人糖尿病介导蛋白的制作方法

专利名称：人糖尿病介导蛋白的制作方法
技术领域：
概括地讲，本发明涉及人糖尿病介导蛋白、鉴定糖尿病介导蛋白的方法、筛选影响糖尿病介导蛋白的表达的药物的方法、以及治疗和预防糖尿病的治疗性化合物。
背景技术：
人体内和人疾病的动物模型内的胰岛素依赖型的糖尿病(IDDM)的发展表征为朗格罕氏岛内单核细胞渗透和β细胞的破坏(胰岛炎)。β细胞破坏的机制还不清楚。积累的证据表明细胞因子，如白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)或干扰素-γ(IFN-γ)或其结合物，主要由巨噬细胞和单核细胞产生的，可能是胰岛β细胞破坏的媒介物[Mandrup-Poulsen T，Nerup J.New concepts in the pathogenesis ofinsulin-dependent diabetes mellitus Contrib Nephrol.1989；731-14；discussion 14-5]。
人糖尿病的动物模型包括有糖尿病倾向的BB(BB-DP)大鼠和非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠。构建大鼠胰岛蛋白的二维(2D)凝胶图，并用它测定在体外将大鼠胰岛细胞与IL-1β接触后蛋白质合成中的定性和定量的变化(Andersen等(1995)Diabetes 44400-407；John NE等，Dieabetes.(2000)491879-29.Christensen等人Autoimmunity.(2000)；321-15和Mose Larsen等人，Diabetes.(2001)501056-63)。PCT/IB97/01627记载了通过二维凝胶分析鉴定的大鼠糖尿病介导蛋白。
发明概述本发明部分建立于人糖尿病介导(DM)蛋白的发现和鉴定。DM蛋白是一种涉及糖尿病发展或预防有发展糖尿病危险的受试者的糖尿病发展的蛋白，并可通过在有疾病发展和无疾病发展期间的差异表达而鉴别的这类蛋白。糖尿病的发展包括临床前可检测的所有阶段。
因此，一方面本发明基本上以纯化的人蛋白为特点，其中该蛋白存在于人胰岛细胞内，并在糖尿病的发展期间呈现出与没有糖尿病发展时的不同的表达。纯化的糖尿病介导蛋白选自表中列举的蛋白(包括其所有的修饰体(如生化或化学修饰的蛋白)、变异体或降解产物)，尤其是表6、7和8中列举的蛋白。在相关的一方面，本发明的特点是选自下列的分离的蛋白IEF斑点8，370，473，524，535，551，651，656，909，1013，1186，1353，1400，1477，1549，1629，1685，1689，1707，1715，1766，1800，1902，1935，2041，2079，2354，2382，2408，2411，13652，和14098(表6中所列的)，NEPHGE斑点26，35，60，76，85，128，130，171，187，188，195，243，270，421，449，508，509，532，558，560，609，719，729，829，836，837，3879，和6600(表7中所列的)和IEF斑点122SPI，123SPI，126SPI，130SPI，135SPI，140SPI，160SPI，218SPI，248SPI，277SPI，304SPI，314SPI，和338SPI(表8中所列的)。这些蛋白中一种或多种蛋白(包括其所有的修饰体、变异体或降解产物)的表达可被用来评估受试者发展糖尿病的危险性，评估方法包括获取受试者的生物样品，并测定上面列举的一种或多种蛋白的表达水平，其中上面列举的一种或多种蛋白表达的改变可能表示有疾病发展的危险。
另一方面本发明的特点为人胰岛细胞蛋白的数据库，这些蛋白被鉴定为当与一种或多种细胞因子的组合接触时显示出相对于未与这些细胞因子接触的人胰岛细胞的改变的蛋白表达的人胰岛细胞蛋白。在一个的实施方案中，这些细胞与IL-1β接触；在另一实施方案中，细胞与包括(i)IFNγ和TNFα(ii)IFNγ和TNFα，以及(ii)IL-1β、IFNγ和TNFα之一的细胞因子混合物接触。在具体的实施方案中，人糖尿病介导蛋白的数据库通过将细胞与IL-1β、IFNγ和TNFα的混合物接触而产生。在更具体的实施方案中，本发明的特点为这样一些蛋白的数据库被鉴定为当人胰岛细胞与150pg/ml的IL-1β，1000U/ml的IFNγ，和5000U/ml的TNFα接触时显示出改变的表达的人胰岛细胞蛋白。在整个说明书和表中称这为‘细胞因子混合物’。
显示出相对于对照细胞表达改变的蛋白包括表1、2和3中所列的和

图1、2和3中所示的蛋白的数据库。在更具体的实施方案中，本发明提供包括表1、2和3中所列蛋白的数据库的蛋白数据库子集。该数据库子集包括在预测和/或评估受试者发展糖尿病的危险性中有诊断作用的标记。因此，一方面本发明提供选自表1和/或表2和/或表3中所列蛋白的标记蛋白子集，包括它们的所有变异体、翻译后的修饰体、降解产物和由其衍生的肽以及同源蛋白。在更具体的实施方案中，数据库包括表1、表2和表3所列的5种或更多种、10种或更多种、15种或更多种或25种或更多种的蛋白。
在与此相关的一方面，本发明的特点是分泌型人胰岛细胞蛋白，包括当与IL-lβ、IFNγ和TNFα接触时显示出相对于未与这些细胞因子接触时改变的蛋白表达的分泌型人胰岛细胞蛋白。在具体的实施方案中，蛋白数据库由表3所列和图3所示的蛋白构成。这些蛋白包括鉴定为12SPI，63SPI，79SPI，81SPI，82SPI，83SPI，122SPI，123SPI，126SPI，130SPI，135SPI，140SPI，160SPI，168SPI，213SPI，215SPI，215SPI，218SPI，248SPI，258SPI，258SPI，259SPI，277SPI，304SPI，314SPI，320SPI，338SPI，和1157SPI的蛋白。在更具体的实施方案中，该数据库包括表3所列分泌蛋白的子集。在更具体的实施方案中，该数据库包括15种或更多、10种或更多和5种或更多的所述蛋白。
另一相关的方面，蛋白质组合可以是细胞蛋白(表1和2所列)和分泌型蛋白(表3所列)的组合。
如表1、2和3及图1、2和3所示，许多糖尿病介导蛋白用质谱通过与先前已鉴定的蛋白相对应而进行鉴定。与先前鉴定过的蛋白没有对应的蛋白在本文中通过其质谱表征。新的非分泌的人糖尿病介导蛋白以分子量、PI、和质谱特征表征，在IEF凝胶上鉴定的蛋白收集在表6中和在NEPHGE凝胶上鉴定的蛋白收集在表7中。对于一些蛋白，不可能得到质谱，所以只能用其等电点和分子量和在凝胶电泳图上的位置表征(图1、2和3)。
如表3中所示的分泌型糖尿病介导蛋白，许多分泌型糖尿病介导蛋白通过与先前鉴定过的蛋白相对应(PI和分子量一致)而鉴定。不与已鉴定蛋白相对应的新的分泌型蛋白以质谱特征表征(表8)。
本发明的糖尿病介导蛋白用于药物筛选试验以鉴定能调节糖尿病发展的化合物，所述化合物通过调节糖尿病介导蛋白的表达用作治疗或预防糖尿病的治疗剂和用作能预防或改善糖尿病的治疗剂的目标。
特定的DM蛋白的表达变化在诊断上用作糖尿病发展的指示并用于预测其发展过程(预后)。因此，一方面本发明的特点是一种诊断糖尿病发展的方法，该方法是通过测量一种或多种选自表1-3中所列的非分泌和/或分泌型糖尿病介导蛋白在蛋白质表达方面的增加或减少。测量怀疑有糖尿病或有发展成糖尿病危险的受试者体内蛋白质表达的变化，蛋白质表达的变化是相对于正常的非糖尿病的对照组体内蛋白质的表达而言的。在优选的实施方案中，表1-3中的一种或多种蛋白质的组合的变化表示糖尿病的发展。在更优选的实施方案中，表1-3中的至少5种蛋白的组合的变化表示糖尿病的发展。在进一步优选的实施方案中，表1-3中的至少10种蛋白的组合的变化表示糖尿病的发展。
本发明提供已鉴定的糖尿病介导蛋白，所述蛋白可被进一步表征为保护性的或有害的蛋白，在PCT/IB97/01627有记载，该申请在此全文引入作为参考。保护性的蛋白是一种阻止、抑制或减缓有发展糖尿病危险的受试者体内糖尿病发展的蛋白，有害的蛋白是一种引起糖尿病发展、增加糖尿病发展的危险或减少有发展糖尿病危险的受试者发展糖尿病所需时间的蛋白。有害的蛋白也包括阻止或干扰保护性蛋白表达的蛋白。
本发明包括基本纯的保护性或有害的糖尿病介导蛋白和编码本发明的糖尿病介导蛋白的多核苷酸序列。
一方面，本发明的特点是一种筛选影响一种或多种糖尿病介导蛋白的表达的化合物的试验方法。在具体的实施方案中，本发明提供一种鉴定能够诱导或增强内源的保护性蛋白表达的试验方法。在另一具体的实施方案中，本发明的试验方法用于鉴定能抑制有害的糖尿病介导蛋白的表达因而抑制糖尿病的发展。
在与此相关的一方面，本发明提供一种鉴定能调节糖尿病介导蛋白活性的化合物，例如激动剂、拮抗剂或通过阻断糖尿病介导蛋白的活化所需的翻译后的步骤调节其活性的。特定DM蛋白在表达上的变化用于鉴定能调节DM蛋白表达的化合物的筛选方法中。能调节一种或多种糖尿病介导蛋白的表达的化合物可用作潜在的治疗或预防糖尿病的治疗剂。因此，一方面本发明的特点是鉴定能调节糖尿病介导蛋白表达的化合物的试验方法，该方法包括将试验化合物与表达一种或多种糖尿病介导蛋白的细胞或组织接触，并测定试验化合物对一种或多种糖尿病介导蛋白表达的作用。测定化合物的作用可通过本领域已知的各种方法进行，包括杂交进行探查或其它的寡核苷酸、抗体识别，例如，免疫扩散法、荧光免疫检验法、ELISA，RIA，印迹、免疫沉淀反应法、免疫电泳法或色谱法以及电泳法。能增加选自表1、2和3的糖尿病介导蛋白中一种或多种蛋白的表达和减少选自表1、2和3的糖尿病介导蛋白中一种或多种蛋白的表达的化合物为预防或治疗糖尿病的候补治疗性物质。蛋白表达的变化是相对于没有试验化合物时的表达来测定的。
另一方面，本发明提供一种通过施用治疗有效量的保护性的糖尿病介导蛋白来预防有糖尿病危险的受试者的糖尿病或改善糖尿病受试者的糖尿病症状的治疗方法。优选受试者为人。提供编码保护性的糖尿病介导蛋白的多核苷酸的基因治疗也包括在本发明的范围内。本发明进一步包括一种通过施用有效量的多核苷酸来预防和/或治疗糖尿病的治疗方法，其中所述的多核苷酸在体内抑制有害的糖尿病介导蛋白的表达。候选治疗性化合物选自表1、2和3中的蛋白、其同源物和衍生物及其模拟物。
在与此相关的方面，本发明提供一种预防和/或治疗有糖尿病危险的受试者的糖尿病的治疗方法，该方法是通过施用治疗有效量的能抑制或减少内源的有害糖尿病介导蛋白表达的化合物进行的。在另一实施方案中，本发明提供一种预防和/或治疗有糖尿病危险的受试者的糖尿病的治疗方法，该方法是通过施用治疗有效量的能诱导或增强内源的保护性糖尿病介导蛋白表达的化合物进行的。在与此相关的方面，本发明提供一种预防和/或治疗有糖尿病危险的受试者糖尿病的治疗方法，该方法是通过施用治疗有效量的能调节糖尿病介导蛋白活性的化合物，例如激动剂、拮抗剂，或是通过阻止糖尿病介导蛋白的激活而进行的。本发明的治疗方法包括本领域已知的用于给有需要的受试者提供治疗剂的离体方法。
本发明的目的之一是鉴定介导糖尿病发病的人蛋白。
本发明的另一目的是提供人糖尿病介导蛋白，该蛋白用于鉴定能预防、延迟或改善受试者糖尿病的试验化合物的试验中。
本发明的另一目的是提供人糖尿病介导蛋白，该蛋白用于鉴定能引起、加速或恶化受试者糖尿病的试验化合物的分析中，表明该试验化合物将不适于作为药物化合物。
本发明的上述和其它目的、优点和特点对于阅读了介导糖尿病的基因和蛋白、分析方法的详述和权利要求后的本领域的技术人员来说是显而易见的。
发明详述本发明一方面涉及一种诊断人糖尿病的方法，该方法包括测定人的生物样品中至少一种标记蛋白表达的存在或其水平，其中所述标记蛋白选自表1、2和3及图1、2和3中公开的任何一种蛋白和表1、2和3中标记蛋白的修饰体和衍生物，所述修饰体和衍生物与表1、2和3中的标记蛋白有至少80％的同源性，其中pI为以等电聚焦法测定的标记蛋白的等电点，向上的箭头表示在接触的细胞内该蛋白增量调节，向下的箭头表示在接触的细胞内该蛋白减量调节，并在聚丙烯酰胺凝胶上测定分子量(分子量以kDa为单位)。
进一步地，所述方法的应用优选包括至少2种、至少5种或甚至更优选至少10种所述的蛋白，因为对于这些标记物的应用2种或更多种、5种或更多种或10种或更多种蛋白的表达变化从统计学上是更加可靠的指示。
本发明进一步的方面涉及一种诊断人糖尿病的方法，该方法包括测定人的生物样品中的至少一种标记蛋白表达的存在或水平，还包括确定至少一种标记蛋白增加的表达(增量调节的标记蛋白)或确定至少一种标记蛋白减少的表达(减量调节的标记蛋白)，这些蛋白选自增量调节和减量调节的标记蛋白或增量和减量调节的标记蛋白的组合。
本发明进一步涉及一种治疗糖尿病的方法，该方法包括上调一种减量调节的蛋白、下调一种增量调节的蛋白或两种手段相结合。也就是说本发明涉及一种治疗人糖尿病的方法，该方法包括改变表1、2或3以及图1、2和3中标记蛋白的表达。此外，本发明涉及治疗人糖尿病的方法，该方法包括对所述的人施用表1、2或3中的标记蛋白、编码表1、2或3的标记蛋白的核苷酸序列、表1、2或3蛋白的抗体、能结合表1、2或3的标记蛋白的核酸片段或能结合表1、2或3中标记蛋白的化合物。
在鉴定作为糖尿病标记蛋白的标记蛋白的过程中，所述的标记蛋白要么是先前不清楚与糖尿病有关的蛋白，要么在糖尿病中它们的表达水平不清楚(增量或减量调节)，本发明的研究者目前已分离出先前未被鉴定且的确未与糖尿病相关的蛋白。与这些新蛋白相关的是，本发明还涉及选自表1、2和3中蛋白以及与其有至少80％同源性的蛋白。
本发明进一步的方面涉及新蛋白和表1、2和3中的蛋白作为糖尿病标记物或指示物的用途以及虽已知但其存在与否或普遍性先前被认为与糖尿病无关的蛋白的用途。蛋白质表达和蛋白质表达模式的变化对于诊断、预后和治疗应用以及靶标是重要的。
本发明的方法可被进一步用来测定人患糖尿病的倾向，该方法包括在人的生物样品内测定至少一种标记蛋白的存在或相对水平，其中所述指示有患糖尿病倾向的标记蛋白选自表1、2和3中公开的蛋白和表1、2或3中标记蛋白的修饰体和衍生物，所述的修饰体和衍生物与表1、2或3中的标记蛋白有至少80％的同源性。
一种诊断人有患糖尿病倾向的方法，可包括在人的生物样品内测定至少一种标记蛋白增加的表达，所述的标记蛋白选自表1、2和3的蛋白，确定人生物样品内至少一种标记蛋白的减少的表达(减量调节的标记蛋白)，确定至少一种标记蛋白的增加的表达，或确定标记蛋白的增加的表达与减少的表达的组合。因此，确定测定一种蛋白是受增量调节还是减量调节可作为易患糖尿病的指示。增量和减量调节的模式也可作为指示。也就是说确定一种以上的蛋白的表达水平并一组蛋白的表达模式作为指示。
在合适的实施方案中，至少一种标记蛋白选自所述生物样品的蛋白在聚丙烯酰胺凝胶上显示出比对照品明显低或明显高的一种或多种的蛋白、在所述生物样品的蛋白聚丙烯酰胺凝胶上显示而在对照品聚丙烯酰胺凝胶上不显示的一种或多种蛋白、在所述生物样品的蛋白聚丙烯酰胺凝胶上没有显示而在对照品聚丙烯酰胺凝胶上显示的一种或多种蛋白。
类似地，关于治疗糖尿病的方法，可将一种单一的蛋白作为治疗的目标或可将一组的蛋白作为目标。这类目标蛋白的表达水平可被改变或可干扰这类蛋白本身以改变其活性。因此，治疗人糖尿病方法的一个有价值的实施方案包括改变表1、2或3中的至少一种标记蛋白的表达。
因此，本发明进一步涉及一种治疗人糖尿病的方法，包括对所述的人施用表1、2或3中至少一种标记蛋白、其衍生物、同源物或其模仿物、编码表1、2或3中的标记蛋白的核苷酸序列、表1、2或3中的抗体、能结合表1、2或3中的标记蛋白(或其对应的基因)的核酸片段、或能结合表1、2或3中的标记蛋白(或其对应的基因)的化合物。
本发明的阻止或延迟人糖尿病发作的方法可包括对所述的人施用表1、2或3中的一种标记蛋白、其衍生物、同源物或其模仿物、编码表1、2或3中的标记蛋白的核苷酸序列(如DNA、cDNA、RNA、其PNA同源物或模仿物)、表1、2或3中的抗体、能结合表1、2或3中的标记蛋白的核酸片段(如DNA、cDNA、RNA、PNA、其同源物或模仿物)、或能结合表1、2或3中的标记蛋白(或其对应的基因)的化合物。
因此，本发明的一个特别有价值的方面涉及一种药物组合物，该组合物包括能调节编码表1、2或3中蛋白的至少部分的核酸片段表达的物质、或表1、2或3中至少一种标记蛋白、表1、2或3中的抗体、能结合表1、2或3中的标记蛋白的核酸片段、或能结合表1、2或3中的标记蛋白的化合物。
本发明进一步涉及一种测定一种物质具有治疗糖尿病的治疗作用的可能性的方法，该方法包括在将实验模型与所述试剂接触之前和之后测定表1、2或3中的一种或多种蛋白的表达水平并比较该表达水平。
在化合物的测试中，有关试剂的活性或靶的知识对于理解所述试剂的治疗活性是有用的并有助于改进所需的治疗效果。本发明研究者的进展允许实现一种测定化合物在治疗糖尿病中的效果的方法，该方法包括测定表1、2或3中的一种或多种蛋白的蛋白质表达水平，本发明涉及到一种测定治疗糖尿病的化合物的效果水平或活性水平的方法，该方法包括测定在将实验模型与所述试剂接触之前和之后测定表1、2或3中一种或多种蛋白的表达水平。
因此，本发明进一步涉及一种测定物质生理作用的方法，该方法包括使用已确定为有较大可能患糖尿病和具有患糖尿病遗传倾向的哺乳动物以本发明的方法进行测定，该方法包括对所述的个体施用所述的物质并测定该物质的效果。本发明的研究者预见到测定患糖尿病或易患所述疾病的人的糖尿病特征和病因，包括确定表1、2或3中的蛋白相对模型的表达水平，用来了解所述的疾病和可能的治疗方法。
本发明的每种方法涉及表1、2或3中的蛋白或与其有至少80％的同源性的蛋白和/或是其翻译后的修饰体的用途。类似地，表1、2或3中的新鉴定的蛋白进一步包括与之有至少80％同源性的蛋白，其是或不是这类蛋白的修饰产品。
本发明进一步涉及一种包括编码表1、2或3中定义的肽的核苷酸序列的核酸片段，以及涉及与上述核酸片段或其部分杂交的核酸片段。可使用所述核酸片段检测表1、2或3中肽的存在。
本发明进一步涉及能结合表1、2或3中定义的蛋白(或其翻译后修饰体的任何部分)的抗体。该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可使用抗体检测表1、2或3中显示的肽的存在。
本发明有价值的一方面涉及一种用于诊断哺乳动物糖尿病或有糖尿病遗传倾向的试剂盒，它包括a)一种结合工具，该结合工具特异性地结合至少一种表1、2或3中所示的标记蛋白(或其翻译后的修饰体的任何部分)或表1、2或3中的蛋白的抗体、能结合表1、2或3中的标记蛋白的核酸片段(或其翻译后的修饰体的任何部分)、或能结合表1、2或3中的标记蛋白的化合物(或其翻译后的修饰体的任何部分)。
b)检测结合工具与至少一种标记蛋白或至少一种肽或至少一种核酸片段的结合(假如有结合的话)、或结合的水平的工具，和c)将与结合工具的结合(如果有的话)、或结合的水平、是否表明个体哺乳动物有较大可能患糖尿病或有患糖尿病的遗传倾向相关联起来的工具。
须知可以预料一种以上的标记物相结合的检测将使得该分析成为糖尿病相关疾病的更可靠的指示。因此，诊断或测定至少一种糖尿病相关疾病的倾向的方法优选包括测定两种标记物的存在、活性、浓度和/或表达水平，三种或更多种的标记物(例如至少4、5、6或7种标记物)将是更优选的。类似地暗示用一种以上的本发明化合物(一种以上选自多肽、核酸片段或本发明的抗体)，例如至少2、3、4、5、6或7种化合物进行治疗将使疾病的治疗更加有效，其中所述化合物能有效地影响一种以上的标记蛋白的水平。
在描述本发明的人糖尿病介导蛋白和基因和所用的试验方法之前，应理解本发明不限于具体的试验方法、糖尿病介导蛋白和基因、所述的试验化合物，因为所述的方法、基因及其制备当然可以变化。也应理解本文中的术语只是为了描述具体的实施方案而不是用来限制本发明，因为本发明只受所附的权利要求的限制。
如说明书和权利要求述中所使用的，单数形式的″一种″和″所述″包括其复数名词，除非上下文另外清楚地加以说明。因此，例如“糖尿病介导蛋白”或“一种糖尿病介导蛋白”包括这类蛋白的混合物，“该制剂”或“该方法”包括本文描述的和/或对本领域的技术人员来说在阅读了本发明公开文本等后是显而易见的一种或多种的这类制剂、方法和/或步骤。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语为本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。虽然任何与本文中描述的方法和材料相似的或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但优选的方法和材料为本文描述的方法和材料。本文中所提到的出版物在此引入作为参考以公开和描述与此相关的被出版物引用的方法和/或材料。
术语“糖尿病”包括胰岛素依赖型的糖尿病(IDDM，青少年糖尿病或T1D)和II型糖尿病(成年发作的糖尿病T2D)。术语“与糖尿病相关的疾病”包括肥胖、循环不足、胰岛素抗性(insulin-resistance)、X综合症、糖尿病性的视网膜病、糖尿病性的神经病变以及神经病变和动脉硬化症中的深度糖化终产物的作用(the involvement of advancedglycation end products(AGE))。
术语“蛋白”包括氨基酸链的蛋白质、多肽和肽，包括所有的翻译后的修饰(例如处理和切断、糖基化或磷酸化)，这种修饰通常在调节蛋白质的功能中起决定作用。该术语还包括天然的蛋白质以及合成的或重组的蛋白质、多肽和肽。术语“糖尿病介导蛋白”是指与糖尿病发病相关的蛋白质。糖尿病介导蛋白是在糖尿病的发病期间显示出变化的表达的蛋白，即与无糖尿病发病相比在糖尿病发病期间受增量调节或减量调节的蛋白或其表达受增量调节或减量调节的蛋白。在本发明中，糖尿病介导蛋白被鉴定为当人胰岛细胞与一种或多种细胞因子接触时显示出改变的表达的人胰岛细胞蛋白，其中所述的改变的表达是相对于没有与一或多种细胞因子接触的对照细胞的表达而言的。
可将蛋白以化学方法或生物方法进行修饰，包括磷酸化、甲基化、硫酸化(sulphylated)、糖基化或加入任何形式的脂质或脂肪酸、泛素或任何其它的大基团或含额外的氨基酸或任何其它形式的修饰(其中有200多种修饰形式是已知的)。这些修饰发生在蛋白质的特定位置并且在一个位置上的特定的修饰可能与在同一蛋白质上的不同位置上相同的修饰具有不同的效果。它们在细胞内可以是可逆的，例如它们可被用来开启和关闭酶，所以这些蛋白质可以各种形式存在-每种形式具有与这些蛋白质功能相关的活性。而且多肽可被裂解，例如通过处理其N-端或C-端以移除信号肽或将其拼接以除去内部的序列。在蛋白质数据库如EXPASY可找到许多这类例子，有越来越多的手段预测这些修饰及其功能(参见http//www.expasy.ch/)。因为据估计人体内的每种蛋白平均被修饰了10次，所以可预料本文中已鉴定过的大多数蛋白都是以某种方式或另外的方式修饰过的。因此在表1、2和3中给出了它们的表观等电点和分子量以便与理论值相比较以显示该修饰对蛋白质具有什么效果。
对多肽而言，术语“基本纯”是指重量比至少60％，无与其自然相关的其他蛋白质和天然存在的有机分子。基本纯的糖尿病介导蛋白为重量比至少75％的糖尿病介导蛋白，更优选至少90％，最优选至少99％。基本纯的糖尿病介导蛋白可从下列方法获得由天然来源提取；编码糖尿病介导蛋白的重组核酸的表达；在对天然或重组细胞或表达系统电泳后回收或以化学方法合成该蛋白质。纯度可用任何合适的方法如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析进行测定。
术语“蛋白质”还包括上述多肽的衍生物、相似物和模拟物。这类衍生物、相似物和模拟物优选地与衍生前的多肽具有相同的活性，例如同一种酶活性。该衍生物、相似物和模拟物可具有比母体多肽低的活性、相同的活性或优选地具有比母多肽高的活性。
术语“至少一种”(例如至少一种化合物或至少一种标记蛋白)包括整数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19等。应理解可用单一的蛋白，但在本发明的方法中使用一种以上的标记蛋白更有利。也就是说确定一种以上的蛋白的表达水平并用一组蛋白的表达模式作为指示。显然糖尿病鉴定的可靠性随组中蛋白的数量增加而增加。
“肽模拟物”是模拟肽的生物活性但在化学特性方面不再具有肽的性质的分子。按严格的定义，肽模拟物是不再含任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的分子。然而术语肽模拟物有时用来描述在特性上不再完全是肽的分子，如伪肽、半肽和类肽。无论是完全的非肽或部分的非肽，本发明的肽模拟物具有非常类似于肽的活性基团的三维空间排列的反应性化学基团的空间排列，模拟肽以肽的这种空间结构为基础。因为这种相似的活性部位的几何结构，模拟肽对生物系统具有作用，该作用类似于肽的生物活性。本发明包括肽模拟物的组合物，其为模拟本发明的生物活性肽的活性的相似物，即本发明的模拟肽可被用来治疗与糖尿病相关的疾病。优选地，本发明的肽模拟物在三维形状和生物活性方面都与肽基本上相似或与如上述的活性部位基本上相似。
另外，模拟物可以是‘抗模拟物’。换而言之，是能适合和阻断蛋白质的活性部位、或与结合部位或跟其它生物活性分子相互作用的部位相结合以干扰蛋白质的功能的分子。目前大多数药物属于这种类型。本发明包括这类能与本发明的多肽相互作应的抗模拟物。
使用特定的肽的模拟物或抗模拟物比使用肽本身具有明显的优点，因为肽通常显示出两种不利的性质(1)低的生物利用度；和(2)短的作用持续时间。肽模拟物或抗模拟物提供了解决这两个主要障碍的明显的途径，因为其分子足够小以致口服时具有活性且作用的持续时间长。还能节约相当可观的成本并有改进的与肽模拟物有关的受试者的依从性，因为与胃肠外给药和经粘膜给药的肽比较，它们能口服给药。而且生产肽模拟物比生产肽廉价。最后，对于肽而言有与稳定性、贮藏和免疫反应有关的问题，而肽模拟物没有这些问题。
因此上述肽可应用于具有相似的生物活性因而具有相似的治疗用途的这类小化合物。开发肽模拟物的技术为常规技术。所以肽键可被非肽键替换，允许肽模拟物采用相似的结构，因而具有与原始的肽相似的活性。此外还可通过以其它相似结构的化学基团替换氨基酸基团来作进一步的修饰。通过NMR光谱、结晶学和/或计算机辅助的分子模拟来测定原始肽的三级结构有助于模拟肽的发展。这些技术有助于开发具有比原始肽更高效力和/或更高生物利用度和/或更高稳定性的新组合物[Dean(1994)，BioEssays，16683-687；Cohen和Shatzmiller(1993)，J.Mol.Graph.11166-173；Wiley和Rich(1993)，Med.Res.Rev.，13327-384；Moore(1994)，Trends Pharmacol.Sci.，15124-129；Hruby(1993)，Biopolymers，331073-1082；Bugg等(1993)，Sci.Am.，26992-98，上述所有文献在此引入作为参考]。一旦一种可能的肽模拟物被鉴定，就可合成它并用本文中描述的诊断分析方法或合适的疾病抑制剂分析方法对其进行分析以估计其活性(见Finlay等人(1983)，Cell，571083-1093及Fujiwara等人1993，Cancer Res.534129-4133，全部引用作为参考)。
因此，通过利用上述的方法，本发明提供具有比上述多肽增强的治疗活性的化合物。本发明包括能通过上述方法获得的具有上述肽的生物活性和相似的三维结构的肽模拟物。肽模拟物可从任何前面描述的修饰肽产生或从带有一种以上的前述修饰的肽产生，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。更显而易见的是，本发明的肽模拟物除用作治疗化合物外可被进一步地用于开发更有效的肽模拟物。
术语“表达”的意思不仅包括蛋白质的物理表达，也包括表达的蛋白质的活性测量。例如蛋白质可以一种非活性的形式表达，通过磷酸化活化。尽管蛋白质的实际表达不变，但其有效的表达(活性)可被修饰。在凝胶上活性的变化可随蛋白质修饰形式的表达变化测量。“改变的蛋白质”或“改变的蛋白质表达”是指在糖尿病发病期间其表达增加(“增量调节”)、减少(“减量调节”)、被抑制(即关闭)或被诱导(即开启)的蛋白质。
术语“介导糖尿病的基因或多核苷酸”是指编码蛋白质、肽或蛋白质片段的遗传物质，它编码完整的糖尿病介导蛋白或其片段。该术语源自任何物种的编码糖尿病介导蛋白的任何基因。介导糖尿病的基因或多核苷酸可以是天然存在的或部分或完全合成的。
术语“核酸片段”“多核苷酸”、“核酸序列”等应理解为包括DNA，RNA，LNA(闭合的核酸)，PNA，RNA，dsRNA和RNA-DNA杂交体的核酸分子。也包括含非天然核苷的核酸分子。该术语包括任何长度的，例如10-10000的核苷酸的核酸分子，这由其用途决定。当核酸分子用作例如在DNA治疗中的药物，或用于生产本发明多肽的方法中时，优选使用编码至少部分多肽的分子，该分子具有约18至约1000核苷酸的长度，任选地将该分子嵌入载体中。当核酸用作探测物、引物或用于反义治疗中时，优选使用长度为10-100的分子。按照本发明，可使用其它的分子长度，例如至少有12、15、21、24，27，30，33，36，39，42，50，60，70，80，90，100，200，300，400，500或1000个核苷酸的分子(或核苷酸衍生物)，或最多有10000，5000，4000，3000，2000，1000，700，500，400，300，200，100，50，40，30或20个核苷酸的分子(或核苷酸衍生物)。应理解可将这些数值自由组合以产生一定的范围。
本文中所用的“分离的”多核苷酸是指不直接与在获取该多核苷酸的生物体天然基因组中直接与之相邻的(即5’末端和3’末端处的序列)任何一个编码序列相邻近(即共价键连接)。因此该术语包括重组的多核苷酸，例如并入载体中的、并入到自发复制的质粒或病毒中的或并入到原核生物或真核生物的基因组的DNA中的、或以独立于其它序列的单独的分子形式存在的重组的多核苷酸。它还包括编码额外的多肽序列的杂交基因的部分。本发明分离纯化的多肽序列还包括在严格的条件下与本文详细说明的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
术语“严格的条件”是指保证杂交的多核苷酸序列之间的特异性的杂交条件。本领域的技术人员可选择杂交后洗涤条件，包括温度和盐的浓度，该条件能减少非特异性的杂交以致于只有高互补性的序列才能被识别(Sambrook etal.(1989)Molecular Cloning，2d ed.；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，在此特别引入作为参考)。例如这样的条件是在具体的条件下杂交的，例如，包括在5xSSC中预浸和在20％的甲酰胺、5xDenhardt′s溶液、50mM磷酸钠、pH6.8、50μg变性的超声处理过的小牛胸腺DNA的溶液中于约40℃下预杂交1小时，接着在补充了100μM ATP的相同溶液中在约40℃下杂交18小时(Sambrook等(1989)op cit.)。本发明分离和纯化的多核苷酸序列还包括与编码糖尿病介导蛋白的多核苷酸序列互补的序列(反义序列)和核糖酶。在本申请中多核苷酸序列之间的杂交优选在严格的条件下进行。
术语“序列同一性”(或“序列同源性”)是指对同等长度的两组氨基酸序列或同等长度的两组核苷酸序列同源性程度的测量。如果被比较的两组序列的长度不等，那么必须通过插入缺口或在蛋白质序列末端截断来将它们比对至尽可能最佳的配合。序列的同一性可用 计算，其中Ndif为两组序列比对时不相同的残基的总数，Nref为其中序列之一的残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC有75％的序列同一性(Ndif＝2且Nref＝8)。缺口当作非同一性的具体残基进行计算，即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC有75％的序列同源性(Ndif＝2且Nref＝8)。另外序列同源性可用BLAST程序例如BLASTP程序进行计算(Pearson W.R和D.J.Lipman(1988)PNAS USA 852444-2448)(www.ncbi.nim.nih.gov/cgi-bin/BLAST)。在本发明的一方面，用序列比对的方法ClustalW以默认的参数进行比对，该方法记载在Thompson J.，等Nucleic Acids Res 1994 224673-4680，从http//www2.ebi.ac.uk/clustalw/可获取该方法。另外，两组核酸序列的同源性程度可用GCG程序组件的第8版的GAP进行测定，使用对于DNAGAP标准罚分权重5.00，长度权重0.300，Gribskov和Burgess在Nucl.Acids Res.14(16)；6745-6763(1986)中描述的矩阵，并且两组氨基酸序列的同源性程度可用GCG程序组件的第8版的GAP(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.53711，USA)进行测定，使用对于蛋白质GAP标准罚分权重3.00，长度权重0.100，Gribskov和Burgess在Nucl.Acids Res.14(16)；6745-6763(1986)中描述的矩阵。
优选的序列同源性的最小百分数为至少70％，如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和至少99.5％。
术语蛋白质“数据库”是指由具有至少一种共有的特征而选择的蛋白质集合。术语“数据库”可被其它表示蛋白质集合的术语替代，这些术语包括“库”或“族”。本发明提供人胰岛细胞蛋白的数据库，在一实施方案中当与特定的细胞因子组合接触时这些蛋白显示出改变的表达为其共有的特征。
整个说明书中，除非上下文另有所指，词语“包括”应理解为包括所述的元素或整数或元素或整数形成的集合，但不排除任何其它的元素或或整数或元素或整数形成的集合。
本发明涉及本发明的多肽或核酸用作治疗的疫苗的用途，这在文献如Lowry，D.B.等1999，Nature 400269-71中有记载。
在免疫检测中与本发明的多肽发生特异性反应的单克隆或多克隆抗体、或所述抗体的特异性结合片段也属于本发明的一部分。所述抗体可用本领域技术人员已知的方法制备。多克隆抗体可在哺乳动物内产生，例如通过注射一种或多种本发明的多肽制备，需要时可加入佐剂。例如，本发明的单克隆抗体可通过杂交瘤方法生产，该方法最早在Kohler和Milstein，Nature，256495(1975)中公开，或者通过重组DNA方法，例如美国专利4,816,567中描述的方法生产。单克隆抗体也可从例如用McCafferty等，Nature，348552-554(1990)中描述的方法产生的噬菌体库中分离得到。其它生产抗体的方法在文献例如US 6,136,958中有记载。
在诊断、治疗或测试中，本发明的抗体、核酸片段和/或多肽可单独使用，或作为组合物中的成分使用。这类组合物为本领域所已知，包括这样的组合物其中本发明的抗体、核酸片段或多肽与至少一种其它的分子例如标记物(例如放射性或荧光物质)偶联，优选以共价键的方式偶联。
本发明进一步涉及利用上述化合物治疗和/或预防受试者的糖尿病相关疾病的方法。
本发明的方法包括这些步骤a)将本发明的一种或多种化合物与合适的药物载体结合；和b)给受试者施用与载体结合的治疗有效量的或预防有效量的化合物。
术语“合适的药物载体”是指任何药学领域已知的用于化合物给药的载体。按照本发明可使用任何合适的药物载体，只要不存在相容性的问题。
将有效的剂量施用于受试者可通过胃肠外注射来实现，如静脉注射、鞘内注射、肌内注射或动脉内注射。化合物也可口服或经皮给药，或通过任何其它的本领域技术人员已知的方式例如通过气雾剂或鼻内喷雾的方式给药。本发明优选口服给药。
本文中所用的术语“治疗有效量”是指治疗性治疗受试者所需的一种或多种本发明的化合物的量。这种治疗对于患有确诊为糖尿病相关疾病的受试者是适当的。类似地，术语“预防有效量”是指预防受试者所需的一种或多种本发明的化合物的量。这种预防对于受试者，例如，还没有确诊为有任何糖尿病相关疾病症状的受试者是适当的。当确定受试者有患糖尿病相关疾病的危险(例如，通过以具有标记物的改变的水平来确定糖尿病的倾向)时就开始预防性治疗是有益的。已知某些IDDM的标记物(例如GAD65和其它自身抗体)能在糖尿病发作前至少8年检测到。
正如本领域技术人员所了解的，所给定的化合物的剂量、给药途径和治疗持续的时间不仅取决于化合物的类型和其治疗疾病的效力，也取决于受治疗的个体，要考虑这样一些因素，如受试者的体重、对受试者进行的其它治疗和受试者的病情、临床反应和耐受性。剂量、给药途径和治疗持续的时间可由本领域技术人员对这些因素和其它相关因素进行评估后决定。
本发明的各个方面人的糖尿病介导蛋白和多核苷酸本发明提供人的糖尿病介导蛋白，即被鉴定为在糖尿病发病期间相关的或受影响的蛋白。糖尿病介导蛋白表征为在糖尿病发病期间相对于没有糖尿病发病时其表达被改变的蛋白。本发明的公开从人胰岛细胞蛋白的二维凝胶数据库中鉴定出糖尿病介导的蛋白。糖尿病介导蛋白包括保护性的糖尿病介导蛋白和有害的糖尿病介导蛋白。通过将人胰岛细胞与细胞因子接触来鉴定糖尿病介导蛋白，其中细胞因子为已知或公认为在糖尿病最终发病之前选择性地破坏胰岛细胞的细胞因子。本发明提供通过下述方法鉴定的糖尿病介导蛋白使用二维凝胶比较对照品和用细胞因子刺激的胰岛从而鉴定哪些蛋白有反应，鉴定在细胞反应中起作用的蛋白。可用连环分析确定蛋白质的官能团及其调节(例如通过激酶磷酸化或其它的翻译后的修饰)。
保护性的糖尿病介导蛋白本发明提供基本纯的保护性糖尿病介导蛋白(“保护性蛋白”)，其特征为能防止有糖尿病发病危险的受试者的糖尿病发病，或能改善或减轻糖尿病受试者的糖尿病症状。本发明的保护性蛋白可直接用于防止糖尿病发病，或通过诱导或增强第二保护性蛋白的合成或者通过减少或抑制有害蛋白的合成而间接作用。本发明进一步包括与人的糖尿病介导蛋白的整个氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列，优选至少90％、更优选至少95％和最优选至少98％的同一性。同源性或同一性的百分数可以测定，例如通过使用GAP计算机程序(第6版，购自University ofWisconsin Genetics Computer Group(UWGCG))对序列信息比较而测定。GAP程序运用Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48443中的比对方法，该方法在Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482中进行了修正。简而言之，GAP程序将相似性定义为比对的符号(即核苷酸或氨基酸)中相似的数目除两个序列中较短序列的符号的总数。GAP程序默认的参数包括(1)一元比较矩阵(unitary comparison matrix)(包含同一性的值1和非同一性的值0)和Gribskov和Burgess(1986)Nucl.Acids Res.146745中权重的比较矩阵(the weighted comparisonmatrix)，这在Schwartz和Dayhoff，eds.(1979)Atlas Of蛋白Sequence And Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358中有记载。(2)每个缺口罚分3.0而对每个缺口的每个符号另外罚分0.10；和(3)对于末端缺口无罚分。
本发明进一步包括编码本发明的糖尿病介导蛋白的多核苷酸序列，包括DNA，cDNA，PNA和RNA序列。还应当理解编码全部的或部分的糖尿病介导蛋白的多核苷酸也包括在本发明的范围内，只要它们编码具有介导糖尿病活性的多肽。这类多核苷酸包括天然存在的、合成和有意操纵的多核苷酸。例如，这类多核苷酸可经历定点突变形成。本发明的多核苷酸序列还包括反义序列。反义序列包括用修饰的寡核苷酸合成的序列。本发明的多核苷酸包括由遗传密码简并生成的序列。有20种天然的氨基酸，其中大多数由一种以上的密码子指定。因此，所有简并的核苷酸序列都包括在本发明的范围内，只要由核苷酸序列编码的介导糖尿病的多肽氨基酸序列功能上没有变化。
有害的糖尿病介导蛋白有害的糖尿病介导蛋白(“有害蛋白”)的特征为增强糖尿病的发病或增加受试者糖尿病发病危险。
鉴定糖尿病介导蛋白的方法二维凝胶电泳(2-DGE)是分离蛋白质混合物特别有效的手段(例如Andersen等(1995)Diabetes 44400-407；John NE等，Diabetes.(2000)；491819-29.Christensen等，Autoimmunity.(2000)；321-15和Mose Larsen等，Diabetes.(2001)；501056-63)。将细胞蛋白提取物加到凝胶上，各蛋白首先依电荷分离，然后依大小分离。结果是有1000-5000个斑点的特征图谱，每个斑点通常为单一的蛋白质。通过增加凝胶的尺寸和通过使用放射性同位素示踪法、银染和将凝胶的厚度减至1.5mm和更低以增加灵敏度可提高分辨率。通过使二维凝胶处于狭窄的pH范围内(例如1.5、1pH单位或更小)而获得分辨率的显著进一步改善。如下面的实施例所述，从2D凝胶上回收的单一的蛋白可通过质谱鉴定以得到胰蛋白酶的裂解模式和各个肽的精确分子量。然后用这些观测到的值在DNA和蛋白质数据库中进行检索以确定是否存在与先前鉴定过的蛋白相匹配的蛋白。根据已知的蛋白可以测定同一性或从与已知蛋白的高同源性可推算出同一性。当用2D凝胶电泳分离和鉴定出在糖尿病的发病期间显示出合成改变的蛋白斑点时，将鉴定的蛋白从凝胶上切离并用胰蛋白酶消化产生肽。从凝胶上回收肽并进行质谱分离(matrix assisted laser desorption/离子化的质谱)(MALDI)，并将所得到的MS图谱与公共的序列数据库中所有序列的计算机化的MS图谱和合适的序列信息对照进行分析。如果得到任何与先前克隆的序列的匹配，就将有关相应的基因和编码的蛋白质的信息收集起来。当所鉴定的糖尿病介导蛋白不能与先前克隆的蛋白质匹配时，可通过本领域技术人员已知的方法将蛋白质微序列化以获得部分氨基酸序列信息。也可将蛋白质(当能以足够的量获得时)部分序列化，例如通过nanoelectrospraytandem质谱部分序列化，在该过程中使特定的肽在气相中成碎片并用所得碎片的分子量推导出部分氨基酸序列。一旦获得部分序列的信息就可能在cDNA或EST(表达的序列标签)数据库中以及前面提到的数据库中进行检索。
在从数据库检索或氨基酸序列化获得的结果的基础上，构建具体的或简并的引物并用于筛选大鼠和人胰岛库，或用PCR的第一链cDNA克隆相应的cDNA的部分序列。然后用所得到的序列通过5′-race PCR或通过常规的杂交筛选技术，然后通过重组蛋白质的表达获得全长编码的区域(Karlsen等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888337-8341；Karlsen等(1994)inInsulin secretion and pancreatic beta-cellresearch，Flatt，P.R.，ed.，Smith-Gordon，USA；Chapter 64，pp.1-9；Karlsen等(1995)Diabetes 44757-758)。
糖尿病介导蛋白可以本领域已知的各种方法进行分离，包括从生物材料纯化、由重组DNA表达(见上面)。常规的方法步骤包括提取、沉淀、色谱、亲和色谱和电泳。例如，细胞表达糖尿病介导蛋白可通过离心法或用合适的缓冲液收集、裂解，并将蛋白质通过柱色谱分离，例如在DEAE-纤维素、磷酸纤维素、多聚核糖胞苷酸-琼脂、羟磷灰石上进行，或通过电泳或免疫沉淀分离。另外，使用特异性抗体通过电泳可分离糖尿病介导蛋白。
糖尿病介导蛋白用于筛选能影响糖尿病介导蛋白表达的化合物的用途本发明提供的方法用于筛选能影响糖尿病介导蛋白表达并因而影响哺乳动物糖尿病发病的化合物。用于筛选能影响一种或多种糖尿病介导蛋白表达的药物的一种模型是将可能有有益作用的化合物(包括抗过敏的寡核苷酸)施用给培养的细胞。有用的细胞是RIN、转染的细胞或胰岛细胞。然后可通过2D凝胶电泳分析试验化合物对蛋白表达的作用。
另一种筛选模式是用有糖尿病发病危险的哺乳动物进行体内筛选的方法。简而言之，将具有增加的患糖尿病危险的哺乳动物(例如有糖尿病倾向的BB大鼠或NOD小鼠)与试验化合物接触，并测定与试验化合物的接触对糖尿病发病的作用。
可通过测定一种或多种糖尿病介导蛋白的表达并通过将糖尿病发作的时间与没有糖尿病发展时的表达和时间比较可监测整个发展期间糖尿病的发展。对一种或多种糖尿病介导蛋白的表达的测定包括介导糖尿病蛋白本身、翻译后的修饰产品和/或糖尿病介导蛋白降解产物。在一实施方案中，糖尿病介导蛋白的活化是通过测量糖尿病介导蛋白在试验样品中的表达水平进行测定的。合适的试验样品包括体液，如血液、尿液或脑脊髓液、或由其得到的液体，如血浆或血清。在一具体的实施方案中，蛋白质在试验样品中的表达水平通过蛋白印迹分析测量。存在样品中的蛋白质通过凝胶电泳分离，转移到膜上，并用标记的蛋白质特异性抗体进行探测。在另一具体的实施方案中，糖尿病介导蛋白的表达水平是通过RNA印迹分析测量的。从试验样品中分离多聚腺苷酸化的[poly(A)+]mRNA。将mRNA通过电泳分离并转移到膜上。用标记的cDNA探测该膜。在另一实施方案中，蛋白质的表达通过应用于表达的mRNA的定量PCR进行测量的。
在又一方面，本发明提供鉴定能抑制或减少内源的有害的蛋白表达的化合物的方法，以及通过施用治疗有效量的能抑制或减少内源的有害的蛋白表达的化合物来预防和/或治疗糖尿病的方法。
本发明的糖尿病介导蛋白也用于筛选调节糖尿病介导蛋白活性的试剂。因此，一方面，本发明的特点是鉴定调节糖尿病介导蛋白活性的试剂，该方法包括以待测试剂孵育表达糖尿病介导蛋白的细胞，并测量待测试剂对糖尿病介导蛋白的合成、磷酸化、功能或活性的作用。当糖尿病介导蛋白经磷酸化激活时，待测试剂同糖尿病介导蛋白孵育和用伽马-[32P]或[33P]-标记的-ATP(或其它的单核苷酸)或[32P]或[33P]-焦磷酸盐(磷酸)或[32S]-蛋氨酸孵育，并测定磷酸化的速率。在另一实施方案中，待测试剂同以糖尿病介导蛋白的多核苷酸表达载体转染的细胞孵育，并以RNA印迹分析方法测量待测试剂对糖尿病介导蛋白转录的作用。在进一步的实施方案中，用糖尿病介导蛋白的抗体以蛋白质印迹分析方法测量待测试剂对糖尿病介导蛋白合成的作用。在另一实施方案中，试剂对糖尿病介导蛋白活性的作用是通过用待测[32P]-ATP(或上述的其它放射化学试剂)和糖尿病介导蛋白的途径中的底物孵育糖尿病介导蛋白进行测量的。所有的试验结果都将与以[35S]-蛋氨酸正常标记的细胞进行比较以测定蛋白质表达的调节。底物磷酸化的速率用本领域已知的方法测定。
术语糖尿病介导蛋白活性的调节包括激动和拮抗。本发明尤其用于筛选抑制有害蛋白活性的试剂。这类试剂用于治疗或预防糖尿病。
治疗应用本发明提供通过应用治疗有效量的保护性糖尿病介导蛋白来预防和/或治疗人糖尿病的方法。优选地哺乳动物为有患糖尿病危险的人。
使用已鉴定的糖尿病介导蛋白和相关的糖尿病治疗剂的药物筛选在本发明的药物筛选法中，已鉴定的保护性的或有害的糖尿病介导蛋白用于鉴定能影响其表达的试验化合物。如此鉴定的试验化合物为预防、改善或延迟有患糖尿病危险受试者的糖尿病发作的候选治疗剂。影响糖尿病介导蛋白的试验化合物可以是，但不限于，至少一种选自核酸、化合物、蛋白质、元素、脂质、抗体、糖、同位素、碳水化合物、显象剂、脂蛋白、糖蛋白、酶、可检测的探测剂、和抗体或其片段、或它们的组合，如本文所述，它们可进行可探测的标记，如标记抗体。这些标记包括但不限于酶标记、放射性同位素或放射性化合物或元素、荧光化合物或金属、化学发光性化合物和生物荧光化合物。
治疗性化合物在本发明的药物筛选法中是通过其诱导或增强保护性蛋白以致有患糖尿病危险的受试者的疾病发作被阻止或延迟的能力而鉴定。候选治疗性化合物也可通过其阻止或减少有害蛋白表达以致有患糖尿病危险的受试者的疾病发作被阻止或延迟的能力而鉴定。作为治疗性化合物的治疗性核酸可具有，但不限于，至少一种下述的对靶细胞的治疗作用抑制有害蛋白DNA序列的转录；抑制有害蛋白RNA序列的翻译；抑制有害蛋白对应的RNA或DNA序列的逆转录；抑制蛋白翻译后的修饰；诱导保护性蛋白对应的DNA序列的转录；诱导保护性蛋白对应的RNA序列的翻译；诱导保护性蛋白对应的RNA或DNA序列的逆转录；核酸翻译为蛋白质或酶；将核酸并入靶细胞的染色体用于治疗性核酸的组成型或短暂表达。治疗性核酸的治疗作用可包括，但不限于关闭有缺陷基因或对其表达进行加工，如反义RNA或DNA；抑制病毒的复制或合成；表达编码治疗性蛋白或修正缺陷蛋白的异源核酸的基因治疗；修正RNA如hnRNA、mRNA、tRNA、或rRNA有缺陷的表达或表达不足；编码药物或前药、或能在表达糖尿病介导蛋白或肽的病变或正常细胞内产生作为药物或前药的化合物的酶；和任何已知的其它治疗作用。本发明也包括通过提供编码保护性的糖尿病介导蛋白的多核苷酸的基因治疗法。本发明进一步包括通过施用有效量的抑制有害的糖尿病介导蛋白体内表达的多核苷酸来预防糖尿病的方法。
在本发明的治疗方法中，对病人长期或短期应用治疗化合物。任选地，长期应用保护性的蛋白并联合应用有效量的与该治疗性化合物不同作用途径的化合物。本发明的治疗方法可与其它治疗糖尿病的方法相结合。治疗制剂在PCT/IB97/01627有记载，特在此全文引入作为治疗制剂的说明和本领域已知的治疗化合物的给药方法，包括常规的和基因治疗技术的参考。
人的糖尿病介导蛋白的鉴定和表征如下面的实施例所述，将从器官捐献者胰腺分离的人朗格罕氏岛在标准的培养条件下于RPMI 1640培养基中在下列重组细胞因子存在的情况下培养A＝仅有培养基；B＝培养基+150pg/ml白细胞介素-1β(IL-1β)(相当于60U/ml)；C＝培养基+1500pg/ml IL-1β；D＝培养基+1000U/ml-IFN-γ+5000U/ml肿瘤坏死因子-α(TNFα)；E＝150pg/ml IL-1β+1000U/mlIFNγ+5000U/mlTNFα。
在标准的细胞培养条件下20小时，将细胞在[35S]-蛋氨酸存在下标记4小时。从细胞和培养基中分离出蛋白质。从培养基得到的蛋白质代表不与细胞因子接触或与一种或多种细胞因子接触后的分泌型蛋白质。通过2-D凝胶电泳和质谱分析蛋白质样品。
对于分析凝胶，用于鉴定表达水平改变的蛋白质，进行6个单独的试验，每个试验用150个胰岛。这可以构造每种培养条件下的合成图像。这样通过这种方式将对照条件(A)和其它与细胞因子接触的任何条件下(B-E)的结果进行比较和统计学评估可以鉴定胰岛中的和分泌到培养基中的与对照条件相比被显著增量调节或减量调节的一组蛋白。为了对在上述的凝胶分析中鉴定为增量调节或减量调节的斑点进行MS鉴定，制备定量的/制备型凝胶，每种试验条件用100,000个胰岛(以便在每个斑点上得到足量的蛋白进行MS鉴定)。这样，将两组各100,000个胰岛在没有细胞因子(A)或在3种细胞因子(E)存在的条件下进行培养，增加了让所有的耳的蛋白点都能进行MS鉴定的可能性。
实验给出下面的实施例是为了将如何制备和使用本发明的蛋白质、基因和试验方法的完整的公开和说明提供给本领域的普通技术人员，而不是用来限制发明人所指的发明范围。已作了很大的努力确保所用的数字(例如量、温度等)的准确性，但仍包括一些实验误差和偏差。除非另有说明，份为重量份量，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。
实施例1。材料和方法试剂克他命(Ketamin)购自Park-Davis(Barcelona，Spain)，xylazin购自Bayer(Lever-kusen，Germany)，Temgesic@购自Reckitt和Colemann(Hull，UK)。RPMI 1640、Hanks′平衡盐溶液(HBSS)，和DMEM购自Gibco，Paisley，苏格兰。RPMI 1640含11mmol D-葡萄糖，并补充了20mM HEPES缓冲液、100,000IU/l青霉素和100mg/l链霉素。可靠的重组人IL-1β由Novo Nordisk Ltd.(Bagsvaerd，Denmark)提供，特异活性为400U/ng。使用的其它试剂2-巯基乙醇、牛血清白蛋白(BSA)、Tris-HCL、Tris碱、甘氨酸，(Sigma，St.Louis，USA)；三氯乙酸(TCA)、磷酸、NaOH、甘油、正丁醇、溴酚蓝、硝普钠(SNP)，H3PO4和NaNO2(Merck，Darms tadt，Germany)；过滤器(HAWP 0.25mm孔径)(Millipore，Boston，USA)；RNAse A，DNAse I(Worthington，Freehold，NJ，USA)；[35S]-蛋氨酸(SJ 204，特异活性＞1.000Ci/mmol，含0.1％的2-巯基乙醇、Amplify@(Amersham International，Amersham，UK)；尿素(超高纯)(Schwarz/Mann，Cambridge，MA，USA)；丙烯酰胺、二丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵(BioRad，Richmond，CA，USA)；两性电解质pH 5-7，pH 3.5-10，pH 7-9，pH 8-9.5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)；Nonidet P-40(BDH，Poole，UK)；两性电解质pH 5-7和十二烷基硫酸钠(Serva，Heidelberg，Germany)；琼脂(Litex，Copenhagen，Denmark)；乙醇(绝对浓度96％)(Danish Distillers，Aalborg，Denmark)；甲醇(Prolabo，Brione Le Blanc，France)；乙酸(技术质量，99％冰乙酸)(Bie & Berntsen，Arhus，Denmark)和X-光胶片(CurixRP-2)(AGFA)。
人的样品分离人胰岛(Andersen等(1995)Diabetes 44400-407；John NE等，Diabetes.(2000)；491819-29.Christensen等，Autoimmunity.(2000)；321-15以及Mose Larsen等，Diabetes.(2001)；501056-63)，人胰岛由糖尿病研究所，细胞移植组，(Diabetes ResearchInst.，Division of Cellular Transplantation，Miami，Florida，美国)提供。在培养几天后，将胰岛按上述的具体条件处理。在试验的最后步骤中在2D-凝胶分析前将洗涤过的胰岛和培养基/标记培养基直接(对于制备型凝胶)，或在样品缓冲液中水解后(对于分析型凝胶)于-80℃下贮藏。
细胞因子激发将制备好的人胰岛细胞在5种不同的试验条件下培养A组在单独的培养基中培养；B组在培养基+150pg/ml IL-1β(相当于60U/ml)中培养；C组在培养基+1500pg/mlIL-1β中培养；D组在培养基+1000U/mlIFNγ+5000U/mlTNFα中培养；D组在150pg/ml IL-1β+1000U/mlIFNγ+5000U/mlTNFα中培养。将细胞在标准的条件下于37℃孵育20小时，接着用[35S]-蛋氨酸孵育4小时。收集细胞以进行2-D凝胶电泳和质谱分析。收集每试验组中标记的培养基以进行分泌蛋白质的分析。
样品的制备将用于分析的部分150胰岛/条件在水解缓冲液中直接裂解，大部分在条件A和E下培养的用于上述制备凝胶和MS鉴定的胰岛(100,000/条件)在研钵内碾碎、再混悬于100ml DNAse I/RNAse A溶液中并经冻/融两次裂解。在第二次融化后，将样品置于冰上30分钟以便核酸消化，然后冷冻干燥过夜。在2D-凝胶分离前通过振摇将样品溶解在120ml的裂解缓冲液(8.5M尿素，2％Nonidet P-40，5％2-巯基乙醇和2％两性电解质，pH范围为7-9)中最少4小时。-蛋氨酸掺入量的测定通过向每组两份同等样品5ml的1∶10稀释液中加入作为蛋白质载体的10mg BSA(0.2mg/mlH2O)、接着加入0.5ml的10％TCA来定量测定[35S]-蛋氨酸掺入量。在经0.25mm HAWP过滤器过滤之前让其在4℃下沉淀30分钟。将过滤器干燥并置入闪烁液体中计数。
2-D凝胶电泳该方法早有记载(O′Farrell等(1977)Cell 121133-1142)。简而言之，第一种二维凝胶含4％丙烯酰胺、0.25％二丙烯酰胺和两性电解质。每种样品的等数计量(106cpm)应用到凝胶上。在放射性较低的情况下，必须调整与凝胶的曝光时间以便可比较的总的光密度。将样品在等电聚焦(IEF；pH3.5-7)和非平衡pH-梯度电泳(NEPHGE；pH6.5-10.5)凝胶上分析。第二种二维凝胶含12.5％的丙烯酰胺和0.063％二丙烯酰胺，进行一整夜。电泳后，在干燥前用Amplify@固定和处理凝胶以便荧光显像。使凝胶与X-光胶片接触并在-70℃下暴光3-40天。每份凝胶暴光至少3次以补偿X-射线的动态范围的不足。将一些凝胶立即干燥并将凝胶暴露于磷光板(phosphorimaging plate)上以便捕获影像。暴光3至15天(每份凝胶暴光1次，因为磷光显像仪的动态范围超过106)后，用AGFA ADC 70在板上读数并将图像以16bit文档输出以便分析。
MW和pI的测定蛋白质的分子量用已知的蛋白质的值以内插法测定。界标(Landmark)蛋白质通过下列中的一种或几种技术鉴定免疫印迹、免疫沉淀反应、质谱、微序化或肽图谱。
荧光图象的计算机分析用BioImage@程序(6.1版)在Sun-sparc工作站进行计算机分析。首先，将荧光图像或自显影图像扫描，通过BioImage@程序鉴定斑点并进行定量测定。接着将锚点(anchor points)置于凝胶上(每份凝胶相同的斑点被指定相同的锚点)，并要求计算机将凝胶相匹配。计算机匹配完后，进行人工编辑以确保正确的斑点分界线的鉴定、正确的计算机匹配能发现计算机程序初期不能发现的斑点和斑点的定量测定。最后，提取数据以便用Excel@电子制表软件(Microsoft)计算。为避免IEF和NEPHGE亚组中重复的斑点的存在，在分析时忽略IEF凝胶碱性部分或NEPHGE凝胶酸性部分中重复的斑点。
统计学分析运用Student的t检验，P＜0.01被认为是有显著性差异。
实施例2.糖尿病介导蛋白的表征质谱在本发明的至少一份凝胶中在包括至少一种蛋白质斑点的至少一个凝胶块上原位消化。按照对Rosenfeld等(1992)Anal.Biochem.203173-179中方法改进后的方法制备凝胶，在Fey等(1997)Electrophoresis 181-12中有记载，两篇文献均在此具体引入作为参考。简而言之，将凝胶迅速染色和脱色。用解剖刀将目的蛋白质的凝胶带切割下来，在-20℃下贮存在含UHQ水的微量离心管中，由此可获得目的蛋白质。通过在40％乙腈/60％的消化缓冲液中洗涤凝胶块至少1小时直到除去考马斯亮兰染料从而将蛋白质消化。
这样洗涤除去了考马斯亮兰染料、凝胶缓冲液、SDS和盐份。如有必要，可反复洗涤。然后将凝胶块在真空离心机中干燥20-30分钟直到收缩并在表面上变白。干燥的时间取决于凝胶块的大小和厚度。将胰蛋白酶(或所用的酶)溶解在消化缓冲液中并取5ml加入到凝胶填料中(取决于待分析的凝胶中蛋白质的量(0.1mg))。另外加入消化缓冲液直到凝胶块在试管底部几乎被缓冲液覆盖，约10ml。然后将凝胶块在37℃下孵育6小时或过夜，然后用70-100ml 60％乙腈/40％水孵育以2-6小时提取肽。可重复提取以增加回收率。然后将提取物冻干并在MALDI-MS分析前溶解在30％乙腈/2％TFA中。
实施例3.定量凝胶分析上述两组二维凝胶分析产生表1-8中所列的人糖尿病介导蛋白数据库的鉴定。这些蛋白质通过用1500pg/ml IL-1β或细胞因子(150pg/mlIL-1β(β白细胞介素)、1000U/ml IFNγ(γ干扰素)和5000U/mlTNFα(α肿瘤坏死因子))的混合物处理人胰导而鉴定。
表1所列的所有细胞蛋白鉴定为当用细胞因子处理[35S]-蛋氨酸标记的人胰岛并在IEF凝胶分析蛋白时显示出统计学上显著的表达改变的细胞蛋白。在表1、2和3各表中IL-1β1500是指用1500pg/ml IL-1β刺激。‘细胞因子混合物’是指用150pg/ml IL-1β、1000U/ml IFNγ和5000U/mlTNFα诱导的刺激。向上的箭头表示在处理的细胞中蛋白质以较高的量表达；向下的箭头则相反。
表2所列的所有细胞蛋白鉴定为当用细胞因子处理[35S]-蛋氨酸标记的人胰岛并在NEPHGE凝胶上分析蛋白时显示出统计学上显著的表达改变的细胞蛋白。
表3所列的所有分泌蛋白鉴定为当用细胞因子处理[35S]-蛋氨酸标记的人胰岛并在IEF凝胶上对蛋白进行分析时显示出统计学上显著的表达改变的分泌蛋白。
表4所列的为被鉴定为在细胞因子激发时在IEF凝胶分析中显示出表达改变的蛋白(cf.表1)并提供蛋白质片段的质谱分子量值。这些蛋白质通过参考记录在公众可获得的数据库中的其它种类的蛋白质(包括氨基酸序列和核苷酸序列)进行鉴定。
表5所列的为被鉴定为在细胞因子激发时在NEPHGE凝胶分析中显示出表达改变的蛋白(cf.表2)并提供蛋白质片段的质谱分子量值。这些蛋白质通过参考记录在公众可获得的数据库中的其它种类的蛋白质(包括氨基酸序列和核苷酸序列)进行鉴定。
表6所列的为以IEF凝胶(cf.表1)鉴定的没有任何已知蛋白相对应的新的人胰岛细胞蛋白并提供这些蛋白质片段的质谱分子量值。
表7所列的为以NEPHGE凝胶(cf.表2)鉴定的没有任何已知蛋白相对应的新的人胰岛细胞蛋白并提供这些蛋白质片段的质谱分子量值。
表8所列的为以IEF凝胶(cf.表1)鉴定的没有任何已知的蛋白相对应的由人胰岛细胞分泌的蛋白并提供这些蛋白质片段的质谱分子量值。
图1显示了两份用[35S]蛋氨酸-标记的人胰岛的二维凝胶图像和按本文中描述的方法分离的蛋白质。本文中或表中提到的蛋白质都被标记以便参考。右边给出了近似分子量的刻度。图像的右边是酸性面并覆盖了标定的4到7的pH范围。
图2显示了两份用[35S]蛋氨酸-标记的人胰岛的二维凝胶图像和按本文中描述的方法分离的蛋白质。本文中或表中提到的蛋白质都被标记以便参考分子量刻度。图像的右边的酸性面并覆盖了标定的6.5到10.5的pH范围。
图3显示了两份用[35S]蛋氨酸-标记的胰岛分泌的人蛋白的二维凝胶图像和按本文中描述的方法分离的蛋白质。本文中或表中提到的蛋白质都被标记以便以分子量的数值范围为指示供参考。图像呈现的是右边的酸性面并覆盖了标定的4到7的pH范围。
表1以MS鉴定表征的、通过与其它种类的相关性鉴定的人胰岛细胞蛋白和未曾鉴定的蛋白
表2以MS鉴定表征的、通过与其它物种的相关性鉴定的人胰岛细胞蛋白和未曾鉴定的蛋白
表3在人胰岛细胞培养基中检测到的、以MS鉴定表征的蛋白和未曾鉴定的蛋白
表4以MS表征的人胰岛细胞蛋白肽的分子量值从质谱仪上直接读出，因此与由这样的仪器一般得到的准确性有关。这些质量值来自从IEF凝胶上回收的人胰岛细胞蛋白，并通过参考记录在公众可获得的数据库(无论是核苷酸序列还是蛋白质序列)中的其它物种的蛋白质进行鉴定。
IEF点724984.4406 1004.6172 1045.5750 1084.6248 1137.5220 1172.5513 1181.57871188.5267 1189.5705 1193.5450 1209.5364 1232.6502 1237.5782 1244.63901273.6111 1365.6163 1381.6246 1418.7151 1434.7000 1437.7885 1476.69721525.7884 1544.7837 1583.7063 1589.8061 1601.7708 1618.7619 1630.81951645.8241 1684.8527 1700.7857 1728.8839 1730.8908 1745.9084 1781.81471794.8168 1826.8641 1860.9918 1918.9139 1940.9287 1989.9645 2005.93352055.9358 2077.1362 2095.9846 2211.0999 2328.1808 2674.4376 3198.8492IEF点963903.5003 976.5949 1045.5749 1064.5752 1168.5158 1198.6904 1319.66041341.6072 1350.6473 1379.6844 1437.8828 1445.7037 1501.7661 1509.65831515.7456 1596.7730 1707.7736 1790.9116 1794.8513 1797.8409 1808.91381838.9222 1852.9407 1878.9424 1946.9897 2122.0285 2150.0260 2211.09992406.2399 2559.1687 2585.3182IEF点977842.5100 973.4918 1021.4022 1031.4738 1037.3794 1045.4938 1060.76761075.5956 1151.6148 1159.5482 1179.5398 1196.5457 1263.5613 1267.61121277.6170 1279.5629 1307.5846 1320.5246 1329.5717 1386.6334 1437.76411458.6907 1472.6424 1475.6892 1536.8279 1597.8518 1674.8387 1700.93371717.7814 1794.8163 1802.9448 1826.7513 1873.0013 1881.0435 1888.90441942.0398 1994.0735 2211.0999 2225.1090 2231.1803 2455.2958IEF点1421957.5447 1053.4829 1075.5106 1114.5114 1146.5867 1151.6223 1163.55301177.5601 1197.6195 1222.5030 1227.5776 1277.6330 1291.6297 1302.65201307.6147 1317.6238 1327.6099 1343.6147 1383.6003 1391.6233 1393.65141396.7482 1403.6989 1421.6244 1427.8312 1434.6764 1439.7253 1460.62491469.7214 1475.6805 1477.6583 1487.7037 1489.6919 1515.7063 1540.74101542.7700 1544.7626 1565.7587 1570.7737 1588.7486 1613.8336 1619.80791630.8408 1639.7890 1645.7757 1650.8568 1674.8047 1678.8083 1685.74861694.8735 1701.7636 1726.8556 1741.8646 1749.8863 1763.7788 1789.90341805.8828 1837.9159 1850.9476 1863.9118 1869.9458 1923.9277 1938.89681988.0785 1993.9638 2052.0445 2101.0154 2139.0677 2155.0785 2175.89642196.1696 2211.1000 2225.1153 2230.0816 2444.2075 2461.1385IEF点1861986.6183 1099.5910 1277.6498 1305.6530 1383.6670 1390.5687 1462.71081475.7014 1489.7417 1516.7727 1544.7517 1555.7811 1590.7901 1594.83111638.7729 1644.8520 1654.8019 1661.7714 1701.8654 1707.7328 1716.87881746.9048 1756.9955 1794.8406 1799.9569 1802.8989 1837.9500 1851.92451900.9804 1920.1066 1990.9681 1993.9618 2062.0419 2211.1082 2225.10142272.1417 2298.1959 2472.2712 2502.2031IEF点1923
1004.6256 1045.5750 1084.6033 1137.4897 1172.5717 1181.5737 1188.51631189.5777 1193.5510 1209.5453 1232.6509 1237.5933 1263.6638 1273.61301277.6849 1307.6799 1365.6431 1381.6188 1394.7306 1418.7243 1425.64241437.8278 1444.6997 1455.7280 1475.7475 1525.7932 1544.7815 1583.71301589.7876 1601.7387 1618.7568 1630.8242 1645.8190 1669.8494 1684.88601686.8789 1700.8011 1707.8472 1728.8715 1737.8908 1746.8984 1748.90941779.9697 1782.8774 1794.8152 1835.9384 1838.9265 1860.9665 1908.02601915.9525 1920.9264 1940.9263 1989.9395 2055.9253 2077.1037 2095.96382211.0999 2278.2563 2328.1495 3197.5962 3494.9900表5以MS表征的人胰岛细胞蛋白肽的分子量值从质谱仪上直接读出，因此与由这样的仪器一般得到的准确性有关。这些质量值来自从NEPHGE凝胶上回收的人胰岛细胞蛋白，并通过参考记录在公众可获得的数据库(无论是核苷酸序列还是蛋白质序列)中的其它物种的蛋白质进行鉴定。
NEPHGE点3081016.5065 1032.4876 1035.6038 1055.5031 1148.5696 1179.6000 1197.61751211.5699 1221.5578 1229.7271 1264.6730 1265.6893 1277.6546 1283.73851307.6327 1317.7154 1338.7857 1352.8162 1379.7060 1383.6587 1405.65571434.7509 1475.7249 1487.7638 1505.7494 1527.6946 1539.7651 1549.76661561.7328 1594.8652 1612.7713 1628.7452 1631.7017 1636.6749 1638.86141645.8028 1707.7680 1710.8218 1719.7991 1757.9016 1770.9237 1786.92091794.8343 1812.9308 1822.9402 1837.9966 1852.9594 1940.9424 1988.00631993.9935 2064.1358 2149.0169 2155.2298 2196.1764 2211.0999 2250.11192596.2598 2674.3040 3150.8016NEPHGE点3391009.3940 1171.5822 1179.5496 1226.4567 1277.6437 1320.6468 1383.63081405.4537 1411.7060 1426.7141 1437.8630 1471.7116 1475.7304 1483.69591493.6772 1501.7870 1542.8788 1592.6512 1596.7767 1638.8489 1695.82171707.7969 1715.8272 1778.8540 1794.8041 1797.8152 1819.8835 1823.92291838.9469 1851.9609 1878.9472 1940.9953 1962.8823 1978.9525 1993.99312018.0026 2211.1201 2225.1558 2274.1434 2283.1658 2299.2521 2344.37612383.9712 2402.2620 2406.3035 2431.0818 2705.2697 2719.1012 2731.34722807.4831NEPHGE点418822.4000 832.4732 842.5100 908.6270 928.4098 992.4582 1033.46021045.4933 1065.4224 1073.4967 1107.4692 1116.4852 1147.5546 1157.49591165.4439 1167.4800 1179.5001 1201.5553 1218.5409 1232.5022 1277.62041299.5559 1307.5788 1352.6447 1357.6185 1384.6983 1393.6325 1406.56871422.5837 1427.6627 1437.6719 1454.6286 1470.6347 1475.6829 1493.65741500.6009 1503.6764 1560.7424 1628.7381 1657.7530 1694.6866 1699.75471707.7213 1716.8199 1741.7043 1751.7916 1784.8936 1791.7001 1838.88551851.8301 1867.8840 1987.9418 2211.0999 2365.2112 2383.9402NEPHGE点474679.5296 706.4771 714.4944 730.4229 991.5260 1012.5126 1092.55791108.5016 1212.5737 1225.5337 1277.6968 1307.6588 1446.8720 1475.77481604.7245 1710.9075 1772.9576 1788.9636 1794.8920 1867.0268 2018.11372174.2120 2211.2344 2401.4191 2789.6777NEPHGE点536
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NEPHGE点26842.5131 870.5369 1045.5217 1179.5371 1265.5405 1277.6271 1308.54571314.6746 1320.5417 1324.5497 1357.6471 1427.7444 1475.6748 1493.66611664.8418 1703.9330 1716.7841 1719.8587 1743.8199 1760.7887 1775.82731791.7874 1794.7814 1826.7590 1940.8930 1945.9745 1993.9401 2211.04532225.0987 2230.1019 2239.1267 2284.1508 2299.1526 2314.0976 2383.8783NEPHGE点351169.6652 1277.6525 1320.5251 1366.6936 1403.7316 1427.7965 1467.64931475.7490 1486.6881 1550.7053 1638.8392 1651.8001 1707.8210 1794.80891838.8934 1940.9146 1950.9534 1994.0184 2011.9465 2082.9935 2152.1050
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NEPHGE点3879806.4919 1029.6369 1036.5549 1045.5927 1065.5397 1087.5387 1090.59701115.5180 1157.6195 1165.5772 1175.6512 1179.6000 1198.6571 1201.67941205.6320 1232.6643 1243.6040 1277.7034 1297.6864 1300.5622 1307.66101314.7621 1320.5558 1323.6573 1330.7207 1337.6185 1340.7602 1344.73201383.6828 1426.7184 1434.7529 1438.8223 1441.7131 1469.7683 1475.75271493.7449 1535.8745 1634.8796 1638.8827 1656.7456 1675.8037 1707.78601716.8731 1728.8562 1743.8410 1759.8798 1785.9333 1794.8294 1804.84411838.9205 1990.1067 1994.0040 2211.1000NEPHGE点66001112.7125 1119.8876 1154.7604 1179.5853 1258.5560 1299.9739 1334.87591342.0311 1369.7625 1376.9353 1404.6771 1411.8281 1691.3292 1726.22451761.1320 1794.8996 2101.1599 2117.5243 2211.2240表8在人胰岛细胞培养基中可检测到的并以MS表征的蛋白肽的分子量值从质谱仪上直接读出，因此与由这样的仪器一般得到的准确性有关。这些质量值来自在培养基(如方法中所述)中培养人胰岛后培养基中可检测到的蛋白质。这些蛋白质从IEF凝胶上回收。其肽的质量值并不能与以相似的方法处理产生的肽匹配，如果有任何蛋白质记录在公众可获得的数据库(无论是核苷酸序列还是蛋白质序列)。
IEF点122SPI842.5100 927.4963 973.5343 1066.4649 1109.4248 1165.5350 1179.55831213.6268 1234.6228 1263.6294 1277.6595 1300.4708 1307.6346 1315.62461320.5471 1357.6533 1365.5835 1379.6918 1383.6430 1390.6393 1400.63691405.6680 1421.6233 1427.7104 1434.7311 1475.7333 1493.6983 1497.75291513.7643 1639.9035 1657.7697 1699.8245 1707.7840 1716.8404 1745.83991797.0431 1819.0044 1834.9854 1837.9651 1993.9989 2096.1253 2114.10742129.9106 2211.0999 2224.2375 2239.1053 2249.0984 2367.2937 2383.95842509.2311 2705.2275 2872.5248 3314.3928IEF点123SPI842.5100 995.6139 1045.5020 1179.5325 1257.6289 1277.6396 1307.6108 1382.61041418.6783 1434.7291 1475.7101 1487.7178 1523.7513 1540.7742 1604.7757 1608.75951638.8370 1707.7398 1716.8473 1794.8201 1812.0723 1837.9388 1851.9256 1867.91821901.0100 1940.9715 1993.9586 2113.0096 2150.0818 2184.0996 2211.0999 2225.11032231.1825 2345.2339 2384.93041EF点1265PI842.5100 1023.6778 1095.6006 1137.7430 1164.6686 1198.6274 1204.6551 1217.65811277.6826 1291.6875 1308.6616 1313.6816 1366.7194 1371.7416 1383.6704 1428.79661439.7924 1444.7147 1475.7456 1487.7390 1570.8290 1619.8479 1629.8740 1638.85141662.8514 1674.8398 1679.8136 1684.8887 1692.8810 1707.7897 1794.8050 1824.96421837.9740 1852.9313 1867.9291 1869.9953 1896.0050 1902.0257 1940.9322 1953.04591962.9743 1993.9616 2151.0562 2158.1156 2169.0372 2184.0868 2211.1000 2283.21572297.1638 2345.2835 2748.3837IEF点1305P1842.5100 1036.5147 1075.5384 1082.5560 1107.5100 1165.5090 1179.5516 1198.65661277.6451 1303.6580 1307.6217 1329.6573 1393.6412 1455.6351 1475.7144 1487.70501515.7538 1638.8218 1657.7565 1704.8650 1707.7353 1758.8640 1790.8768 1794.7723
1799.8790 1811.8747 1837.9550 1839.9159 1872.9456 1914.0100 1941.9548 1993.95092047.0529 2054.0744 2150.0295 2184.0963 2211.0999 2250.0364 2383.9437IEF点135SPI842.5100 1271.6481 1343.6065 1413.7382 1440.6092 1452.6148 1515.7276 1571.79851692.8303 1709.7921 1794.8135 2211.1000IEF点140SPI842.5100 995.6118 1192.5588 1198.6323 1277.6308 1311.5802 1333.6658 1344.59901350.6185 1419.6963 1475.7224 1487.6666 1515.7236 1575.7435 1638.8524 1687.86741707.7437 1773.8513 1780.8198 1790.8845 1794.8104 1838.9057 1853.9362 1858.94841901.1178 1954.0130 1993.9445 2016.0588 2075.9670 2155.1313 2211.0999 2279.21902284.2035 2384.9802 2401.1453IEF点160SPI842.5100 944.4201 1045.4319 1093.3863 1121.4125 1179.4628 1195.4396 1277.56551297.5044 1302.5312 1307.5412 1320.4609 1350.5468 1383.5719 1475.6543 1556.65941638.8052 1650.7700 1657.7602 1684.7837 1707.7410 1794.7624 1812.8635 1838.92081851.8857 1872.9481 1931.9711 1993.9814 2211.0999 2225.1307 2383.9509 2389.2171IEF点218SPI842.5100 950.6771 995.4745 1021.4311 1043.4929 1045.4833 1060.51281109.4391 1126.4305 1142.4871 1157.5613 1179.5079 1199.4923 1210.52031220.5043 1234.6055 1263.6086 1277.6299 1286.5597 1300.4350 1302.61751307.5960 1314.7119 1320.5066 1329.5849 1353.6598 1357.6076 1365.54601383.5880 1393.6262 1427.7609 1434.7341 1475.6921 1493.6654 1545.77371553.7960 1700.7823 1707.7831 1714.8079 1716.8088 1726.8174 1794.79791825.9672 1838.9224 1922.9490 1933.9836 1940.9304 1987.0506 1993.96882005.0097 2083.0669 2211.0999 2225.1217 2230.1991 2239.1338 2283.25172297.1804 2344.3708 2367.2739 2384.1822 2401.2136 2662.6332 3077.67263095.4811 3339.9445 3349.7509IEF点248SPI842.5100 995.5661 1192.5533 1198.6455 1344.5956 1419.6789 1424.7739 1515.74731704.8844 1794.8113 1869.9654 1902.0689 1940.9132 1952.9542 1959.9920 2016.10832153.1172 2155.0712 2211.1000 2279.1779 2284.1800 2344.2439 2402.2584IEF点277SPI842.5100 944.5108 989.5777 1032.5590 1137.6793 1180.5632 1277.6210 1325.65291335.6512 1349.6238 1363.6523 1366.7033 1398.7028 1467.7336 1475.7235 1538.84411602.7634 1636.8005 1638.8129 1652.7675 1670.9066 1703.8669 1719.9301 1743.80321758.8949 1794.7991 1839.8938 1931.1572 1940.9432 1993.9414 2030.0920 2153.03952176.9849 2211.0999 2284.1637 2298.1739 2345.2744IEF点304SPI842.7320 2211.6199 2225.6395 2284.7376 2346.7681IEF点314SPI1747.1466 1929.2249 2040.3318 2079.2340 2292.4766 2309.5383 2338.5453 2367.6507IEF点338SPI842.5100 1277.6344 1298.6552 1302.6274 1307.5972 1329.6478 1381.7755 1398.66031426.7642 1475.7128 1487.6784 1523.7645 1602.7505 1638.8279 1707.7565 1742.84191758.8799 1784.7091 1794.7915 1812.0358 1838.9245 1851.9135 1867.8992 1941.95941966.0151 1969.0193 1993.9537 2150.0574 2176.0349 2184.0894 2211.0999 2225.11842286.1485 2299.1497 2331.1452 2361.1860 2383.9924 2501.1805 2509.2701 2580.31952643.3333 2702.2667 2707.2342 2718.2130 2723.3186 2808.3617 2832.346权利要求
1.一种诊断包括人类的哺乳动物的糖尿病的方法，该方法包括测定取自所述哺乳动物的生物样品内的至少一种标记蛋白的存在与否或表达水平，其中该标记蛋白选自a) 表1、2和/或3中定义的蛋白质；和b) 表1、2或3中蛋白质的修饰体或衍生物，它与表1、2或3中的蛋白质有至少80％的序列同源性。
2.权利要求1的方法，其中所述的方法包括确定选自下列中的至少一种标记蛋白增加的表达(增量调节的标记蛋白)a) 表1和/或2和/或3中定义的并用上箭头标记的蛋白质；和b) a)中蛋白质的修饰体或衍生物，它与a)中的蛋白质有至少80％的序列同源性。
3.权利要求1或2任一项的方法，其中所述生物样品选自尿液、血液、唾液、淋巴液和组织。
4.权利要求3的方法，其中所述组织为胰腺组织。
5.一种测定包括人的哺乳动物患糖尿病倾向的方法，该方法包括测定取自所述哺乳动物的生物样品内的至少一种标记蛋白的存在与否或相对表达水平，其中该标记蛋白选自a) 表1、2和3中定义的蛋白质；和b) 表1、2或3中蛋白质的修饰体或衍生物，它与表1、2或3中的蛋白质有至少80％的序列同源性。
6.一种测定人患糖尿病倾向的方法，该方法包括a) 测定取自人体的生物样品内至少一种标记蛋白增加的表达，所述的标记蛋白选自i)表1、2和/或3中定义的增量调节的蛋白，和ii)i)中蛋白的修饰体或衍生物，它与i)中蛋白有至少80％的序列同源性；b) 测定取自人体生物样品内至少一种标记蛋白减少的表达，所述的标记蛋白选自i)表1、2和/或3定义的减量调节的蛋白，和ii)i)中蛋白的修饰体或衍生物，它与i)蛋白有至少80％的序列同源性；或c) a)与b)中测定的组合。
7.权利要求1、5或6中任一项权利要求所述的方法，其中至少一种标记蛋白选自a) 所述的生物样品的蛋白中在聚丙烯酰胺凝胶上显现出的量明显低于或明显高于对照品的一种或多种蛋白；b) 在所述生物样品蛋白的聚丙烯酰胺凝胶上存在而在对照品的聚丙烯酰胺凝胶上不存在的一种或多种蛋白；和c) 在所述生物样品蛋白的聚丙烯酰胺凝胶上不存在而在对照品的聚丙烯酰胺凝胶上存在的一种或多种蛋白。
8.一种治疗包括人类的哺乳动物的糖尿病的方法，包括改变选自下列中的至少一种标记蛋白的表达a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
9.一种治疗包括人类的哺乳动物的糖尿病的方法，包括对所述的人施用选自下列中的至少一种化合物a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3中的蛋白有至少80％的序列同源性；c) 与a)和/或b)中的蛋白有同样功能的蛋白；d) 编码a)、b)或c)中蛋白的核苷酸序列；e) a)、b)或c)的蛋白的抗体；f) 能结合a)、b)或c)的蛋白的核酸片段；和g) 能结合a)、b)或c)的蛋白的化合物。
10.一种预防或延迟包括人的哺乳动物糖尿病发病的方法，包括给所述的人施用a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性；c) a)和b)中定义的蛋白的模拟物；d) 编码a)和/或b)中定义的蛋白的核苷酸序列；e) a)和/或b)中定义的蛋白的抗体；f) 能结合a)和/或b)的蛋白的核酸片段；和/或g) 能结合a)和/或b)中定义的蛋白的化合物。
11.一种测定物质对治疗糖尿病具有治疗性效果的可能性的方法，包括在将测试模型暴露于所述物质之前和之后测定选自下列中的一种或多种蛋白的表达水平a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
12.一种测定化合物治疗糖尿病的效果的方法，包括测定选自下列中的一种或多种蛋白的表达水平a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3中的蛋白有至少80％的序列同源性。
13.一种测定用于治疗糖尿病的化合物效果水平的方法，包括在将试验模型暴露于所述物质之前和之后测定选自下列中的一种或多种蛋白的表达水平a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
14.一种测定患糖尿病或易患糖尿病的包括人类的哺乳动物的糖尿病的特征或诱因的方法，包括相对一种模型确定选自下列的蛋白的表达水平a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
15.一种基本纯的蛋白，选自a) 表1、2和3中的蛋白；和c) 与a)中蛋白有至少80％序列同源性的蛋白。
16.一种核酸片段，包括编码表1、2或3中定义的蛋白或与其有至少80％序列同源性的蛋白的核苷酸序列。
17.一种与根据权利要求16的核酸片段或其部分或其互补链杂交的核酸片段。
18.根据权利要求16-17中任一项的核酸片段用于检测选自下列的肽的存在的用途a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
19.能结合选自下列的蛋白的抗体a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
20.权利要求19的抗体，所述抗体为多克隆抗体。
21.权利要求19的抗体，所述抗体为单克隆抗体。
22.权利要求19-21中任一项的抗体用于检测选自下列的蛋白的存在的用途a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；和b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性。
23.一种诊断包括人类的哺乳动物的糖尿病或糖尿病遗传倾向的测试试剂盒，包括a) 一种特异性结合选自下列的至少一种标记蛋白的结合工具i)表1、2和/或3中定义的蛋白；和ii)i)中蛋白的修饰体或衍生物，它与i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；或该结合工具为至少一种所述标记蛋白的抗体、能结合至少一种所述标记蛋白的核酸片段或能结合至少一种所述标记蛋白的化合物；b) 一种检测所述结合工具与至少一种所述标记蛋白或与至少一种所述核酸片段结合，若有的话，或结合的水平的工具，和c) 一种将与结合工具的结合，若有的话，或结合的水平是否表示个体哺乳动物有患糖尿病的较高可能性或有患糖尿病的遗传倾向相关联的工具。
24.一种测定物质的效果的方法，该方法包括使用哺乳动物，例如人，其中哺乳动物是通过运用权利要求1-7中的任一项的方法确定为有患糖尿病的较大可能性或有患糖尿病的遗传倾向的个体，该方法包括将所述的物质施用给所述个体并测定该物质的效果。
25.一种药物组合物，包括a) 能调节核酸片段表达的物质，该核酸片段编码选自下列的蛋白的至少片段i)表1、2和/或3中定义的蛋白；和ii)i)中蛋白的修饰体或衍生物，它与i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；b) 选自下列的标记蛋白i)表1、2和/或3中定义的蛋白；和ii)i)中蛋白的修饰体或衍生物，它与i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；c) 选自下列的蛋白的衍生物、同源物或模拟物i)表1、2和/或3中定义的蛋白；和ii)i)中蛋白的修饰体或衍生物，它与i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；d) 选自下列的蛋白的抗体i)表1、2和/或3中定义的蛋白；和ii)i)中蛋白的修饰体或衍生物，它与i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；e) 能结合选自下列的标记蛋白的核酸片段、衍生物或模拟物(如PNA)i)表1、2和/或3中定义的蛋白；和ii)i)中蛋白的修饰体或衍生物，它与i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；f) 能结合选自下列的标记蛋白的化合物i)表1、2和/或3中定义的蛋白；和ii)i)中蛋白的修饰体或衍生物，它与i)中的蛋白有至少80％的序列同源性；
26.用作药物，如用于治疗或预防糖尿病的权利要求25的药物组合物。
27.选自下列的化合物在制备用于治疗或预防糖尿病的药物中的用途a) 表1、2和/或3中定义的蛋白；b) 表1、2或3的蛋白的修饰体或衍生物，它与表1、2或3的蛋白有至少80％的序列同源性；c) 与a)和/或b)中的蛋白有同样功能的蛋白；d) 编码a)、b)或c)中蛋白的核苷酸序列；e) a)、b)或c)中蛋白的抗体；f) 能结合a)、b)或c)的蛋白的核酸片段、衍生物或模拟物(例如PNA)；和g) 能结合a)、b)或c)的蛋白的化合物。
全文摘要
本发明提供人分沁型和非分沁型糖尿病介导蛋白质，包括保护性的和有害的糖尿病介导蛋白质，以及编码上述蛋白质的多核苷酸，用于鉴定能改变糖尿病介导蛋白质表达的试验化合物的药物筛选法，通过施用能改变糖尿病介导蛋白质表达的化合物来预防或改善糖尿病的方法。
文档编号C07K14/47GK1856708SQ03811434
公开日2006年11月1日 申请日期2003年3月20日 优先权日2002年3月20日
发明者P·M·拉森, S·J·菲, J·纳鲁普, A·E·卡尔森 申请人:普赖德普罗特奥米克斯公司