，B所示的黑色三联点为检测探针。
具体实施例方式
以下实施例对本发明的与SARS相关的冠状病毒全基因组芯片的制备和用途作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。实施例1 芯片的制备探针的选取我们选取SARS冠状病毒TOR2株全基因组序列(NC_004718)为检测对象，设计相应的探针和芯片。TOR2株全基因组序列(NC_004718)基因组全长29736碱基，从5’端开始，以70个碱基为探针标准长度，相邻探针重叠25个碱基。如探针1的首尾位置为基因组序列中第1-70个碱基，探针2的首尾位置为基因组序列中第46-115个碱基，探针3的首尾位置为基因组序列中第91-160个碱基，探针4的首尾位置为基因组序列中第136-205个碱基，以此类推，共得到660个探针，如表1所示，这660个探针覆盖了该基因组的全部序列。每条探针的5’端进行氨基修饰。
表1 SARS冠状病毒TOR2株全基因组探针序列序号 序列 起始位点sars001 CTACCCAGGAAAAGCCAACCAACCTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTG1sars002 CTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTAGCTGTCGCTCGGCTGCATGCCTAGTGCACCTACGCAGTATAAA46sars003 GCCTAGTGCACCTACGCAGTATAAACAATAATAAATTTTACTGTCGTTGACAAGAAACGAGTAACTCGTC91sars004 GTTGACAAGAAACGAGTAACTCGTCCCTCTTCTGCAGACTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGTCGAT136sars005 CGGTTTCGTCCGTGTTGCAGTCGATCATCAGCATACCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGA181sars006 GTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGAGAGCCTTGTTCTTGGTGTCAACGAGAAAACACACGTCCAAC226sars007 GTCAACGAGAAAACACACGTCCAACTCAGTTTGCCTGTCCTTCAGGTTAGAGACGTGCTAGTGCGTGGCT271sars008 GTTAGAGACGTGCTAGTGCGTGGCTTCGGGGACTCTGTGGAAGAGGCCCTATCGGAGGCACGTGAACACC316sars009 GCCCTATCGGAGGCACGTGAACACCTCAAAAATGGCACTTGTGGTCTAGTAGAGCTGGAAAAAGGCGTAC361sars010 CTAGTAGAGCTGGAAAAAGGCGTACTGCCCCAGCTTGAACAGCCCTATGTGTTCATTAAACGTTCTGATG406sars011 TATGTGTTCATTAAACGTTCTGATGCCTTAAGCACCAATCACGGCCACAAGGTCGTTGAGCTGGTTGCAG451sars012 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TTTGCTGCATACAACCGCTACCGTATTGGAAACTATAAATTAAATACAGACCACGCCGGTAGCAACGACA26956sars601 ACAGACCACGCCGGTAGCAACGACAATATTGCTTTGCTAGTACAGTAAGTGACAACAGATGTTTCATCTT27001sars602 TAAGTGACAACAGATGTTTCATCTTGTTGACTTCCAGGTTACAATAGCAGAGATATTGATTATCATTATG27046sars603 AGCAGAGATATTGATTATCATTATGAGGACTTTCAGGATTGCTATTTGGAATCTTGACGTTATAATAAGT27091sars604 TTGGAATCTTGACGTTATAATAAGTTCAATAGTGAGACAATTATTTAAGCCTCTAACTAAGAAGAATTAT27136sars605 TAAGCCTCTAACTAAGAAGAATTATTCGGAGTTAGATGATGAAGAACCTATGGAGTTAGATTATCCATAA27181sars606 ACCTATGGAGTTAGATTATCCATAAAACGAACATGAAAATTATTCTCTTCCTGACATTGATTGTATTTAC27226sars607 TCTTCCTGACATTGATTGTATTTACATCTTGCGAGCTATATCACTATCAGGAGTGTGTTAGAGGTACGAC27271sars608 ATCAGGAGTGTGTTAGAGGTACGACTGTACTACTAAAAGAACCTTGCCCATCAGGAACATACGAGGGCAA27316sars609 GCCCATCAGGAACATACGAGGGCAATTCACCATTTCACCCTCTTGCTGACAATAAATTTGCACTAACTTG27361sars610 CTGACAATAAATTTGCACTAACTTGCACTAGCACACACTTTGCTTTTGCTTGTGCTGACGGTACTCGACA27406sars611 TTGCTTGTGCTGACGGTACTCGACATACCTATCAGCTGCGTGCAAGATCAGTTTCACCAAAACTTTTCAT27451sars612 GATCAGTTTCACCAAAACTTTTCATCAGACAAGAGGAGGTTCAACAAGAGCTCTACTCGCCACTTTTTCT27496sars613 AAGAGCTCTACTCGCCACTTTTTCTCATTGTTGCTGCTCTAGTATTTTTAATACTTTGCTTCACCATTAA27541sars614 TTTTAATACTTTGCTTCACCATTAAGAGAAAGACAGAATGAATGAGCTCACTTTAATTGACTTCTATTTG27586sars615 GCTCACTTTAATTGACTTCTATTTGTGCTTTTTAGCCTTTCTGCTATTCCTTGTTTTAATAATGCTTATT27631sars616 ATTCCTTGTTTTAATAATGCTTATTATATTTTGGTTTTCACTCGAAATCCAGGATCTAGAAGAACCTTGT27676sars617 AATCCAGGATCTAGAAGAACCTTGTACCAAAGTCTAAACGAACATGAAACTTCTCATTGTTTTGACTTGT27721sars618 GAAACTTCTCATTGTTTTGACTTGTATTTCTCTATGCAGTTGCATATGCACTGTAGTACAGCGCTGTGCA27766sars619 ATGCACTGTAGTACAGCGCTGTGCATCTAATAAACCTCATGTGCTTGAAGATCCTTGTAAGGTACAACAC27811sars620 TGAAGATCCTTGTAAGGTACAACACTAGGGGTAATACTTATAGCACTGCTTGGCTTTGTGCTCTAGGAAA27856sars621 CTGCTTGGCTTTGTGCTCTAGGAAAGGTTTTACCTTTTCATAGATGGCACACTATGGTTCAAACATGCAC27901sars622 GGCACACTATGGTTCAAACATGCACACCTAATGTTACTATCAACTGTCAAGATCCAGCTGGTGGTGCGCT27946sars623 GTCAAGATCCAGCTGGTGGTGCGCTTATAGCTAGGTGTTGGTACCTTCATGAAGGTCACCAAACTGCTGC27991sars624 TTCATGAAGGTCACCAAACTGCTGCATTTAGAGACGTACTTGTTGTTTTAAATAAACGAACAAATTAAAA28036sars625 TTTTAAATAAACGAACAAATTAAAATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCA28081sars626 TCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGACAATAACCAGAATG28126sars627 GATTCAACTGACAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTT28171sars628 CCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATG28216sars629 TGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCA28261sars630 CCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAG28306sars631 GACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCA28351sars632 GGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTT28396sars633 TACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAA28441sars634 AAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCA28486sars635 CCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAA28531sars636 ACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCA28576sars637 TACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAA28621sars638 TCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAA28666sars639 AGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAG28711sars640 ACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAAC28756sars641 AGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCAT28801sars642 ACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACAAAACAGTACAACG28846sars643 CGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAA28891sars644 CGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAAC28936sars645 ATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCT28981sars646 TTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACAT29026sars647 ATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCAC29071sars648 ATTAAATTGGATGACAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCAT29116sars649 CTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAA29161sars650 GAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAGACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGC29206sars651 TTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCA29251sars652 GCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTC29296sars653 AGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCATAAACACTCATGATGACCACACAAGGCAGATGGGCTATGT29341sars654 ACCACACAAGGCAGATGGGCTATGTAAACGTTTTCGCAATTCCGTTTACGATACATAGTCTACTCTTGTG29386sars655 TTACGATACATAGTCTACTCTTGTGCAGAATGAATTCTCGTAACTAAACAGCACAAGTAGGTTTAGTTAA29431sars656 AAACAGCACAAGTAGGTTTAGTTAACTTTAATCTCACATAGCAATCTTTAATCAATGTGTAACATTAGGG29476sars657 CTTTAATCAATGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCATCGAGGCCACGCGGAGT29521sars658 CATTTTCATCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGGGTACAGTGAATAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATAT29566sars659 TAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCC29611sars660 AATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAAAAAAAA29656另外，选取四条烟草花叶病毒特异性探针作为阴性对照探针，序列来源于烟草花叶病毒基因组(GenBank序列号NC_001367)。如表2所示表2 烟草花叶病毒特异性探针序列序号 序列 起始位点tmv1 ATATTCTTAAGTATGTGTGCAAAACTTACTTCCCGGCCTCTAATAGAGAGGTTTACATGAAGGAGTTTTT 895tmv2 TCTGCTGCGGTGTCGAATCTCGTCAAGATCCTCAAAGATACAGCTGCTATTGACCTTGAAACCCGTCAAA 2220tmv3 CTTCTTAAAGGAGTTAAGCTTATTGATAGTGGATACGTCTGTTTAGCCGGTTTGGTCGTCACGGGCGAGT 5065tmv4 TGACAATTGCAGAGGAGGTGTGAGCGTGTGTCTGGTGGACAAAAGGATGGAAAGAGCCGACGAGGCCACT 5145我们还选取了猪传染性胃肠炎病毒以及禽传染性气管炎病毒特异性探针序列共12条探针，序列见表3表3 猪传染性胃肠炎病毒以及禽传染性气管炎病毒特异性探针序列TGEV1CTCTTATGGTGGTGCTTCAGTTTGTATTTATTGCAGATGCCATGTTGAACATCCTGCTATTGATGGATTATGEV1_rc TAATCCATCAATAGCAGGATGTTCAACATGGCATCTGCAATAAATACAAACTGAAGCACCACCATAAGAGTGEV2AGGTGTTATAACACTTGACAACCAAGATCTTAATGGCAATTTCTACGATTTCGGCGATTTCGTGAAGACTTGEV2_rc AGTCTTCACGAAATCGCCGAAATCGTAGAAATTGCCATTAAGATCTTGGTTGTCAAGTGTTATAACACCTTGEV3GATAATGGTTGTTTGATGGGATGGGACTATCCTAAGTGTGACCGTGCTTTACCTAATATGATTAGAATGGTGEV3_rc CCATTCTAATCATATTAGGTAAAGCACGGTCACACTTAGGATAGTCCCATCCCATCAAACAACCATTATCAIBV1AACACTAGAAATGCTTCTGTAGTTATTGGAACAACCAAGTTTTATGGCGGTTGGGACAACATGTTGAGAAAIBV1_rc TTCTCAACATGTTGTCCCAACCGCCATAAAACTTGGTTGTTCCAATAACTACAGAAGCATTTCTAGTGTTAIBV2TTATGGGTTGGGATTATCCTAAGTGTGATAGAGCAATGCCTAATTTGTTGCGTATAGCAGCATCCTTAGTAIBV2_rc ACTAAGGATGCTGCTATACGCAACAAATTAGGCATTGCTCTATCACACTTAGGATAATCCCAACCCATAAAIBV3TATTTATGTTAAACCTGGTGGCACTAGCAGTGGTGATGCTACTACTGCTTATGCAAACAGTGTTTTTAACAIBV3_rc GTTAAAAACACTGTTTGCATAAGCAGTAGTAGCATCACCACTGCTAGTGCCACCAGGTTTAACATAAATA我们还设计了针对香港公布的CUHK-W1-S的SARS全序列的特异性探针序列共3条探针，序列见表4表4 CUHK-W1-S的SARS的特异性探针序列CUHK-W1-S-210 TACTATTAATCATACGTTTGGCAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCACAGAGCUHK-W1-S-710 CCTTTTCACCTGCTCAAGACATTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTTAAAGCCAACCUHK-W1-S-1710 ATTAGACATTTCACCTTGCTCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGGAACAAATGCTTCATCTGAA当然不局限于CUHK-W1-S的SARS还包括了根据其它最新公布的SARS序列所设计的特异性探针。
同时选取来自人基因组序列的40-100条寡核苷酸单个或者成组分布排列作为芯片扫描的对照。
SARS冠状病毒TOR2株660个探针，烟草花叶病毒4个探针，猪传染性胃肠炎病毒以及禽传染性气管炎病毒12条探针，CUHK-W1-S的SARS全序列探针序列共3条探针，最后，上述总共679个探针。
实施例2 芯片点制将上述679个探针约计为680个探针进行矩阵设计。按679条探针进行合成，合成产物溶于点样缓冲液(3×SSC)，终浓度为800ng/ul。通过基因芯片点样仪将探针溶液点于醛基修饰的玻璃片基上，随后在湿度为60％的环境中进行水合30min，以使探针的氨基与片基的醛基发生连接反应，从而使探针固定于片基之上。
点制规则为每条探针重复三个点，分为5个矩阵，每个矩阵136条探针，每个矩阵包括38个阳性坐标点，形成25列×14行的点阵。如说明书附图中图1所示，图1为SARS冠状病毒全基因组芯片点样示意图，每组三联点为一条探针。图中的A所示的灰色点为阳性坐标点，B所示的黑色三联点为检测探针。实施例3 样本处理与标记对于可能含有SARS冠状病毒的待测样本，通过Trizol试剂应用常规方法提取总体RNA，用5’端带有特异性末端的九碱基随机引物(GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN)进行随机反转录，然后利用特异性末端(GTTTCCCAGTCACGATC)进行特异性扩增，在扩增的过程中掺入Cy3或Cy5标记的dCTP以使扩增产物带有荧光信号。
操作流程如下RT(20ul体系)，1ul随机引物(GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN，100pmol/ul)2ulRNA模板(1-2ug总体RNA)1ul dNTP(10mM)8ul DEPC-ddH2O混匀，70℃5min，迅速冰浴，快速离心加入4ul5*第一链合成Buffer2ul0.1M DTT1ul RNA酶抑制剂(40U/ul)25℃5min，加入1ul反转录酶，混匀，25℃10min，42℃1h，70℃ 15min终止。
PCRA(20ul体系)RT产物1ul10*PCR Buffer 2ul随机引物1ul(GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN，100pmol/ul)dNTP(10mM)0.6ulddH2O 14.4ulTaq(5U/ul)1ul95 5min-94 1min-30 5min-72 3min-5cycles-72 5minB(50ul体系)PCR-A产物5ul10*PCR Buffer 5ul特异引物2ul(GTTTCCCAGTCACGATC，100pmol/ul)dNTP(10mM)1ulCy3/5-dCTP(1mM)1ulddH2O 34ulTaq(5U/ul)2ul95 5min-94 50s-40 1min-50 1min-72 1min-30cycles-72 5min实施例4 芯片杂交将芯片进行预处理，即分别用0.5％SDS和去离子水漂洗芯片，晾干备用。
将标记好的50ul待测样品扩增产物进行冷冻真空干燥，用1×杂交缓冲液20ul重新溶解，95℃变性5min，迅速冰浴，取20ul杂交液滴加于芯片表面，并以盖玻片覆盖，37℃温浴1小时后，分别用0.5％SDS和去离子水漂洗芯片5min，晾干后通过基因芯片扫描仪扫描芯片，并利用分析软件计算各条探针的信号值与分析阴阳性结果。实施例5 结果分析经过采集SARS冠状病毒的标准毒株(临床病人的血清及呼吸道分泌物样品)以及其他与SARS冠状病毒具有同源性的冠状病毒，包括感染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus)等(病毒标准品)，采用正常人血清及呼吸道分泌物样品作为阴性实验对象，根据以上技术路线进行多次实验，得到实验结果为1、杂交结果中阴性对照探针均呈现阴性信号；2、标准毒株杂交结果中SARS冠状病毒检测探针中阳性率为83％-92％；3、其他与SARS冠状病毒相关的冠状病毒杂交结果中SARS冠状病毒检测探针中阳性率为37％-58％；4、阴性实验对象杂交结果中SARS冠状病毒检测探针中阳性率为1％-16％。
通过以上实验得到杂交实验结果判定标准，即在阴性探针反应呈阴性的前提下，80％以上检测探针为阳性结果时可判定待测样品带有SARS病毒；30％-80％检测探针为阳性结果时可判定待测样品带有与SARS病毒相关的病毒；30％以下检测探针为阳性结果时可判定待测样品不带有与SARS病毒相关的病毒。
权利要求
1.本发明描述了一种基因芯片，其特征是固定在基片上的探针矩阵覆盖了SARS冠状病毒的全基因组序列。
2.权利要求1所述的SARS冠状病毒的全基因组序列是指GenBank已公布的SARS冠状病毒毒株或亚型的全基因组序列。
3.权利要求2中所述的SARS冠状病毒毒株或亚型包括SARS coronavirus TOR2(GenBank序列号NC 004718/AY274119)，SARS coronavirus HKU-39849(GenBank序列号AY278491)，SARS coronavirus CUHK-WI(GenBank序列号AY278554)，SARScoronavirus Urbani(GenBank序列号AY278741)，SARS coronavirus BJ01(GenBank序列号AY278488)，SARS coronavirus BJ02(GenBank序列号AY278487)，SARScoronavirus BJ03(GenBank序列号AY278490)，SARS coronavirus BJ04(GenBank序列号AY279354)，SARS coronavirus GZ01(GenBank序列号AY278489)。
4.权利要求1所述的基因芯片上的探针特征是从SARS冠状病毒全基因组中的每40-80个碱基序列作为一个探针序列，相邻探针序列重复5-30个碱基。
5.权利要求1所述的基因芯片上的探针特征特别是指以70个碱基序列作为一个探针序列，相邻探针序列重复25个碱基的模式。
6.权利要求1所述的基因芯片的用途之一是用于检测SARS冠状病毒。
7.权利要求6所述的检测对象可以包括来自人体的血液及分泌物等临床样品、动植物样品、食品水源样品以及水环境和大气环境样品等等。
8.权利要求1所述的基因芯片的用途之二是用于监测SARS冠状病毒的变异和亚型。
9.权利要求8所述的监测对象可以包括来自人体的血液及分泌物等临床样品、动植物样品、食品水源样品以及水环境和大气环境样品等等。
10.权利要求1所述的基因芯片的用途之三是用于鉴别SARS冠状病毒和其它冠状病毒。
11.权利要求10所述的鉴别对象可以包括来自人体的血液及分泌物等临床样品、动植物样品、食品水源样品以及水环境和大气环境样品等等。
全文摘要
本发明涉及用于急性传染性疾病SARS相关冠状病毒诊断的全基因组基因芯片，并提供了用于诊断其它有经济价值的动物冠状病毒基因芯片的高检出率的新引物。该全基因组基因芯片包括检测监控系统(A)和疾病诊断系统(B)两个系统，可准确、快速检测SARS相关冠状病毒，并设有检测监控系统，诊断时间更短，且大大提高诊断准确性。本发明的SARS冠状病毒全基因组芯片尤其适用于检疫局的生物体检测、医院临床样本，生物环境病毒污染监控、病人出院后疾病的传播及人群中SARS冠状病毒基因组水平的微小变化规律及基因多样性数据库的建立，特别对追踪SARS冠状病毒的动物来源都将具有十分深远的重要意义。本发明特别应用于诊断领域。
文档编号C07H21/04GK1450173SQ0312295
公开日2003年10月22日 申请日期2003年4月25日 优先权日2003年4月25日
发明者吴小岳, 马鑫, 任鲁风, 董小岩 申请人:本元正阳基因技术股份有限公司