专利名称：环丙孕酮乙酸酯的改进合成方法
技术领域：
本发明涉及合成环丙孕酮乙酸酯(17α-乙酰氧基-6-氯-1α，2α-亚甲基-4，6-孕二烯-3，20-二酮)的改进方法。
背景技术：
式(M)的环丙孕酮乙酸酯(17α-乙酰氧基-6-氯-1α，2α-亚甲基-4，6-孕二烯-3，20-二酮，CAS 427-51-0) 首先在DE-AS 11 58 966中描述为具有强妊娠活性的化合物。随后被发现其还是有效的雄激素拮抗剂(Neumann.抗雄激素环丙孕酮乙酸酯在基础研究中的发现，化学，基础药理学，临床应用和工具，Exp Clin Endocrinol(1994)，1021-32)。该化合物目前是存在于用于各种疾病的药物组合物中的有价值药物。
存在用于化合物的化学合成的各种策略，参见例如DE-OS 40 06 165或Neumann，同上。常规合成方法由式(A)的茄解定开始
它可由热带植物Solanum laciniatum，Ait的叶子提取，根据图1，包含费力的18个步骤方法(Sree，Rao和Mahapatra，Research and Industry，27卷，1982，326-328页；Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1976，816-819页；US 3,485,852；DE 1075114；Ringold等，J.Am Chem.Soc.，81，3485(1959)；GB 890315；The Merck Index，12版，1996；The MerckIndex，12版，1996；US 3,234,093)。
发明公开本发明现在提供用于该有价值的化合物的改进合成方法，它们是更快和成本更有效的。尤其是，通过本发明，相对于常规的18步合成法，能够以14或16步由茄解定合成环丙孕酮乙酸酯。
为实现此改善，本发明提供尤其有利的一些反应步骤。因此，在一实施方案中，它涉及制备环丙孕酮乙酸酯(M)的方法，包括(a)将6，7α-环氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)通过一步法转化为氯地孕酮乙酸酯(K2)；(b)在(K2)的1位上引入双键得到去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯(L2)；和(c)引入桥接(L2)1位和2位的亚甲基得到环丙孕酮乙酸酯(M)。
如下方案说明该方法
6，7α-环氧-4-孕烯-17α-醇- 氯地孕酮乙酸酯(K2)3，20-二酮-17-乙酸酯(J2) 环丙孕酮乙酸酯(M) 去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯(L2)优选，步骤(a)通过将无水氯化氢气体通过含有6，7α-环氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)的反应混合物进行。或者，使用在含水二噁烷中的盐酸得到中间体氯醇，它可脱水得到乙酸氯地孕酮(Bruckner，Hampel，和Johnson，Chem.Ber.，94，1225，1961；Lednicer和Mitscher，药物合成的有机化学，John Wiley and Sons，New York，1977)。
在另一优选实施方案中，步骤(b)通过使用脱氢试剂2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ，CAS 84-58-2)进行，二噁烷可用作溶剂。或者，可使用二氧化硒，例如与用作溶剂的吡啶和叔丁基醇一起使用(US专利3,485,852)，或根据Ringold等的方法，J.Amer.Soc.，81，1959，3485)。进行该步骤的另一种方法是使用在乙酸中的Pb(OAc)4(Abe，T.，Amer.Chem.Pharm，Bull.，21(6)，1973，1295-1299)。此外，DDQ可以与在苯中的4-硝基-苯酚一起使用(Abe T.，Kambegawa，A.，Chem.Pharm.Bull.，22，1974，2824-2829)。
步骤(c)方便地使用C1试剂前体碘化三甲基氧化锍(TMSI，CAS1774-47-6)和碱金属氢化物进行，DMSO可用作溶剂(Goto，G等，Chem.Pharm.Bull.，26，1978，1718-1728)。此外，该步骤可使用重氮甲烷，用酸处理实现(Krakower and Van Dine，J.Org.Chem，31，3467(1966)。按照Wiechert和Kaspar，Chem.Ber.，93，1710(1960)，另一种方法可采用重氮甲烷和水解。另一种反应途径可以是使用重氮甲烷和热解掉氮(Lednicer D和Mitscher LA，药物合成的有机化学，2卷，A Wiley-IntersciencePublication，1980，166页)。多步骤实施方案由Tolf等描述(Tolf等，Tetrahedron Lett，25，43，1984，4855-4858)。
因此，在另一方面，本发明涉及制备环丙孕酮乙酸酯(M)的方法，包括使乙酸氯地孕酮(L2)与碘化三甲基氧化锍(TMSI)和碱金属氢化物，优选氢化钠反应。反应可在二甲基亚砜(DMSO)中进行。
在优选实施方案中，6，7α-环氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)通过如下方法得到，该方法包括(d)在17α-乙酰氧基孕酮(H)的6位引入双键，将其转化为4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(I2)；(e)将(I2)6位的双键转化为环氧官能团得到6，7α-环氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)。
该方法用如下方案说明 4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(l2) 17α-乙酰氧基孕酮(H)
步骤(d)可通过单独地使用氯醌(四氯-对-苯醌，CAS 118-75-2)，或氯醌与二氧化硒的混合物方便地进行(Lednicer D，Mitscher LA，药物合成的有机化学，2卷，A Wiley-Interscience Publication，1980，182卷)。在另一实施方案中，可使用在叔丁基醇或甲苯中的氯醌(L.F.Fieser和M.Fieser，用于有机合成的试剂，1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1967)。另一种方法是DDQ和用作催化剂的TsOH(L.F.Fieser和M.Fieser，用于有机合成的试剂，2卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1969)。
步骤(e)可用间-氯-过苯甲酸或单过氧邻苯二甲酸进行。或者，可使用过苯甲酸和用作溶剂的二氯甲烷(US 3,234,093)，或根据Lednicer和Mitscher的方法使用过苯甲酸，药物合成的有机化学，2卷，AWiley-Interscience Publication，1980，166页。
17α-乙酰氧基孕酮(H)可由茄解定用本领域的已知方法方便地制备。茄解定可通过例如Solanum laciniatum，Ait的干叶或新鲜或干燥绿桨果的醇提取，使用例如2-丙醇或甲醇作为提取剂，和随后水解得到的配糖茄解碱得到。植物原料优选在提取前被干燥和粉碎成粉末，提取剂优选是在水中的65-85％(v/v)2-丙醇，更优选70-80％(v/v)2-丙醇。初级提取产物茄解碱可由提取物中沉淀，例如通过向热提取物中加入热水和氨溶液，并使其冷却。通常粗沉淀物通过如下实施例1中所示，通过洗涤和重结晶步骤被进一步纯化，随后例如用盐酸酸解，得到茄解定盐酸盐。水解优选在2-丙醇中的1N盐酸中进行，随后可通过由碱性醇溶液重结晶得到游离茄解定。茄解定随后可通过在乙酸/乙酐中回流，例如在催化量的对甲苯磺酸(TsOH)和/或吡啶存在下，转化为16-脱氢孕烯醇酮(16-DPA)，随后氧化，例如用铬酐、三氯化铬或重铬酸钠，再次用乙酐回流。
在一方面，本发明涉及制备16-脱氢孕烯醇酮乙酸酯(B)的方法，其包括(k)乙酰基化茄解定(A)得到O，N-二乙酰基茄解定；(l)异构化O，N-二乙酰基茄解定得到假茄解定二乙酸酯；(m)在相转移催化剂存在下氧化得到的假茄解定二乙酸酯。
如上所述，茄解定的乙酰基化可通过使其与乙酐在催化量的碱和/或对甲苯磺酸存在下反应得到，碱可以是吡啶。异构化可以用乙酸进行。在氧化步骤中的相转移催化剂优选是碘化四乙基铵或硫酸氢四丁基铵，优选后者。作为氧化剂，可使用重铬酸钾、重铬酸钠或高锰酸钾，优选重铬酸钾，二氯甲烷可用作溶剂。氧化在酸性PH下进行，这可使用用硫酸实现，氧化产物水解得到16-DPA。
尤其有利的是在一步方法中将16-DPA(B)转化为16，17α-环氧孕烯醇酮(C)。这可通过使(B)与过氧化物，优选过氧化氢在碱性溶液，优选碱性醇溶液中反应实现，在该反应中，甲醇可用作溶剂，氢氧化钠用作碱。
16-去氢孕烯醇酮乙酸酯(B) 16，17α-环氧孕烯醇酮(C)随后(C)可转化为16-溴-17α-羟基-孕烯醇酮，例如通过加成HBr，例如在冰醋酸中，得到溴醇(bromohydrin)(D1)和溴醇乙酸酯(D2)的混合物(参见附图3A，4A)。随后溴醇可使用催化剂，如阮内镍还原成17α-羟基孕烯醇酮(E2，与乙酸酯E1，Δ5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-乙酸酯的混合物)，通过与甲酸反应转化为3-甲酸酯(F)。随后它通过与乙酐和催化的酸，例如对甲苯磺酸反应转化为17-乙酸的二酯(G)。(G)可与丙醇铝反应得到17α-乙酰氧基-孕酮(H)(参见附图3A，4A)。
在其它实施方案中，本发明提供制备环丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括(f)通过一步法在17α-乙酰氧基孕酮(H)的1和6位引入双键将其转化为1，4，6-三烯化合物(I1)；(g)引入桥接1和2位的亚甲基得到1，2α-亚甲基化合物(J1)；(h)引入桥接(J1)的6和7位的环氧基得到6，7α-环氧化合物(K1)；(i)将(K1)的环氧基团转化为6-氯-7-羟基化合物(L1)；和(j)将(L1)转化为环丙孕酮乙酸酯(M)。
该反应过程通过如下方案说明
1，4，6-孕三烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(l1) 17α-乙酰氧基孕酮(H) 环丙孕酮乙酸酯(M) (L1)用于步骤(f)的优选试剂是脱氢试剂2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ，CAS 84-58-2；Muller，M.等，Helvetica Chemica Acta，63，1878，1980)。或者，使用在无水二噁烷中的溴得到二溴化物(中间体)，它与三甲基吡啶反应(US 2,962,510)。
步骤(g)有利地使用C1试剂前体碘化三甲基氧化锍(TMSI，CAS1774-47-6)和碱金属氢化物进行。或者，该步骤可使用重氮甲烷，用酸处理实现(Krakower和Van Dine，J.Org.Chem，31，3467(1966)。按照Wiechert和Kaspar，Chem.Ber.，93，1710(1960)，另一种方法可采用重氮甲烷和水解。另一种试剂可以是重氮甲烷和热解掉氮(Lednicer D和Mitscher LA，药物合成的有机化学，2卷，A Wiley-Interscience Publication，1980，166页)。多步骤实施方案由Tolf等描述(Tolf等，Tetrahedron Lett，25，43，1984，4855-4858)。
步骤(h)可使用间-氯过苯甲酸进行(CAS 937-14-4)，在一实施方案中，二氯甲烷用作溶剂(US 3,234,093)。或者，C-6双键与间-氯过氧苯甲酸(m-CPBA)的环氧化可根据Shibata等，Chem.Pharm.Bull，40(4)，935-941(1992)的方法进行。
对于步骤(i)，三氟甲基磺酰氯(CAS 421-83-0)是选择的试剂，优选与氯化锂结合使用。或者，可在75℃使用在DMSO中的N，N-二甲基乙酰胺盐酸盐(Uthai Sakee，Boonsong Kongkathip and Nganpong Kongkathip，Abstract of the 27thScience and Technology Conference of Thailand，234页)。最后步骤(j)可使用碱金属乙酸盐，如乙酸钠进行。
因此，在另一方面，本发明涉及制备环丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括使式(K1)化合物 与氯化锂/三氟甲基磺酰氯反应得到下式化合物(L1)化合物(L1)与乙酸盐水溶液，优选乙酸钠水溶液反应得到环丙孕酮乙酸酯(M)。
同样，17-α-乙酰氧基孕酮(H)可根据如上所述的本领域中的已知方法方便地由茄解定制备。
在另一方面，本发明涉及制备去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯(L2)的方法，其包括将氯地孕酮乙酸酯(K2)加入能够将(K2)转化为(L2)的微生物培养物中，由培养物分离得到的去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯。微生物优选是简单节杆菌(Arthrobacter simplex)或球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)，更优选菌株ATCC 6946或ATCC 13805，它们可由American Type CultureCollection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA获得。优选将外源电子载体加入培养物，例如浓度为0.1-1.0mmol/l，优选0.2-0.4mmol/l的甲萘醌(2-甲基-1，4-萘醌)。此外，收率可通过向培养物加入类固醇改善，例如浓度为0.01-0.55mmol/l，更优选0.3-0.5mmol/l的氢化可的松。当培养液含有5％二甲基甲酰胺(DMF)以改善类固醇的溶解性时得到良好结果。通过加入表面活性剂，优选非离子表面活性剂进一步改善收率，更优选浓度为0.25-1.0％(w/v)，更优选0.5-1.0％的聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80TM)。对B.sphaericus，0.1-0.2mmol/l氯地孕酮乙酸酯原料浓度是最佳的，而对于A.simplex，良好原料浓度是0.2-0.3mmol/l去氯地孕酮乙酸酯。尽管方法的总收率低于化学合成法，但它尤其有利于大规模生产，因为它能够避免大量的毒性试剂(DDQ)和有机溶剂(二噁烷)。
在本发明中，术语“反应混合物”包括由液体和/或固体组分组成的均相混合物以及多相混合物，如悬浮液、浆状物等。
附图1说明由茄解定的环丙孕酮乙酸酯的常规18步合成法。
附图2给出本发明合成途径的实验概要的纵览。
附图3说明根据本发明的途径A由茄解定的环丙孕酮乙酸酯合成法。
附图4说明根据本发明的途径B由茄解定的环丙孕酮乙酸酯合成法。
附图5说明根据本发明的途径C由茄解定的环丙孕酮乙酸酯合成法。
实施例1由Solanum laciniatum，Ait的叶提取茄解定1.PCRNC方法
1.1茄解碱分离将500g粉碎干燥的叶放在2升Erlenmeyer烧瓶中，加入1400ml含水异丙醇(80％v/v)，混合物回流4小时。过滤提取的混合物，残余物重新提取5次，汇总所有6次滤液。合并的滤液用旋转蒸发器浓缩直到蒸发滤液中的所有异丙醇。使混合物静置过夜，随后过滤。滤液加热到80℃，加入相等体积的水。混合物静置1小时，磁力搅拌。加入25％氨水直至形成沉淀物。在80℃持续搅拌1小时。将混合物转移到2升分液漏斗中，静置过夜。倒出上清液，沉淀物用水彻底洗涤直至上清液无色。脱色也可通过电解或用H2O2漂白进行。混合物通过滤纸过滤，弃掉滤液。配糖生物碱的沉淀物在60℃下干燥，经柱色谱法由配糖生物碱分离茄解定和β澳洲茄边碱。
1.2茄解碱/β澳洲茄边碱水解将10g粗配糖茄解碱放置在250ml圆底烧瓶中，加入100ml异丙醇和8.3ml盐酸(37％HCl)，在水浴中回流3小时。随后使其冷却到室温，静置过夜。过滤混合物，沉淀物用异丙醇(20ml)洗涤，由异丙醇和氢氧化钠水溶液(50％)重结晶。产物(茄解定)是无色的，形成六边形片状体。
*茄解定收率％＝干燥叶子的0.8％(由50g干燥叶子)。
**水解还可通过使用纯酶(半乳糖苷酶/葡萄糖苷酶)或来自微生物(A.niger，E.coli，酵母)的酶反应进行。
2.由Solanum laciniatum，Ait提取茄解定的替代方法2.1替代方法1(由R.Culford Bell和Linsay H.Briggs改进，Journal of the Chemical Society，1942，1-2页)茄解碱分离.来自生长在Chiang Mai(泰国)灌木丛中的干的绿浆果用醇充分提取。当大多数醇通过蒸馏由提取物中除去后，加入过量的2％乙酸水溶液，通过蒸汽蒸馏除去残余的醇。过滤水溶液，沸腾滤液，加入氨水形成颗粒状沉淀的粗茄解碱(在冷却下沉淀产生冻胶)。粗生物碱通过溶解在稀乙酸中并再次用氨水沉淀纯化，随后由60-80％醇和80％二噁烷-水重复结晶(由更高浓度醇或二噁烷结晶产生冻胶)得到无色尖角片状体，m.p.284-285℃(分解)。
茄解碱水解.纯生物碱用过量的3％盐酸在100℃加热3小时(与茄解碱盐酸盐相反，茄解定盐酸盐在冷却下仅微溶，在结晶条件下由热溶液也可沉淀)。冷却后，收集盐酸盐，由80％醇重结晶两次，悬浮在热水中，用氨水碱化，在100℃加热半小时。在冷却后收集茄解定，由80％醇重复结晶，形成六边形片状体，m.p.197.5-198.5℃。
2.2替代方法2(由Linsay H.Briggs和R.C.Cambie，Journal of theChemical Society，1958，1422-5页)S.laciniatum，Ait-茄解碱分离.将新鲜绿浆果(466g)粗切碎，立即在回流下用沸腾的醇提取2小时，由混合物分离果肉，用热甲醇充分洗涤，在消泡剂存在下减压浓缩滤液至少量体积。在加入等体积水后，向沸腾的溶液中加入氨水，在冷却后收集凝结的沉淀物。灰色配糖生物碱以结晶状态由3％乙酸溶液与氨水再沉淀两次。由含水甲醇(75％)重复结晶(炭)得到茄解碱的无色、扁平针状物(4.10g)，m.p.301-302℃(分解)，在296℃烧结。部分纯化的物质(m.p.297-301℃)在水-饱和丁-1-醇中在氧化铝上(预先用湿丁-1-醇搅拌，保持1小时)色谱纯化，用丁-1-醇/甲醇(1∶1)展开，得到单一产物(由75％甲醇为针状物)，m.p.301-302℃(分解)，与单独用结晶法纯化的一致。
茄解碱水解-在乙醇(10ml)中的茄碱(500mg)通过在浓盐酸(2ml)中回流3小时水解，在水解后30分钟沉积的结晶盐酸盐(细长针状物)在冷却过夜后收集，用水(10ml)洗涤。盐酸盐悬浮液用浓氨水(25ml)在100℃处理1小时得到粗糖苷配基。由甲醇结晶三次后得到茄解定大的无色六边形片状体，m.p.和混合m.p.196-198℃。红外光谱与真实茄解定一致。
2.3替代方法3(U.S 3,960,839，Milton Gverrero，Equador，1976)A.huapag的果实在pinton阶段摘下，使用1kg的果实。每个果实通过沿果实轴两次互相垂直的切割分成四分之一，随后在60℃的烘箱中干燥直至足够脆以易于粉碎。果实随后在简单的开槽圆盘研磨机中粉碎只是为了避免破裂种子。粉碎果实的重量是270g，基于在100℃下的失重，粉碎颗粒的固体含量是94％。
为进行提取，将粉碎的果实放置在2升Erlenmeyer烧瓶中，加入810ml含水异丙醇(按体积计77％异丙醇)。将烧瓶塞住，提取在室温下以剧烈手动搅拌和静置的交互5分钟周期进行2小时。提取的混合物在圆锥漏斗中在滤纸上排水，固体放回Erlenmeyer烧瓶中。为进行第二次提取，加入另外部分(540ml)的含水异丙醇，重复交替搅拌和静置，只是周期是1小时而不是2小时。液体同样进行排水，随后进行与第二次同样的第三次提取，合并所有三次滤液。
合并的液体缓慢加入用水浴在60-70℃下加热的1升旋转蒸发器中。最初的压力是约150mm汞柱，逐渐下降到50mm，此时馏出液基本上是纯水。不使含水残余物冷却，但通过加入加热到60-70℃的水调整其重量至510g。加水持续2分钟，同样搅拌混合物。立即形成沉淀物，混合物随后静置4小时，在此期间，其冷却到接近室温。
随后上清液通过中等滤纸倒出，最后的沉淀物(P)转移至滤纸。P是细粉碎但容易过滤的物质，其颜色是橄榄褐色。在100℃干燥后，P重量是1.9g，该物质在约160℃开始熔融，但在230℃仍未完全熔化。
将滤液放置在配有回流冷凝器的1升圆底烧瓶中，随后加热到80℃。保持在此温度下，磁力搅拌，同时加入15ml的25％氨水，在80℃持续搅拌1小时以上。混合物立即通过中等滤纸过滤，丢弃滤液，它具有9-10的pH，没有糖苷。
保持在滤纸上的滤饼在吸水纸间挤压以除去尽可能多的液体。随后在60℃干燥到25.7g最后重量，在100℃进一步干燥达到27.7％失重。25.7g滤饼样品分析显示，它含有16.7g糖苷，表示在纯化和分离过程中糖苷损失可以忽略。
B.在1升圆底烧瓶中放入46g湿的粗糖苷(如A部中所述制备)、138g异丙醇、37g盐酸(37.6％HCl)和9g自来水。烧瓶配备回流冷凝器和磁性搅拌器，在水浴中回流加热3小时。结束后，内容物是浅棕色悬浮液，使其在2小时内冷却到室温。随后加入在40％(重量)氢氧化钠水溶液，氢氧化钠首先以5ml的增量加入，随后滴加。在添加过程中，混合物用手剧烈打漩1-2分钟。在约pH9时，混合物的粘度明显下降，颜色加深，第二液相的形成变得明显。在pH约9.5-10时停止加入碱，此时液体明显分成两相，可观察到形成沉淀物，加入的氢氧化钠溶液总量是29ml。
使混合物在室温下静置1小时，随后借助重力通过中等滤纸过滤，沉淀物通过在吸水纸间挤压干燥。
滤液由两层组成，上层是棕色的，显示除杂质外含有大部分异丙醇以及非常少量的茄解定。下层是暗棕色，显示含有水、氯化钠和杂质。丢弃全部滤液。湿沉淀物与加入的含水盐酸一起搅拌直至pH在6-7之间，使其静置过夜。随后混合物通过中等滤纸借助重力过滤，沉淀物在吸水纸间挤压，沉淀物在烘箱中在60℃干燥12小时。
沉淀物的干重是14g。
在所报道的纯茄解定在200-202℃熔融的基础上，估计沉淀物含有97％茄解定。过程中早期得到的不太纯的样品在191-197℃熔融，含有95％茄解定。
2.4.替代方法42.4.1原料收集在Bann Huay Sai District，Chiang Mai(泰国)生长3.5月的S.laciniatum的浆果(编码No.160695-3P)和叶(编码No.G1090395)，在烘箱中在60℃下干燥，用简单开槽圆盘研磨机中粉碎成粉末。茄解定参照标准，16-DPA，和其它化学品由Sigma Co.(St.Louis，MO，USA)购买。用于色谱法的溶剂是HPLC级，其它溶剂是试剂级。
2.4.2由Solanum laciniatum Ait分离茄解定2.4.2.1 2-丙醇浓度对粗糖苷提取的效果在70℃，干叶粉(500g)在Erlenmeyer烧瓶中用0-100％v/v的2-丙醇/水提取4-5次(每次1.5l)，汇总所有的滤液，用旋转蒸发器(Buchi，Switzerland)真空蒸发2-丙醇。滤液加热到80℃，搅拌，同时加入30％氨水溶液直至pH达到9-10。收集形成的沉淀物，随后粗糖苷在圆底烧瓶中用在2-丙醇中的1N盐酸水解3小时。加入20％氢氧化钠溶液以沉淀粗茄解定，纯茄解定通过在甲醇中结晶得到。用70-80％(v/v)2-异丙醇，在此范围内0.45％w/w的干叶，收率最佳。对该方法尤其合适的是浓度70％2-丙醇，因为这是获得高收率茄解定的最低浓度。
2.4.2.2用于水解糖苷的各种方法的比较干叶粉(1kg)用2.4.2.1中的相同方法提取，但使用蒸馏水而不是2-丙醇。将粗糖苷分成4份，用电解、在水、乙醇或2-丙醇中的1N盐酸等4种方法水解。
对于电解方法，在3升容器中使用2对铝板电极(10×10cm2)向在0.02N盐酸中的含水提取物(1.5l)中通入DC电流(30A)2小时。
在盐酸水解中使用2-丙醇作为溶剂得到最高收率的茄解定。
2.4.2.3在Solanum laciniatum Ait果实和叶子中茄解定含量的比较干果实(60-750g)或叶子(40-750g)粉末分散在70％2-丙醇中，在提取前声波处理2小时。将悬浮液加入套管中，将醇溶液(体积调节至300或3000ml)加入Soxhlet接受烧瓶中。回流溶液直至耗尽，使用旋转蒸发器真空蒸发2-丙醇。在搅拌下向残余物中加入沸水，过滤溶液，滤液加热到80℃，在加入30％氨水溶液过程中搅拌，直至pH达到9-10。沉淀物重复地用蒸馏水洗涤，过滤和在60℃下干燥。
将上述粗糖苷、2-丙醇和37.6％盐酸以按重量计16.4∶76∶7.6％的比率加入圆底烧瓶中。溶液回流3小时，用真空泵过滤。收集的沉淀物溶解在2-丙醇和20％w/v氢氧化钠溶液中，向溶液中加入大量的水以得到结晶茄解定。茄解定通过滤纸过滤，在60℃干燥。茄解定由甲醇重结晶得到无色六边形片状体的结晶茄解定，它用作16-DPA合成的前体。
与具有绿色粉末特性的叶子提取产物相比，由干果实用70％2-丙醇提取茄解定得到粗茄解定糖苷浅棕色粉末。由提取得到的粗糖苷被有色杂质污染，因为有色杂质和糖苷均溶解于醇中。当粗糖苷重复地用水洗涤时，观察到较好的外观，这是由于几乎所有有色杂质在水中的溶解性。对于干果实和叶子，粗糖苷收率分别是2.03和2.17％w/w。对于粗糖苷水解过程，发现粗糖苷、2-丙醇和盐酸的重量比例起完成酸水解反应和得到较少副产物反应的作用。色谱图结果显示糖苷的水解得到相应的糖苷配基与尤其少量的脱氢产物(澳洲茄二烯)。在水解后，在粗茄解定中所有残留的杂质通过过滤和结晶除去。对于干果实和叶子，白色结晶纯茄解定粉末的平均收率是0.34和0.44％。在干果实和叶子中茄解定的最大收率分别是0.42和0.70％，茄解定的纯度超过90％(m.p.198-200℃)。该产物具有足够的纯度用作原料以转化为16-DPA。产物的所有光谱(IR、MS和MNR)与真实样品的光谱相同，这表示用此方法可以由S.laciniatum的果实和叶子中分离茄解定。它不需要色谱法估计残留的杂质和有色物质，该方法是简单、有效和低成本的，还可以用于大规模生产茄解定，因为它更便于在分离过程中同时收获果实和叶子或全植物。
实施例2步骤1/途径B用由在泰国种植的S.laciniatum，Ait提取的茄解定合成16-DPA(16-去氢孕烯醇酮乙酸酯，3β-乙酰氧基-孕-5，16-二烯-20-酮)1.PCRNC方法将茄解定(1g)在乙酐(5ml)、吡啶(7ml)和对甲苯磺酸(0.0250g)中的溶液回流(160℃)6小时，反应物冷却至室温，加入乙酸(10ml)和水(4ml)，回流(160℃)4小时。混合物冷却到15℃，在搅拌下在20分钟内滴加铬酐(0.75g)在80％乙酸(3ml)中的溶液。在加入氧化剂后，反应物在室温下搅拌4小时，加入在水中的亚硫酸钠(0.08g)以分解过量的氧化剂。使混合物静置过夜，加入乙酐(5ml)，回流(160℃)6小时。反应物冷却到室温，加入冷水以沉淀16-DPA。过滤出产物，用水洗涤并干燥，由甲醇重结晶，得到黄色粉末。产物还可在氧化铝上用柱色谱法纯化，用正己烷和乙酸乙酯(9∶1)洗脱，得到16-DPA无色针状物。
*16-DPA％收率＝44.6，由10g茄解定。
注参见下文，相转移催化剂(PTC)也可用于增加16-DPA的收率。
2.由种植在泰国的S.laciniatum，Ait提取的茄解定合成16-DPA的替代方法2.1替代方法1(J.Rodriguez等，J.Chem.Tech.Biotechnol，卷29，1979，525-530)二乙酰基衍生物的乙酰基化和异构化将茄解定(2g，80％)在乙酸(12ml)中的溶液加入对甲苯磺酸(140mg)在乙酸(1.2ml)和乙酐(2.2ml)中的溶液中，混合物在室温下搅拌1小时，随后回流加热6小时。随后将溶液冷却到15-18℃，在用乙酸(14ml)稀释后，基于茄解定的理论转化率，16-DPA的收率在15-20％。
茄解定(2g，80％)、乙酐(1.8ml)和吡啶(40ml)的混合物回流加热1小时，随后加入吡啶盐酸盐(3g)在吡啶(50ml)中的溶液，再回流2小时。真空蒸馏出溶剂，残余物溶解在乙酸(60ml)中，如下所述进行随后的步骤。
得到的16-DPA收率在20-30％间变化。
将茄解定(2g，80％)溶解在吡啶(40ml)中，回流加热，缓慢加入乙酐(2.3ml)，再回流1.5小时。真空蒸馏出吡啶和过量乙酐。得到的残余物用乙酸(20ml)处理，回流加热15分钟。对此改进方法，基于由纯茄解定得到的理论值，16-DPA收率改善至48-53％。
氧化和水解异构化后得到的在乙酸中的溶液冷却到15-20℃，保持温度低于40℃，加入重铬酸钠在乙酸中的溶液(11％，10ml)。混合物在室温下搅拌1小时，随后加入无水亚硫酸钠(0.52g)以破坏过量氧化剂，混合物再加热2小时。
16-DPA的分离和纯化在用各种方法(结晶或用苯和氯仿提取)进行16-DPA分离和纯化后，最终采用如下技术真空蒸馏含有16-DPA的溶液避免残余物的完全干燥。其余乙酸通过加入苯和形成的共沸混合物的蒸馏脱除。将残余物溶解在水-乙醚混合物(1∶1，100ml)中，分离醚层，水溶液用乙醚充分提取，真空除去溶剂。
得到棕黄色残余物(3.3g)，它通过由甲醇/水(4∶1)结晶或通过在氧化铝上进行色谱法(用苯洗脱)纯化，得到非常纯的产物(0.69g)，用UV、IR和NMR表征。
2.2替代方法2(A.Sree，Y.R.Rao & S N Maha Patra改进，Researchand Industry，27卷，1982年12月，326-328页)茄解定乙酰基化和异构化假茄解定乙酸酯茄解定(100g)在乙酐(105ml)和胺溶剂(650ml)中的溶液蒸馏出乙酸和乙酐。反应混合物冷却，加入水以分解过量乙酐。将O，N-二乙酸酯的粗产物溶解在乙酸中，回流1小时得到假茄解定二乙酸酯。
氧化和水解16-去氢孕烯醇酮乙酸酯将含有假茄解定二乙酸酯的反应混合物冷却到15℃，在搅拌下在20分钟内滴加铬酐(45g)在200ml 80％乙酸水溶液中的溶液。在加入氧化剂后，反应物在室温下搅拌1小时，加入在水中的亚硫酸钠(5g)以分解过量氧化剂。反应混合物回流3小时，蒸馏出溶剂，加入水以沉淀16-DPA。过滤产物，洗涤并干燥，用烃溶剂提取三次，合并提取物，蒸馏出溶剂得到无色固体(44.5g)，m.p.169-72℃。
16-去氢孕烯醇酮乙酸酯将吡啶(40ml，0.05mol)和NH4CI(26.0g，0.50mol)的混合物一次加入搅拌的茄解定(210g)悬浮液中，混合物加热到125-135℃，保持在此温度下直至TLC显示反应完成(通常8-9小时)。随后加入乙酸(400ml)、1，2-二氯乙烷(400ml)和水(54ml)，混合物冷却到0℃。滴加预冷至0℃的CrO3(88.2g，0.882mol)在水(124ml)和乙酸(42ml)中的溶液，同时保持温度在7-10℃。当90％溶液(200ml)加入后，中断冷却，在其余部分加入后，混合物在室温搅拌1小时。随后加入氯化钠(100g)在水(1.5l)和甲醇(16ml)中的溶液，再持续搅拌1小时。酮酯用1，2-二氯乙烷(1×450ml和3×60ml)提取，合并的提取物用水(2×500ml)洗涤以除去残留的铬盐。向有机相中加入固体NaOAc×3H2O(70g，0.51mol)，共沸蒸馏出溶剂以除去水(4-6h)。冷却的残余物仔细地用水(2l)处理以得到固体产物，它用过滤收集，产物用水充分洗涤直至滤液完全无色。(为使残留铬盐的完全除去，将需要1天后的类似洗涤)。由甲醇(400ml)结晶得到纯16-去氢孕烯醇酮乙酸酯(4)；收率117.1-123.8g(65.0-69.0％)；mp 167-172℃。
2.3替代方法3(由Chowdhury I等的US 5,808,117改进，1998年9月)
(a)茄解定乙酸水解成假茄解定二乙酸酯 将50g茄解定加入40ml乙酐中，在压力反应容器中加入150ml二甲苯，开始加热，同时搅拌直至达到温度200℃和相应压力5kg/cm2。在达到所需的温度(190-200℃)后反应进行10小时。停止加热，使其在搅拌下冷却1小时，通过排出管放出温度低于100℃的产物。进行样品的TLC(薄层色谱法)分析显示仅在TLC板上显示一个主要斑点。
在旋转蒸发器中减压(约50mbar)除去溶剂，回收的溶剂保持循环，在除去最后痕量溶剂后，得到固体物质，它被证实是假茄解定。
(b)假茄解定氧化成O，N-二乙酸酯(i)氧化剂溶液制备将25g三氧化铬(CrO3)溶解在25ml水和10ml冰醋酸中得到透明溶液，将其预冷到0℃-5℃。
(ii)氧化剂溶液的加入将如上得到的茄解定二乙酸酯溶解在100ml二氯乙烷和100ml冰醋酸和25ml水中。混合物冷却到0-5℃，在保持反应混合物温度低于5℃下向其中滴加如上制备的氧化剂溶液直至加完。在滴加氧化剂溶液完成后，中断冷却，使反应混合物的温度上升到15℃，并在该温度下搅拌25分钟。当薄层色谱法显示反应完成后，加入5g氯化钠在水(200ml)和甲醇(10ml)中的溶液，持续搅拌20分钟。
(iii)O，N-二乙酸酯提取酮酯O，N-二乙酸酯由反应混合物用1，2-二氯乙烷(4次，200ml)提取，分离后有机层减压蒸馏以回收溶剂。得到O，N-二乙酸酯的胶状残余物，使用石油醚和乙酸乙酯经柱色谱法纯化。
(c)O，N-二乙酸酯水解和降解为16-DPA。使如上得到的O，N-二乙酸酯在200ml冰醋酸中回流5小时，反应用TLC监测。在反应完成后，通过减压(50mbar)蒸馏回收乙酸。随后冷却的残余物用冷水(1l)处理以除去存在的最大数量的铬盐，最终通过过滤收集分离出的固体16-DPA。
残余物用冷水充分洗涤5次，最终固体残余物用1.5l石油醚(b.p.60-80℃)极限提取，得到16-DPA黄色溶液，遗留黑色残余物。
蒸馏黄色溶液得到粗黄色16-去氢孕烯醇酮乙酸酯，由乙醇重结晶得到乳白色结晶，16-DPA的收率为60％。
2.4.替代方法4用相转移催化法(PTC)由茄解定合成16-DPA2.4.1乙酰基化和异构化将茄解定(1g)、吡啶(10ml)和乙酐(5ml)的混合物回流2小时，随后冷却。随后将混合物倾入加入冰和氨水中，过滤出沉淀物并干燥。产物在冰醋酸(10ml)中回流1小时，真空蒸馏出冰醋酸得到黄色残余物。
2.4.2氧化和水解2.4.2.1常规技术对于过氧化氢用作氧化剂，2.4.1的残余物与冰醋酸(10ml)和过氧化氢(30mol％过量)在70℃回流5小时，随后加入水以破坏过量氧化剂。反应混合物用乙酸乙酯提取，蒸发溶剂。残余物在冰醋酸(10ml)中回流。对于高锰酸钾、重铬酸钾和三氧化铬用作氧化剂，将在异构化得到的在冰醋酸中的溶液冷却到0-15℃，在搅拌下在3小时内滴加高锰酸钾、重铬酸钾或三氧化铬(30mol％过量)在冰醋酸(10ml)中的溶液。随后加入甲醇以破坏过量氧化剂，反应混合物回流2小时，真空蒸馏出溶剂。
2.4.2.2相转移催化技术将2.4.1的残余物溶解在二氯甲烷(10ml)中，将氧化剂(30mol％过量)和相转移催化剂(碘化四乙基铵或硫酸氢化四丁基铵；10mol％氧化剂)溶解在水(10ml)中，滴加到反应混合物中。混合物被剧烈搅拌，同时通过加入硫酸保持pH在0-1。浴温保持在0-15℃3小时，由系统中分离有机相，用水洗涤几次。随后真空除去溶剂直至获得胶质物质。产物在冰醋酸(10ml)中回流2小时，真空蒸馏。
2.4.3纯化产物的胶质物质充入硅胶60柱(Merck，Germany)中，用石油醚和乙酸乙酯以增加的极性洗脱。由洗脱得到纯16-PDA。由甲醇重结晶16-PDA得到杆状结晶。
2.4.4.茄解定和16-DPA分析2.4.4.1定性分析分离的茄解定首先由薄层色谱法(TLC)检测，与真实样品比较，使用硅胶60GF254铝板(Merck，Germany)，用由氯仿/甲醇(9∶1)组成的移动相展开。斑点通过在加热板加热前在TLC板上喷洒30％v/v硫酸溶液显示。16-PDA以相同方法检测，但用由乙酸乙酯/石油醚(2∶8)组成的移动相展开，斑点在254nm的UV灯下检测。
2.4.4.2定量分析茄解定用高效液相色谱(HPLC，Thermo Separation Products Inc.，Califomia，USA)在205nm使用Lichrosorb C-18柱(250×4.6mm内径；10μm粒径，HPLC Technology，UK)和0.01M Tris-HCl缓冲液/乙腈(20∶80体积比)作为移动相以2.00ml/min流量和20μl注射体积分析。16-DPA用HPLC在254nm使用Hypersil C-18柱(250×4.6mm内径；10μm粒径；250°A平均孔径，Hichrom，UK)分析，用100％甲醇作移动相，流量1.00ml/min和注射体积5μl。
2.4.4.3鉴定与真实样品相比较，茄解定和16-DPA通过熔点(m.p.)测量(StuartScientific，UK)、IR(Jasco FTIIR-5000，Japan)、GC-MS(Varian Satum 2100，UK)和NMR(Hitachi R-1500，Japan)测定。
2.5.替代方法4的结果和讨论KMnO4、CrO3、Na2Cr2O7或K2Cr2O7可用作氧化剂。碘化四乙基铵或硫酸氢四丁基铵可用作相转移催化剂。相对于茄解定，16-DPA的最佳收率用硫酸氢四丁基铵和K2Cr2O7获得(37.0％)。
茄解定首先在两个连续步骤中转化为假茄解定二乙酸酯即茄解定乙酰基化得到O，N-二乙酰基茄解定，和二乙酸酯异构化得到假茄解定二乙酸酯。得到的残余物在TPC下用各种氧化剂和常规方法氧化。氧化产物进一步水解得到16-PDA。最后，用柱色谱法分离产物。基于连续操作而不纯化中间体的茄解定理论值，最高收率(37.0％，93％纯度，m.p.169-172℃)在使用硫酸氢四丁基铵和重铬酸钾的PTC系统中得到。由m.p.、IR、MS和NMR表征的产物与真实样品相同。在硫酸氢四丁基铵用作相转移催化剂条件下的重铬酸钾得到比碘化四乙基铵和常规技术更好的收率。
在常规技术中，用重铬酸钾得到的产物收率高于用高锰酸钾的收率。然而，即使是强氧化剂，三氧化铬不能用于PTC，这是因为它不被碘化。在过氧化氢情况下，由于它低的氧化效力，未观察到氧化产物。
在我们通过使用重铬酸钾作为氧化剂在PTC下氧化假茄解定二乙酸酯制备16-PDA的新方法中，不仅产物可容易地由系统分离，而且在水相中过量的活性重铬酸盐可重新使用，此外，使用较低毒性和较少数量的铬。因此，可以预期低成本和低废物产生，这对16-PDA的工业生产规模是有利的。
实施例3步骤2/途径B由16-去氢孕烯醇酮乙酸酯(16-DPA)合成16，17α-环氧孕烯醇酮(PercyL.Julian等，J.Am.Chem.Soc.，72卷，1950，5145-5147页)将3g5，16-孕二烯-3β-醇-20-酮乙酸酯溶解在200ml甲醇中，在冷却至15℃后，溶液用6ml 4N氢氧化钠溶液处理，随后立即用12ml 30％过氧化氢溶液处理。随后混合物在冰箱中在5℃贮存23小时。将甲醇溶液倾入800ml水中，分离生成的白色固体。用水充分洗涤并干燥后的固体重量为2.63g(95％)，在180-186℃下熔化。样品由甲醇重结晶得到无色针状物，在187-190℃熔化。
*％收率＝100.43，由8g原料实施例4步骤3/途径B由16，17α-环氧孕烯醇酮合成16-溴-17α-羟基-孕烯醇酮(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1956，816-819页)在10分钟内向107g的16α，17α-环氧-Δ5-孕烯-3β-醇-20-酮在1.1l冰醋酸中的搅拌悬浮液中加入溴化氢在冰醋酸(215ml，32％w/v)中的溶液，内部温度用冰冷却保持在18℃。在加完后在几分钟内得到均匀溶液，随后即刻溴醇部分结晶。在18℃25分钟反应时间后，混合物倾入7升水中，收集粗溴醇，用水充分洗涤，在室温下空气干燥24小时。
*％收率＝88.57(42.13+46.44)，由5g原料实施例5步骤4/途径B由16-溴-17α-羟基孕烯醇酮(溴醇)合成17α-羟基孕烯醇酮(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，卷78，1956，816-819页)将所有粗溴醇悬浮在5L96％乙醇与400g阮内镍中，悬浮液加热到沸腾，除去催化剂，用沸腾乙醇充分洗涤。合并的滤液浓缩至500ml，用冰冷却，收集生成的沉淀物。该步骤产生91.0g Δ5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-乙酸酯。
*％收率＝84.19(41.57+42.62)，由5g原料。
实施例6步骤5/途径B由17α-羟基孕烯醇酮合成5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-甲酸酯(甲酸酯)(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1956，816-819页)将90gΔ5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮在2.3L的85％甲酸中的悬浮液在70℃下搅拌2小时，在任何时间都不产生均匀溶液，但注意结晶形式的改变。混合物在冰中冷却，收集甲酸酯，重量为81.0g(83％)，显示203-207℃的熔点，样品由丙酮结晶，显示207-209℃的熔点。
*％收率＝98.83，由10g原料实施例7步骤6/途径B由5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-甲酸酯(甲酸酯)合成5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-甲酸酯17-乙酸酯(二酯)(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1956，816-819页)将100g所述甲酸酯、2.5g对甲苯磺酸水合物和400ml乙酐的混合物在搅拌下在80℃搅拌30分钟，使其在室温下静置2小时，最终在0℃下过夜。收集二酯，首先用少量冷乙酐洗涤，随后用热水洗涤。干燥产物的重量为99.5g(89％)，显示192-196℃的熔点，由丙酮结晶得到分析样品，显示熔点198-200℃。
*％收率＝94.78，由10g原料实施例8步骤7/途径B由5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-甲酸酯17-乙酸酯(二酯)合成17α-乙酰氧基孕酮(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1956，816-819.页)将所述二酯(51g，m.p.192-196℃)溶解在1.4L工业二甲苯和环己酮中，蒸馏溶液(收集250ml馏出液)除去水分。在5分钟内将溶解在210ml二甲苯中的异丙醇铝(51g)加入缓慢蒸馏的溶液中，随后再持续蒸馏45分钟(再收集210ml馏出液)。迅速冷却混合物，加入冰和水的混合物，通过蒸汽蒸馏除去溶剂。得到的固体通过过滤收集并干燥，用热丙酮提取，随后由该溶剂结晶，得到40.7g(86％)17α-乙酰氧基-孕酮，熔点240-243℃，进一步纯化的样品显示熔点243-247℃。
*％收率＝78.95，由29原料。
实施例9步骤8I途径B由17α-乙酰氧基孕酮合成17α-乙酰氧基-4，6-孕二烯-3，20-二酮(Giichi Goto，等，Chem.Pharm.Bull.，26卷(6)，1978，1718-1728页)向17α-乙酰氧基孕酮(5.0g)在叔丁基醇(50ml)中的溶液加入氯醌(4.0g)，反应混合物加热到80℃5小时。冷却后，将反应混合物倾入10％Na2CO3溶液中，产物用CH2CI2提取。提取物用水洗涤，用Na2SO4干燥，蒸发溶剂得到粗结晶。由丙酮重结晶得到(4.6g)无色针状物。
*％收率＝98.53，由4g原料。
实施例10步骤9/途径B由17α-乙酰氧基-4，6-孕二烯-3，20-二酮合成17α-乙酰氧基-6，7α-环氧-4-孕烯-3，20-二酮(步骤9-2/途径B)1.PCRNC方法将1.0g的17α-乙酰氧基-4，6-孕二烯-3，20-二酮溶解在30ml二氯甲烷中，加入0.9g间氯过苯甲酸。使溶液在室温下静置24小时。将反应混合物倾入5％碳酸钠溶液中，产物用二氯甲烷提取。提取物用水洗涤，用无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂得到17α-乙酰氧基-6，7α-环氧-4-孕烯-3，20-二酮(无色油状物)。残余物在硅胶上经色谱分离，使用石油醚和乙酸乙酯混合物(3∶2)，得到无色针状物。
*％收率＝95.02，由1g原料。
2.由17α-乙酰氧基-4，6-孕二烯-3，20-二酮合成17α-乙酰氧基-6，7α-环氧-4-孕烯-3，20-二酮的替代方法2.1替代方法1(US 3,234,093，Rudoff Wiechert等，1966)将2.34g的1，2α-亚甲基-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯溶解在含有844mg过苯甲酸的18.25ml二氯乙烷中。溶液在+5℃下贮存16小时，在室温下7小时。随后用二氯甲烷和硫酸亚铁水溶液、碳酸氢钠溶液稀释，用水洗涤至中性。
2.2替代方法2(Giichi Goto等，Chem，Pharm.Bull，26卷(6)，1978，1718-1728页)向17β-乙酰氧基-1，2α-亚甲基-6α，7α-环氧-16β-异丙基雄-4-烯-3-酮(1.5g)在CH2Cl2(30ml)中的溶液加入间氯过苯甲酸(0.9g)，使溶液在室温静置24小时。将反应混合物倾入5％Na2CO3溶液中，产物用CH2CI2提取，提取物用水洗涤，用Na2SO4干燥，蒸发溶剂。
2.3替代方法3(U.S 3485852，Howard J.Ringold，1969)将4g的19-去甲-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮17-乙酸酯在100ml氯仿中的溶液冷却到0℃，随后与溶解在乙醚中的等摩尔当量的单过邻苯二甲酸混合。得到的反应混合物在室温下放置20小时，随后用水稀释。接着分离有机层，用碳酸氢钠水溶液洗涤，随后用水洗涤直至中性，随后用无水硫酸钠干燥，最后蒸发至干。干残余物由丙酮/己烷中重结晶得到6α，7α-环氧-19-去甲-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。随后以每个环节重复该过程，但一个例外是Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯用作原料类固醇，因此得到6α，7α-环氧-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。
2.4替代方法4(DE 1158966，Rudolf Wiechert等，1963.)
将2.34g的1，2α-亚甲基-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯溶解在含有844mg过苯甲酸的18.25ml二氯甲烷中。溶液保持在+5℃16小时，在室温下7小时。随后用二氯甲烷稀释，用硫酸铁(II)水溶液、碳酸氢钠溶液洗涤，随后用水洗涤至中性。在干燥后，有机相用硫酸钠减少至干。将得到的1.62g粗1，2α-亚甲基-6，7α-环氧-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯溶解在109ml冰醋酸中，该溶液用氯化氢气体饱和，贮存在室温20小时。随后用二氯甲烷稀释，用水洗涤至中性。干燥后，有机相用硫酸钠减少至干。将得到的粗6-氯-1α-氯甲基-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯加入20ml三甲基吡啶，在氮气下加热至沸腾20分钟。在用乙醚稀释后，用4N盐酸和水洗涤至中性。
在硫酸钠干燥后并减少至干的残余物在硅胶上进行色谱分离，用苯和乙醚(19∶1)混合物洗脱得到900mg的6-氯-1，2α-亚甲基-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯，由异丙基醚重结晶后，具有200-201℃的熔点。UV＝ε281＝17820(甲醇)。
实施例11步骤10/途径B由6，7α-环氧-4-孕烯合成氯地孕酮乙酸酯(步骤10-2/途径B)1.PCRNC方法将3.3640g的17α-乙酰氧基-6，7α-环氧-4-孕烯-3，20-二酮溶解在80ml冰醋酸中，无水氯化氢气体流缓慢通过悬浮液4小时，贮存20小时，随后倾入冰水中。过滤形成的沉淀物，得到氯地孕酮乙酸酯浅黄色粉末。
*氯地孕酮收率％＝91.18，由6，7α-环氧-4-孕烯开始2.由6，7α-环氧-4-孕烯制备氯地孕酮乙酸酯的替代方法2.1替代方法1(US 3485852，Howard J.Ringold，1969)将1g的6α，7α-环氧-19-去甲-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯悬浮在35ml冰醋酸中，随后无水氯化氢气体流缓慢通过悬浮液，在10分钟内所有存在的固体物质溶解。所述气体通过持续总共5小时，随后通过在35℃下减压蒸馏浓缩溶液至其最初体积的约三分之一，倾入冰水中。通过过滤收集形成的沉淀物，用水洗涤直至中性，然后干燥。由二氯甲烷/己烷重结晶得到6-氯-19-去甲-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。
以每个细节重复该过程，只有一项例外，即用无水溴化氢气体代替氯化氢气体，得到相应的6-溴-19-去甲-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。
同样，通过用6α，7α-环氧-19-去甲-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯替代原料类固醇和用无水溴化氢气体代替无水氯化氢气体，保持所有其它因素相同，得到6-溴-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。
2.2替代方法2(US 3234093，Rudolf Wiechert等，1966)将1.62g粗1，2α-亚甲基-6α，7α-环氧-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯溶解在109ml冰醋酸中，溶液随后在室温下用氯化氢气体饱和，贮存20小时。随后用二氯甲烷稀释，用水洗涤直至中性。
有机相用硫酸钠干燥，随后浓缩至干。
2.3替代方法3(Giichi Goto等，Chem.Pharm.Bull.，26卷(6)，1978，1718-1728页)将17β-乙酰氧基-1，2α-亚甲基-6α，7α-环氧-16β-异丙基雄-4，6-二烯-3-酮(2.0g)在冰醋酸(20ml)中的溶液用无水氯化氢饱和，在室温静置20小时后，反应混合物倾入冰水中，产物用CH2CI2提取。提取物以通常的方式加工得到17β-乙酰氧基-1α-氯-甲基-6-氯-16β-异丙基雄-4，6-二烯-3-酮(1.74g)，将其溶解在γ-三甲基吡啶(15ml)中，在N2下回流30分钟。冷却珀，反应混合物用CH2CI2提取，提取物用5％HCl溶液、水洗涤，用Na2SO4干燥，蒸发溶剂得到粗结晶，由醚重结晶得到1.4g无色针状物。
实施例12步骤11/途径B由氯地孕酮乙酸酯合成去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯(步骤11/途径B)1.PCRNC方法1.1化学合成将1.0g氯地孕酮乙酸酯溶解在二噁烷(40ml)中，加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)(0.636g)。反应混合物回流6小时(110℃)。在冷却到室温后，溶液通过中性氧化铝短柱，产物用乙酸乙酯洗脱。蒸发洗脱剂至干得到浅黄色去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯。
*去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯％收率＝81.43，由1g氯地孕酮1.2生物技术合成细菌细胞培养。保存在矿物油分层琼脂斜面中的标准细菌的两种菌株，A.simplex(ATCC 6946)和B.sphaericus(ATCC 13805)在TSA(Tryptic SoyAgar，Difco，USA)中继代培养48小时。每个菌株在250ml振荡烧瓶中在25±2℃在含有(g/l)在50mmol Tris-HCl缓冲液pH7.8中的酵母，5；硫酸铵，3和氯化镁，0.1的100ml第一级培养介质中以200rpm生长48小时。细菌细胞浓度主要用平板计数法测定。
生物转移。将每部分细菌细胞悬浮液加入与第一级培养液相同的调节到50.0ml的第二级培养液中，培养物在250-ml烧瓶中在25±2℃，200rpm生长48h。向培养液中加入如下描述的各种化学物质(在进一步研究中使用对于每种细菌的各个效果的预先最佳结果)。如上所述保持条件，在0、4、24、48、72和96小时收集所有培养反应物(各为0.5ml)用于HPLC分析。
为最佳化外源电子载体的效果，向培养液中加入氯地孕酮乙酸酯和溶解在二甲基甲酰胺(DMF)(5％)中的不同浓度的甲萘醌(0-1.2mmol/l)。
为最佳化底物和有机溶剂的效果，向培养液中加入甲萘醌和不同浓度的氯地孕酮乙酸酯(0.12-0.50mmol/l)和DMF(5或10％)。
为最佳化类固醇诱导物的效果，向培养液中加入氢化可的松2％的乙醇溶液(0-0.55mmol/l)。在氢化可的松存在下培养24小时后，加入在DMF中的甲萘醌和氯地孕酮乙酸酯。
为最佳化表面活性剂的效果，在氢化可的松存在下培养24小时后，向培养液中加入甲萘醌、氯地孕酮乙酸酯和在DMF中的各种浓度的Tween 80(0-1.00％w/v)。
为最佳化D(+)-葡萄糖的效果，在第二级培养液中包含不同浓度的D(+)-葡萄糖(0-10.0g/l)，在氢化可的松存在下培养24小时后，加入甲萘醌、氯地孕酮乙酸酯和在DMF中的Tween 80。
HPLC分析.培养混合物的样品(0.5ml)通过涡流混合2分钟用2.0ml氯仿提取。氯仿部分(0.5ml)转移到取样小瓶，用高效液相色谱(HPLC，ThermoSeparation Products Inc.，USA)在282nm测定氯地孕酮乙酸酯和去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯浓度。每个样品(5μl)在250×4.6mm Hypersil 5μODS250A柱(Hichrom Inc.，USA)使用流量为1.0ml/min的甲醇/水(70∶30体积)作为移动相进行分析。去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯和氯地孕酮乙酸酯与其它化合物得到完全的分离，保留时间分别9.3和11.3min。其它检测到的化合物是氢化可的松、脱氢皮醇和甲萘醌。
在A.simplex and B.sphaericus中，没有甲萘醌的反应混合物具有非常低的生产能力。B.sphaericus的所有培养物，在0.3 to 1.2mmol/l甲萘醌存在下得到比没有外源电子载体的培养物高3-5倍的去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯收率。但在超过0.3mM的较高浓度下，甲萘醌明显不能增加产物收率。
在5％和10％DMF中，底物浓度由0.50mmol/l降低至0.12mmol/l，对于B.sphaericus，导致底物更完全的转化，在5％DMF中时，在0.12mmol/l氯地孕酮乙酸酯时，具有约15％的最高收率。
带有类固醇诱导物的A.simplex的所有条件在4小时得到最多产物，超过没有氢化可的松的情况。氢化可的松不仅诱导用于氯地孕酮乙酸酯生物转变的酶活性，而且本身完全转化为脱氢皮质醇。
在A.simplex中，0.25-1.00％(w/v)的Tween 80浓度改善收率，优选范围为0.5-1.00％。对A.simplex，在0.75％w/v的Tween 80浓度得到28.7％的最高收率。
用DDQ的氯地孕酮乙酸酯的化学脱氢方法通常以较高收率使用，但尤其对于大规模生产，该方法使用大量的毒性试剂(DDQ)和有机溶剂(二噁烷)，必然直接影响环境。另一总量是由DDQ产生对苯二酚，它不得不与产物一起用柱色谱法处理，这进一步增加了成本。另一方面，通过在含水培养液中，使用A.simplex或B.sphaericus游离细胞，氯地孕酮乙酸酯向去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯的生物转变过程，可用作清洁合成方法的有利替代途径。对于A.simplex，用于起始0.25mmol/l氯地孕酮乙酸酯的生物转变，最佳条件是5％DMF，0.41mmol/l氢化可的松和0.75％w/v Tween 80，对于B.sphaericus，用于起始0.12mmol/l氯地孕酮乙酸酯，最佳条件是0.6mmol/l甲萘醌，5％DMF，0.41mmol/l氢化可的松和0.25g/l D(+)-葡萄糖。在两种菌株的总效果得到少于40％的去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯产生。
两相体系和细胞固定技术还开发用于氯地孕酮向去乙酰去氢氯地孕酮的生物转变。
应用脂质体以增溶底物和上述实验的产物也引起用于增加生物转变收率。
2.替代方法2.1替代方法1(Anthony Y.等，Steroids，卷62 221-225t页1997)将二氯二氰基苯醌(100mg，3.3当量)加入氯地孕酮乙酸酯(63mg，1.45×10-4mole)在二噁烷(2ml)中的溶液中，在搅拌下回流过夜。在冷却到室温后，过滤反应混合物，加入三滴吡啶，蒸发至干。残余物用乙酸乙酯提取，用饱和碳酸氢钠水溶液，水洗涤，干燥(Na2SO4)和蒸发得到50mg(80％)。
2.2替代方法2(Bernardo Beyer等.Steroids.31卷，481-488页，1980)将氯地孕酮乙酸酯(1g.2.68mmol)和2，3-二氯-5，6-二氰基苯醌(0.92g.4.05mmol)在二噁烷(40ml)中的溶液回流16小时，随后冷却。形成沉淀的对苯二酚，滤液中的溶剂经减压除去。得到的黑色固体在活化的硅酸镁上进行色谱分离，用苯-CHCl3洗脱得到白色固体61％)。
2.3替代方法3(Giichi Goto等，Chem.Pharm.Bull.26卷(6)1987，1718-1728页)向氯地孕酮乙酸酯(3.5g)在二噁烷(40ml)中的溶液中加入DDQ(2.8g)，反应混合物回流5小时，冷却后，溶液以相同方式处理，由乙醚重结晶得到去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯(3.2g)无色针状物。
实施例13步骤12/途径B由去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯合成环丙孕酮乙酸酯将1.2g碘化三甲基氧化锍(5.6mmol)和0.08g氢化钠(3.3mmol)溶解在10ml二甲基亚砜(DMSO)中，在氮气中在5℃搅拌30分钟。随后加入0.5g去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯(1.24mmole)，搅拌5小时。使混合物在室温下24小时，混合物倾入1N HCl(带冰)溶液中，过滤沉淀物，用水洗涤。由异丙醚重结晶得到环丙孕酮乙酸酯白色粉末。
*％收率＝51.51，由0.5g原料。
权利要求
1.制备环丙孕酮乙酸酯(M)的方法，包括(a)将6，7α-环氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)通过一步法转化为氯地孕酮乙酸酯(K2)；(b)在(K2)的1位上引入双键得到去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯(L2)；和(c)引入桥接(L2)1位和2位的亚甲基得到环丙孕酮乙酸酯(M)。
2.权利要求1的方法，其中6，7α-环氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)通过如下方法得到，其包括(d)在17α-乙酰氧基孕酮(H)的6位引入双键，将其转化为4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(I2)；(e)将(I2)6位的双键转化为环氧官能团得到6，7α-环氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)通过将无水氯化氢气体通过含有6，7α-环氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)的反应混合物进行。
4.权利要求1-3任一的方法，其中步骤(b)通过使用2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)进行。
5.权利要求1-4任一的方法，其中步骤(c)使用碘化三甲基氧化锍(TMSI)和碱金属氢化物，优选氢化钠进行。
6.权利要求2-5任一的方法，其中步骤(d)使用氯醌进行。
7.权利要求2-6任一的方法，其中步骤(e)使用间-氯-过苯甲酸或单过氧邻苯二甲酸进行。
8.制备环丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括(f)通过一步法在17α-乙酰氧基-孕酮(H)的1和6位引入双键将其转化为1，4，6-三烯化合物(I1)；(g)引入桥接1和2位的亚甲基得到1，2α-亚甲基化合物(J1)；(h)引入桥接(J1)6和7位的环氧基得到6，7α-环氧化合物(K1)；(i)将(K1)的环氧基团转化为6-氯-7-羟基化合物(L1)；和(i)将(L1)转化为环丙孕酮乙酸酯(M)。
9.权利要求8的方法，其中在步骤(f)中使用DDQ。
10.权利要求8或9的方法，其中在步骤(g)中使用TMSI和碱金属氢化物。
11.权利要求8-10任一的方法，其中在步骤(i)中使用三氟甲基磺酰氯和氯化锂。
12.权利要求1-11任何之一的方法，其中17α-乙酰氧基孕酮(H)通过包括以本领域已知的方法将茄解定(A)转化为17α-乙酰氧基孕酮(H)的方法制备。
13.权利要求12的方法，其中16-去氢孕烯醇酮乙酸酯(B)通过一步法转化为16，17-环氧-孕烯醇酮(C)。
14.权利要求13的方法，其中(B)向(C)的转化通过在碱性溶液中使用过氧化氢实现。
15.制备环丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括使去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯(L2)与TMSI和碱金属氢化物，优选氢化钠反应。
16.制备环丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括使式(K1)化合物 与氯化锂/三氟甲基磺酰氯或氯化锂/N，N-二甲基乙酰胺盐酸盐反应得到下式化合物(L1) 和使化合物(L1)与乙酸盐水溶液，优选乙酸钠水溶液反应得到环丙孕酮乙酸酯(M)。
17.制备16-去氢孕烯醇酮乙酸酯(B)的方法，包括(k)乙酰基化茄解定(A)得到O，N-二乙酰基茄解定；(l)异构化O，N-二乙酰基茄解定得到假茄解定二乙酸酯；(m)在相转移催化剂存在下氧化得到的假茄解定二乙酸酯。
18.权利要求17的方法，其中相转移催化剂是硫酸氢四丁基铵。
19.权利要求17或19的方法，其中氧化剂是重铬酸钾或重铬酸钠。
20.制备去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯(L2)的方法，包括将氯地孕酮乙酸酯(K2)加入能够将(K2)转化为(L2)的微生物培养物中，由培养物分离得到的去乙酰去氢氯地孕酮乙酸酯。
21.权利要求20的方法，其中微生物是简单节杆菌(Arthrobactersimplex)或球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)。
22.权利要求21的方法，其中简单节杆菌是ATCC 6946或球形芽孢杆菌是ATCC 13805。
23.权利要求20-22任一的方法，其中将电子载体加入培养物，优选甲萘醌(2-甲基-1，4-萘醌)。
24.权利要求20-23任一的方法，其中向培养物加入类固醇，优选氢化可的松。
25.权利要求20-24任一的方法，其中将表面活性剂加入培养物中，优选聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。
全文摘要
本发明涉及用于由茄解定合成环丙孕酮乙酸酯(17α－乙酰氧基－6－氯－1α，2α－亚甲基－4，6－孕二烯－3，20－二酮)的改善方法，本发明的方法比现有技术的方法简短，因此更经济。
文档编号C07J71/00GK1649891SQ03809778
公开日2005年8月3日 申请日期2003年4月14日 优先权日2002年4月29日
发明者阿兰亚·马诺斯罗伊, 吉拉德杰·马诺斯罗伊, 杜昂·巴德哈苏克, 帕塔纳·斯里帕拉基特, 罗兰·梅尔, 罗尔夫·沃纳 申请人:贝林格尔·英格海姆国际有限公司