专利名称：：在胞内环境中表现出增强的稳定性的免疫球蛋白构架及其鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白质化学、分子生物学以及免疫学。相关
技术领域：
背景抗体能以高度的特异性和亲和力识别并靶向几乎任何分子。这个特点已被开发，以便将这些天然蛋白转变为用于诊断和治疗应用的强有力的工具。重组DNA技术的进展已推动了抗体基因在广泛种类的非淋巴细胞中的操作、克隆和表达(Skerra，1988；Martineau，1998；Verma，1998)。已经构建了许多不同的抗体片段，以便最佳地满足各种应用。保留整个母体免疫球蛋白全部抗原结合能力的最小实体是单链Fv片段(scFv)(Bird，1988)。该抗体片段包含由柔性肽接头连接起来的重链和轻链可变区，这使得该蛋白能够由单个基因表达。抗体片段较之于完整免疫球蛋白分子具有若干重要的优势。由于分子小，它们在多种表达宿主细胞如大肠杆菌细胞中的表达得以易化、且产量得以提高(Plückthun，1996)。而且，抗体片段允许在体内应用中改善肿瘤穿透力(Yokota，1992)，并且它们能够与多种用于治疗途径的效应分子共价连接。天然存在的抗体是由浆细胞分泌的，已进化至能够在胞外氧化环境中行使功能。为获得其功能性折叠结构，它们通常需要在不同结构域内形成二硫键，这对于免疫球蛋白折叠是至关重要的。与全长抗体形成对照，scFv或Fab抗体片段原则上能够在任何细胞内部的还原环境中功能性地表达，并定向到任何区室，以靶向胞内蛋白，从而引发特定的生物学效应(Biocca，1991)。的确，有些称之为内体(intrabodies)的胞内单链抗体片段，已被成功地用于调节不同的生物系统中胞内靶蛋白的功能。从而，针对病毒侵染的抗性已在植物生物技术中得到展示(Tavladoraki，1993；Benvenuto，1995)，内体与HIV蛋白的结合业已证明(Rondon，1997)，并且与癌基因产物的结合(Biocca，1993；Cochet，1998；Lener，2000)也已有描述。而且胞内抗体在表征目前通过人类基因组测序鉴定到的大量基因的功能方面有希望成为有价值的工具(Richardson，1995；Marasco，1997)。例如，它们可在功能基因组途径中用于封闭或调节新近鉴定的蛋白的活性，由此促成对其功能的了解。最后，内体具有诊断和治疗应用的潜力，例如在基因治疗环境中。尽管存在极大的前景，功能性内体的产生仍然受限于其不稳定性和不可溶性或者聚集的倾向。胞浆的还原环境防止形成保守的链内二硫桥，从而使得高百分比的抗体片段不稳定，因此在细胞内无功能(Biocca，1995；Proba，1997)。抗体片段的稳定性和可溶性因此构成了内体在体内作为潜在的蛋白功能调解剂的应用的主要障碍。迄今为止，尚不可预言使得抗体片段在胞内环境中具备功能的序列要求。因此，急需在广范围的不同细胞类型中性能良好的抗体片段，从而可作为用于多种结合特异性的构架。此类构架可用于构建用于胞内筛选的文库，或者可作为既有抗体结合部分的受体。除了独特地满足胞内应用之外，在众多的胞外和体外应用中，基于极为稳定的可变结构域构架的此类抗体片段或完整抗体相比于其它抗体也具有独特的优势。当此类构架在氧化环境中产生时，其二硫桥能够形成，进一步增强其稳定性，并使得它们高度抵抗聚集和蛋白酶降解。体内半衰期(及针对聚集和血清蛋白酶降解的抗性)是除了亲和力和特异性之外的、使抗体在治疗或诊断应用中成功的唯一最为重要的因素(Willuda，1999)。抗体片段的半衰期可通过共价连接聚合物分子如聚乙二醇(PEG)而进一步得以提高(Weir，2002)。这类稳定分子代表了抗体应用的显著进步，尤其但并不仅当不期望FC功能时。抗体片段文库极大的实践重要性激发了该领域的研究。Winter(EP0368684)提供了抗体可变区基因的初始克隆和表达。由这些基因出发，他建立了在互补决定区(CDR)以及构架区具有高度多样性的巨大抗体文库。不过，Winter未披露不同构架用于文库构建的用途。另一方面，Plückthun(EP0859841)教导试图通过将构架限于有限数目的合成共有序列而改进文库设计。包括引入大量合理设计的突变的蛋白质工程的努力以前就提示针对相应共有序列的突变是提高分离的可变免疫球蛋白结构域稳定性的合适手段(Ohage1999；Ohage1999以及US5,854,027，特此并入作为参考)。Plückthun(EP0859841)公开了基于这些共有序列进一步优化结合亲和力的方法。Plückthun专利也承认正在发生着的有关抗体的知识的增长，因此意欲包括此类文库设计的远景发现。然而，未建议合成共有构架可能的进一步改善。因而Winter、Plückthun及他人(如Soderlind，WO0175091)的教导试图以CDR的高度多样性为焦点建立巨大的抗体文库，用于选择并在氧化条件下应用所选scFv。然而，所有这些文库未进行胞内应用优化，因而不能用于还原环境或对所表达的抗体片段的稳定性和可溶性提出特殊要求的其它条件下的选择和应用。抗体片段在还原环境如原核和真核细胞的胞浆中表现良好所需的性质尚不清楚。因此胞内抗体或“内体”的应用目前受限于其在还原条件下(可影响其稳定性和可溶性能)不可预测的行为(Biocca，1995；Wrn，2000)。现有专利申请(EP1040201、EP1166121和WO0200729)及出版物(Visintin，1999)涉及以筛选技术为焦点的内体的胞内筛选，但是未公开在真核细胞特别是酵母中有功能、从而可用于本上下文的文库构建的具体抗体序列。Visintin和Tse独立地描述了所谓的胞内共有序列(ICS)的分离(Visintin，2002；Tse，2002)。该序列来自于已从酵母抗原-抗体相互作用筛选中分离出的许多序列。然而，由于现有噬菌体展示选择，胞内筛选的输入是有严重偏差的。因而，在Visintin等的例子中，只有一个输入序列属于VH3亚群。公开的共有序列ICS与由Knappik(2000)和EP0859841描述的人类VH3亚群的共有序列完全相同。ICS的62个氨基酸中的60个也与由Steipe以构建具有增强的稳定性的可变结构域为基础而提出的一般人类VH-结构域共有序列相同(美国专利号No.6,262,238，特此并入作为参考)。这些工作依次建立在早期的序列收集(即Kabat，1991)和可变结构域亚群及结构决定簇的定义(Tomlinson，1992；Williams，1996；Chothia，1989和Chothia，1987)的基础上。然而，由于所述内体选择的输入是有严重偏差的(即在Visintin等例子中，只有一个VH结构域为VH3)，由胞内筛选分离VH3序列并不是特别令人惊讶。由于其输入文库的严重偏差，Tse等和Visintin等的工作未能提供对人类可变结构域所有组成部分的全面评价，而这将会由无偏差的查询提供，并且这是鉴定存在于人类所有组成部分中的有用内体构架所必需的。我们以前曾描述过不依赖于其抗体-结合特异性而允许在酵母中选择稳定且可溶的内体的系统(AufderMaur(2001)，WO0148017)。这个途径允许有效地筛选scFv文库和分离特定构架，它们在酵母细胞的还原环境中是稳定且可溶的。目的仍然是实际分离构架序列，并且使用的模式是，第一步中预测何种序列类型将会在还原环境中最稳定，而第二步中通过分析、重组以及进一步的体内和体外实验鉴定最佳序列。发明的简要概述本发明填补了抗体产生领域缺失的环节。它提供了就稳定性和可溶性而言具有优异特性的抗体可变结构域构架序列。这些对许多相关应用，例如在诊断、治疗或研究中是关键特点。这些构架可用于移植既有的结合特异性或者用于产生具有高稳定性和可溶性的抗体文库。ScFv文库被用来分离在酵母细胞的还原环境中稳定且可溶的构架。分离构架的性能随后在人类细胞系和体外实验中表征。所述构架可直接作为既有结合特异性的受体主链，或者通过一个或多个高变环的随机化构建CDR文库用于还原或其它挑战性的环境。分离的可变结构域序列进一步通过对比进行分析，以鉴定优选的序列家族。从那些优选的可变结构域序列家族中，根据结构分析选择最佳序列，该结构分析可排除含干扰免疫球蛋白折叠的构架残基的序列。鉴定的可变结构域序列候选物随后以所有可能的变化重组，并通过分析其在酵母、哺乳动物细胞和体外的性能挑选最佳的轻链和重链可变结构域组合。这些优化的scFv及组成它们的可变结构域构架，以及其它抗体片段或由其衍生的全抗体，举例来说，可理想地作为既有结合特异性的受体主链，或通过一个或多个高变环的随机化构建CDR文库用于还原或其它挑战性的环境。适于胞内应用的抗体从定义上来讲更为稳定且可溶。从而，它们在胞内环境外界的应用中的用途也将具有优势。本发明提供了包括抗体可变结构域构架和单链Fv抗体(ScFv)片段的组合物，其可掺入到多种抗体片段或全抗体中。提供了最稳定且可溶种类的抗体可变结构域片段，因而最适于胞内应用。也提供了在胞内测定中表现出最高性能的抗体可变结构域和scFv抗体片段的具体构架序列。本发明也提供了抗体可变结构域和scFv片段中轻链和重链可变结构域的人造组合的具体构架序列，举例来说，它们可最理想地用于胞内应用，并且就稳定性和可溶性而言在体外表现出最佳性能。本发明提供具有如下通式结构的单链构架试剂NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。在本发明的另一个实施方案中，所述单链构架可融合于第二蛋白成分，以产生具有如下通式结构的融合构建体NH2-VL-接头-VH-第二蛋白-COOHNH2-第二蛋白-VL-接头-VH-COOH这些融合构建体中VH和VL区的取向可以颠倒。在本发明的另一个实施方案中，可变结构域可掺入到Fab片段中，其可融合于第二蛋白成分，以产生具有如下通式结构的融合构建体NH2-VH-CH-第二蛋白-COOH及NH2-VL-CL-COOH第二蛋白可融合于重链或轻链的N-端或C-端。在优选的实施方案中，单链或Fab构架融合构建体的第二蛋白是直接或通过转录激活为胞内测定提供读出的蛋白。本发明的另一个目的是提供抗体可变结构域的构架类型以及可变结构域和scFv序列，举例来说，它们适于从既有抗体上移植高变环，以便获得在还原或者其它挑战性环境中具有功能的抗体。本发明的另一个目的是提供抗体可变结构域的构架类型以及可变结构域和scFv序列，举例来说，通过随机化此类构架的一个或多个高变环，它们适于建立文库用在还原或者其它挑战性环境中。本发明的另一个目的是所公开的序列在鉴定保守残基和共有序列中的应用。因利用所公开的构架而得的抗体或抗体片段可用作靶确认以及人类、动物和植物疾病的治疗、预防和诊断中的试剂。所述抗体可以蛋白或编码该蛋白的DNA的形式应用，而且不限于胞内应用。附图简述图1显示了通过lacZ表达的激活而测定的典型的酵母中的“质控”筛选(例如参见实施例1)。在若干不同的筛选中鉴定到所选的阳性菌落(黑色)，并且阳性菌落的相应序列可见于表1和2。所选序列与阳性对照极为稳定的λ-移植物(深灰)进行了比较。图2显示了通过与极为稳定的λ-移植物(深灰)相比的由荧光素酶表达的激活而测定的由典型的酵母“质控”筛选分离的构架(黑色)在人类细胞系Hela中的性能。阳性对照Gal4-VP16(白色)给出了该系统最大可能的转录激活水平。荧光素酶活性已就转染效率进行了校正。图3显示了在酵母中通过lacZ表达的激活而测定的优良构架组合的体内性能。构架序列(黑色)与阳性对照(极为稳定的λ-移植物(深灰))进行了比较。构架的编号如表5所述。图4显示了在人类细胞系Hela中通过荧光素酶表达的激活而测定的优良构架组合的体内性能，并通过与极为稳定的λ-移植物(深灰)的比较进行图解说明。阳性对照Gal4-VP16(白色)给出了该系统最大可能的转录激活水平。荧光素酶活性已就转染效率进行了校正。图5显示了通过酵母菌株酿酒酵母(S.cerevisiae)JPY9胞浆中产生的可溶蛋白的量测定的优良构架组合的体内性能。图6显示了所选构架组合在大肠杆菌(E.coli)周质中的表达行为。箭头标示对应于这些scFv构架的条带位置。图7显示了在三种人类细胞系(Hela(黑色)、Saos-2(深灰)及HEK293(白色))中通过荧光素酶表达的激活而测定的所选优良构架组合的体内性能，并通过与极为稳定的λ-移植物的比较进行图解说明。阳性对照Gal4-VP16给出了该系统最大可能的转录激活水平。荧光素酶活性已就转染效率进行了校正。图8代表如在PBS-缓冲液中所示的通过温育前后存在的单体蛋白的量而定量的所选构架组合在37℃对聚集的抗性。图表A代表构架2.4和5.2，而图表B代表构架4.4、6.4和7.3。图9代表通过延长温育前后存在的可溶性全长蛋白的量而定量的所选构架组合在37℃人类血清中对蛋白酶降解聚集的抗性。图10显示了在酵母相互作用测定中通过lacZ表达的激活而测定的两个所选结合物对Fab-环境下新构架7.3的性能。Fab-链的表达始于位于ars/cen或2微米载体之上的双向半乳糖诱导型启动子。所述Fab载体的表达产生抗体轻链和VH-CH1-Gal4-AD融合蛋白。结合物定向于人类球样激酶1(hPLK1)。与该靶的结合和与无关抗原的非特异性结合以及未随机化的构架7.3的结合进行了比较。注意作为参照包括在内的相应scFv是由肌动蛋白启动子(2微米)表达的。图11显示了通过酵母菌株JPY9胞浆中产生的可溶蛋白的量测定的所述scFv构架在Fab-环境下的体内性能。Gal4-AD-scFv融合子(肌动蛋白/2微米)的表达与相应的Fab-构建体的表达并与作为Fab的母体构架7.3进行了比较，两者均来自两个不同的载体(Gal-诱导型、ars/cen和2微米)。Fab载体的表达产生抗体轻链和VH-CH1-Gal4-AD融合蛋白，它在该印迹中检测。表1显示了由多种酵母“质控”筛选挑选出的所有VH-结构域构架序列的对比。表2显示了由多种酵母“质控”筛选挑选出的所有VL-结构域构架序列的对比。表3显示了从文库中随机挑取的序列的对比。表4显示了由“质控”系统分离到的序列中VH-和VL-结构域亚类频率的统计分析。只考虑随后在定量酵母测定中发现是阳性的那些序列。所选序列与由有限数目的随机序列(表3)确定的未选文库进行了比较。表5显示了用于进一步重组和评价最佳scFv组合的序列以及它们各自的缩写(abb.)、来源和亚家族。发明详述除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有如本发明所属
技术领域：
的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于实施或检验本发明，合适的方法和材料还是描述于下文。特此将文中提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献全文并入作为参考。如有冲突，将以本说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅用于举例说明，而并非旨在限制。如本文所用，“同一性”是指两多肽、分子或两核酸之间的序列相似性。当两相比序列的某位置都被同一碱基或氨基酸单体亚单位占据时(例如，两DNA分子中每一个的某位置都被腺嘌呤占据，或者两多肽中每一个的某位置都赖氨酸占据)，则相应分子在该位置上是一致的。两序列间的“百分比同一性”是两序列共有的匹配位置数目除以比较的位置数目×100的函数，例如，如果两序列10个位置中有6个匹配，则这两个序列具有60％的同一性。作为离子，DNA序列CTGACT和CAGGTT享有50％的同源性(总共6个位置上有3个匹配)。一般而言，当两序列比对可得出最大同源性时就进行比较。此类对比可利用例如Needleman等，J.MolBiol.48443-453(1970)的方法提供，通过计算机程序例如Alignprogram(DNAstar，Inc.)方便地执行。“相似”序列是那些在比对时享有相同和相似氨基酸残基的序列，其中相似残基是比对的参照序列中相应氨基酸残基的保守取代或者“许可的点突变”。就这点而言，参照序列残基的“保守取代”是被与对应参照残基物理上或功能上类似，如具有相似大小、形状、电荷、化学特性，包括形成共价键或氢键的能力等的残基取代。因而，“保守取代修饰”的序列是与参照序列或野生型序列的差异在于存在一个或多个保守取代或许可的点突变的序列。两序列间的“阳性百分比”是含两序列共有的匹配残基或保守取代的位置数目除以比较的位置数目×100的函数。例如，如果两序列10个位置中有6个匹配，且10个位置中有2个含保守取代，则这两个序列具有80％的阳性同源。“VH结构域”是指免疫球蛋白分子重链的可变部分。“VL结构域”是指免疫球蛋白分子轻链的可变部分。VH或VL“亚型”是指通过如Knappik(2000)中所定义的相应共有序列所定义的亚型。术语“亚家族”或“亚类”作为“亚型”的同义词使用。如本文所用的术语“亚型”是指与代表其亚型的相应共有序列享有高度同一性和相似性的序列。某一可变结构域序列是否属于某“亚型”是通过将该序列与相应结构域的所有已知人类生殖系区段、或者定义的共有序列比对，并随后鉴定最大同源性确定的。确定同源性和通过利用查询矩阵例如BLOSUM(Henikoff1992)对序列分类的方法是本领域技术人员众所周知的。如本文所用的“氨基酸共有序列”是指氨基酸序列，它可利用至少两个或优选更多比对的氨基酸序列矩阵产生，并且考虑到比对中的空缺，有可能确定各位置上最频繁的氨基酸残基。共有序列是包括了各位置上最频繁表示的氨基酸的序列。如果在单个位置上等同地表示两个或多个氨基酸，则共有序列包括两个或所有那些氨基酸。蛋白的氨基酸序列可在多种水平分析。例如，保守或变异可表现在单残基水平、多残基水平、具有空缺的多残基水平等。残基可表现出相同残基的保守或者可以在分类的水平上保守。氨基酸分类的实例包括极性但不带电荷的R基团(丝氨酸、苏氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺)；带正电荷的R基团(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；带负电荷的R基团(谷氨酸和天门冬氨酸)；疏水R基团(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其它分类是本领域技术人员公知的，并且可利用结构决定簇或其它数据定义，以评估可取代性。就该意义而言，可取代氨基酸可以指能够被取代并维持该位置上的功能保守性的任何氨基酸。如本文所用的“多核苷酸共有序列”是指核苷酸序列，它可利用至少两个或优选更多比对的核酸序列矩阵产生，并且考虑到对比中的空缺，有可能确定各位置上最频繁的核苷酸。共有序列是包括了各位置上最频繁表示的核苷酸的序列。如果在单个位置上等同地表示两个或多个核苷酸，则共有序列包括两个或所有那些核苷酸。如本文所用的“结构亚-元件”是指蛋白或多肽内与该分子限定的结构或功能部分对应的一段氨基酸残基。这些可以是环(即抗体的CDR环)或者蛋白或多肽内任何其它二级或功能结构(即结构域、α-螺旋、β-片层、抗体构架区等)。结构亚元件可利用相似或同源多肽的已知结构或者通过利用上文提及的比对氨基酸序列的矩阵鉴定。这里各位置上的变异是确定属于某一结构亚元件(如抗体高变区)的一段氨基酸残基的基础。如本文所用的“亚序列”是指编码至少一个结构亚元件的基因模块。它未必一定与结构亚元件相同。如本文所用的“抗体CDR”是指抗体的互补决定区，其由如Kabat等(1991)所定义的抗原结合环组成。例如，抗体Fv片段的两可变结构域中的每一个都含3个CDR。如本文所用的“抗体”是“免疫球蛋白”的同义词。根据本发明的抗体可以是完整免疫球蛋白或其片段，包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单可变结构域，Fv(Skerra，1988)、scFv(Bird，1988；Huston，1988)、Fab、(Fab′)2或本领域技术人员众所周知的其它片段。如本文所用的“抗体构架”是指可变结构域VL或VH的一部分，它起着该可变结构域抗原结合环的支架的作用(Kabat等，1991)。合理设计的scFv片段已证明了scFv片段的热动力学稳定性与其体内性能之间清楚的关联(Wrn，2000；AufderMaur，2001)。利用最近研发的命名为“质控”的系统(AufderMaur，2001)，已分离到适于胞内应用的特定抗体可变结构域构架序列(表1和2)、描述了特征(图1和2)并进一步改善(图3至9及表3)。如同我们以前的实验中所观察到的那样，在胞内测定中所选的性能良好的构架表现出高的体外稳定性，如通过其37℃抗聚集和蛋白酶降解所证明的那样(图8和9)。而且，形成了允许在更广基础上根据其构架亚家族(表4)选择用于胞内应用的构架的模式。文中公开了可用于胞内应用的特定抗体可变结构域，还有通用模式。一方面，这允许利用这些序列作为移植实验的构架供体以获得保留了环供体的结合特异性的功能性内体。另外，可利用公开的序列作为构架构建抗体文库。此类文库适用于还原条件下的胞内选择系统，例如原核和真核细胞系统。另外，所公开的序列可用于鉴定例如保守序列或残基或基序。结构亚元件的移植，例如抗体结合环的移植(如Jung，1997)，还有抗体或其片段文库的制备(如Vaughan，1996；Knappik，2000)已有详细描述，并且是本领域技术人员众所周知的。由于胞内应用将抗体片段暴露于极为不利的条件下(即升高的温度、还原环境)，而本发明公开的序列获得了使之抵抗最不利条件的特点。因此，当与“普通”序列相比时，这里公开的序列具有出色的稳定性和可溶性，如通过其对聚集和蛋白酶降解的抗性所证明的那样(图8和9)。这些特点，连同其优良的表达产率，使得所公开的抗体构架序列独特地不仅适于胞内应用，而且尤其适于所有其中极需关注长半衰期、耐用性和制备的容易性的治疗和诊断应用。本发明使得可能设计包括至少抗体的可变部分、可用于还原或其它挑战性环境下的应用的多肽序列。在第一实施方案中，本发明提供了可用于胞内应用的抗体构架序列集合(表1和2)。在第一步中，利用酵母质控系统不依赖于结合亲和力地筛选多种序列的文库。分离的序列可在酵母和哺乳动物细胞中评价其胞内性能(图1和2)。在本发明的一个实施方案中，对分离序列的集合通过比对进行分析，以鉴定抗体可变结构域亚类和适用于胞内应用的共有序列。在本发明另一优选的实施方案中，对上述抗体构架序列的集合进一步通过相互比对和亚家族分类进行分析。属于一个亚型的所有构架就其在酵母和在哺乳动物细胞中的胞内性能进行比较(图1和2，作为实例)，并就其氨基酸序列中相对于各亚型共有序列所发生的阴性、中性或阳性交换进行比较。本领域技术人员能够根据免疫球蛋白结构域中特定交换残基的结构环境区别阳性、中性和阴性变化。随后，选择表现出最佳胞内性能的可变抗体结构域构架序列，并且其与相应亚型共有序列相比没有阴性交换。优选地，挑选进一步含有据认为是阳性氨基酸交换的序列。在另一优选的实施方案中，所选的重链和轻链抗体可变结构域随后以所有可能的组合重组为scFv片段，以鉴定具有最高稳定性和可溶性的组合。为了这个目的，对新的重组scFv片段进行有关在酵母(图3)和在哺乳动物细胞系(图4和7)的胞内相互作用测定中还原条件下的性能以及有关在酵母中的可溶性胞内表达(图5)的评价。对有希望的组合进一步通过分析大肠杆菌中的周质表达(图6)、升高的温度下对聚集的抗性(图8)以及在人类血清中于37℃延长温育后对聚集和蛋白酶降解的抗性(图9)进行有关氧化条件下的行为的评价。这些数据被用来鉴定最适于胞内或氧化条件下的任何特定应用的scFv构架。本文公开的所选且优化了的构架序列不仅在胞内应用中，而且在所有可得益于scFv提高的稳定性和/或可溶性的应用中都具有显著的优势。实例有在诊断应用中需要以高浓度长期贮存，以及37℃血清中延长的功能半衰期(例如象治疗应用中所需的那样)。根据本发明的一个方面，提供了包括具有如下通式结构的单链构架的内体构架NH2-VL-接头-VH-COOH；或NH2-VH-接头-VL-COOH其中VH构架为1a、1b或3亚型。在另一个实施方案中，上述单链构架中VH和VL区的取向颠倒。根据本发明的一个方面，提供了包括具有如下通式结构的单链构架的内体构架NH2-VL-接头-VH-COOH；或NH2-VH-接头-VL-COOH其中VH构架为1a、1b或3亚型，且VL构架为λ1、λ3或κ1亚型。在另一个实施方案中，本发明提供了融合于第二蛋白成分的单链构架，以产生具有如下通式结构的融合构建体NH2-VL-接头-VH-第二蛋白-COOH；或NH2-第二蛋白-VL-接头-VH-COOH其中VH构架为1a、1b或3亚型，且VL构架为λ1、λ3或κ1亚型。在另一个实施方案中，这些融合构建体中VH和VL区的取向可以颠倒。在另一个实施方案中，可变结构域可掺入到Fab片段中，所述片段可另外融合于第二蛋白成分，以产生具有如下通式结构的融合构建体NH2-VH-CH-第二蛋白-COOH和NH2-VL-CL-COOH所述第二蛋白可融合于重链或轻链的N-端或C-端。如本文所公开的，胞内应用中存在着对亚型为3及1a和1b的VH构架极强的偏好。至于轻链可变结构域(VL)，κ1构架在数量上具有清楚的偏好，但λ1和3也被富集。因此，这些构架亚型，即与κ1、λ3VL结构域相组合的VH1a、1b和3最适合用于胞内应用以及需要scFv折叠性质的其它应用。因此，为了降低还原环境中无功能分子的数量，用于胞内筛选系统的文库应当优选由这些构架亚型的混合物构建。在优选的实施方案中，本发明抗体片段的VH结构域为1a、1b或3亚群。在优选的实施方案中，本发明抗体片段的VL结构域为κ1、λ1或3亚群。在优选的实施方案中，用作为构架的抗体片段选自如表5所示的1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4和6.4。在本发明的一个实施方案中，至少两个并且优选多个构架被鉴定然后予以分析。当蛋白序列彼此比对时，可建立蛋白序列的数据库。则该比对可用于定义例如在序列和结构排列上(如果该信息可用的话)都表现出高度相似性的残基、亚元件、亚序列或构架序列亚群。亚元件的长度优选，但并非仅在1个氨基酸(例如酶活性位点中的一个残基或结构决定残基)和150个氨基酸(例如完整蛋白结构域)的范围之内。最优选的是，长度范围在3和25个氨基酸之间，例如最常见于抗体CDR环中的。在另一个实施方案中，合成了由分析推测的共有核酸序列。这可通过本领域熟练从业人员众所周知的多种方法中的任何一种，例如通过全基因合成或通过以PCR为基础的途径实现。在另一个实施方案中，所述核酸序列被克隆到载体中。载体可以是测序载体、表达载体或展示(如噬菌体展示)载体，所有这些都是本领域技术人员众所周知的。载体可包含一个核酸序列或在不同或同一操纵子中的两个或多个核酸序列。在最后一种情况下，它们可单独或作为连续的序列克隆。在一个实施方案中，多肽具有特定物种的模式特征。例如，这可通过由仅仅一个种类的同源蛋白的集合，优选由人类蛋白集合推断共有序列而实现。本发明另一实施方案涉及通过提供编码如上所述的多肽和附加成分的DNA序列而得的融合蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了核酸序列、含所述核酸序列的载体、含所述载体的宿主细胞以及根据本文所述方法可获得的多肽。在另一实施方案中，本发明提供了合成或以其它方式在本发明的核酸序列末端安置限制性位点，以使其能够克隆到合适的载体中。在另一优选的实施方案中，本发明提供了与编码所述多肽的核酸序列相容的载体系统。所述载体包括限制性位点，这将是，举例来说，在该载体系统中独一无二的，并且就掺入到编码所述多肽的核酸序列中的限制性位点而言基本上是唯一的，除了例如该核酸序列克隆到载体中所必需的限制性位点之外。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，包括一个或多个核酸序列、重组载体、多肽和根据上述方法的载体，以及例如用于产生所述多肽的合适的宿主细胞。所有上述本发明的实施方案可利用本领域技术人员公知的分子生物学标准技术完成。在另一个实施方案中，核酸序列是能够编码本发明的多肽的任何序列。在另一个实施方案中，本发明的核酸用于基因治疗。在另一个实施方案中，单链构架是(表5)中1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4、6.4任一序列的变体，其中如本文所用的“变体”是指表现出90％或更大的同一性、同时又保持增强的稳定性的序列。在另一个实施方案中，单链构架是(表5)中1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4、6.4任一序列的衍生物，其中如本文所用的“衍生物”是指仅保持了对于该分子功能和稳定性至关重要的那些氨基酸的序列。如实施例3中所述的构架中孤立的中性或阳性交换不被认为是与本发明的抗体构架相关的变化。在本发明优选的实施方案中，所述单链构架融合于第二蛋白，其中该蛋白为胞内测定提供了读出。所述读出可以是直接的，例如以与可检测的蛋白如可通过荧光观察的GFP(绿色荧光蛋白)、增强的蓝色荧光蛋白、增强的黄色荧光蛋白、增强的青色荧光蛋白或者具有不同检测方法的其它融合伴侣融合的形式。或者，所述读出可通过报告基因的转录激活实现，其中scFv-融合蛋白的融合伴侣是转录激活剂，例如Gal4激活结构域，或者DNA-结合蛋白，例如LexA或Gal4DNA-结合结构域，其激活酶例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰基转移酶等报告基因的转录，这转录提供了读出。提供读出的融合蛋白是本领域技术人员众所周知的。本发明的另一个实施方案是包括本文所述的构架的抗体。本发明的另一个实施方案是本发明抗体的应用。本发明另一优选的实施方案是抗体可变结构域的所述构架类别以及可变结构域和scFv序列用于从既有抗体上移植高变环的用途，以获得在还原或其它挑战性环境中有功能的抗体。本发明另一个进一步优选的实施方案是抗体可变结构域的所述构架类别以及可变结构域和scFv序列的用途，例如通过此类构架的一个或多个高变环的随机化，用于建立文库，应用于还原或或其它挑战性环境中。对本领域普通技术人员将会显而易见的是，文中所述的本发明的分子可用于诊断和治疗应用、靶确认以及基因治疗。本发明可通过如下实施例举例说明，其并不旨在以任何方式限制本发明的范围。参考文献Agatep，R.，Kirkpatrick，D.1，.，Parchaliuk，R.A.，Woods和Gietz，R.D.(1998).″TransformationofSaccharomycescerevisiaebylithiumacetate/single-strandedcarrierDNA/polyethyleneglycolprotocol.″Technical.TipsOnline(http//tto.trends.corn).AufderMaur，A.，Escher，D.和Barberis，A.(2001).″Antigen-independentselectionofstableintracellularsingle-chainantibodies.″FEBSLett508407-412.Benvenuto，E.和Tavladoraki，P.(1995).″Immunotherapyofplantviraldiseases.″TrendsMicrobiol3(7)272-5.Biocca，S.和Cattaneo，A.(1995).″Intracellularimmunizationantibodytargetingtosubcellularcompartments.″TrendsCellBiol5248-252.Biocca，S.，DiLuzio，A.，Werge，T.和Cattaneo，A.(1991).″Intracellularimmunizationexpressionofantibodydomainsinthecytoplasmandinthenucleusofmairurtaliancells.″Cytotechnology5Suppl149-50.Biocca，S.，Pierandrei-Amaldi，P.和Catta-neo，A.(1993).″Intracellularexpressionofanti-p21rassinglechainFvfragmentsinhibitsmeioticmaturationofxenopusoocytes.″BiochernBiophysResCoinmun197(2)422-7.Biocca，S.，Ruberti，F.，Tafani，M.，Pierandrei-Amaldi，P.和Cattaneo，A.(1995).″RedoxstateofsinglechainFvfragmentstargetedtotheendoplasmicreticulum，cytosolandmitochond.ria.″Rio/Technology13(10)1110-5.Bird，R.E.，liardinan，K.D.，Jacobson，J.W.，Johnson，S.，Kaufman，B.M.，Lee，S.M.，Lee，T.，Pope，S.H.，Riordan，G.S.和Whitlow，I-E.(1988).″Single-35chainantigen-bindingproteins.″Science242(4877)423-6Chothia，C.和Lesk，A.N.(1987).″Canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmuno-globulins.″J..Tylol.Biol.196(4)901-17.Chothia，C.，Lesk，A.N.，Tramontano，A.，Le5vitt，N.，Smith-Gill，S.J.，Air，G.，Sheriff，S.，Pad-lan，E.A.，Davies，D.，Tulip，W.R.，Colman，W.R.，Spinelli，S.，Alzari，P.N.和Poljak，R.J.(1989).″Conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions.″J.Mol.Biol.342877-883.Johnson，G.，Kabat，E.A.和Wu，T.T.(1996).kabatdatabaseofsequencesofproteinsofimmunologicalinterest.WEIR′SHandbookofexperimantalInurtu-nologyIImmunochemistryandMolecularImmunology.Cambridge，NA，BlackwellScienceInv6.1-6.21.Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.N.，Gottesman，K.S.和Foeller，C.(1991).Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91-3242.Wasinghton，DC，USDepartmentofhealthandhumanservi-ces.Knappik，A.，Ge，L.，Honegger，A.，Pack，P.，Fischer，N.，Wellnhofer，G.，Hoess，A.，Wolle，J.，Pluckthun，A.和Virnekas，B.(2000).″Fullysynthetichumancombinatorialantibodylibraries(HuCAL)basedonmodularconsensusframeworksandCDRsrandomizedwithtrinucleotides.″JMolBiol296(1)57-86.Cochet，D.，Kenigsberg，N.，Delumeau，I.，Virone-Dddos，A.，Nulton，N.C.，Fridinan，W.H.，Schweighoffer，F.，Teillaud，J.L.和Tocque，B.(1998).″Intracellularexpressionofanantibodyfragment-neutralizingp21raspromotestumorregression.″CancerRes58(6)1170-6.Corpet，F.(1988).″Nultalin.Multiplese-quencealignmentwithhierarchicalclustering.″NucleicAcidsRes16(22)10881-10890.Cox，J.P.，Tomlinson，I.N.和Winter，G.(1994).″Adirectoryofhumangerm-lineVkappasegmentsrevealsastrongbiasintheirusage.″.EurJImmunol24827-836.deHaard，ii.J.，vanNeer，N.，Reurs，A.，Hufton，S.E.，Roovers，R.C.，Henderik，P.，deBruine，A.P.，Arends，J.-W.和Hoogenboom，ii.R.(1999).″alargenon-immunizedhumanFabfragmentphagelibrarythatpermitsrapidisolationandkineticanalysisofhighaffinityantibodies.″J.Biol.Chexn.27418218-18230.Escher，D.，Bodiner-Glavas，M.，Barberis，A.和Schaffner，W.(2000).″Conservationofglutamine-richtransactivationfunctionbetweenyeastandhumans.″MolCellBiol20(8)2774-82.Escher，D.和Schaffner，W.(1996).″Improved″activatortrap″methodfortheisolationoftranscriptionalactivationdomainsfromrandomDNAfragments.″Biotechniques21(5)848-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al4-AD构建体的N-端。人类scFv文库，是由别处描述的人脾细胞cDNA扩增的(Welschhof，1995；Krebber，1997；deHaard，1999)，通过SfiI位点以正确读码框克隆到该融合构建体的N-端，并且取向为VL-接头-VH，其中接头具有序列(GGGS)4。从而表达产生具有通式结构scFv-Gal11p-SV40NLS-Gal4AD的融合蛋白。在酵母菌株酿酒酵母YDE172(MATαura3-52leu2Δ1trp1d63his3Δ200lys2Δ385gal4Δ11)(AufderMaur，2001)中实施筛选，所述菌株通过将取向相异的LacZ和HIS3报告基因在来自Gal1-GAL10调控序列的天然UASG调节之下整合到his3Δ200基因座而衍生自菌株JPY9(Escher，2000)。该报告系统的转录激活是继其Gal11P部分与Gal4-DNA-结合结构域(DBD，氨基酸1-100)特异性相互作用之后，由scFv-融合构建体的Gal4-AD部分介导的。所述Gal4-DBD由第二质粒pMP83的表达提供。它含用于酿酒酵母转化选择的酵母LEU2基因以及ARSCEN复制起点。而且，它具有用于强表达的组成型肌动蛋白启动子以及GAL11转录终止序列。对于细菌系统的操作，它也具有细菌复制起点和amp抗性基因。对于筛选，酵母菌株酿酒酵母YDE172由作为位于载体pESBA-Act2之上的融合构建体的scFv-文库共转化，而pMP83-载体提供Gal4-DBD。使用标准醋酸锂转化方案(Agatep，1998)。在转化之后，将细胞涂布于含80mM3-氨基三唑的漏失(dropout)平板(-Trp/-Leu/-His)。在于30℃温育3天后挑取菌落，并在含80mM3-氨基三唑的漏失平板(-Trp/-Leu/-His)上重新划线。重新长出的菌落通过在含底物X-Gal板的滤纸测定中的蓝色形成进行LacZ-表达测试。取阳性菌落用于进一步的分析，包括从酵母中分离scFv-携带质粒、转化大肠杆菌DH5α、从大肠杆菌单菌落中分离质粒、并重新转化到新鲜制备的酵母菌株YDE172中用于下文所述的测定。所有方法根据本领域普通技术人员众所周知的标准操作实施。另外，利用了改良的筛选操作，其中scFv直接融合于DNA-结合结构域(LexA氨基酸1-202)和激活结构域(Gal4，氨基酸768-881)，以产生具有如下结构的融合构建体scFv-LexA-NLS-Gal4AD。用于表达scFv-融合构建体以在酵母中进行筛选的质粒衍生自pESBA-Act2。它含有用于酿酒酵母(S.cerevisiae)转化选择的酵母TRP1基因，以及2微米复制起点以确保高拷贝数。而且它具有组成型肌动蛋白启动子(用于强表达)和GAL11转录终止序列，两者由多克隆位点隔开。对于细菌系统的操作，它也具有细菌复制起点和amp抗性基因。筛选在酵母菌株酿酒酵母ImmunaLHB(MATαura3-52leu2Δ1trp1d63his3Δ200lys2Δ385)中实施，该菌株通过在具有六LexA-结合位点的双向启动子(整合型报告质粒pDE200，Escher2000)调控之下将取向相异的LacZ和HIS3报告基因整合到his3Δ200基因座、并将处于具有八LexA-结合位点的启动子(来自EGY48)调控之下的LEU2报告基因整合到leu2Δ1基因座而衍生自菌株JPY5。该报告系统的转录激活是由scFv-融合构建体的Gal4-AD部分介导的。筛选基本上如上文所述利用漏失培养基(-Trp/-Leu/-His)和高达40mM的3-氨基三唑浓度实施。实施例2体内性能评价a)酵母中对于酵母中所选构架性能的定量分析(图1和3)，酿酒酵母菌株ImmunaLHB用作为pESBA-ACt2载体之上的LexA-Gal4-AD-融合构建体的分离的scFvs按照标准醋酸锂转化方案(Agatep，1998)转化。转化后，将细胞涂布于漏失平板(-Trp)上。平行接种来自数个菌落划线的2ml漏失培养基(-Trp)的过夜培养物，并于30℃培养。将培养物在1ml漏失培养基(-Trp)中稀释至600nm(OD600)0.7的光密度。它们接着于30℃培养2小时。对于测定，取100μl细胞培养物，与900μl缓冲液、45μl氯仿和30μl0.1％SDS混合，震荡并于室温下温育5分钟。显色通过添加0.2mlONPG(4mg/ml)起始，并由0.5mlNa2CO3(1M)终止。活性通过考虑所测培养物的OD600以及显色的温育时间和所用的培养物体积计算。对至少等同于或优于阳性对照(以前描述的极为稳定的λ-移植物(Wrn，2000；AufderMaur，2001))的菌落进行测序，以鉴定构架亚型(构架亚型根据Tomlinson，(1992)，Cox，(1994)和Williams，(1996)定义)。测序揭示了对某些构架亚型惊人的偏好。对于重链可变结构域(VH)，构架亚型2和6从未见过，并且亚型4在阳性菌落中显著减少。分离序列的性能经酵母胞内测定校正后，胞内应用不仅对亚型3，而且还有1a和1b的VH构架都具有极其强烈的偏好。关于轻链可变结构域(VL)，对κ1、λ1和λ3亚型的构架具有清楚的偏好(表4)。这些构架亚型，即与κ1、λ1和λ3VL结构域组合的VH1a、1b和3因此最佳地满足胞内用途以及就scFv折叠特性而言具有严格要求的其它应用。用于胞内筛选系统的文库应当，例如，优选仅由这些构架亚型的混合物构件，以减少在还原环境下无功能分子的数量。b)哺乳动物细胞中利用Hela细胞系进行人类细胞中所选构架性能的定量分析(图2、4和7)。荧光素酶报告基因由共转染的pGL3(Promega)报告质粒提供，其含有处于天然Gal4UAS调控之下的荧光素酶。用于瞬时转染的哺乳动物表达载体含有Gal4(1-147)，融合于VP16-AD的C-端，处于CMV启动子的调控之下。分离的scFv以正确的读码框克隆到Gal4(1-147)-VP16-融合子的C-端，以便经表达产生Gal4(1-147)-VP16-scFv-融合蛋白。细胞在DMEM中培养，补充有2.5％FCS和2mM1-谷氨酰胺。瞬时转染根据Polyfect-方案(Qiagen)实施，在60mm组织培养板中利用0.01-0.1μg含scFv-构建体的载体，0.5μgCMV启动子驱动的Gal4(1-147)-VP16-scFv表达质粒和0.5μgLacZ表达载体用作为转染效率的参照。细胞在转染后24-48小时收获，重悬于1000μl缓冲液中，并通过三次冻融循环裂解。细胞裂解物离心，对上清利用荧光素酶测定液(Promega)进行荧光素酶活性测定，并根据标准方案测定LacZ活性。所得的荧光素酶活性由LacZ活性校正，以说明转染效率的变化。实施例3序列比较的多重比对和分析为阐明适用于胞内应用的构架序列的通用模式，分离所有阳性菌落(即在质控系统的选择条件下生长的那些菌落)，并对编码scFv的部分进行测序。随后，scFv以其轻链和重链组分进行划分，以允许根据Honegger(2001)结构调整的免疫球蛋白结构域编号策略对各自的结构域进行比对(表1和2)。为允许对所得的数据加以阐述，建立了代表所选文库的比对(表3)。为获得未选的序列，文库在不表达scFv基因的大肠杆菌细胞中转化，并随机挑取菌落用于质粒分离和scFv-序列的测序。文库如期涵盖了人类抗体的所有组成部分，因而就特定亚型而言没有偏差，与由通常见于人类的表达模式所预期的不同。VH和VL序列根据其亚群分组。亚群特异性共有序列的改变被突出显示。本领域技术人员能够根据特定交换残基的结构环境来辨别阳性、中性和阴性改变(如Honegger，2001)。属于特定氨基酸组别的残基交换为同组的残基一般确认为中性交换。属于指向蛋白疏水核心的疏水氨基酸组的残基交换为极性但不带电荷或者带正或负电荷的氨基酸组的氨基酸将会是非常不利的，因为不饱和的氢供体/受体位点干扰疏水核心的密堆积。此种改变因此被认为是阴性的。属于位于免疫球蛋白结构域表面的极性但不带电荷组的残基交换为带正或负电荷组的氨基酸是非常有利的，因为蛋白的可溶性得以提高。此种改变因此确认是阳性的，而由极性交换为疏水残基是非常不利的，因为蛋白的可溶性下降，因此确认是阴性的。在具有保守正Φ-角的位置处，任何氨基酸交换为甘氨酸确认是阳性的，而甘氨酸交换为任何氨基酸确认是阴性的，因为甘氨酸是唯一能够形成正Φ-角的氨基酸。因带正或负电荷的残基组的氨基酸交换为不带电荷的氨基酸所致的位置45-53、45-100、77-100以及108-137之间保守盐桥的丧失导致热动力学稳定性下降，因此认为是阴性的。最后，我们挑选了在质控期间优选的7个VL结构域和4个VH结构域(即表现出共有序列的最少阴性和最多阳性交换且涵盖亚群)，并且每一个在酵母中都表现出高的体内性能。序列总结于表5，并且包括两个Vκ1(kI27(1.x)和kIII25(2.x))、两个Vκ3(kIV103(3.x)和kIV135(5.x))、一个Vλ1(kIV107(4.x))、两个Vλ3(a33(7.x)和a43(6.x))、一个VH1b(a33(x.3))和三个VH3(afw10(x.2)、a43(x.4)和a44(x.1))。这些VL和VH结构域被改组，给出22个scFv形式的新组合(1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4、6.4)。实施例4改组的结构域的体内性能评价a)在酵母和哺乳动物细胞胞内测定中的性能如实施例2所述的那样对这22个组合测试了其在酵母和哺乳动物细胞中的体内性能(图3和4)。b)可溶性蛋白在酵母中还原条件下的表达为比较可溶性蛋白在还原条件下表达后的产量，所选的构架作为与Gal4AD的融合蛋白在酵母酿酒酵母的胞浆中表达。位于pESBA-Act2载体上的融合构建体具有通式结构Gal4AD-scFv。它们被如上所述转化到酵母酿酒酵母菌株JPY9中，并涂布于-Trp漏失平板中。接种来自含数个菌落的划线的5ml漏失培养基(-Trp)过夜培养物，并于30℃培养。将培养物在50ml漏失培养基(-Trp)中稀释至600nm(OD600)0.5的光密度。它们于30℃培养5小时。对于天然细胞提取物，离心收集2.5ml标准化至OD600为3的细胞培养物，液氮中冷冻，随后重悬于含蛋白酶抑制剂(PMSF)的75μlY-PER(Pierce)中。重悬的细胞沉淀震荡片刻，并于20℃温育(轻摇)20分钟。不溶和聚集的物质在eppendorf离心机中于4℃以最大速度离心10分钟沉淀。上清与上样染料混合，加热到100℃5分钟，然后在12％SDS-PAGE上分离。可溶性Gal4AD-scFv融合构建体由蛋白质印迹通过用抗-Gal4AD单克隆鼠抗体(SantaCruzBiotechnology)作为一抗、而抗-鼠-过氧化物酶偶联物(Sigma)作为二抗、并利用化学发光底物(Pierce)检测Gal4-部分而显现(图5)。SDS-PAGE和蛋白质印迹操作是本领域普通技术人员众所周知的。c)在大肠杆菌周质中的表达行为为评价在大肠杆菌中的周质表达(图6)，将分离的scFv-构架克隆到带有cam抗性基因(catR)和lacI阻遏基因(Krebber，1997)的细菌载体上，其中N-端具有pelB-前导序列，而C-端具有his-标签，处于lac启动子/操纵子调控之下。感受态大肠杆菌JM83用这些质粒转化。在50ml含35mg/l氯霉素的dYT-培养基摇瓶中以1∶40接种过夜培养物，并于30℃温育。细胞在OD600为0.8时用1mMIPTG诱导，并在诱导3小时之后通过离心收集。沉淀重悬于50mMTris，pH7.5，500mMNaCl中，并标准化至OD600为10。对每个scFv片段样品或直接(总提取物)分析或在超声破碎再离心后(可溶性级分)通过SDS-PAGE进行分析。可溶蛋白的含量由考马斯亮兰染色的凝胶估计。实施例5具有优良特性的5个组合用于胞外用途的详细评价选取五个组合作为实例，它们在酵母和哺乳动物胞内测定中表现出良好性能，在酵母和大肠杆菌表达期间产生可溶性蛋白，并且涵盖了在质控期间偏好选择的亚群(2.4、4.4、5.2、6.4和7.3，详见表5)。我们更为详细地分析这些组合，以进一步评价其在还原以及氧化条件下的用途。a)在不同哺乳动物细胞的胞内测定中的性能五个组合在人类细胞中性能的定量分析利用Hela细胞并且额外利用人骨肉瘤细胞系Saos-2和人胚肾细胞系HEK293如实施例2所进行的那样实施(图7)。b)体外表达和纯化的性能为评价体外性能，将五个优良组合在大肠杆菌周质中表达(图6)。在0.1l含35mg/l氯霉素的dYT-培养基摇瓶中以1∶40接种过夜培养物，并于30℃温育。细胞在OD550为1.5时用1mMIPTG诱导，并在诱导2小时之后通过离心收集。为纯化scFv，将细胞沉淀重悬并通过超声裂解。在可溶蛋白的含量由考马斯亮兰染色的凝胶估计。在SS34中以20krpm、4℃离心30分钟之后，将上清以pH7.5施加到Ni-MC-亲合柱(Hi-TrapTMChelatingHP，1ml，AmershamPharmacia)上，并利用来自AmershaxnPharmacia的ktaBasic系统由200mM咪唑洗脱。scFv片段的纯度大于98％，如通过SDS-PAGE所测定的(数据未显示)。纯化蛋白的浓度利用计算的280nm处的消光系数确定。可溶性纯化蛋白的产量以OD600为10的1升培养物体积标准化，并且从8到超过55mg不等。聚集抗性聚集抗性已证明与体外的热动力学稳定性(Wrn，1999)以及小鼠异种移植肿瘤模型的肿瘤定位效率(Willuda，1999)有关。为了测试稳定性、聚集抗性以及解折叠可逆性，处于50mMTris，pH7.5，100mMNaCl中浓度为6μM的200μl纯化蛋白样品或于4℃保存4天或37℃4天或4℃3天，紧接着在100℃温育15或60分钟，缓慢冷却至室温，并于4℃过夜温育。每个样品的寡聚状态随后在由50mMTris，pH7.5，100mMNaCl平衡的凝胶过滤柱上分析，以估计聚集体相对于单体物质的含量(图8)。将蛋白以100μl的体积在ktaBasic系统(AmershainPharmacia)中以1ml/分的流速注入Superdex-75柱(AmershamPharmacia)中。蛋白酶降解抗性为确定分离的构架就蛋白酶降解而言的稳定性(对于治疗应用很重要的一个参数)，我们在人类血清中于37℃温育纯化的构架(图9)。将浓度为50μM的纯化的his-标记的scFv-蛋白(见上文)在人类血清中稀释10倍，至90％血清中的终浓度5μM。样品然后在37℃温育3天或1天，或者直接取来上样。在上样前，不溶和聚集的物质在eppendorf离心机中于4℃以最大速度离心10分钟沉淀。上清由上样染料稀释6倍，以降低上样到凝胶上的血清的量，100℃加热5分钟，然后在12％SDS-PAGE上分离。可溶性his-标记的scFv片段由蛋白质印迹通过用抗-his单克隆鼠抗体(Qiagen)作为一抗、而抗-鼠-过氧化物酶偶联物(Sigma)作为二抗、并利用化学发光底物(Pierce)检测his-标签观察。SDS-PAGE和蛋白质印迹操作是本领域普通技术人员众所周知的。实施例6通过在酵母交互作用筛选系统中在构架7.3中筛选随机化的CDR-文库来选择抗原结合剂用交互作用系统筛选抗原结合剂基本上如以前所详述的那样进行(AufderMaur，2002)。用于表达scFv-融合构建体以在酵母中进行筛选的质粒衍生自pESBA-Act2。它含有酵母TRP1营养标记和2微米复制起点。而且它具有用于强表达的组成型肌动蛋白启动子和GAL11转录终止序列，两者由多克隆位点隔开。对于细菌系统的操作，它也具有细菌复制起点和amp抗性基因。Gal4激活结构域(AD氨基酸768-881)最初是利用pGAD424(Clontech)作为模板，用包括位于Gal4-ADN-端的SV40T-抗原核定位信号在内的引物通过PCR扩增的。scFv文库利用引物随机化VH的CDR3内的7个氨基酸通过PCR扩增scFv-构架7.3而获得。所得的PCR产物以正确读码框克隆进构架7.3中，以VL-接头-VH的取向存在于载体中，作为Gal4-AD的C-端融合物。从而表达产生具有通式结构Gal4-AD-scFv的融合蛋白。在酵母菌株酿酒酵母ImmunaLHB(MATαura3-52leu2Δ1trp1d63his3Δ200lys2Δ385)中实施筛选。它通过将处于具有六个LexA-结合位点的双向启动子调控之下的取向相异的LacZ和HIS3报告基因(整合型报告质粒pDE200，Escher2000)整合到his3Δ200基因座、并将处于具有八个LexA-结合位点的启动子(来自EGY48)调控之下的LEU2报告基因整合到leu2Δ1基因座而衍生自菌株JPY5。该报告系统的转录激活是继其scFv部分与诱饵-融合蛋白的抗原部分特异性相互作用之后，由scFv-融合构建体的Gal4-AD部分介导的。诱饵-融合蛋白由融合于DNA-结合LexA蛋白C-端的人类球样激酶1的激酶结构域(hPlk1-KD)组成。激酶结构域(氨基酸2-332)由hPlk1cDNA利用上游引物5′-tgctctagaagtgctgcagtgactgcag-3′(Seq.Id.No.12)和下游引物5′-ggttgtcgacttacaggctgctgggagcaatcg-3′(Seq.Id.No.13)进行PCR扩增。所得的PCR产物通过XbaI和SalI被克隆到的诱饵载体中LexA的C-端。诱饵载体含有URA3营养标记和ArsCen复制起点。诱饵-融合蛋白的表达由组成型活性的肌动蛋白启动子驱动。转录通过GAL11终止序列终止。诱饵蛋白也携带用于在细菌系统中增殖的细菌复制起点和amp抗性基因。对于筛选，酵母菌株酿酒酵母ImmunaLHB由作为位于载体pESBA-Act2之上Gal4-AD的融合物的scFv-文库以及提供LexA-hPLK1-KD融合子的诱饵载体按照标准醋酸锂转化方案(Agatep，1998)共转化。在转化之后，将细胞涂布于漏失平板(-Trp/-Leu/-Ura)。于30℃温育3到5天后挑取菌落，并在漏失平板(-Trp/-Leu/-Ura)上重新划线。重新长出的菌落通过在含底物X-Gal板的滤纸测定中的蓝色形成进行LacZ-表达测试。取阳性菌落用于进一步的分析，包括从酵母中分离携带scFv的质粒、转化大肠杆菌DH5α、从大肠杆菌单菌落中分离质粒、测序并重新转化到新鲜制备的酵母菌株ImmunaLHB中用于下文所述的测定。所有方法根据本领域普通技术人员众所周知的标准操作实施。实施例7来自新scFv构架的Fab构建体体内性能的评价为评价在不同抗体形式中使用稳定可变结构域构架的有益效果，构建Fab表达载体用于酵母相互作用的筛选。a)用于酵母胞内筛选的Fab构建体构建了两个不同的表达载体以允许不同的表达水平。所述载体以yEplac112(2微米)或yCplac22(ars/cen)主链(Gietz，1988)为基础。两者都含有酵母TRP1营养标记、可诱导的双向Gal1/Gal10启动子、用于细菌系统操作的细菌复制起点以及amp抗性基因。在一个方向上，构架7.3的VH结构域被克隆到包括C-端半胱氨酸的IgG1的CH1-结构域的N-端，紧接着是接头和包括SV40T-抗原在内的Gal4激活结构域(AD氨基酸768-881)。在另一侧，构架7.3的VL结构域被克隆到包括C-端半胱氨酸的CL(λ)结构域的N-端。终止子为重链侧的Gal11终止子以及轻链侧的Cyclin1终止子。b)酵母胞内测定中的性能为定量分析酵母中scFv和Fab形式的抗原结合剂的性能(图1和3)，酿酒酵母菌株ImmunaLHB由作为载体pESBA-Act2上的Gal4-AD-融合物构建体的分离的scFv以及含LexA-hPLK-KD融合子的诱饵载体按照标准醋酸锂转化方案(Agatep，1998)共转化。在转化之后，将细胞涂布于漏失平板(-Trp，-Ura，Glc)。平行接种来自数个菌落划线的2ml漏失培养基(-Trp，-Ura，Glc)过夜培养物，并于30℃培养。将培养物在1ml漏失培养基(-Trp，-Ura，Glc)中稀释至600nm(OD600)0.7的光密度。它们于30℃培养5小时。测定如上文所述进行。C)酵母中还原条件下可溶性蛋白的表达为比较可溶性蛋白在还原条件下表达后的产量，scFv和Fab构建体、连同hPLK1-KD-诱饵载体，如上文所述在酵母菌酿酒酵母的胞浆中表达。它们如上文所述被转化到酵母菌株YDE173中，并涂布于含葡萄糖的-Trp、-Ura漏失平板上。接种来自含数个菌落的划线的5ml漏失培养基(-Trp，-Ura，Glc)过夜培养物，并于30℃培养。将培养物在YPAG中稀释至600nm(OD600)0.5的光密度。它们于30℃培养7.5小时。测定如上文所述进行。对于天然细胞提取物，离心收集2.5ml标准化至OD600为3的细胞培养物，液氮中冷冻，随后重悬于75μlY-PER(Pierce)中。重悬的细胞沉淀震荡片刻，并于20℃轻摇温育20分钟。随后不溶和聚集的物质在eppendorf离心机中于4℃以最大速度离心10分钟沉淀。上清与上样染料混合，100℃加热5分钟，并在12％SDS-PAGE上分离。可溶性Gal4AD-scFv融合物和融合于Gal4-AD的Fab重链部分由蛋白质印迹通过用抗-Gal4-AD单克隆鼠抗体(SantaCruzBiotechnology)作为一抗、而抗-鼠-过氧化物酶偶联物(Sigma)作为二抗、并利用化学发光底物(Pierce)检测Gal4-成分的显现(图11)。SDS-PAGE和蛋白质印迹操作是本领域普通技术人员众所周知的。序列表<110>ESBATECHAG<120>在胞内环境中表现出增强的稳定性的免疫球蛋白构架及其鉴定方法<130>08420PC<150>US60/382,649<151>2002-05-22<150>US60/438,246<151>2003-01-03<160>13<170>PatentInversion3.1<210>1<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>1GluIleValMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValIleIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrLysAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyAlaGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrLysSerTyrTrpThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105<210>2<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>2GluIleValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrLeuThrCysArgAlaSerGlnGlyIleArgAsnGlu202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnArgProGlyLysAlaProLysArgLeuIle354045TyrAlaGlySerIleLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGlnTyrTyrSerLeuProTyr859095MetPheGlyGlnGlyThrLysValAspIleLysArg100105<210>3<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>3GluIleValMetThrGlnSerProAlaThrLeuSerValSerProGly151015GluSerAlaAlaLeuSerCysArgAlaSerGlnGlyValSerThrAsn202530ValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrGlyAlaThrThrArgAlaSerGlyValProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleAsnSerLeuGlnSer65707580GluAspPheAlaAlaTyrTyrCysGlnGlnTyrLysHisTrpProPro859095TrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysArg100105<210>4<211>111<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>4GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerThrSerAsnIleGlyAspAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProGlnLeuLeu354045IleTyrAspAsnThrLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerGlyValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105110<210>5<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>5GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnThrLeuThrHisTyr202530LeuAlaTrpThrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspThrSerLysArgAlaThrGlyValProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspSerAlaLeuTyrTyrCysGlnGlnArgAsnSerTrpProHis859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysArg100105<210>6<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>6SerTyrValLeuThrGlnProProSerValSerValAlaProGlyGln151015ThrAlaThrValThrCysGlyGlyAsnAsnIleGlySerLysSerVal202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuValValTyr354045AspAspSerAspArgProSerGlyIleProGluArgPheSerGlySer505560AsnSerGlyAsnThrAlaThrLeuThrIleArgArgValGluAlaGly65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysGlnValTrpAspSerSerSerAspHis859095AsnValPheGlySerGlyThrLysValGluIleLysArg100105<210>7<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>7LeuProValLeuThrGlnProProSerValSerValAlaProGlyGln151015ThrAlaArgIleSerCysGlyGlyAsnAsnIleGluThrIleSerVal202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuVa1ValSer354045AspAspSerValArgProSerGlyIleProGluArgPheSerGlySer505560AsnSerGlyAsnThrAlaThrLeuThrIleSerArgValGluAlaGly65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysGlnValTrpAspSerSerSerAspTyr859095ValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105<210>8<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>8GlnValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaHisValLeuArgPheLeuGluTrpLeuProAspAlaPheAsp100105110IleTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>9<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>9GluIleValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerSerGlnSerGlyValProSerArgPheArgGly505560SerGluSerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerAsnLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnSerTyrArgThrProPhe859095ThrPheGlyProGlyThrLysValGluIleLysArg100105<210>10<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>10ValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAlaSer151015ValLysValSerCysThrAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrPhe202530LeuHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMetGly354045ArgIleAsnProAspSerGlyAspThrIleTyrAlaGlnLysPheGln505560AspArgValThrLeuThrArgAspThrSerIleGlyThrValTyrMet65707580GluLeuThrSerLeuThrSerAspAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgValProArgGlyThrTyrLeuAspProTrpAspTyrPheAspTyr100105110TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>11<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗体构架<400>11GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysAspAlaGlyIleAlaValAlaGlyThrGlyPheAspTyrTrp100105110GlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>12tgctctagaagtgctgcagtgactgcag28<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>13ggttgtcgacttacaggctgctgggagcaatcg3权利要求1.单链构架，具有如下通式结构NH2-VL-接头-VH-COOH；或NH2-VH-接头-VL-COOH其中VH构架为1a、1b或3亚型。2.融合于第二蛋白成分的单链构架，以产生具有如下通式结构的融合构建体NH2-VL-接头-VH-第二蛋白-COOH；或NH2-第二蛋白-VL-接头-VH-COOH其中VH构架为1a、1b或3亚型。3.权利要求1或2的单链构架，其中VH和VL区的取向颠倒。4.根据权利要求1至3的单链构架，其中VL构架为κ1、λ1或3型。5.根据权利要求2的单链构架，其中第二蛋白为胞内测定提供读出信息。6.单链构架，选自下组AH、BH、CH、DH、EH、FH、GH、AI、BI、CI、DI、EI、FI、GI、AJ、BJ、CJ、DJ、EJ、FJ、GJ、AK、BK、CK、DK、EK、FK及GK其中A为氨基酸序列(Seq.Id.No.1)EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYKSYWTFGQGTKLTVLG；B为氨基酸序列(Seq.Id.No.2)EIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGIRNELAWYQQRPGKAPKRLIYAGSILQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGTKVDIKR；C为氨基酸序列(Seq.Id.No.3)EIVMTQSPATLSVSPGESAALSCRASQGVSTNVAWYQQKPGQAPRLLIYGATTRASGVPARFSGSGSGTEFTLTINSLQSEDFAAYYCQQYKHWPPWTFGQGTKVEIKR；D为氨基酸序列(Seq.Id.No.4)QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLG；E为氨基酸序列(Seq.Id.No.5)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTLTHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSKRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDSALYYCQQRNSWPHTFGGGTKLEIKR；F为氨基酸序列(Seq.Id.No.6)SYVLTQPPSVSVAPGQTATVTCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIRRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHNVFGSGTKVEIKR；G为氨基酸序列(Seq.Id.No.7)LPVLTQPPSVSVAPGQTARISCGGNNIETISVHWYQQKPGQAPVLVVSDDSVRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTKLTVLG；H为氨基酸序列(Seq.Id.No.8)QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHVLRFLEWLPDAFDIWGQGTLVTVSS；I为氨基酸序列(Seq.Id.No.9)EIVLTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSSQSGVPSRFRGSESGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYRTPFTFGPGTKVEIKR；J为氨基酸序列(Seq.Id.No.10)VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTGYFLHWVRQAPGQGLEWMGRINPDSGDTIYAQKFQDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPRGTYLDPWDYFDYWGQGTLVTVSS；且K为氨基酸序列(Seq.Id.No.11)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAGIAVAGTGFDYWGQGTLVTVSS。7.单链构架，选自根据权利要求6的单链构架的变体。8.单链构架，选自根据权利要求6的单链构架的衍生物。9.根据权利要求1-7或17-18中任一项的单链构架、抗体或抗体片段在靶确认、诊断应用、文库构建或治疗应用中的用途。10.至少两个构架序列在鉴定保守构架残基种类中的用途。11.根据权利要求10的用途，其中保守构架残基种类选自下组极性但不带电荷的R基团；带正电荷的R基团；带负电荷的R基团；疏水R基团；及特定氨基酸。12.至少两个构架序列在鉴定至少一个保守构架序列中的用途。13.根据权利要求12的用途，其中保守构架序列为2-5个残基。14.根据权利要求12的用途，其中保守构架序列为5-10个残基。15.根据权利要求12的用途，其中保守构架序列为10-25个残基。16.根据权利要求12-15的用途，其中保守构架序列具有缺口。17.抗体，包括来自根据权利要求1-8中任一项的单链构架的VL或VH或两者兼而有之。18.抗体片段，包括来自根据权利要求1-8中任一项的单链构架的VL或VH或两者兼而有之。19.核酸，能够编码根据权利要求1-8中任一项的单链构架。20.载体，包含根据权利要求19的核酸。21.宿主细胞，包含根据权利要求19的核酸。22.根据权利要求19的核酸在基因治疗中的用途。全文摘要本发明提供了组合物，其可作为用于创建极为稳定且可溶的单链Fv抗体片段的构架。这些构架经胞内性能选择，因而可理想地适用于创建scFv抗体片段或scFv抗体文库，以用于其中稳定性和可溶性为抗体片段性能的限制因素的应用，例如在细胞的还原环境中。此类构架也可用于鉴定表现出增强的可溶性和稳定性的高度保守残基及共有序列。文档编号C07K16/18GK1662556SQ03814626公开日2005年8月31日申请日期2003年5月21日优先权日2002年5月22日发明者K·缇索特,S·艾沃特,A·奥弗德尔茂尔,A·巴伯里斯,D·艾施尔申请人:艾斯巴技术股份公司