猪背膘厚psme3基因及其制备方法

专利名称：猪背膘厚psme3基因及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及猪背膘厚PSME3基因的克隆及其制备方法。
背景技术：
随着人们对动物蛋白食品需求的不断增长和商品经济的发展，胴体品质评定已成为遗传、育种学家、生产者、肉品经营者、消费者普遍关心的问题。随着国内外活猪及猪肉产品的商品市场的发展及科技水平的提高，对胴体品质评定的标准化、规格化等已成为研究热门，目前世界上公认的胴体品质评定指标具体有胴体瘦肉率(lean percentage in the carcass，CLP)、瘦肉量(lean content in thecarcass，CLC)或可销售瘦肉分割块比率(lean cuts ratio，LCR)。在实际工作中，人们试图寻找一种简便的活体评定胴体品质的方法，以减少屠宰带来的经济损失，因此大量研究致力于寻找胴体组成的最佳预测指标。活体性状与胴体瘦肉率的遗传相关分析结果表明，活体平均背膘厚与胴体瘦肉切块产量的rA最高，为-0∶80，活体背膘厚与胴体瘦肉量的rA为-0∶54，因此通过对活体背膘厚的直接选择，可望使瘦肉率(量)获得相关反应(彭中镇等《猪的遗传改良》，北京，农业出版社，1991)，而目前DNA分子标记技术的发展和应用，为胴体瘦肉率的直接选择，特别是早期选择和胴体品质的快速评定开辟了新途径。
目前已研究的与猪背膘厚相关的基因有(1)Geldermann等(Geldermann H等，Mapping ofquantitative traits loci by means of marker genes in F2 generations of wild boar，Pietrianand Meishan pigsJAnimBreedGenet，1996，113381-387)，Knorr等(Knorr C等，Associationof GH gene variants with performance traits in F2generations of Europesan wild boar，Pietrainand Meishan pigsAinm Genet，1997，28124-128)研究发现猪12号染色体上不同的生长激素(Growth hormore，GH)基因单倍型与几个胴体组成性状有显著关联。(2)有报道猪7号染色体上的主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)基因单倍型与初生重、断奶重、生长速度、背膘厚等性状有关(彭中镇等，猪的数量性状基因及其标记研究进展，国外畜牧科技，1999，26(10)28-32)。(3)Yu等(Yu T P等，Association of PIT1 polymorphisms with growth andcarcass traits in pigsJ Anim Sci，1995，731282-1288)在一个含中国与美国猪品种“血液”的资源家系中检测到垂体转录因子(Pituitan transcription factor 1，PIT1)与平均背膘厚存在显著相关。(4)Jeon等(Joen J T等，A paternally expressed QTL affecting skeletal and musclemass in pigs maps to the IGF2 locusNature Genetics，1992，21157-158)和Nezer等(NezerC等，An imprinted QTL with major effect on muscle mass and fat deposition maps to theIGF2 locus in pigsNature Genetics，1992，21155-156)分别用两个家系类胰岛素生长因子2(Insulin like growth factor II，IGF-II)定位与猪2号染色体上，并检测到该基因与背膘厚有显著相关。(5)te Pas等(MFWtePas等，Messenger ribonucleic acid expression of theMyoD gene family in mucle tissue at slaughter in relation to selection for porcine growthrate，J AnimSci，2000，7869-77)在大白猪的杂交群体中分析了MyoD基因家族的一个重要成员肌细胞生成素(Myogenin)基因与生长、胴体性状可能存在相关，肌细胞生成素基因位于猪9号染色体上。(6)黑素皮质激素受体4(Melanocortin-4 receptor，MC4R)位于猪1号染色体上(Kim K S等，Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)geneJ AnimSci，2000a，78791-792)，Kim等(Kim K S等，Amissense variant of the porcine melanocortin-4receptor(MC4R) gene is association with fatness，growth，and feed intake traitsMammGenome，2000b，11131-135)在5个猪商品系中检测到MC4R基因遗传变异与背膘厚显著相关。(7)正在研究的与猪生长和胴体性状相关的候选基因还有与生长、胴体性状可能有关的瘦素基因(Leptin，LEP)即肥胖基因和生肌因子3(myf3)(Kim K S等，Amissense variant of the porcinemelanocortin-4 receptor(MC4R)gene is association with fatness，growth，and feed intaketraitsMamm Genome，2000b，11131-135)。对骨骼肌的生长有负调控作用的肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)基因，该基因又称GDF-8(Growth differentiation factor 8，生长分化因子8)(Mcpherron A C等，Double muscling in cattle due to mutation in the myostatin geneProc Natl Acad Sci，USA，1997，94(23)12457-12461)，与背膘厚有显著相关的组织蛋白酶B(Cathepsin B，CTSB)基因(Russo V等，Investigation of candidate genes for meat qualityin dry-cured ham productionthe porcine cathepsin B(CTSB)and cystatin B(CSTB)genesAnim Genet，2002，33123-131)等。
蛋白酶体激活亚单位3(Proteasome activator subunit 3，PSME3)又称蛋白酶体PA28-γ亚单位(PA28-γsubunit)，是20S蛋白酶体激活因子PA28复合体的一个亚单位。PA28复合体(也称11S调节子)，是20S蛋白酶体的重要调节因子，其作用是能够增加20S蛋白酶体的肽酶活性，增大20S蛋白酶体产生适合于与主要组织相容性复合体I类分子结合的多种底物肽的能力，提高最大反应速度(Albertsen H M等，A physical map amd candidate genes in the BRCAl region on chromosome17q12-21Nature Genet，1994，7(4)472-479；Jiang H等，Sequence and expression ofmouse proteasome activator PA28 and the related autoantigen KiImmunol，1997，4693-98；Murray等，Identification and linkage of the proteasome activator complex PA28subunit genes in ZebrafishScand J Immunol，2000，51(6)571-577)。
PA28复合体由三个亚单位组成，两个分子量均为28KDa的α和β亚单位，以及30KDa的γ亚单位，分别由PSME1、PSME2和PSME3三个基因编码。
目前已有人、小鼠、牛和斑马鱼(Albertsen H M等，A physical map amd candidate genes inthe BRCA1 region on chromosome 17q12-21Nature Genet，1994，7(4)472-479；Jiang H等，Sequence and expression of mouse proteasome activator PA28 and the relatedautoantigen KiImmunol，1997，4693-98；Murray等，Identification and linkage of theproteasome activator complex PA28 subunit genes in ZebrafishScand J Immunol，2000，51(6)571-577)的PSME3基因组织结构、表达和功能研究报道，人PSME3基因定位于17q12-21，cDNA序列全长2,894bp。小鼠PSME3基因定位于11号染色体上，基因组序列8,733bp，有11个外显子。经Northern分析表明，PSME3基因在小鼠的脾脏、胸腺和睾丸组织中的表达量高(Jiang H等，Sequence and expression of mouse proteasome activator PA28 and the related autoantigenKiImmunol，1997，4693-98)，Kandil等(Kandil E等，PA28 subunits of the mouseproteasomeprimary structures and chromosomal localization of the genesImmunogenetics，1997，46(4)337-344)和Kohda等(Kohda K等，Characterization of the mouse PA28 activatorcomplex gene familycomplete organizations of the three member genes and a physical mapof the~150-kb region containing the α-and β-subunit genes J Immunology，1998，1604923-4935)对人、小鼠、大鼠的PSME1、PSME2和PSME3三个基因的氨基酸序列的比较分析结果表明这三个基因有很高的序列同源性，说明这三个基因是由一个祖先基因的重复(Duplication)产生的。
PA28-γ亚单位的功能目前还不十分清楚，Murata等(Murata S等，Growth retardation in micelacking the proteasome activator PA28γJ Biol Chem1999，27438211-38215)采用同源重组方法获得缺失PSME3基因的第2至8外显子区域的纯合体和杂合体小鼠，与正常小鼠相比，这些小鼠出生时所有被研究的组织均表现正常，但是出生后的生长却表现迟缓，表明PSME3基因功能可能与小鼠的细胞增殖和体生长的调节有关。
尽管猪背膘厚侯选基因的研究取得了一些重要进展，但仍然存在不足(1)猪的重要经济性状通常是数量生状，涉及到的生理生化过程相当复杂，即使同一个数量性状，尽管已揭述其1-2个受控基因，但仍有其它具有大效应的新基因有待发现。(2)目前有关数量性状基因的研究，基本上是选用单一候选基因进行分析，忽略了基因间的相互作用。现代分子育种的内容之一是基因组育种，即根据个体所有性状的基因和基因型的组织结构及功能效应进行整体或全基因组选择、选配、保种和杂种优势分析利用等，其基础是有完整的高密度的基因图，并充分了解所有基因的组织结构、功能表达调控机理以及与性状的关联，然而目前在猪中已经遗传定位和物理定位的基因和标记仍十分有限，这方面的工作还需要进一步的加强。(3)寻找具有重要生理功能基因的方法不够全面，检测基因的数量有限，效率不高，需要创新，进一步寻找与猪重要经济性状相关新基因的工作迫在眉睫。
但目前国内外对猪PSME3基因的研究还是空白。

发明内容
本发明的目的在于克隆猪PSME3基因、制备方法及应用，为猪的标记辅助育种提供分子标记。
本发明通过以下技术实现一种猪背膘厚PSME3基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
它的DNA序列如序列表SEQ ID NO2所述。
所获得的PSME3基因cDNA序列长度为2592bp，序列中包含762bp的开放阅读框，140bp 5’非翻译区和1690bp的3’非翻译区。
所获得的PSME3基因cDNA序列中有一个如序列表SEQ ID NO1所述的C659-T659的碱基替换。
序列表SEQ ID NO2中的72bp处有一段如附图2所示的147bp的缺失突变。
序列表SEQ ID NO2中有1个A619-G619的碱基替换。
序列表SEQ ID NO2中有1个C1425-T1425的碱基替换。
用于检测如序列表SEQ ID NO2中第72bp处缺失突变的两条引物序列如序列表SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所述。
用于检测如序列表SEQ ID NO2中第619bp处碱基突变的两条引物序列如序列表SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所述。
用于检测如序列表SEQ ID NO2中第1425bp处碱基突变的两条引物序列如序列表SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所述。
制备所述的cDNA或DNA序列的方法，其特征按照以下步骤(1)用人PSME3基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80％以上的表达序列标签(EST)；然后拼接猪EST-重叠群；根据EST-重叠群设计两对引物，扩增得到两条片段；再分别以人PSME3基因cDNA和猪EST-重叠群为模板设计第三对引物，扩增得到三条片段；以成年香猪的脾脏组织提取总RNA为模板，作RT-PCR扩增和3’RACE，PCR产物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO1所述的cDNA序列；(2)从猪血液基因组提取DNA，以猪PSME3基因cDNA序列为模板设计引物，进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO2所述DNA序列；应用PCR和PCR-RFLP方法检测猪PSME3基因的多态性(为猪的标记辅助育种提供分子标记)。
更详细的技术方案由以下所述1.PSME3基因的克隆(1)引物设计用人PSME3基因cDNA(GenBank收录号NM005789)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http//wwwncbinlmnihgov/web/Search/indexhtml)查询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计两对引物PS-A2，PS-B1和PS-A3，PS-B3，扩增得到两条片段A2B1和A3B3；为获得猪PSME3基因的完整编码区序列，分别以人PSME3基因cDNA和猪EST拼接序列为模板设计第三对引物PS-A1和PS-B1，扩增片段标记为A1B1。
表1用于PSME3基因cDNA克隆的引物序列引物标号 引物序列 退火 预期PCR 引物设计所依据的序温度 产物长度 列PS-A1CATGGCCTCGTTGCTGAAG XM03276757℃ 约600PS-B1TCAATCTCTGTCACGGTGCGEST重叠群PS-A2GGAGCAAGTGAGCAGTGAGT58℃ 约960 EST重叠群PS-B3CAATGTCGGTCTTGAGCCAGPS-A3ATGTGGAGGACTATCGGCG 58℃ 约220 EST重叠群PS-B3CAATGTCGGTCTTGAGCCAG3’RACE GCAGAGACACTGTACTGAGGCCAG58C 约1200EST重叠群(2)反转录PCR扩增反应利用TRIzoL试剂盒(美国GIBCO公司)从成年香猪脾脏组织中提取总RNA，具体操作依照试剂盒说明书进行。
cDNA第一链的的合成反应总体积为50μl，首先将2μg总RNA与oligo d(T)11混合于一Ependorff管中，70℃温育5min以解除RNA的二级结构，立即置于冰上冷却以避免二级结构的重新生成，经短暂离心后按照表2的加样条件加入其余组分，于37℃温育1h后将温度升至95℃灭活反转录酶，置于-20℃保存备用。
PCR反应反应总体积为20μl，各组分的加样体积及终浓度如表3所述。PCR扩增程序是94℃ 3min，94℃ 30s，退火45s，72℃ 1min，循环35次，最后72℃延伸5min，退火温度见表1。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
表2 反转录反应体系 表3 PCR反应体系组分 体积 终浓度总RNA 10μl 2μgoligo d(T)115μl 1μmol/LDEPC H2O 20μl -5×PCR buffer 10μl 5×dNTP 2∶5μl500μmol/LRNAsin1μl 40UM-MLV 1∶5μl300U总体积50μl
组分 体积 终浓度dd H2O 15∶3μl -10×PCR buffer2μl 10×MgCl21∶2μl 1∶5mmol/L上游引物 0∶4μl 0∶2μmol/L下游引物 0∶4μl 0∶2μmol/LdNTP 0∶3μl 150μmol/LTaqDNA聚合酶 0∶4μl 2UcDNA 1μl ＞100ng总体积20μl(3)PCR产物的纯化、克隆和测序在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1∶5ml Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1mlResin，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过Minicolumn挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1∶5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1∶5ml Ependorff管中，加入30~50μl灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。
将纯化PCR产物与pGEM-T载体的连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2∶5μl 2×buffer，0∶5μl的T载体，0∶5μl的纯化PCR产物，0∶5μl的T4连接酶，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。
感受态细胞的制备是从37℃培养了16~20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0∶3~0∶4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10~15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0∶1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0∶1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
无菌状态下取100~120μl感受态细胞于1∶5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3~4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。
序列测定策略是每个片段均同时采用PCR产物直接测序和克隆测序两种方法。克隆测序是挑取单个克隆子用于测序，序列测定由上海博亚生物技术公司完成，每个基因片段至少测两个克隆子。
(4)DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http//wwwncbinlmnihgov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。
2.物理定位(1)用于物理定位的引物序列是PSME3-PPL 5′-GCGAAGGTTGGATGAGTGTG- 3′PR 5′-CCTGTGGCATGTGCAAGATC- 3′该引物扩增片段长度为700bp。
(2)用于物理定位的实验材料用猪×啮齿类体细胞杂种板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)进行染色体区域定位，用美国Minnesota大学共同构建的猪辐射杂种板(INRA-Minnesota porcine radiation hybridpanel，IMpRH)进行染色体精确定位，两套体细胞杂种板均由由法国MartinYerle博士(Laboratoire deGénétique Cellulaire，INRA，Castanet-Tolosan，France)惠赠。
其中SCHP包括27个体细胞杂种细胞系，1~19号是猪×仓鼠体细胞杂种细胞系，20~27号是猪×小鼠体细胞杂种细胞系，并以仓鼠、小鼠和猪基因组DNA作为阳性对照。经细胞遗传学鉴定该杂种板保留了猪的除Y染色体外的全部18条常染色体以及X染色体，其中含有127个非重叠的染色体区域，各细胞系中所包含的猪染色体及染色体片段信息可从WWW(http//wwwtoulouseinrafr/lgc/lgchtml/)获得。
IMpRH使用的辐射剂量是7,000-rad。IMpPH包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29∶3％，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理论分辨率是145kb。
(3)PCR分型条件进行扩增的PCR反应总体积为15μl，其中模板DNA为20ng，含1×buffer(Promega)，1∶5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0∶4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是94℃ 3min，循环35次94℃ 30s，60℃ 40s，然后72℃ 1min，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.PCR-RFLP诊断方法建立(1)引物序列PSME3 CATS-1PL 5′-GCGAAGGTTGGATGAGTGTG- 3′PR 5′-ATCAACAGCCGGATCTCAGG- 3′
该引物扩增片段长度919bp。
PSME3 CATS-2PL 5′-AGAGGTTGGAGGTGGCTAC- 3′PR 5′-GGGAATCAGGAGCTGTACC- 3′该引物扩增片段长度835bp。
PSME3 CATS-3PL 5′-GGAGGTGATGTTGGAGTTGG- 3′PR 5′-CTGATATGATGAGCCGAAGG- 3′该引物扩增片段长度772bp。
(2)PCR扩增条件PCR反应总体积20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1∶5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0∶2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是94℃ 4min，循环5次94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 1min，然后再循环30次94℃ 45s，57℃ 45s，72℃ 1min，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。
(3)RFLP检测条件PCR产物酶切反应体积是15μl，其中1×buffer 1∶5μl，PCR产物3~5μl，限制性内切酶AluI为0∶5μl(5U)，用H2O补足15μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
4.标记性状关联分析试验猪群是一个大白猪群，用建立起的PCR-RFLP诊断方法对201个DNA样品进行基因型检测。
本发明的效果是1.猪PSME3基因的克隆结果以成年香猪的脾脏组织提取总RNA反转录合成的cDNA为模板，分别用表1所列的三对引物PS-A1和PS-B1，PS-A2和PS-B1以及PS-A3和PS-B3进行PCR扩增，将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显述A1B1片段长度为630bp，A2B1和A3B3片段大小分别为957bp和225bp。
将三个片段A1B1，A2B1和A3B3用GeneTool1∶0软件中的ASSEMBLY程序进行拼接，得到一条长度为2592bp的cDNA整合序列。将这段cDNA序列在GenBank中进行同源性检索，检索结果该序列与人PSME3基因cDNA(GenBank收录号NM005789)的同源性达96％，序列分析表明该cDNA序列具有762bp(nt 141-902)的开放阅读框，编码一个由254个氨基酸组成的蛋白质。
2.猪PSME3基因的定位结果用PSME3-P引物在SCHP中分型结果表明，19个猪×中国仓鼠体细胞杂种细胞系(1~19号)中，15-16号出现与猪基因组DNA阳性对照扩增一致的700bp的目的片段，而在8个猪×小鼠体细胞杂种细胞系(20~27号)中，20-27号杂种细胞系均扩增得到700bp的目的片段。将上述实际观测的PCR分型数据提交给HybWeb(http//wwwtoulouseinrafr/lgc/lgchtml/)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果是PSME3基因定位于猪12号染色体上(P＝1.000)，进一步的区域定位结果为SSC12 p11-(2/3)p13(P＝0.8901，与该区域标记间的相关系数为1.000，P＜0.1％)。
用PSME3-P引物在IMpRH分型结果是0000000000 0100000110 0000001000 00000000000000001000 1001000001 0000001010 1000101000 0000100001 0000000101 0010000001 10111100(其中0和1分别表述扩增结果为阴性和阳性)。统计分析结果，PSME3基因与猪12号染色体上的GH基因紧密连锁，LOD值为6.52，RH图距是0.58Ray。进一步证实该基因位于猪12号染色体上。
3.PCR-RFLP诊断方法建立用PSME3 CATS-1引物在用于PSME3基因分离的二花脸猪基因组DNA中扩增的片段长度为919bp，两端分别是推测的长度为35bp和97bp的第5和第6外显子的部分序列。用该PSME3 CATS-1引物在几个猪品种基因组DNA中扩增检测，结果发现存在有长度多态性。测序结果分析表明，造成长度多态性的原因是因为在第5内含子区域有一段长度为147bp的片段缺失(如图2所示)。将包含有147bp片段插入的1066bp PCR扩增片段定为等位基因1，而919bp片段定为等位基因2。
用引物PSME3 CATS-2在猪基因组中扩增产物长度为835bp，包括外显子6和部分外显子7序列以及内含子5的部分序列和内含子6序列。酶切检测发现在内含子5中的一个HhaI酶切位点具有多态性，分别对该位点两个纯合子的测序结果显示，在该835bp片段的第257bp处若为A257时，则不存在HhaI酶切位点，检测结果只有一条835bp片段(定为等位基因A)；但在群体中该位点存在A257→G257的替换，其结果导致一个HhaI酶切位点的产生，得到两个片段，长度分别为578bp和257bp(定为等位基因G)，三种基因型AA，AG，GG如图3所示。
用PSME3 CATS-3扩增猪基因组DNA得到772bp特异扩增片段，包括外显子7、8、9和部分外显子10序列以及内含子6的部分序列和内含子7、8、9的序列。测序的结果发现在该772bp片段中存在四个AluI酶切位点(AG↓CT)，其中第404bp处为多态性切点，位于外显子8中，再分别对该位点两个纯合子的测序结果显述，当第406bp位置是C406时，则该AluI酶切位点不存在，AluI酶切后检测结果只有4个片段，长度是502bp、123bp、83bp和64bp(定为等位基因B)；但存在C406→T406的替换时，其结果导致第404bp处一个AluI酶切位点的产生，得到5个片段，长度分别为404bp、123bp、98bp、83bp和64bp(定为等位基因A)，三种基因型AA，AB，BB如图4所述。
4.标记性状关联分析对猪PSME3基因第8外显子AluI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析，所分析的性状是初生重、断奶重和170日龄屠宰时的背膘厚。
基因型检测结果表明在201个个体中占绝大多数的是AA基因型，有182个，AB基因型有18个个体，AA与AB基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表4，分析结果表明，AA与AB基因型在170日龄屠宰时的背膘厚呈显著性差异(P＜0.05)，并且该位点与初生重存在相关趋势(P＝0.11)。
表4不同PSME3基因AluI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析基因型 个体数 初生重 断奶重背膘厚1AA 182 1.5±0.2510.55±1. 52 11.09±1.97AB 18 1.43±0.23 10.74±1.72 11.98±2.12P值 0.11 0.5 0.0471170日龄屠宰时背膘厚序列表、附图及其说明序列表SEQ ID NO1是本发明克隆的猪背膘厚PSME3基因的cDNA序列；序列表SEQ ID NO2是本发明克隆的猪背膘厚PSME3基因的DNA序列；序列表SEQ ID NO3是本发明检测如序列表SEQ ID NO2中第72bp处缺失突变的正向引物序列；序列表SEQ ID NO4是本发明检测如序列表SEQ ID NO2中第72bp处缺失突变的反向引物序列；序列表SEQ ID NO5是本发明检测如序列表SEQ ID NO2中第619bp处碱基突变的正向引物序列；序列表SEQ ID NO6是本发明检测如序列表SEQ ID NO2中第619bp处碱基突变的反向引物序列；序列表SEQ ID NO7是本发明检测如序列表SEQ ID NO2中第1425bp处碱基突变的正向引物序列；序列表SEQ ID NO8是本发明检测如序列表SEQ ID NO2中第1425bp处碱基突变的反向引物序列。


图1是本发明关于PSME3基因制备的流程图；图2是本发明中PSME3基因第72bp处缺失片段的序列测定结果，图中分别用大写字母和小写字母表示推测的外显子和内含子区域，5’-和3’拼接位点的两个保守核苷酸(GT/AG)用双下划线标出，147bp的缺失片段序列用下划线表示，方框中显示的是引物序列。
图3是本发明中猪PSME3基因第619bp处的HhaI-RFLPs的三种基因型(AA AG GG)电泳结果。MDNA分子量标准(100bp ladder)图4是本发明中猪PSME3基因第1425bp处的AluI-RFLPs的三种基因型(AA AB BB)电泳结果。MDNA分子量标准(100bp ladder)具体实施方式
实施例1猪标记性状关联分析在一个大白猪商业群中对猪PSME3基因第8外显子AluI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析，所分析的性状是初生重、断奶重和170日龄屠宰时的背膘厚。
基因型检测结果表明在201个个体中占绝大多数的是AA基因型，有182个，AB基因型有18个个体，AA与AB基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表5，分析结果表明，AA与AB基因型在170日龄屠宰时的背膘厚呈显著性差异(P＜0.05)，并且该位点与初生重存在相关趋势(P＝0.11)。
表5不同PSME3基因AluI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析基因型 个体数 初生重 断奶重 背膘厚1(kg) (kg) (mm)AA 182 1.5±0.25 10.55±1.52 11.09±1.97AB 18 1.43±0.23 10.74±1.72 11.98±2.12
P值0.11 0.50.047P-value1170日龄屠宰时背膘厚实施例2猪标记性状关联分析在一个通城猪群中对猪PSME3基因第8外显子AluI-RFLP多态性位点与部分生产性状进行关联分析，所分析的性状是初生重和达90公斤屠宰时的背膘厚。分析结果表明，BB与AB基因型的背膘厚呈显著性差异(P＜0.05)(表6)表6不同PSME3基因AluI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析基因型 个体数 初生重 背膘厚Genotypes NBirth weightBackfat thickness1(kg) (mm)BB 90 1.1±0.2712.18±2.11AB 18 1.21±0.31 11.07±1.86P值 0.16 0.04P-value实施例3PCR-RFLP-AluI多态性在各猪品种中的分布情况在6个猪品种中检测猪PSME3基因PCR-RFLP-AluI多态性，检测结果如表7所述，表7的数据分析显述，在所检测的这几个猪品种中，杜洛克和贵州香猪中占优势的等位基因A的频率分别为0.8475和0.6406，而二花脸、通城和大自猪中优势等位基因B的频率分别为0.9688、0.7884和0.6539，在藏猪中等位基因A和等位基因B的频率接近，分别为0.4255和0.5745。
表7几个猪品种中PSME3基因AluI多态性的基因型和基因频率基因型 等位基因频率个体数品种GenotypeAllele frequencyNoofBreedsAA ABBBA Banimals杜洛克 36 28 5 3 0.8475 0.1525Duroc藏猪 27 6 1110 0.4255 0.5745Tibet二花脸 32 0 2 30 0.0312 0.9688Erhualian通城 26 1 9 16 0.2116 0.7884Tongcheng
贵州香猪 32 1413 5 0.6406 0.3594GuizhouXiangzhu大白 13 4 18 0.3461 0.6539Large white对猪PSME3基因AluI-RFLP多态性位点基因频率在不同品种中的分布差异进行检验，差异显著性结果表明该位点基因频率在所检测的这六个猪品种中存在较大程度的差异。
实施例4PCR-RFLP-HhaI多态性在各猪品种中的分布情况在5个猪品种中检测猪PSME3基因PCR-RFLP-HhaI多态性，检测结果如表8所述，表8的数据分析显述，在所检测的这几个猪品种中，占优势的是等位基因G。
表8几个猪品种中PSME3基因HhaI多态性的基因型和基因频率基因型 等位基因频率个体数品种Genotype Allele frequencyNoofBreedsAA AGGG A Ganimals杜洛克 22 0 0 22 0 1Duroc藏猪 22 1 8 13 0.227 0.773Tibet二花脸 22 5 107 0.455 0.545Erhualian清平 27 0 1314 0.241 0.759Qingping梅山 15 0 1 14 0.033 0.967Meishan实施例5不同猪群中长度多态性的检测结果在6个猪品种和荷兰动物科学与卫生研究所组建的大白猪群中检测猪PSME3基因第5内含子的缺失突变，检测结果如表9所示，表9的数据分析显示，在所检测的这几个猪品种中，杜洛克和香猪中占优势的等位基因1的频率分别为0.8475和0.6406，而二花脸、通城和大白猪中优势等位基因2的频率分别为0.9688、0.7884和0.6539，在藏猪中等位基因1和等位基因2的频率接近，分别为0.4255和0.5745，而在荷兰动物科学与卫生研究所组建的大白猪群中占优势的等位基因1的频率很高，达到0.9545。
对猪PSME3基因第5内含子缺失突变位点基因频率在不同品种中的分布差异进行t检验，分析结果表明该位点基因频率在所检测的这7个猪群中存在较大程度的差异。
表9不同猪群PSME3基因第5内含子的缺失突变多态性的基因型和基因频率品种 个体数 基因型 等位基因频率Breeds No.of GenotypeAllele frequencyanimals11 1222 1 2(1066bp)(919bp)杜洛克 36 2853 0.8472 0.1528Duroc藏猪 27 6 11 100.4259 0.5741Tibet二花脸 32 0 2300.0312 0.9688Erhualian通城 26 1 9160.2116 0.7884Tongcheng香猪 32 1413 5 0.6406 0.3594Xiangzhu大白 13 4 18 0.3461 0.6539Large white荷兰大白猪群187 171 15 1 0.9545 0.0455Large white(Netherlands)
序列表(猪背膘厚基因)(SEQUENCE LISTING)<110>华中农业大学<120>猪背膘厚PSME3基因及其制备方法<130>
<141>2003-08-25<150>02139236.6<151>2002-11-01<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2592<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(2592)<223>
<220>
<221>variation<222>(659)..(659)<223>
<220>
<221>3’UTR<222>(903)..(2592)<223>
<220>
<221>CDS<222>(141)..(902)
<223>
<220>
<221>5’UTR<222>(1)..(140)<223>
<400>1ggagcaagtg agcagtgagt gggccagcga gagcggccgc gtcccgagag cagccgagat 60tcctcccgtc cctctgaccc tctccccgga gcccacagcg cctccggtct ccagcggagc120ggacacggcc cggcccggcc atg gcc tcg ggg cgg gag gtg gat cag gaa gta173Met Ala Ser Gly Arg Glu Val Asp Gln Glu Val1 5 10aag ctc aag gtt gat tct ttc agg gag cgg att aca agt gag gca gaa 221Lys Leu Lys Val Asp Ser Phe Arg Glu Arg Ile Thr Ser Glu Ala Glu15 20 25gac ttg gtg gca aat ttt ttc cca aag aaa ttg tta gaa ctt gat agt 269Asp Leu Val Ala Asn Phe Phe Pro Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Ser30 35 40ttt ttg aag gag cca atc cta aac atc cat gac cta act cag atc cac 317Phe Leu Lys Glu Pro Ile Leu Asn Ile His Asp Leu Thr Gln Ile His45 50 55tca gac atg aat ctc cca gtc cct gac ccc att ctt ctc acc aat agc 365Ser Asp Met Asn Leu Pro Val Pro Asp Pro Ile Leu Leu Thr Asn Ser60 65 70 75cat gat gga ctg gac ggt ccc act tay aag aag cga agg ttg gat gaa 413His Asp Gly Leu Asp Gly Pro Thr Tyr Lys Lys Arg Arg Leu Asp Glu80 85 90tgt gaa gag gcc ttc caa gga acc aag gtg ttt gtg atg ccc aat ggg 461Cys Glu Glu Ala Phe Gln Gly Thr Lys Val Phe Val Met Pro Asn Gly95 100 105atg cta aaa agc aac cag cag ctg gtg gac att att gag aaa gtg aag 509Met Leu Lys Ser Asn Gln Gln Leu Val Asp Ile Ile Glu Lys Val Lys110 115 120cct gag att cgg ctg ctg atc gag aaa tgc aac acg gtc aaa atg tgg 557Pro Glu Ile Arg Leu Leu Ile Glu Lys Cys Asn Thr Val Lys Met Trp
125 130 135gta caa ctc ctg att cct agg ata gaa gat ggg aac aac ttt ggg gtg 605Val Gln Leu Leu Ile Pro Arg Ile Glu Asp Gly Asn Asn Phe Gly Val140 145 150 155tcc att cag gaa gag aca gtt gca gaa tta aga act gtt gag agt gaa 653Ser Ile Gln Glu Glu Thr Val Ala Glu Leu Arg Thr Val Glu Ser Glu160 165 170gca gcc tct tat ctg gac cag att tct aga tat tat att aca aga gcc 701Ala Ala Ser Tyr Leu Asp Gln Ile Ser Arg Tyr Tyr Ile Thr Arg Ala175 180 185aaa ttg gtt tct aaa ata gct aaa tac ccc cat gtg gag gac tat cgg 749Lys Leu Val Ser Lys Ile Ala Lys Tyr Pro His Val Glu Asp Tyr Arg190 195 200cgc acc gtg aca gag att gat gag aaa gaa tat atc agc ctt cgg ctc 797Arg Thr Val Thr Glu Ile Asp Glu Lys Glu Tyr Ile Ser Leu Arg Leu205 210 215atc ata tca gag cta agg aat cag tat gtc act cta cat gac atg atc 845Ile Ile Ser Glu Leu Arg Asn Gln Tyr Val Thr Leu His Asp Met Ile220 225 230 235ctg aaa aac atc gag aag atc aaa cgg ccc cgg agc agc aat gca gag 893Leu Lys Asn Ile Glu Lys Ile Lys Arg Pro Arg Ser Ser Asn Ala Glu240 245 250aca ctg tac tgaggccagg gccagggcca ggggactctg tgagtctggc 942Thr Leu Tyrtcaagaccga cattgccttg gtttgttaca tgactatcgt gatggggaaa ctggctggaa1002atagtaatca cacctctctc tgtttttagt tagagtctaa tgaaactctc atgtagttct1062gtgacgtgtt tacctctttt ttcaggcctc aggaactctt ctatttcctt ccctcatacc1122ccagaccccc gtcctaattt ctggagtact ccaggtttgt gtgcgcagga tgttggcaca1182agtttacttg tgttttctct ccccacttcc cttctgtgtg ttgggcttta tgttttcttc1242cctttgatgt tcagttggtt agaagttgag ggaacttgaa ggaaagtgct aggtattttg1302taggaactgg ggctggatgg gggaaccagc ttctctcttc ctgatggcag gttagtatct1362cttgcctctg tgggacactg gatcctccct gccacagttg ccctggtgat gacttagggt1422ttcccatcca catacatgac accttgaacc tgatcacgac aagaaacacc ttagaccttc1482
tgccaagtcc ctagctcctt cagatatttt tataagtagg attttcacat acacaaatgt 1542gcatctcaca cacacacaca cacacgtaca tgcgcgccct ccgactctgt tacttgatgc 1602ctcccccact ctgccccacc cacagacctt gtctgtcagt ctgtctgtgt ctcacacaca 1662catacaccgt tcagaaggtg atagttgttt aagtccttat ctgctgggac ccattgtctc 1722ctgacattgt agcctcttgg tgcttgaggc tggtgggttg gaagacagct gagagatgag 1782aagcagaggg agtggggaag gccccttcct ctgtgactca ggtccttttg gacgagttga 1842aattggtgtg ggggtgacca gaagctgctg ctcctactgg gctttcccgt tgggaaaaat 1902gtttctctta tttatagtgt tgtgcttcca gggaaagcag tcacttgtgt gtgtatgtgt 1962gtgcatgcac acgtaggcat gtacacgttg tgtgtatgtg gacatctgtt gggcaagtca 2022aaaccataga agagttgcct cttatctctc gaatcgtctg gagatatcac ttgttacagc 2082ttttgtgtta accctcatca acccccactt ttttattctc accactggag agagagtctg 2142ttggtgactc tctcggtgtc taattctgac ttttattctt tgtcctgtct ctgtcttcca 2202acctccaatc atctttccac ctggatgcat catctttact cccagtgcgc tgtagagaag 2262gagttcgggt gtggtcttcc cgtgaatagt actcagtaac aaaccaattg cattttagtt 2322gggcagtgct cctacccacc ctcagacccc tttcaacgaa aaccctccct tcctcccaac 2382atgtgtttct cagtttccct ttttgtttgt tggattgttc cagtgcccct gctccccacc 2442ttaccaccct tggatcgtaa tgtaaaattc ttttaccatg tcaagaaatt attaaaaaca 2502caggtacttt gacctctttc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacca 2562aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2592<210>2<211>254<212>PRT<213>猪(Sus scrofa)<400>2Met Ala Ser Gly Arg Glu Val Asp Gln Glu Val Lys Leu Lys Val Asp1 5 10 15Ser Phe Arg Glu Arg Ile Thr Ser Glu Ala Glu Asp Leu Val Ala Asn20 25 30Phe Phe Pro Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Ser Phe Leu Lys Glu Pro35 40 45Ile Leu Asn Ile His Asp Leu Thr Gln Ile His Ser Asp Met Asn Leu50 55 60
Pro Val Pro Asp Pro Ile Leu Leu Thr Asn Ser His Asp Gly Leu Asp65 70 75 80Gly Pro Thr Tyr Lys Lys Arg Arg Leu Asp Glu Cys Glu Glu Ala Phe85 90 95Gln Gly Thr Lys Val Phe Val Met Pro Asn Gly Met Leu Lys Ser Asn100 105 110Gln Gln Leu Val Asp Ile Ile Glu Lys ValLys Pro Glu Ile Arg Leu115 120125Leu Ile Glu Lys Cys Asn Thr Val Lys Met Trp Val Gln Leu Leu Ile130 135 140Pro Arg Ile Glu Asp Gly Asn Asn Phe Gly Val Ser Ile Gln Glu Glu145 150 155 160Thr Val Ala Glu Leu Arg Thr Val Glu Ser Glu Ala Ala Ser Tyr Leu165 170 175Asp Gln Ile Ser Arg Tyr Tyr Ile Thr Arg Ala Lys Leu Val Ser Lys180 185 190Ile Ala Lys Tyr Pro His Val Glu Asp Tyr Arg Arg Thr Val Thr Glu195 200 205Ile Asp Glu Lys Glu Tyr Ile Ser Leu Arg Leu Ile Ile Ser Glu Leu210 215 220Arg Asn Gln Tyr Val Thr Leu His Asp Met Ile Leu Lys Asn Ile Glu225 230 235 240Lys Ile Lys Arg Pro Arg Ser Ser Asn Ala Glu Thr Leu Tyr245 250<210>3<211>1793<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(1793)<223>
<220>
<221>variation<222>(72)..(72)<223>
<220>
<221>variation<222>(619)..(619)<223>
<220>
<221>variation<222>(1425)..(1425)<223>
<220>
<221>exon<222>(1)..(35)<223>
<220>
<221>exon<222>(823)..(935)<223>
<220>
<221>exon<222>(1168)..(1236)<223>
<220>
<221>exon<222>(1383)..(1450)<223>
<220>
<221>exon<222>(1540)..(1604)<223>
<220>
<221>exon<222>(1724)..(1793)
<223>
<400>3gcg aag gtt gga tga atg tga aga ggc ctt cca ag gtaagagcca 45Ala Lys Val Gly Met Arg Gly Leu Pro Arg1 5ccttcactgt cccctccccc aacccttttc tttatagggc cgcactcacg gcatatggag105gttcccaggc taggggtctg atcagagctg ttgctgctgg cctacaccac agtcacagca165atgccaggtc tgagccgcat cttcgaccta caccacagct catggcaacg ccagatcctt225taacccactg agcaaggcca gggattgaac tcacaacctc atgggtccta gttggattgt285ttccactgtg ccaggactgg aactccgtaa ttttccattt aacagggagg gttggactta345atgtgaacta ccaagggaga ggttggaggt ggctacacat cacagatttt tcgcaaaacc405ccagttcata tcattttttc ctcttcaata atgcttggtg cgttaagtct gtagagcata465ttttaatctt gttctttaga ctttccggat gttttagaca ctcatctgtt aatccccata525ttctctcttt ttttaattct gttggtggtg tcacggttta tagatagctt tgtgacagat585aaaaggcaga agtcataagc ttttccttgt ggcgcagtgg gttaaggatc cggtattgtc645actgttgtgg ctcaggtcgc tactgtggag cccaggatct tgcacatgcc acaggcatgg705ccaggaacaa aggtagaggt catagtatct cacgggtcta ggaaagagag aaaggtgggg765aatgctgcct ccttccaccc agctccagtc atttgacctt cctcgtgtcc ttgccag g 823aac caa ggt gtt tgt gat gcc caa tgg gat gct aaa aag caa cca gca 871Asn Gln Gly Val Cys Asp Ala Gln Trp Asp Ala Lys Lys Gln Pro Ala15 20 25gct ggt gga cat tat tga gaa agt gaa gcc tga gat tcg gct gct gat 919Ala Gly Gly His Tyr Glu Ser Glu Ala Asp Ser Ala Ala Asp30 35 40cga gaa atg caa cac g gtgaggcagg ggctgatgac ctaggggctg accccaaata975Arg Glu Met Gln His45gcctggcttg agctatgcaa gacaatggat gtggggccag aggcatggag gtgatgttgg 1035agttggcaga ctaaatatct tgactcctgt gctcctggca tctggcccca gcagcatgag 1095ttgtatatgt cttggcttaa gtagaaaagg ctaagatcct catatgcata ttttggtccc 1155ctcacccttc ag gt caa aat gtg ggt aca act cct gat tcc tag gat aga 1205Gly Gln Asn Val Gly Thr Thr Pro Asp Ser Asp Arg50 55aga tgg gaa caa ctt tgg ggt gtc cat tca g gtaatgtgct tgcattggaa 1256
Arg Trp Glu Gln Leu Trp Gly Val His Ser60 65atgggagagg aaggtttggg aggtaatctc atctcccctg cttttgtgtt ttccctttct 1316ctttggtttg ctgtggggtg atgtggaagt ggctttcaac ctttttgttt tgtttttttt 1376tttcag ga aga gac agt tgc aga att aag aac tgt tga gag tga agc 1423Gly Arg Asp Ser Cys Arg Ile Lys Asn Cys Glu Ser70 75agc ttc tta tct gga cca gat ttc tag gtagggctgc ttggacttgg 1470Ser Phe Leu Ser Gly Pro Asp Phe80 85cccaggaatt gagggctggt gagatggcat gcgctgtctg gggtcccctg cagctttctc 1530ctcttctct ctc ctt cca gat att ata tta caa gag cca aat tgg ttt cta 1581Leu Leu Pro Asp Ile Ile Leu Gln Glu Pro Asn Trp Phe Leu90 95 100aaa tag cta aat acc ccc atg tg gtaagtaagg gtttgtggcc gagggtggaa1634Lys Leu Asn Thr Pro Met Trp105gtggtaggac agggaggcat gccttcctgg gaagagctgc gtgggacagt cagccctcga 1694ggactagcct tttctctgcc cttcgtcag g agg act atc ggc gca ccg tga cag 1748Arg Thr Ile Gly Ala Pro Gln110 115aga ttg atg aga aag aat ata tca gcc ttc ggc tca tca tat cag 1793Arg Leu Met Arg Lys Asn Ile Ser Ala Phe Gly Ser Ser Tyr Gln120 125 130<210>4<211>20<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(20)<223>
<400>4gcgaaggttg gatgagtgtg20
<210>5<211>20<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(20)<223>
<400>5atcaacagcc ggatctcagg 20<210>6<211>19<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(19)<223>
<400>6agaggttgga ggtggctac 19<210>7<211>19<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(19)<223>
<400>7gggaatcagg agctgtacc 19<210>8<211>20<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(20)<223>
<400>8ggaggtgatg ttggagttgg 20<210>9<211>20<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(20)<223>
<400>9ctgatatgat gagccgaagg 20
权利要求
1.一种猪背膘厚PSME3基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.根据权利要求1所述的基因，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO2所述。
3.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所获得的PSME3基因cDNA序列长度为2592bp，序列中包含762bp的开放阅读框，140bp 5’非翻译区和1690bp的3’非翻译区。
4.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于所获得的PSME3基因cDNA序列中有一个如序列表SEQ ID NO1所述的C659-T659的碱基替换。
5.根据权利要求2所述的基因，其特征在于序列表SEQ ID NO2中的72bp处有一段如附图2所示的147bp的缺失突变。
6.根据权利要求2所述的基因，其特征在于序列表SEQ ID NO2中有1个A619-G619的碱基替换。
7.根据权利要求2所述的基因，其特征在于序列表SEQ ID NO2中有1个C1425-T1425的碱基替换。
8.根据权利要求2所述的基因，其特征在于用于检测如序列表SEQ ID NO2中第72bp处缺失突变的两条引物序列如序列表SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所述。
9.根据权利要求2所述的基因，其特征在于用于检测如序列表SEQ ID NO2中第619bp处碱基突变的两条引物序列如序列表SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所述。
10.根据权利要求2所述的基因，其特征在于用于检测如序列表SEQ ID NO2中第1425bp处碱基突变的两条引物序列如序列表SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所述。
11.制备如权利要求1或2所述的DNA序列的方法，其特征按照以下步骤(1)用人PSME3基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80％以上的表达序列标签(EST)；然后拼接猪EST-重叠群；根据EST-重叠群设计两对引物，扩增得到两条片段；再分别以人PSME3基因cDNA和猪EST-重叠群为模板设计第三对引物，扩增得到三条片段；以成年香猪的脾脏组织提取总RNA为模板，作RT-PCR扩增和3’RACE，PCR产物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO1所述的cDNA序列；(2)从猪血液基因组提取DNA，以猪PSME3基因cDNA序列为模板设计引物，进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO2所说的DNA序列；
12.应用PCR和PCR-RFLP方法检测猪PSME3基因的多态性。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及猪背膘厚PSME3基因的克隆及其制备方法。特征是克隆到如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的猪背膘厚PSME3基因的cDNA和DNA序列，检测到三个位点的碱基突变，其中的一个碱基突变与猪背膘厚性状有关。本发明公开了猪PSME3基因序列，三个位点的碱基突变，其中包括影响猪背膘厚的碱基突变位点。本发明还公开了获得上述基因的制备方法及检测三个位点的碱基突变的引物序列。本发明为猪的标记辅助育种提供了新的分子标记。
文档编号C07H21/04GK1498897SQ0315624
公开日2004年5月26日 申请日期2003年9月2日 优先权日2002年11月1日
发明者奎 李, 李奎, 余梅, 刘榜, 熊统安, 赵书红, 潘佩文, 王彦芳, 朱猛进, 樊斌 申请人:华中农业大学