专利名称：Vegf肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及VEGF(血管内皮生长因子)的片段且具有可能有利于治疗的活性的肽。
背景技术：
VEGF-A是一种分泌的多肽，它是胚胎发生中形成血管系统所必需的，在多种疾病状态的血管发生中起主要作用。VEGF的表达由低氧和数种细胞因子在不同细胞型中上调，在体内和体外引发多种生物活性，包括内皮细胞的分化、增殖、迁移和存活，提高血管通透性，单核细胞迁移，以及血管舒张因子NO和前列环素的内皮产生提高。
人VEGF-A存在多种同工型，有121、145、165、189和206个氨基酸，通过不同mRNA剪接产生，其中已知VEGF121、VEGF145和VEGF165是分泌的并且具有生物活性。已经鉴定了VEGF的两种不同的蛋白质酪氨酸激酶受体，即Flt-1(VEGFR1)和KDR/Flk-1(VEGFR2)。KDR/flk-1被认为是主要介导VEGF在内皮细胞中的促有丝分裂作用和体内血管发生的受体；Flt-1在内皮细胞中的功能未知。一种非酪氨酸激酶跨膜蛋白质，神经菌毛蛋白(neuropilin)-1(NP-1)，已经被鉴定为VEGF的另外一种受体，它特异结合VEGF165。VEGF有助于表达NP-1的肿瘤细胞的存活，包括某些乳腺癌细胞(Bachelder等人，Cancer Res 615736-5740，2001)。NP-1在介导VEGF的生物效应中的作用仍然大部分不清楚。
NP-1是被称为互斥蛋白(semaphorin)或脑衰蛋白的分子家族的一种受体，它在哺乳动物发育过程中神经元轴突的引导方面起关键作用。具体而言，已知NP-1介导互斥蛋白3的生长锥损害(collapsing)和化学排斥(chemorepulsive)活性。
Soker等人，J.Biol.Chem.271(10)5761-5767(1996)公开了含有由VEGF外显子7编码的44个氨基酸的GST融合蛋白与NP-1结合。
Soker等人，J.Biol.Chem.272(10)31582-31588(1997)公开了外显子7的一个区域是抑制VEGF与HUVEC结合所必需的。最短的活性肽(SEQ ID NO.1)是CSCKNTDSRCKARQLELNERTCRC即VEGF(137-160)，或外显子7的氨基酸22-44和外显子8的氨基酸1。末端半胱氨酸残基(VEGF中的C137)显然是活性和分子的三维结构的关键。这提示VEGF单体内可能存在内部二硫键(intradisulfidebonding)。
发明概述意外地发现，某些肽具有NP-1拮抗剂活性。根据本发明的一种新型肽具有SEQ ID NO.2，即氨基酸序列SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR或其基本保留NP-1拮抗剂活性的的片段，其为环形。
给定序列对应于VEGF内的氨基酸138-165，即至少包含外显子8的一部分。令人惊讶地，发现缺乏Cys残基(Soker等人认为它是必需的)的肽具有活性。
本发明也包括给定序列的变体，其保留新的活性，即NP-1拮抗作用，而没有意料之外的结构变化。因此，给定的序列可包含使肽相对稳定的同构或同源置换或衍生。
优选实施方案描述本发明的肽可以用已知的方法合成。下文给出了实施例。具体而言，通过自动肽合成，随后环化，可生产线性肽。已知的环化方法包括Tam等人，JACS 1136657-62(1991)所述的方法。也可以采用其它环化，例如Mitsunobu或链烯复分解环闭合。
本发明的一种肽优选地含有4个Cys残基。其优选地是双环的。
如上所述，本发明的肽可包含给定序列的修饰。本领域技术人员公知这些修饰。同构置换包括Abu置换Cys(当肽为了环化应当保留偶数Cys残基时，这可能是希望的)，Phe置换Tyr，和不同的烷基/芳基取代。氨基酸残基内取代基从C原子到N原子的转移，产生具有较高蛋白水解抗性的类肽，以及其它修饰，均公知并且包括于本发明的范围内。此处报告的一种具体肽是N-乙酰化的；本领域技术人员也知道其它末端修饰。这些修饰的肽可以作为前体药物，和/或具有修饰的免疫原性。
本发明的肽的NP-1拮抗剂特性可以用以下描述的方法确定。活性水平优选地至少为合成的二环28-mer的25％或50％。
本发明的肽的活性是指它们可以用于治疗NP-1在病理学上可能起重要作用的疾病。对于治疗应用，本发明的肽可以通过本领域技术人员公知的方法、使用本领域技术人员公知的成分配制并施用。肽的适宜剂量可以由熟练技术人员选择，考虑常见因素，例如将要治疗的患者的病情、化合物的效力、施用途径等。适合的给药途径包括肌肉内、鼻内和皮下。
NP-1拮抗剂可以与互斥蛋白3竞争结合NP-1，因此拮抗神经细胞中互斥蛋白3对轴突生长晕(outgrowth)和迁移的作用。其可能的用途是促进神经突生长、刺激神经修复或治疗神经变性。此外，NP-1拮抗剂也可以促进互斥蛋白3-反应性神经元的存活，这是证实或增强它在上述用途中的应用的一个效应，并且可以扩展如下这些用途，例如在中风和某些眼病中，治疗由于局部缺血引起的神经元死亡。
NP-1在血管发生中起重要作用，可能是癌症、眼病、类风湿性关节炎和其它疾病中VEGF诱导的血管发生所必需的。因此，NP-1拮抗剂可用于抑制疾病中依赖VEGF的血管发生。
NP-1拮抗剂也可能在免疫抑制中起作用。因此，在移植之前、期间或之后施用本发明的肽可能是有用的。
另外，在肿瘤细胞中NP-1拮抗剂可与VEGF竞争结合NP-1，促进表达NP-1的肿瘤细胞的细胞死亡。其可能的用途是抗癌症治疗。
下列实施例说明了本发明。
缩写MBHA，甲基二苯甲胺；Fmoc，9-芴基甲氧基-羰基；Ala，丙氨酸；Arg，精氨酸；Asn，天冬酰胺；Asp，天冬氨酸；Abu，氨基丁酸；Cys，半胱氨酸；Gln，谷氨酰胺；Glu，谷氨酸；Gly，甘氨酸；His，组氨酸；ILe，异亮氨酸；Leu，亮氨酸；Lys，赖氨酸；Met，甲硫氨酸；Phe，苯丙氨酸；Pro，脯氨酸；Ser，丝氨酸；Thr，苏氨酸；Trp，色氨酸；Tyr，酪氨酸；Val，缬氨酸；Pbf，2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；Pmc，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基；Trt，三苯甲基；tBu，叔丁基；Boc，丁氧基羰基；Pybop，苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷基-六氟磷酸磷鎓；NMM，N-甲基吗啉；DCM，二氯甲烷；DMF，二甲基甲酰胺；TBME，叔丁基甲醚；TFA，三氟乙酸；HPLC，高效液相色谱；LC-MS，液相色谱质谱法；，埃；AAA，氨基酸分析；DMSO，二甲亚砜；VEGF，血管内皮生长因子。
小规模肽合成利用固相法，用自动AMS 422多重肽合成仪合成
图1所示的肽。使用Rink Amide MBHA树脂(0.59和0.68mmol/g填充)和N-Fmoc策略，其中正交保护(Acm，t-Bu)待环化的衍生物的Cys侧链。以25μM的规模合成希望的肽，与基质偶联一次，偶联时间为30分钟。树脂和氨基酸衍生物Fmoc-Ala-OH·H2O、Fmoc-Arg(Pbf/Pmc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoe-Phe-OH、Fmoc-Pro·H2O、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Val-OH购自Calbioehem-NovabiochemUK Ltd.(Nottingham，UK)或Alexis(Nottingham，UK)。
通过活性酯法，用Pybop(Calbiochem-Novabiochem)和NMM(Rathburn Chemicals，Walkerburn，UK)作为偶联剂，使每个氨基酸从C端向N端顺序偶联到生长的肽链上。使用DMF中的20％哌啶(Rathburn Chemicals，Walkerburn，苏格兰)去除N-Fmoc保护基团，随后用DMF和DCM连续洗涤。以Rink-Amide-MBHA树脂的置换为基础，用4倍过量的乙酸(0.7摩尔，Rathburn Chemicals，Walkerburn，苏格兰)在每种肽合成之后进行自动乙酰化。除了氨基酸Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-Phe-OH之外，偶联剂Pybop、NMM和所有氨基酸衍生物均溶于DMF(0.7M，以Rink-Amide-MBHA树脂的置换为基础，4倍过量)中。这些保护的氨基酸衍生物均溶于N-甲基吡咯烷酮中。使用的所有溶剂都是HPLC级品质。在作为产生的反应性阳离子之清除剂的5％茴香硫醚、2.5％水和2.5％乙二硫醇(ethanedithiol)存在下，用90％TFA在室温下同时去保护3小时，从树脂上切下肽。过滤切割混合物，并在冰冷的TBME中沉淀。剩余的树脂用切割试剂洗涤一次，过滤，与以前的级分合并。离心后收集沉淀，用冰冷的TBME洗涤三次，在室温下干燥过夜。粗肽溶解于15％乙酸水溶液中，冻干2天(-40℃，6mbar)。
纯化及表征使用分析型反相柱(柱Alltech Hypersil PEP反相柱，100，C8，5μ(250×4.6mm)，0％→50％乙腈，在配备Hewlett-Packard 1100型HPLC仪器的来自Micromass的Quattro LC质谱仪上，通过分析型LC-MS在20分钟内分析粗肽。以1mL/min的流速，在215nm波长下根据酰胺键的吸光度监测分离。粗肽通过制备型反相HPLC(Gilson)纯化，在215nm下监测，以20mL/min的流速洗脱。使用与粗肽的LC-MS分析所述相同的流动相。粗肽用Alltech Hypersil PEP反相柱，100，C8，8μ(250×22mm)纯化。在20分钟内用0％→50％乙腈洗脱。利用高效液相色谱(LC-MS)证实类似物的纯度大于95％，并且进行预期的氨基酸分析。
肽的洗脱使用不同梯度，在215nm下监测。有机相乙腈和水相都含有0.1％TFA和3％1-丙醇。梯度和流速在下文列出。百分数表示有机相的比例。0％→50％，20分钟，流速为1mL/min。
线性SEQ ID NO.2的较大规模合成利用Fmoc-Arg(Pbf)-对烷氧基苄醇树脂(o.59mmol/g填充)，通过自动单固相法(Applied Biosystems 433A肽合成仪)合成SEQ ID NO.2。利用FastmocTM化学和21分钟的单偶联时间，通过Fmoc策略以0.25mmol的规模附着氨基酸。树脂和氨基酸衍生物Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH(位点9和23)、Fmoc-Cys(Acm)-OH(位点2和21)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH购自Bachem AG，Bubendorf，瑞士。使用溶于DMF(Applied Biosystems，Warrington，UK)中的0.45M 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基六氟磷酸尿鎓(HBTU)/1-羟基苯并三唑(HOBt)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，FisherChemicals，Loughborough，UK)作为偶联剂，使每个氨基酸从C端向N端顺序添加到生长的肽链上。用溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP，M56Chemicals，Runcorn，UK)的20％哌啶(Romil，Cambridge，UK)去除N-Fmoc保护的基团，随后用NMP连续洗涤。偶联剂HBTU/HOBt为3.6倍过量(0.9mmol)，所有氨基酸衍生物均为4倍过量(1.0mmol)。使用的所有溶剂均为HPLC级品质。
线性Ac-SEQ ID NO.2的合成使用Fmoc-Arg(Pbf)-对烷氧基苄醇树脂(0.59mmol/g填充)，通过自动多固相法(Rainin Symphony多重肽合成仪)合成Ac-SEQ ID NO.2。利用Fmoc化学和20分钟的单偶联时间，通过Fmoc策略以0.2mmol的规模(肽3)附着氨基酸。树脂和氨基酸衍生物Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Abu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH(肽3的位点9和23)、Fmoc-Cys(Acm)(肽3的位点2和21)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH购自Bachem AG，Bubendorf，瑞士。利用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲鎓(TBTU，Severn BiotechLtd，Kidderminster，UK)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，FisherChemicals，Loughborough，UK)作为偶联剂，使每个氨基酸从C端向N端顺序添加到生长的肽链上。使用溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP，M56Chemicals，Runcorn，UK)的20％哌啶(Romil，Cambridge，UK)去除N-Fmoc保护的基团，随后用NMP连续洗涤。偶联剂TBTU(4倍过量)溶解于DMF(Apollo Scientific，Stockport UK)中，所有氨基酸衍生物(4倍过量)和DIEA(8倍过量)溶解于NMP中。在合成(肽3)后，利用过量的乙酸酐/卢剔啶/DMF/DCM(2∶1∶9∶8)的加帽混合物进行自动N端乙酰化。使用的所有溶剂均为HPLC级品质。
线性Ac-SEQ ID NO.2-NH2的合成使用三环酰胺连接树脂(0.63mmol/g填充)，用半自动固相法(Labortec AG SP4000肽合成仪)合成Ac-SEQ ID NO.2-NH2。利用Fmoc化学和60分钟的单偶联时间，通过Fmoc策略以4mmol的规模附着氨基酸。利用Kaiser颜色试验监测每个偶联步骤的完成。进行再偶联，直到获得阴性颜色检测。树脂和氨基酸衍生物Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH(位点9和23)、Fmoc-Cys(Acm)-OH(位点2和21)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH购自Bachem AG，Bubendorf，瑞士。利用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲鎓(TBTU，Severn Biotech Ltd，Kidderminster，UK)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，Fisher Chemicals，Loughborough，UK)作为偶联剂，使每个氨基酸从C端向N端顺序添加到生长的肽链上。用溶于DMF的20％哌啶(Romil，Cambridge，UK)去除N-Fmoc保护的基团，随后用DMF和异丙醇连续洗涤。偶联剂TBTU、所有氨基酸衍生物(3倍过量)和DIEA(6倍过量)均溶解于DMF中。在合成后，利用过量的乙酸酐/卢剔啶/DMF/DCM(2∶1∶9∶8)的加帽混合物进行N端乙酰化。使用的所有溶剂均为HPLC级品质。
肽的切割在5％茴香硫醚、5％水、2.5％乙二硫醇和6％(w/v)苯酚存在下，用82.5％TFA在室温下同时去保护3小时，从树脂上切下肽。过滤切割混合物，在冰冷的乙醚中沉淀。剩余的树脂用TFA洗涤一次，过滤，与以前的级分合并，沉淀贮存于4℃过夜，通过过滤收集，用冰冷的乙醚洗涤，在室温下干燥，粗肽溶解于TFA/乙腈/水中，冻干过夜(-50℃，6mbar)。
粗肽的表征使用分析型C-18柱(Vydac 218TP54，250×4.6mm，5μm颗粒大小，300孔径)和对于B0-100％的线性AB梯度，在40分钟内以1mL/min的流速通过反相HPLC(Gilson)表征肽，其中洗脱液A为0.1％TFA/水，洗脱液B为溶于60％CH3CN/水的0.1％TFA。质量用MALDI-MS证实，适用时Ellman′s颜色试验证实了游离巯基的存在。
双环肽的生产粗线性前体溶解于最少的TFA中，用水稀释为2L/0.25mmol。使用K3Fe(CN)6在未保护的Cys残基之间形成第一个二硫键。肽溶液用氢氧化铵水溶液调节为pH7.5。向该溶液中逐滴加入0.01MK3Fe(CN)6至过量，直到保持浅黄色。在酸化后通过HPLC采样证实反应的完成。用50％乙酸水溶液将溶液的pH调节为4。粗反应混合物与Bio-Rex 70弱阳离子交换树脂(BioRad，CA)一起搅拌过夜，包装于玻璃柱内。用水充分洗涤后，肽用50％乙酸水溶液洗脱，使用茚三酮通过TLC检测。合并茚三酮阳性的级分，并冻干。粗物质通过制备型反相HPLC纯化。收集、合并、冻干纯化的级分。通过I2氧化在Cys(Acm)保护的残基之间形成第二个二硫键。该肽(5mg/ml)在10％水TFA中的溶液与8当量的碘剧烈混合。利用HPLC采样监测反应过程。在反应完成时(通常0.5小时后)，用1M抗坏血酸猝灭过量的碘。反应混合物用洗脱液A稀释2倍，通过0.45μm一次性滤膜过滤，通过制备型反相HPLC直接纯化。收集相关级分，蒸发，冻干，贮存于4℃。
获得三种本发明的肽。它们在下文中被称为EG 3287(SEQ IDNO.2的双环形式)、EG3307(Ac-SEQ ID NO.2的双环形式)和EG3315(Ac-SEQ ID NO.2-NH2的双环形式)。
对所有纯化的物质进行完全质量控制。通过在两种缓冲系统(TFA和TEAP)中的HPLC，显示肽的纯度大于95％。酸水解后的氨基酸分析(Beckman 6300)证实氨基酸组成。MALDI-MS(Kratos KompactProbe)显示预期的分子离子。Ellman′s颜色试验用来证实单环和二环肽中不含游离巯基。
KDR磷酸化测定细胞用10、30、100mM的肽预处理15分钟，随后用25ng/ml VEGF处理10分钟，立即用裂解缓冲液(64mM Tris-HCl，pH6.8，0.2mMNa3VO4，2％SDS，10％甘油，0.1mM AEBSF，5mg/ml亮抑酶肽)提取细胞。通过用可识别酪氨酸1054和1059处磷酸化的KDR(购自Oncogene Research Products Inc.)或总KDR(购自Santa Cruz Inc.)的抗体免疫印迹细胞提取物，测定KDR的磷酸化。使用辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG和ECL试剂，通过化学发光显示免疫反应带。
可以参照附图。简言之，图1显示环化的VEGF外显子7衍生的肽(100μM)对125I-VEGF165与PAE/NP1细胞结合的影响。具体而言，它显示EG3287抑制VEGF放射性标记的配体与只表达神经菌毛蛋白-1(NP-1)的猪主动脉内皮细胞(PAE)的结合，许多其它相关环肽没有影响。F9和F10是指同一肽制品的两个级分。
图2显示125I-VEGF165与PAE/NP-1细胞结合的特异性、选择性抑制，但是不影响与只表达KDR(PAE/KDR)或Flt-1(PAE/Flt-1)的细胞的结合，KDR和Flt-1是另外两种主要的VEGF受体。EG3287也抑制放射性标记的VEGF与表达NP-1、KDR和Flt-1的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的结合(图2)，并且抑制VFGF-诱导的KDR磷酸化(图3)。
图4显示肽EG3287也抑制放射性标记的VEGF与乳腺癌细胞系MDA-MB-231的结合，该细胞系只天然表达VEGF的NP-1受体。
序列表<110>ARK Therapeutics Ltd.
<120>VEGF肽及其用途<130>REP06595WO<140>未知<141>2003-03-28<150>0207644.6<151>2002-04-02<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>PRT<213>Artificial<400>1Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu1 5 10 15Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys20<210>2<211>28<212>PRT<213>artifical<400>2Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu1 5 10 15
Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg20 2权利要求
1.一种肽，其具有氨基酸序列SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR，或其基本保留NP-1拮抗剂活性的片段，其为环形。
2.根据权利要求1的肽，其含有给定的序列，为双环形。
3.根据权利要求1或权利要求2的肽，用于治疗用途。
4.根据权利要求1或权利要求2的肽用于制备刺激神经修复的药物的用途。
5.根据权利要求1或权利要求2的肽用于制备治疗神经变性的药物的用途。
6.根据权利要求1或权利要求2的肽用于制备抗癌症治疗中使用的药物的用途。
全文摘要
一种新肽，其具有氨基酸序列SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR，或其基本保留NP－1拮抗剂活性的片段，为环形，建议供治疗使用。
文档编号C07K14/47GK1642979SQ03807113
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月28日 优先权日2002年4月2日
发明者D·塞尔伍德, M·罗赫, I·扎伽利 申请人:Ark治疗学有限公司