专利名称：活化t细胞核因子受体的制作方法
发明
背景技术：
领域本发明概言之涉及细胞受体，具体而言涉及活化T细胞核因子(“NFAT”)活化受体。
背景技术：
经活化的T淋巴细胞能够分泌细胞因子以调节免疫系统活性并使此免疫系统形成有效的免疫响应。细胞因子的产生可在细胞因子基因的转录启动水平进行调节。一族被命名为“活化T细胞核因子”(NFAT)的蛋白质转录因子在细胞因子基因的转录调节中起着重要的作用。已知NFAT蛋白质在多种可调介重要免疫功能的细胞因子及细胞表面受体(例如，白介素-2，白介素-4，白介素-5，白介素-13，干扰素-γ，肿瘤坏死因子-α，GM-CSF，CD40L及CTLA-4)的转录调节中均起到重要作用。已知最佳的且经良好定性的NFAT家庭成员是NFAT1、NFAT2、NFAT3及NFAT4。
NFAT蛋白质活化是通过一包括NFAT蛋白质去磷酸化、核移位及DNA结合的过程来调节的。在静止细胞中，经去磷酸化的NFAT蛋白质驻留于细胞质中且具有较低的DNA结合亲和性。能够触发钙移动的各种刺激可通过一由Ca2+/钙调素依赖性蛋白磷酸酶即钙调磷酸酶调介的过程而引起NFAT蛋白质的快速去磷酸化。具有一暴露的核定位信号的去磷酸化NFAT蛋白质移位于其中其以高亲和性与DNA结合并调介靶基因转录的核中。NFAT蛋白质不仅可在T细胞中表达，而且亦可在多种类型的免疫及非免疫细胞中进行表达。NFAT蛋白质与肥大细胞、B淋巴细胞及NK细胞的活化有关。在这些细胞中，NFAT蛋白质是通过刺激与钙/钙调磷酸酶信号结合的受体(例如，T细胞及B细胞上的抗原受体、肥大细胞及嗜碱性粒细胞上的Fcε受体、巨嗜细胞及NK细胞上的Fcγ受体以及结合于异三聚体G蛋白质的受体)来进行活化的。
下述专利揭示了与转录复合体NFAT有关的多肽及相关多核苷酸、抗体及有关的方法和产物。于1998年11月17日颁予Crabtree等人的美国专利第5,837,840号(让与Board of Trustees of Leland Stanford Jr.University(Stanford，CA))，其名称为“NF-AT polypeptides and polynucleotides(NF-AT多肽与多核苷酸)”；于2000年8月1日颁予Crabtree等人的美国专利第6,096,515号(让予Board of Trustees of the Leland Stanford JuniorUniversity(Stanford，CA))，其名称为“NF-AT polynucleotides(NF-AT多核苷酸)”；于2000年11月21日颁予Crabtree等人的美国专利第6,150,099号(让予Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University(Stanford，CA))，其名称为“NF-AT polypeptides and polynuc leotides(NF-AT多肽与多核苷酸)”；于2001年1月9日颁予Crabtree等人的美国专利第6,171,781号(让与The Board of Trustees of the Leland Stanford JuniorUniversity(Stanford，CA))，其名称为“NF-AT polypeptides andpolynucleotides(NF-AT多肽与多核苷酸)”；于2001年3月6日颁予Crabtree等人的美国专利第6,197,925号(让予Sara Lee Corporation(Winston-Salem，NC))，其名称为“NF-AT polypeptides and polynucleotides(NF-AT多肽与多核苷酸)”；于2001年11月6日颁予Crabtree等人的美国专利第6,312,899号(让予Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University (PaloAlto，CA))，其名称为“NF-AT polypeptides and polynucleotides(NF-AT多肽与多核苷酸)”；于2002年3月5日颁予Crabtree等人的美国专利第6,352,830号(让予The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University(Stanford，CA))，其名称为“NF-AT polypeptides and polynucleotides andscreening methods for immunosuppressive agents(NF-AT多肽与多核苷酸及免疫抑制剂的筛选方法)”；以及于2002年5月14日颁予Crabtree等人的美国专利第6,388,052号(让予Board of Trustees of the Leland Stanford JuniorUniversity(Stanford，CA))，其名称为“NF-AT polypeptides andpolynucleotides(NF-AT多肽与多核苷酸)”。
尽管人们已对NFAT蛋白质及其对细胞因子产生的影响机制具有较多了解，但仍需要了解NFAT路径并应用此了解来开发对调节该路径有用的组合物及方法，包括可调节细胞因子及细胞表面受体表达的激动剂及拮抗剂(例如，抗体)以及用于鉴别可预防或治疗与细胞因子及受体相关的疾病的药物之筛选方法。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供能够与活化T细胞配体蛋白质核因子发生相互作用的新颖NFAT活化受体。
本发明的另一目的是提供可与天然NFAT活化受体结合并抑制或活化该等受体之表达或作用的激动剂或拮抗剂。
本发明的再一目的是提供可与NFAT活化受体结合的抗体以及用于产生此等抗体的方法。
本发明的又一目的是提供可编码能够与活化T细胞配体蛋白质核因子发生相互作用的新颖NFAT活化受体的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供包含可编码新颖NFAT活化受体的核苷酸序列之载体及含有此等载体之宿主细胞。
本发明的再一目的是提供一种筛选方法以鉴别NFAT活化受体激动剂及拮抗剂并在将药物投与动物时用于确定该等药物是否会引起不期望的副作用。
本发明的又一目的是提供一种用于阻断或调节NFAT活化受体之表达的方法。
本发明的另一目的是提供一种方法以诊断一患者是否具有形成由未经调节的细胞因子表达造成的疾病之倾向。
本发明的再一目的是提供一种可预防或治疗哺乳动物中由NFAT蛋白质介导的疾病之方法。
本发明的又一目的是提供一种诊断方法以检测在特定细胞、组织或体液中表达的NFAT活化受体。
本发明的另一目的是提供一种可自重组细胞培养物、杂质及天然环境分离及纯化NFAT活化受体的方法。
本发明的再一目的是提供一种在一可能经历一不期望免疫响应的哺乳动物中引发耐受性的方法。
该等及其它目的通过提供一种新颖的活化T细胞(“NFAT”)核因子活化受体(该活化受体具有SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列)、用于编码该受体的核苷酸序列以及可表达该核苷酸序列并产生该受体的载体及宿主细胞来达成。该受体用于产生可用来影响细胞因子与细胞受体及配体在细胞内的产生之激动剂及拮抗剂抗体。该等抗体可用来筛选受体激动剂及拮抗剂以及筛选药物以确定在将药物投与动物进行治疗时该等药物是否会引起不期望的副作用。
熟习此项技术者将易知本发明的其它及进一步的目的、特征及优点。
具体实施例方式
定义术语“纯化多肽”指自至少一种杂质多肽(该杂质多肽通常在其天然环境内伴随该纯化多肽)鉴别及分离的多肽，尤其指自其细胞环境分离的多肽。
术语“分离多核苷酸”指自至少一种杂质多核苷酸(该杂质多核苷酸通常在其天然环境内伴随该分离多核苷酸)鉴别及分离的多核苷酸，尤其指自其细胞环境分离的多核苷酸。
术语“天然”当用于阐述一种多核苷酸、多肽序列或其它分子时系指一种可在自然界中发现的多肽、多核苷酸或其它分子，例如，存在于一诸如病毒或原核或真核细胞等有机体内的多肽或多核苷酸序列，其可自一自然界来源分离且未经用以改变其结构、性质或功能的特意修饰。一具有SEQ ID NO1中所示核苷酸序列的未分离细胞多核苷酸是一种天然核苷酸，具有SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的未纯化细胞多肽是一种天然多肽。
术语“序列同一性百分比”指在两或多种核苷酸或氨基酸序列的对比中所发现的序列相似性百分比。同一性百分比可以电子方式确定，例如，通过使用MEGALIGN程序(DNASTAR，Inc.，Madison Wisconsin.)。MEGALIGN程序可根据不同方法(例如，多序列联配方法(clustal method)，参见(例如)Higgins，D.G.及P.M.Sharp(1988)Gene73237-244)在两或多种序列之间产生比对。利用多序列联配算法可通过测定各对之间的距离而将序列分成簇。先对该等簇进行成对比对，然后按组进行比对。两个氨基酸序列(例如，序列A及序列B)之间的相似性百分比可通过除序列A的长度、减去序列A中间隙残基的数量、减去序列B中间隙残基的数量、除序列A及序列B之间的匹配残基和、并乘以100来加以计算。在确定相似性百分比时不包括此两个氨基酸序列之间的低相似性或非相似性间隙。核苷酸序列之间的同一性百分比可通过业内已知的方法计数或计算，例如，Hein，J.(1990)Methods Enzymol.183626-645中给出的Jotun Hein方法。序列之间的同一性亦可通过业内已知的其它方法来确定，例如，通过改变杂交条件。
术语“变型体”当用于描述一个多核苷酸序列时系指一与其天然对等部分差别一或多个核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列可具有与其天然对等部分相同或类似的生物功能，或者不具有与其天然对等部分相同或类似的生物功能但可用作探针以鉴别或分离其天然对等部分。较佳的变型体是与其天然对等部分相比具有至少85％序列同一性(较佳具有至少90％至95％的序列同一性，且最佳具有至少99％的序列同一性)的核苷酸序列以及在严格条件下结合于天然序列或其补体上的核苷酸序列。最佳的变型体是可像其天然对等部分一样编码相同氨基酸序列且仅基于基因代码简并性而不同于该天然核苷酸序列的核苷酸序列。
术语“变型体”当用于描述一个多肽序列时系指一与其天然对等部分差别一或多个氨基酸(包括修饰、取代、插入及删除)的氨基酸序列，该氨基酸序列可具有与其天然对等部分相同或类似的生物功能，或者不具有与其天然对等部分相同或类似的生物功能但可用作免疫原以产生结合于其天然对等部分上的抗体或用作其天然对等部分的激动剂或拮抗剂。较佳的变型体是与其天然对等部分相比具有至少70％序列同一性(较佳具有至少85％的序列同一性，且最佳具有至少95％的序列同一性)的多肽。最佳的变型体是具有保守氨基酸取代的多肽。
术语“片段”当用于描述一个多核苷酸时系指其天然对等部分的一个核苷酸序列子集，该子集在严格条件下结合于该天然对等部分或其补体上。较佳片段具有一个至少含25至50个连续的天然序列核苷酸的核苷酸序列。最佳片段具有一个至少含50至100个连续的天然序列核苷酸的氨基酸序列。
术语“片段”当用于描述一个多肽时系指其天然对等部分的一个氨基酸序列子集，该子集可保留有其天然对等部分的任何生物活性或者作为能够产生结合于其天然对等部分上的抗体的免疫原。较佳片段具有一个至少含10至20个连续的天然序列氨基酸的氨基酸序列。最佳片段具有一个至少含20至30个连续的天然序列氨基酸的氨基酸序列。
术语“激动剂”指任何可促进、加强或刺激NFAT活化受体的正常功能的分子。一种类型的激动剂是可以类似于其配体的方式与NFAT活化受体相互作用的分子，包括一抗体或抗体片段。
术语“拮抗剂”指任何可阻断、防止、抑制或中和NFAT活化受体的正常功能的分子。一种类型的拮抗剂是可干扰NFAT活化受体与其受体之间的相互作用的分子，包括一抗体或抗体片段。另一种类型的拮抗剂是能够抑制天然NFAT活化受体的正确转录的反义核苷酸。
术语“保守氨基酸取代”指多肽中的一个氨基酸已经受到一个具有类似侧链的氨基酸的取代。例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸具有脂肪族侧链；丝氨酸及苏氨酸具有羟基脂肪族侧链；天门冬酰胺及谷氨酰胺具有含酰胺的侧链；苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸具有芳香族侧链；赖氨酸、精氨酸及组氨酸具有碱基侧链；且半胱氨酸及蛋氨酸具有含硫侧链。较佳的保守氨基酸取代是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、丙氨酸-缬氨酸及天门冬酰胺-谷氨酰胺。
术语“严格条件”指(1)在50％(vol/vol)甲酰胺与0.1％小牛血清白蛋白、0.1％的Ficoll、0.1％的聚乙烯吡咯烷酮、50 mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)及750mM的NaCl、75mM的柠檬酸钠中于42℃下进行杂交；(2)在50％的甲酰胺、5× SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt氏溶液、经超声波处理的鲑鱼精子DNA(5μg/ml)、0.1％的SDS、及10％的硫酸葡聚糖中于42℃下进行杂交；于42℃下在0.2×SSC及0.1％的SDS中洗涤或在50℃下用0.015M NaCl、0.0015 M柠檬酸钠、0.1％的Na2SO4或以采用类似低离子强度及高温洗涤剂和类似变性剂的类似步骤进行洗涤。
本文所用术语“反义”是指包含与一特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列之任何组成。所用术语“反义链”是指与“有义”链互补的核酸链。反义分子包括肽核苷酸且可通过任何包括合成或转录的方法产生。当互补核苷酸被引入一细胞后，该等互补核苷酸与该细胞产生的天然序列结合以形成双链并阻断转录或转译。有时使用“-”符号来表示反义链，且有时使用“+”来表示有义链。
术语“剔除”指部分或完全去除至少一部分由一哺乳动物的单个细胞、选定细胞或所有该等细胞的内源基因(例如，NFAT活化受体)编码的多肽之表达。该哺乳动物可为“杂合剔除”(其中该内源基因的一个等位基因受到破坏)或“纯合剔除”(其中该内源基因的两个等位基因皆受到破坏)。
本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、细胞系、载体及试剂，因为这些皆会发生改变。此外，本文所用术语仅用于阐述具体实施例之目的而不拟对本发明之范畴加以限定。除上下文中另有明确说明外，本文及随附权利要求中所用的单数形式“一”、“一个”及“该”皆包括其复数含义，例如，“一宿主细胞”包括多个此等宿主细胞。
由于基因代码的简并性，故可产生可编码本发明NFAT活化多肽的众多核苷酸序列。部分该等序列与任何已知的天然核苷酸序列的核苷酸序列高度同源，部分则与之具有最低程度的同源性。本发明涵盖每一种可能的核苷酸序列变异，所述变异可通过基于可能的密码子选择的组合选择来达成。该等组合根据编码天然NFAT活化受体所用核苷酸序列的标准三联基因代码达成，且所有此等变异皆视为得到具体揭示。
除另有定义者外，本文所用的所有技术术语及科学术语以及任何简称皆具有与熟习本发明领域中的此项技术者之普遍理解相同的含义。本文阐述了较佳的方法、装置及材料，但亦可使用任何与本文所述者相似或等效的方法及材料来实施本发明。
本文提及的所有专利及公开案皆在法律允许的范围内以引用方式并入本文中，以便于阐述及揭示该等文献中报告的可用于本发明的蛋白质、酶、载体、宿主细胞及方法。然而，不应将本文所述理解为认可本发明无权早于先前发明所揭示的此等揭示内容。
本发明之多肽本发明之一方面提供了一种纯化多肽，其包含一氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO2的一变型体、SEQ ID NO2的一片段、一由一经分离多核苷酸编码的氨基酸序列组成之群，该经分离多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO1、SEQ ID NO1的一变型体及SEQ IDNO1的一片段组成之群。
本发明的纯化多肽较佳为参与各种细胞因子及细胞受体基因之转录调节的NFAT活化受体。该等受体优先在与人类免疫相关的细胞及组织中表达，尤其是嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、肥大细胞、脾组织及肺组织。该等受体用于产生可结合于该等受体上并影响受体结构、性质或功能(包括生物功能)的抗体。较佳地，该等抗体用作受体激动剂来激活细胞因子及细胞受体的产生或用作受体拮抗剂来抑制细胞因子及细胞受体的产生。
激动剂及拮抗剂本发明之另一方面提供了可特异性结合于NFAT活化受体并抑制或激活该等受体之表达或作用的激动剂及拮抗剂。激动剂及拮抗剂的类型包括但不限于多肽、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核苷酸、有机分子、生物分子、拟肽物质、药剂及其代谢产物以及转录和转译控制序列。
在一实施例中，拮抗剂为一可溶形式的NFAT活化受体及衍生自NFAT活化受体的细胞外结构域且能够结合于所述NFAT活化受体的可溶性多肽。较佳地，该等拮抗剂是选自由SEQ ID NO2的氨基酸43至150或其拮抗剂片段组成之群的肽。该等拮抗剂可通过结合于天然配体并防止该配体与天然受体结合来阻断天然配体对NFAT活化受体的结合。
较佳地，激动剂及拮抗剂是可特异性结合于受体并影响其生物作用及功能(例如，激活或抑制细胞因子及细胞受体的产生)的抗体。该等抗体可为多克隆或单克隆抗体，但较佳为单克隆抗体。
激动剂抗体用于防止或治疗其特征表现为具有较非疾病状态为低的细胞因子及受体表达水平之疾病。拮抗剂抗体用于防止或治疗其特征表现为具有较非疾病状态为高的细胞因子及受体表达水平之疾病。
激动剂及拮抗剂可用于治疗各种免疫疾病，包括但不限于过敏性疾病(例如，哮喘、过敏性鼻炎、遗传性过敏性皮炎、食物超敏反应、风疹)；与移植相关疾病(包括移植排斥反应及移植物抗宿主疾病)；自体免疫或免疫介导的皮肤病(包括大疱性皮肤病、多形性红斑及接触性皮炎、牛皮癣)；类风湿性关节炎、幼年慢性关节炎；肠炎疾病(即，溃疡性结肠炎、克隆氏病(Crohn′s disease))；系统性红斑狼疮；脊柱关节病；系统性硬化症(硬皮病)；特发性炎症性肌病(皮肌炎、多发性肌炎)；干眼症候群(Sjogren′s syndrome)；系统性脉管炎；结节病；自体免疫溶血性贫血(免疫全血细胞减少症、阵发性睡眠性血红蛋白尿症)、自体免疫血小板减少症(特发性血小板减少性紫斑症、免疫介导的血小板减少症)；甲状腺炎(葛雷芙氏症(Graves′disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、幼年淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)；糖尿病；免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)；中枢或周围神经系统脱髓鞘病(例如，多发性硬化、特发性脱髓鞘多发神经病变或季南巴尔氏症候群(Guillain-Barre syndrome)及慢性发炎性脱髓鞘多神经病变)；肝胆病(例如，传染性肝炎(A、B、C、D、E及其它非嗜肝病毒型肝炎)、自体免疫慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽性肝炎及硬化性胆管炎)；炎性或纤维性肺病(例如，纤维性囊肿、麸质过敏性肠病及惠普耳氏病(Whipple′sdisease))；免疫性肺病(例如，嗜酸粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化及过敏性肺炎)。
抗体及抗体的产生本发明之再一方面提供了一种可结合于本发明NFAT活化受体上的抗体及产生此抗体的方法，包括可用作天然NFAT活化受体激动剂或拮抗剂的抗体。在一实施例中，该方法包括作用经分离的NFAT活化受体或其抗原片段作为一抗原，以便采用一用于产生抗原抗体的已知方案来产生可结合于本发明NFAT活化受体上的抗体，包括单克隆抗体及多克隆抗体。在另一实施例中，该方法包括使用表达重组NFAT活化受体的宿主细胞作为一抗原。在再一实施例中，该方法包括使用DNA表达载体(其包含该受体基因)作为一抗原用来产生该等抗体。
熟习此项技术者已熟知用于产生抗体(包括多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、人源化抗体、双特异性抗体及杂共轭抗体)的各种方法。
多克隆抗体可通过单独注射一免疫原或注射一免疫原与一佐剂之组合至一哺乳动物中而于该动物中产生多克隆抗体。通常使用一或多种皮下或腹腔内注射将免疫原注射于哺乳动物中。免疫原可包括感兴趣的多肽或一包含此多肽及另一已知可在该接受免疫的哺乳动物中产生免疫作用的多肽之融合蛋白。该免疫原亦可包括表达一重组受体或一DNA表达载体(含有该受体基因)的细胞。此等免疫原蛋白质的实例包括但不限于钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、小牛甲状腺球蛋白及大豆胰蛋白酶抑制剂。佐剂的实例包括但不限于佛氏完全佐剂(Freund′scomplete adjuvant)及MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A、合成的trehalosedicorynomycolate)。
熟习此项技术者无需进行过多实验即可选择出免疫方案。
单克隆抗体使用杂交瘤方法(例如，Kohler及Milstein阐述于Nature，256495(1975)中的那些方法)可产生单克隆抗体。在一杂交瘤方法中，使用一免疫原接种一小鼠、仓鼠或其它适当的宿主哺乳动物来诱发出可产生或能够产生特异性结合于此抗原上的抗体的淋巴细胞。或者，亦可在体外对淋巴细胞进行免疫。免疫原通常包括感兴趣的多肽或一含此多肽的融合蛋白。一般而言，如果需要来源于人类的细胞，则使用周边血液淋巴细胞(“PBL”)。如果需要非人类哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴节细胞。随后使用一适宜融合剂(例如，聚乙二醇)使淋巴细胞与一永生细胞系融合，以形成一杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp 59-103(AcademicPress，1986))。永生细胞系通常是经转化的哺乳动物细胞，尤其为啮齿类动物、小牛或人类骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。骨髓瘤细胞可在一适宜的培养基中进行培养，该培养基中较佳包含一或多种可抑制未融合永久细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，则用于该等杂交瘤的培养基将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸苷(HAT培养基)。该HAT培养基可防止HGPRT缺陷细胞的生长。
较佳的永久细胞系是可有效融合、支持选定抗体产生细胞对抗体的稳定高水平表达且对诸如HAT培养基等培养基敏感的细胞系。更佳的永久细胞系是鼠类骨髓瘤细胞系，例如衍生自MOPC-21及MPC-11小鼠肿瘤的细胞系(可自SalkInstitute CellDistribution Center，San Diego，Calif.USA获得)及SP2/0或X63-Ag8-653细胞(可自American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA获得)。人们亦阐述了使用人类骨髓瘤及小鼠-人杂骨髓瘤细胞系来产生人类单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur等人之Monoclonal Antibody Production Technique sand Applications，pp.51-63(Marcel Dekker公司，纽约，1987))。亦可使用小鼠骨髓瘤细胞系NSO(EuropeanCollection of Cell Cultures，Salisbury，Wiltshire UK)。另外，亦可使用业内熟知的人类骨髓瘤及小鼠-人杂骨髓瘤细胞系来产生人类单克隆抗体。
因此，用于培养杂交瘤细胞的培养基可用于分析针对感兴趣多肽的单克隆抗体的存在。较佳地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或体外结合分析来测定，例如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)。此等技术及分析方法已为业内所熟知。单克隆抗体的结合亲和性可通过(例如)Scatchard分析(Munson及Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980))来测定。
在鉴别所需的杂交瘤细胞后，该等纯细胞系可通过限制溶解步骤来进一步克隆并可通过标准方法使之生长。适用于此目的的适宜培养基包括DMEM培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)和RPMI-1640培养基。或者，可在一哺乳动物体内的腹水中生长。
次株所分泌的单克隆抗体可通过习用的免疫球蛋白纯化方法(蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱、凝胶电泳透析或亲和色谱)自培养基或腹水液体进行分离或纯化。
单克隆抗体亦可通过重组DNA方法(例如，阐述于美国专利第4,816,567号中的方法)产生。编码本发明之单克隆抗体的DNA可使用习用方法容易地分离及测序，例如，使用能够特异性结合于编码轻链及重链鼠类抗体的寡核苷酸探针(Innis M.等人之“PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications”，Academic，San Diego，CA(1990)；Sanger，F.S等人，Proc.Nat.Acad.Sci.745463-5467(1977))。本文所述的杂交瘤细胞是此类DNA的一较佳来源。经分离后，可将此DNA置于表达载体中。然后，将该等载体转染至不会以其它方式产生免疫球蛋白的宿主细胞中，例如，猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。该等重组宿主细胞可用于产生所需的单克隆抗体。亦可通过(例如)用人类重链及轻链恒定域的编码序列来代替同系鼠类序列或通过将免疫球蛋白编码序列共价结合于一非免疫球蛋白多肽的部分或全部编码序列来对DNA进行修饰。此一非免疫球蛋白多肽可替代一抗体的恒定域或可替代一抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生一嵌合双价抗体。
单价抗体可使用一免疫球蛋白轻链及经修饰重链的重组表达来产生。一般而言，可在Fc区域的任何一点将重链切断，以防止重链交联。或者，以另一氨基酸残基来替代相关的半胱氨酸残基或删除相关的半胱氨酸残基以防止交联。同样地，亦可使用体外方法来产生单价抗体。可使用已知方法利用抗体消化来产生抗体片段，较佳可产生Fab片段。
抗体及抗体片段可使用抗体噬菌体文库产生，该等抗体噬菌体文库是采用McCafferty等人在Nature 348552-554(1990)中阐述的技术产生的。Clackson等人及Marks等人皆分别在Nature 352624-628(1991)中和J.Mol.Biol.222581-597(1991)中阐述了使用噬菌体文库来进行鼠类及人类抗体的分离。下述出版物阐述了通过链改组(Marks等人，Bio/Technology 10779-783(1992))来产生高亲和性(nM范围)人类抗体、以及作为构造极大噬菌体文库的策略的组合感染和体外重组(Waterhouse等人，Nuc.Ac ids.Res.212265-2266(1993))。因此，这些技术相对于用来分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术而言是更具优势的替代方案。此外，亦可通过(例如)用人类重链及轻链恒定域的编码序列来代替同系鼠类序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 816851(1984))或通过将一非免疫球蛋白多肽的部分或全部编码序列共价结合于免疫球蛋白编码序列来对DNA进行修饰。通常，此等非免疫球蛋白多肽可替代一抗体的恒定域或可替代一抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生一嵌合双价抗体，该抗体包括一个对一抗原具有特异性的抗原结合位点及另一个对一不同抗原具有特异性抗原结合位点。
亦可使用电融合而非化学融合的方法来产生抗体以形成杂交瘤。该项技术已得到良好的发展。除融合方法外，亦可使用(例如)一Epstein Barr病毒或一转化基因对B细胞进行转化以使其存活(“Continuously Proliferating HumanCell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity”，Zurawaki，V.R.等人阐述于Kennett R.H.等人编辑的“Monoclonal Antibodies”(PlenumPress，N.Y.1980，pp19-33)中)。
人源化抗体人源化抗体可使用Winter in Jones等人在Nature，321522-525(1986)中、Riechmann等人在Nature，332323-327(1988)中以及Verhoeyen等人在Science，2391534-1536(1988)中所述的方法来产生。人源化过程通过以啮齿类CDR或CDR序列来代替相应的人类抗体序列来完成。一般而言，人源化抗体具有自一非人来源引入其内的一或多个氨基酸。此等“人源化”抗体为嵌合抗体，其中，实质上少于一个完好人类可变域的部分已由来自一非人类物种的相应序列替代。实际上，人源化抗体通常为人类抗体，其中某些CDR残基且可能某些FR残基由来自啮齿类动物抗体中类似位点残基取代。非人类(例如鼠类或牛类)抗体的人源化形式可为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或免疫球蛋白片段，例如，Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、或含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列之抗体的其它抗原结合子序列。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自该受体的一互补决定区域(CDR)的残基由来自一诸如小鼠、大鼠或兔等非人类物种(供体抗体)CDR且具有期望特异性、亲和性及能力的残基替代。有时，人类免疫球蛋白的Fv骨架残基由对应的非人类残基替代。人源化抗体亦包含既未见于受体抗体亦未见于引入CDR或骨架序列中的残基。一般而言，人源化抗体包含实质上至少一个且通常为两个可变结构域的全部部分，其中CDR区域的全部或实质上其全部部分对应于一非人类免疫球蛋白，且FR区域的全部或实质上其全部部分为人类免疫球蛋白相同序列的那些部分。人源化抗体较佳包括一免疫球蛋白恒定区域(Fc)(通常为一人类免疫球蛋白恒定区域)的至少一部分。
人类抗体人类抗体可使用业内已知的各种技术来产生，例如，Hoogenboom及Winter在J.Mol.Biol.，227381(1991)中及Marks等人在J.Mol.Biol.，222581(1991)中所阐述的噬菌体展示文库。人类单克隆抗体可使用Cole等人在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，p.77 (1985)中及Boemer等人在J.Immunol.，147(1)86-95 (1991)中阐述的技术来产生。或者，可利用转基因动物(例如小鼠)，其在免疫后可于不产生内源免疫球蛋白的情况下产生整组人类抗体。该等转基因小鼠可自Abgenix公司(Fremont，California)及Medarex公司(Annandale，New Jersey)获得。有人曾阐述了嵌合及种系突变小鼠中抗体重链接合区域(JH)基因的纯合缺失会完全抑制内源抗体的产生。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转入该等种系突变小鼠中可在受到抗原攻击后产生人类抗体。参见(例如)Jakobovits等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)中、Jakobovits等人在Nature 362255-258(1993)中、Bruggermann等人在Year in Immunol.733(1993)中以及Duchosal等人在Nature 355258(1992)中的阐述。人类抗体亦可衍生自噬菌体展示文库(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Vaughan等人，Nature Biotech 14309(1996))。
双特异性抗体双特异性抗体可由两个免疫球蛋白重链/轻链对的重组共表达产生，其中该等两个重链具有不同的特异性。双特异性抗体是单克隆抗体，较佳为对至少两种不同抗原具有结合特异性的人类或人源化抗体。在本发明中，一种结合特异性是针对NFAT活化受体的结合特异性，另一种结合特异性是针对任何其它抗原的结合特异性，较佳为一细胞表面受体或受体亚单位。由于免疫球蛋白重链及轻链的随机分配，因此，该等杂交瘤可产生一由10种不同抗体构成的可能混合物。然而，该等抗体中只有一种具有适当的双特异性结构。适当分子的回收及纯化通常通过亲和色谱来完成。
具有期望结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可融合于免疫球蛋白恒定结构域序列中。该融合较佳具有一免疫球蛋白重链恒定结构域，该结构域包含铰合区域、CH2区域及CH3区域中的至少一部分。较佳地，至少该等融合之一具有包含轻链结合所需位点的第一重链恒定区域(CHI)。将编码免疫球蛋白重链及(若需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并将此等DNA共转染至适宜的宿主有机体中。Suresh等人之Methods inEnzymology(121210(1986))阐述了用于产生双特异性抗体的适宜技术。
杂共轭抗体杂共轭抗体可使用已知的蛋白融合方法(例如，通过将一抗体的胺基连接至另一抗体或另一多肽的硫醇基上)来产生。若需要，可使用已知方法引入一硫醇基。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成一硫醚键来产生包含一抗体或抗体片段及一多肽毒素的免疫毒素。适用于此目的的适宜试剂实例包括亚胺基硫醇盐及甲基-4-巯基丁亚胺酯(mercaptobutyrimidate)。此等抗体可用于针对不需要的细胞来定向免疫系统细胞或治疗HIV感染。
多核苷酸本发明另一方面提供了一种经分离的多核苷酸，其包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO1、SEQ ID NO1的一变型体、SEQ ID NO1的一片段及一核苷酸序列组成之群，其中该核苷酸序列可编码一多肽，该多肽具有选自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO2的一变型体及SEQ ID NO2的一片段组成之群的氨基酸序列。在一实施例中，该经分离多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列可编码一多肽，该多肽具有一选自由SEQ ID NO2的氨基酸43至150或其拮抗剂片段组成之群的氨基酸序列。
本发明的经分离多核苷酸较佳为参与各种细胞因子及受体基因之转录调节的NFAT活化受体之编码序列。该等多核苷酸用于产生可在用来产生激动剂及拮抗剂抗体的过程中作为抗原的NFAT活化受体，其中该等抗体可特异性结合于NFAT活化受体上并抑制或激活此等受体的表达或作用。
载体或宿主细胞本发明的另一方面提供了一种包括一核苷酸序列(该核苷酸序列可编码本发明的NFAT活化受体)的载体及包括此一载体的宿主细胞。
宿主细胞的实例可为哺乳动物细胞(例如CHO细胞)、原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))或酵母菌(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。本发明进一步提供了一种用于产生脊椎动物融合多肽的方法，该方法包括在适于表达脊椎动物融合多肽的条件下培养宿主细胞以及自细胞培养液中回收所述宿主细胞。
NFAT活化受体的重组表达根据本发明，可通过将对应的核苷酸序列引入表达载体并在适宜的宿主细胞中表达该核苷酸序列以产生多肽的方法来提供经分离及纯化的重组NFAT活化受体。
表达载体包含一编码所述多肽的核苷酸序列之重组表达载体可使用已知技术来制备。该等表达载体包括一可以有效方式连接至适宜转录或转录调节核苷酸序列(例如，衍生自哺乳动物基因、微生物基因、病毒基因或昆虫基因的那些序列)上的核苷酸序列。调节序列的实例包括转录启动子、操纵子、增强子、mRNA核糖体结合位点及可控制转录及转译启动和终止的适宜序列。当该调节序列在功能上与适宜多肽的核苷酸序列相关时，可以有效方式来连接核苷酸序列。因此，若一启动子核苷酸序列可控制所述适宜核苷酸序列的转录，则该启动子核苷酸序列可以有效方式连接至一NFAT活化受体序列。
此外，亦可将在期望宿主细胞中复制的能力引入所述表达载体中，该能力通常由一复制来源及一选择基因(通过其可对转化体加以鉴别)赋予所述载体。
此外，可将编码适宜信号肽(此信号肽非天然伴随NFAT活化受体)的序列引入表达载体中。例如，可将一信号肽的核苷酸序列(分泌型前导序列)融合于多肽序列框内中，以使所述多肽可初步转译成一包含此信号肽的融合蛋白。可在目标宿主细胞中发挥作用的信号肽能够增强适宜多肽的细胞外分泌。该信号肽可在细胞分泌多肽后自所述多肽解离。
宿主细胞用于表达NFAT活化受体的适宜宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、古细菌及其它真核细胞。适用于细菌、真菌、酵母菌及哺乳动物细胞宿主的克隆及表达载体已为业内所熟知，例如，Pouwels等人在Cloning VectorsA LaboratoryManual(Elsevier，New York(1985))所述。该载体可为一质粒载体、一单链或双链噬菌体载体或DNA病毒载体。通过用于将DNA和RNA引入细胞的已知技术可将该等载体引入细胞中作为多核苷酸(较佳为DNA)。当该等载体作为噬菌体及病毒载体时，亦可且较佳采用已知技术将其引入细胞中作为封装或封包病毒载体以进行感染或转转导。病毒载体可具有复制能力或具有复制缺陷。对于后一种情况，病毒通常仅在互补宿主细胞中传播。亦可使用衍生自本发明DNA构造的RNA并采用无细胞转译系统来产生蛋白质。
在本发明中用作宿主细胞的原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽胞杆菌。在一原核宿主细胞中，一多肽可包括一N末端甲硫氨酸残基，以促进重组多肽在原核宿主细胞中的表达。该N末端甲硫氨酸可自所表达的重组NFAT活化受体多肽上解离。通常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括β-内酰胺酶及乳糖启动子系统。
用于原核宿主细胞的表达载体通常包含一或多个表现型可选标记基因。一表现型可选标记基因可为(例如)一编码一可赋予抗体抗性或可满足自养需要的蛋白质之基因。可用于原核宿主细胞的表达载体之实例包括那些衍生自市售质粒(例如，克隆载体pBR322(ATCC37017))的载体。pBR322包含可提供氨苄青霉素及四环素抗性的基因，因而可提供用于鉴别转化基因的简单手段。为了构造一使用pBR322的表达载体，可将一适宜的启动子及一DNA序列插入该pBR322载体。其它市售载体包括(例如)pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pGEMl(Promega Biotec，Madison，Wisconsin.，USA)及pET(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)和pRSET(Invitrogen公司，Carlsbad，California，USA)系列的载体(Studier，F.W.，J.Mol.Biol.21937(1991)；Schoepfer，R.Gene 12483(1993))。
通常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括T7(Rosenberg，A.H.，Lade，B.N.，Chui，D-S.，Lin，S-W.，Dunn，J.J.及Studier，F.W.(1987)Gene(Amst.)56，125-135)、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang等人，Nature 275615，(1978)；及Goeddel等人，Nature281544，(1979))、色胺酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，Nucl.Acids Res.84057，(1980))及tac启动子(Maniatis，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，p.412(1982))。
在本发明中用作宿主细胞的酵母菌包括那些来自酿酒酵母属(Saccharomyces)、酵母属(Pichia)、放线菌属(K.Actinomycetes)及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。酵母载体通常包含一来自一2μ酵母菌质粒的复制序列来源、一自主复制序列(ARS)、一启动子区域、用于多聚腺苷化的序列、用于终止转录的序列及一可选标记基因。酵母载体的适宜启动子序列还包括金属硫蛋白启动子、3-磷酸甘油醛激酶(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.2552073，(1980))或其它糖酵解酶(Holland等人，Biochem.174900，(1978))，例如，烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸盐异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、三磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶及葡糖激酶。其它适用于酵母菌表达的载体及启动子由Fleer等人进一步阐述于Gene，107285-195(1991)中。其它适用于酵母菌及酵母菌转化方案的启动子及载体已为业内所熟知。
熟习此项技术者已熟知酵母菌转化方案。Hinnen等人在Proceedings of theNational Academy of Sciences USA，751929(1978)中对一个此类方案进行了阐述。该Hinnen方案在一选择性培养基中选择Trp.sup.+转化体，其中该选择性培养基由0.67％酵母氮源、0.5％水解酪蛋白氨基酸、2％葡萄糖、10μg/ml腺嘌呤及20μg/ml尿嘧啶组成。
亦可采用业内熟知的哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统来表达重组NFAT活化受体，例如，可采用在昆虫细胞中产生异源性蛋白的杆状病毒系统(Luckow及Summers，Bio/Technology 647(1988))或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于哺乳动物表达。用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录及转译控制序列可自病毒基因组切除。常用的启动子序列及增强子序列衍生自多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)及人类巨细胞病毒。衍生自SV40病毒基因组的DNA序列可用于提供其它遗传要素以便在一哺乳动物宿主细胞(例如，SV40来源、早期及晚期启动子、增强子、拼接点及多聚腺苷化位点)中表达一结构基因序列。病毒早期及晚期启动子特别有用，此乃因二者皆易于自一病毒基因组获得作为一其亦可包含一病毒复制来源的片段。用于哺乳动物宿主细胞中的实例性表达载体已为业内所熟知。
当有益时，NFAT活化受体可被表达为一融合蛋白，在该融合蛋白中NFAT活化受体连接于一融合片段上。该融合片段通常可通过(例如)使用亲和色谱来分离及纯化该融合蛋白而有助于蛋白质纯化。可通过培养一使用核酸序列(该序列可编码一包括该融合片段的蛋白质，其中该融合片段连接于该蛋白质的羧基及/或氨基末端)转化的重组细胞来产生融合蛋白。较佳融合片段包括但不限于谷胱甘肽硫转移酶、β-半乳糖苷酶、一能够结合于二价金属离子上的多组胺酸片段及麦芽糖结合蛋白。
表达及回收根据本发明，经分离及纯化的NFAT活化受体可通过上述重组表达系统来产生。该方法包括培养一经一表达载体转化的宿主细胞，该表达载体包括一核苷酸序列，且该核苷酸序列可在足以促进多肽表达的条件下编码此多肽。然后，根据所采用的表达系统自培养基或细胞提取物中回收该多肽。如业内人士所熟知，用于纯化重组多肽的方法可根据诸如所用宿主细胞类型及重组多肽是否分泌于培养基中等因素而加以变化。当采用分泌此重组多肽的表达系统时，首先可对该培养基进行浓缩。在此浓缩步骤后，可将所得浓缩物施于一纯化基质(例如，凝胶过滤培养基)中。或者，可采用阴离子交换树脂，例如，一具有侧二乙基氨基乙基(DEAE)的基质或底物。此等基质可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或通常用于蛋白质纯化的其它类型基质。此外，亦可采用阳离子交换步骤。适宜的阳离子交换树脂包括各种含磺丙基或羧甲基的不溶性基质。此外，可采用一或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤来进一步纯化蛋白质，其中该等步骤中使用疏水性RP-HPLC媒介(例如，具有侧甲基或其它脂肪族基团的硅胶)、离子交换型-HPLC(例如，具有侧DEAE或磺丙基(SP)的硅胶)、或疏水作用型-HPLC(例如，具有侧苯基、丁基或其它疏水性基团的硅胶)。业内已知部分或全部上述纯化步骤之各种组合且其可用于提供一经分离及纯化的重组多肽。
在细菌培养物中产生的重组多肽通常通过以下来分离先破坏宿主细胞，再离心、自细胞碎片提取(对于一不溶性多肽)或自上清液中提取(对于一可溶多肽)，随后进行一或多次浓缩、盐析、离子交换、亲和纯化或尺寸排除色谱分析步骤。最后，可采用RP-HPLC进行最终纯化步骤。使用任何习用方法皆可破坏微生物细胞，包括冷冻-解冻循环、超声波处理、机械破坏或使用细胞溶解剂。
激动剂或拮抗剂筛选本发明的另一方面提供了一种用于鉴别NFAT活化受体激动剂及拮抗剂的筛选方法。该筛选方法包括将一NFAT活化受体暴露于一潜在的NFAT激动剂/NFAT拮抗剂以及确定该潜在的激动剂/拮抗剂是否结合于所述受体。如果该潜在的激动剂/拮抗剂可结合于所述受体，则可有力地假定此潜在的激动剂/拮抗剂实际上可在投与一患者体内并暴露于天然NFAT活化受体时作为一激动剂或拮抗剂。使用所述方法鉴别的该等NFAT激动剂及NFAT拮抗剂可通过将能够产生细胞因子的细胞暴露于此激动剂/拮抗剂并对照未经暴露细胞测量细胞因子的产生情况来将其定性为一激动剂或一拮抗剂。激动剂可增加细胞因子的产生；拮抗剂可降低细胞因子的产生。另一筛选方法包括使用一报道基因结构物来转染细胞，其中所述结构物中包含NFAT DNA结合序列。较佳地，此潜在的激动剂/拮抗剂是一有机化合物或多肽，包括抗体。该等筛选方法可用于鉴别化合物是否可作为预防或治疗疾病(尤其是其特征为可产生较非疾病状态为低或高的细胞因子量的疾病)的药物。
不良副作用筛选本发明的再一方面提供了一种在将药物投与一动物以治疗预期症状时用来确定该等药物是否可能引起与降低或增加细胞因子及细胞受体产生相关的不期望副作用之筛选方法。该筛选方法包括将NFAT活化受体暴露于所述药物以及确定所述药物是否结合于所述受体或通过使细胞因子的生成发生变化来模拟所述受体配体的生物功能。如果所述药物可结合于所述受体或模拟所述受体配体的生物功能，则当将此药物投与一动物以治疗预期症状时存在一种可能性，即此药物将会引起不良副作用。该等不良副作用是由细胞因子生成的不期望变化造成的。可通过该方法筛选的药物包括但不限于多肽、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核苷酸、有机分子、生物有机分子、拟肽物质、药剂及其代谢产物以及转录和转译控制序列。在一较佳实施例中，对拟投与以治疗特定症状的抗体进行筛选以确定其是否与NFAT活化受体发生交叉反应，因而可在投与其以治疗预期症状时确定其是否会引起不期望的副作用。
受体表达调节本发明的又一方面提供了一种通过干扰一DNA或RNA多核苷酸的转录或转译来阻断或调节细胞内NFAT活化受体表达的方法，其中所述DNA或RNA多核苷酸能够编码所述NFAT活化受体。该方法包括将一能够表达一NFAT活化受体的细胞暴露于一分子，所述分子能够干扰一编码所述NFAT活化受体的DNA或RNA多核苷酸之正确转录或转译。该分子可为一有机分子、一生物有机分子、一反义核苷酸、一RNAi核苷酸或一核酶。
在一较佳实施例中，该方法包括通过将一细胞暴露于一多核苷酸来阻断或调节细胞内NFAT活化受体的表达，该多核苷酸相对于NFAT活化受体编码的DNA或调节NFAT活化受体编码的DNA之表达的DNA为反义或者可与NFAT活化受体编码的DNA或调节NFAT活化受体编码的DNA之表达的DNA形成一个三螺旋结构。将该细胞暴露于其量足以抑制或调节NFAT活化受体之表达的反义多核苷酸或三螺旋结构形成的多核苷酸中。此外，本发明亦提供了一种通过将一多核苷酸投与一动物来阻断或调节此动物中细胞内NFAT活化受体表达的方法，该多核苷酸相对于NFAT活化受体编码的DNA或调节NFAT活化受体编码的DNA之表达的DNA为反义或者可与NFAT活化受体编码的DNA或调节NFAT活化受体编码的DNA之表达的DNA形成一个三螺旋结构。向该动物投与其量足以抑制或调节该动物中NFAT活化受体之表达的反义多核苷酸或三螺旋结构形成的多核苷酸。较佳地，该反义多核苷酸或三螺旋结构形成的多核苷酸为一DNA或RNA多核苷酸。
业内已熟知用于将细胞暴露于反义多核苷酸以及用于将反义多核苷酸投与动物的方法。在一较佳方法中，使用已知方法将此多核苷酸引入细胞内基因组中并使此多核苷酸在该细胞内进行表达。所表达的反义多核苷酸结合于编码NFAT活化受体的多核苷酸并干扰其转录或转译。
该等方法可用于抑制细胞因子受体的表达并对各种类型的细胞(例如，嗜中性粒细胞或肥大细胞)进行研究，且可用于预防或治疗其特征在于相对于非疾病状态而言产生过量细胞因子的动物疾病。
疾病倾向诊断本发明的另一方面提供了一种用于诊断一患者是否具有形成由未经调节的细胞因子表达造成的疾病之倾向。本发明所依据的发现是，当患者的某些细胞、组织或体液存在NFAT活化受体或该等受体的量增高时，表明此患者具有患某些免疫疾病的倾向。在一实施例中，该方法包括收集一细胞、组织或体液样品，已知所述样品中包含少量(如果有)来自一患者的NFAT活化受体；分析所述组织或体液，以确定所述组织中是否存在NFAT活化受体；以及根据所述组织或体液中是否存在NFAT活化受体来预测所述患者是否具有患某些免疫疾病之倾向。在另一实施例中，该方法包括收集一细胞、组织或体液样品，已知所述样品中包含一定义量来自一患者的NFAT活化受体；分析所述组织或体液，以确定所述组织中存在的NFAT活化受体量；以及根据所述组织或体液中的NFAT活化受体相对于为正常细胞、组织或体液所建立的一定义量或测试量之变化量来预测所述患者是否具有患某些免疫疾病之倾向。NFAT活化受体的定义量可为一基于文献值的已知量或可事先通过测量正常细胞、组织或体液中的量来确定。具体而言，确定特定组织或体液中的NFAT活化受体量允许对患者中的免疫疾病进行特异性及早期(较佳在发病之前)检测。可使用本发明方法诊断的免疫疾病包括但不限于本文所述的免疫疾病。在一较佳实施例中，所述组织或体液为周边血液、周边血液白血球、活体组织(例如，肺或皮肤组织)以及滑膜液及组织。
疾病预防及治疗本发明的又一方面提供了一种用于预防或治疗一哺乳动物中由NFAT蛋白质介导的疾病的方法。该方法包括将一疾病预防或治疗量的NFAT活化受体激动剂或拮抗剂投予所述哺乳动物。该激动剂或拮抗剂可结合于所述NFAT受体上并调节细胞因子及细胞内受体的表达，以产生非疾病状态特征下的细胞因子量。较佳地，此疾病为一过敏症、哮喘、自体免疫或其它炎性疾病。最佳地，该疾病为过敏症或哮喘。
NFAT活化受体激动剂或拮抗剂的剂量可根据特定哺乳动物的年龄、体格和特征以及疾病而有所不同。业内人士可根据该等因素来确定其剂量。可在若干天的时期内根据对症治疗方案投与(例如)单一剂量或若干剂量的激动剂或拮抗剂以改善一疾病状态或在一较长时期内采用定期投与剂量来预防过敏症或哮喘。
激动剂及拮抗剂可以任何可接受的方式投与哺乳动物，包括注射、采用一植入物以及诸如此类。较佳者为注射和采用植入物，此乃因其可精确控制投与时所用的时间及剂量水平。激动剂及拮抗剂较佳以非经肠方式投与。本文所用的非经肠投与系指通过静脉内、肌内或腹腔内注射或通过皮下植入等方式投与。
当通过注射投与时，可以一可注射调配物的形式投与激动剂及拮抗剂，该调配物中可包含任何生物相容的以及激动剂和拮抗剂相容的载剂，例如，各种媒剂、佐剂、添加剂及稀释剂。水性媒剂(例如不含非挥发性致热原的水、无菌水和抑菌水)亦适于形成可注射溶液。除了这些形式的水之外，亦可使用若干其它水性媒剂。该等媒剂包括但不限于可进行灭菌的等渗注射组合物，例如，氯化钠、林格试剂、葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸化林格试剂。亦可使用诸如棉籽油、芝麻油或花生油及酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯)等非水性媒剂作为此等组合物的溶剂系统。此外，还可添加各种能够增强组合物的稳定性、无菌性及等渗性的添加剂，包括抗菌保存剂、抗氧化剂、螯合剂以及缓冲剂。然而，所用的任何媒剂、稀释剂或添加剂皆必须与本发明之激动剂和拮抗剂具有生物相容性和相容性。
NFAT多肽诊断本发明抗体亦可用于一种用来检测表达于特定细胞、组织或体液或其成份中的NFAT活化受体之诊断方法。该方法包括将细胞、组织或体液或其成份暴露于一本发明之抗体；以及测定所述细胞、组织或体液或其成份是否结合于所述抗体。如果该等细胞、组织或体液或其成份结合于所述抗体，则可将该等细胞、组织或体液或其成份诊断为含有NFAT活化受体。该方法可用于确定一特定细胞、组织或体液是否为预先已知含有NFAT活化受体的某一类型的细胞、组织或体液。可采用业内熟知的各种诊断方法，例如，可于异相或同相中实施的免疫沉淀分析、竞争生结合分析以及直接或间接夹心分析。
NFAT多肽纯化本发明抗体亦可用于一种自重组细胞培养物、杂质及天然环境中分离及纯化NFAT活化受体的方法。该方法包括将一包含NFAT活化受体及杂质的组合物暴露于一能够结合于所述受体的抗体；使所述NFAT活化受体结合于所述抗体；自所述杂质中分离所述抗体-受体复合物；以及自所述复合物回收所述NFAT活化受体。可采用业内已知的各种纯化方法，例如，可自重组细胞培养物或天然来源回收NFAT活化受体的亲和纯化方法。在该方法中，使用业内已知的方法将针对NFAT活化受体的抗体固定于一适宜载质(例如，Sephadex树脂或滤纸)上。然后，经固定化的抗体与一包含拟纯化NFAT活化受体和杂质的样品组合物接触。然后，使用能够移除样品中除结合于固定化抗体上的NFAT活化受体之外的实质上所有材料之适宜溶剂来洗涤此载质。最后，使用另一可自该抗体移除所述NFAT受体的适宜溶剂来洗涤此载质。
耐受性引发方法本发明的另一方面提供了一种用于在一可能经历一不期望免疫响应的哺乳动物中引发耐受性的方法。该方法包括以足以抑制NFAT蛋白质移位于细胞核中并抑制其随后与转录因子活化蛋白1(AP-1，一种已知可与NFAT蛋白质相互作用的转录因子)相互作用的量将一NFAT活化受体拮抗剂施予一患者。较佳地，该拮抗剂是一种可结合于NFAT活化受体并防止NFAT蛋白质移位于细胞核中以及与AP-1相互作用的一种抗体。
耐受性是通过一不完全信号过程引发的。自身抗原仅刺激T细胞受体并导致能够激活NFAT蛋白质的细胞间钙水平之增加。然后，NFAT蛋白质结合于T细胞DNA的特异性位点并触发可引发耐受性的基因表达。然而，NFAT蛋白质通常与另一被称为AP-1的转录因子相互作用。该等转录因子间的相互作用可诱发一完全免疫响应，其中T细胞将会对抗外来抗原。然而，如果NFAT蛋白质不与AP-1发生相互作用，则会产生一种T细胞无响应状态，其中T细胞可耐受抗原。对外来抗原的完全免疫响应将会引起许多不期望的免疫响应，例如，过敏症及移植器官排斥反应。因此，任何可防止NFAT与AP-1相互作用的试剂皆能够防止该等不期望的破坏性响应并诱发耐受性。
在一较佳实施例中，本发明提供了一种用于在一器官移植患者中诱发耐受性的方法。通常，对一移植器官的外来抗原的完全免疫响应是造成器官排斥反应的原因。目前，移植患者使用免疫抑制药物环胞素通过关闭NFAT蛋白质的活性来防止排斥反应。然而，对环胞素的这一应用会防止NFAT蛋白质启动T细胞耐受性。因此，防止NFAT蛋白质与AP-1间的相互作用可诱发对移植器官的耐受性。
剔除动物本发明的再一方面提供了一种剔除动物，该动物包含一基因组，该基因组的内源NFAT活化受体基因中具有一杂合或纯合破坏，该破坏能够抑制或防止具有生物功能的NFAT活化受体蛋白质的表达。较佳地，本发明剔除动物的内源NFAT活化受体基因中具有一纯合破坏。较佳地，本发明剔除动物为一小鼠。使用业内人士所熟知的技术可易于制得此剔除动物。基因破坏可以若干方式完成，包括将一终止密码子引入多核苷酸编码序列的任何部分来导致一生物上无效的多肽、将一突变引入一启动子或其它调节序列来抑制或防止多肽表达、将一外源序列插入该基因以使该基因失活以及自该基因删除序列。
可采用若干技术将特异性DNA序列引入哺乳动物种系并达成该等序列(转基因)至每一后代的稳定传递。最常用的技术是直接将DNA显微注射于受精卵母细胞的原核中。衍生自该等卵母细胞的小鼠或其它动物将约有10％至20％的机率成为转基因建立者，该等转基因建立者经培育后将产生不同的转基因小鼠系。用于通过胚胎操作及显微注射来产生转基因动物(尤其为诸如小鼠等动物)的方法已为业内所熟知，例如，在美国专利第4,736,866、4,870,009及4,873,191以及Hogan，B.的Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)所阐述者。还可使用类似的方法产生其它转基因动物。
胚胎干细胞(“ES细胞”)技术可用于产生具有特别删除基因的剔除小鼠(及其它动物)。全能胚胎干细胞(其可于体内培养并进行基因修饰)可与小鼠胚胎聚结或可显微注射于小鼠胚胎中以产生一嵌合小鼠，该小鼠可将此基因修饰传递至其后代。因此，可通过定向培育获得一缺乏此基因的小鼠。亦可采用若干其它方法来产生经过基因修饰的动物，例如，可采用卵泡浆内单精子注射技术(ICSI)来产生转基因小鼠。该方法要求将精母细胞的头部显微注射于一未受精卵母细胞的细胞质中、使该卵母细胞受精并随后激活一预先植入胚胎的适宜细胞内分区。将如此获得的此等小鼠胚胎转移至一假孕受体母体中。该母体将生出各种不同的小鼠。在用来产生转基因小鼠的ICSI方法中，将一精子或精母细胞头部悬浮液与一含期望DNA分子(转基因)的溶液一起培养。该等将与该精子相互作用，该精子在经显微注射后可作为外来DNA的一载剂媒剂。当存在于卵母细胞内部后，该DNA被整合于基因组中，从而可产生一转基因小鼠。与当前使用传统原核显微注射方案所获得的转基因小鼠产率相比，利用该方法可获得更高的转基因小鼠产率(80％以上)。
实例本发明可由其较佳实施例的下述实例来进一步阐释，但应了解，除非另有说明，否则加入这些实例仅用于阐释目的而非意欲限制本发明的范围。
实例1NFAT活化受体基因的鉴别在非冗余人类蛋白质数据库IPI(International Protein Index)中搜索含有1)免疫球蛋白(Ig)结构域、(2)免疫受体酪氨酸基活化基元(ITAM)及3)跨膜区域的新颖分子。它们为许多调节免疫系统功能的信号活化受体(包括TCR、BCR、FcεRI等组份)及许多其它最近鉴识别的活化受体所共有的常见特征(Isakov 1997 “ITMs and ITAMs”Immunologic Research 1685)。使用一基于隐马尔科夫模型(Hidden Markov Model)(HMM)的方法来搜索Ig-结构域。HMM自一113个置信Ig结构域的比对构建且使用程序HMMER校准，其自Pfam(6.6版)数据库获得。为搜索含ITAM基元的蛋白质，首先根据ITAM基元的常见特征构建一PROSITES格式化基元曲线，使用软件“seedtop”(NCBI)进行搜索。使用软件TMHMM2.0版(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)实施所有该等IPI蛋白质的大规模跨膜区域预测。结果发现，标记为“IPI00086590”的推测蛋白质序列符合这三种准则中的每一个。使用电子(in silico)克隆程序来衍生SEQ ID NO2中所示的其全长cDNA序列。
实例2NFAT活化受体基因表达的定量实时PCR分析将具有序列正5’TCCTGCTCTTTGGCTTCACC及反5’GCCGTGCCCACTACACTCA的寡核苷酸引物使用Primer Express 2.0(Applied Biosys tems公司)自NFAT活化受体核苷酸序列中选出，合成并用于PCR反应中来实时监控NFAT活化受体多核苷酸的表达。分离出RNA以测量NFAT活化受体多核苷酸在下列组织及细胞中的表达水平脑；心脏；肾脏；肝脏；肺、脾脏、单核细胞、Daudi(一Burkitt氏淋巴瘤细胞系)；HPB-ALL(一T细胞白血病细胞系)；THP-1(急性单核细胞性白血病细胞系)；淋巴细胞；Jurkat(一T细胞白血病细胞系)；HMC-1(一肥大细胞系)；HUVAC；原人类血管内皮细胞；嗜中性粒细胞；PBMC、周边血液单核细胞；及四批不同的自体外培育脐血获得的肥大细胞试样。
实时定量PCR分析根据制造商的说明书使用Taqman试剂利用ABI Prism7900(Applied Biosystems公司)序列检测系统实施。在反应中使用等量的自上述细胞源获得的第一链cDNA作为PCR模板来获得阈值循环(Ct)，使用18RNA的已知Ct将该Ct标准化，获得ΔCt。为比较NFAT活化受体多核苷酸在不同细胞系中的相对基因表达水平，使用最低表达水平作为基数来计算ΔΔCt值，然后将ΔΔCt转换成真实倍数表达差值。结果示于表1中。
表1
参照表1，数据显示，NFAT活化受体mRNA在嗜中性粒细胞、原单核细胞及单核细胞性细胞系、淋巴细胞及体外培育肥大细胞在均高度表达。在脾脏及肺组织中检测到表达。相反，在所有其它组织及细胞(脑，心脏；肾脏，肝脏，Daudi，HPB-ALL，Jurkat，HUVAC)中的表达水平极低。
实例3NFAT活化受体的分析克隆及定性使用分7别涵盖起始蛋氨酸密码子(5’-CACCATGGAG从CCAGCCTG)及终止密码子(5’-ACCTGGTCTATG从AATCTC)的两种寡引物通过RP-PCR自人类单核细胞克隆NFAT活化受体cDNA。将两种cDNA纯系分离并测序，结果发现与SEQ ID NO1中所示的自电子克隆获得的编码区域序列完全相同。自电子克隆获得的序列极有可能代表NFAT活化受体多核苷酸的完整编码区域，因为它含有一完整的Kozak基元且具有数个位于预测起始蛋氨酸之前的框内终止密码子。另外，它具有一自假定起始蛋氨酸开始的推定信号肽。
据预测，NFAT活化受体为具有270个氨基酸的I型跨膜蛋白质，其具有一约30kD的计算分子量，且具有一在N末端的推定信号肽(氨基酸1-42)、在细胞外区域内的一Ig-结构域(氨基酸43-150)、一跨膜结构域(氨基酸164-186)及在细胞质区域内的一ITAM基元(氨基酸220-235)。其位于cDNA的染色体22q13.2比对处，基因组序列显示，NFAT活化受体多核苷酸的编码区域包含6个外显子。在细胞外区域(氨基酸107-110)发现一潜在N-糖基化位点。基于相应EST文库源的分布的“电子北方墨点分析(Electronic northern)”表明，NFAT活化受体优先在白细胞中表达。基于网络的SCANSITE设计用于搜索极有可能由特定蛋白磷酸酶磷酸化或与结构域结合的蛋白质内基元(http://scansite.mit.edu/)，使用其预测出NFAT活化受体在细胞质区域含有一针对Lck(淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶，一种在信号转导中极常见的活化接头分子)的SH2-结构域的结合位点。
实例4NFAT活化受体的表达为测定NFAT活化受体基因产物，将表达NFAT活化受体的多核苷酸的编码区域进一步克隆至一pcDNA3.1哺乳动物表达载体(INVITROGEN，CA)中(其中一融合于框内的V5标签插入C端或N端)，然后用Lipofectamine 2000瞬时转染至293T细胞中。整个蛋白质试样通过以下制备将8×105细胞重新悬浮在100μl ddH2O中，在加入等量2X试样加样缓冲液后将其在98℃下加热5分钟。将蛋白质在15％SDS-PAGE中分离并转移至膜上。使用抗V5单克隆抗体通过点蛋白質印跡分析检测到经标记NFAT活化受体为一约35kD的主要蛋白质带及一约30kD的次要带。仅用质粒载体转染的细胞中不存在这些蛋白质带。
实例5NFAT活化受体的细胞移位为确定NFAT活化受体是否在膜表面表达，用其C端具有一V5标签的NFAT活化受体构筑体转染293T细胞，通过冷冻-解冻方法溶解这些细胞。将细胞悬浮在1X溶胞缓冲液中并冷冻-解冻3次。通过在一微离心机中以最大速度离心将不溶的膜部分与溶解的蛋白质分离。将蛋白质在15％SDS-PAGE中分离。通过抗V5单克隆抗体检测到NFAT活化受体主要存在于膜部分中。在溶解的部分中几乎检测不到。
然后实施免疫荧光染色来确定NFAT活化受体在膜中的位置及取向。NFAT活化受体或者在N端或者在C端与V5标签融合并转染到293T细胞中。洗涤细胞并将其于40℃在含1％BSA且不含酶的细胞离解缓冲液(Invitrogen)中预培养30分钟。然后将细胞在相同缓冲液中用FITC共轭抗V5单克隆抗体(10μg/ml)(Invitrogen)培育30分钟。洗涤3次后，将细胞重新悬浮在1XPBS(用/未用1％低聚甲醛固定)中并用荧光显微术(ZEISS Axioskop，Germany)分析。结果发现，通过抗V5单克隆抗体检测到N端标记NFAT活化受体存在于活(未固定)及甲醇固定细胞二者的膜上，而C端标记NFAT活化受体仅存在于甲醇固定细胞的膜上。这些结果显示，NFAT活化受体为N端暴露于细胞膜外的跨膜蛋白质。
实例6NFAT活化受体的NFAT活化已知一免疫响应的活化或抑制的第一级调节是在受体位点处发生并涉及位于受体亚单位的细胞质区域的蛋白质分子。最近的研究识别出两种类型的模组，ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基元)及ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基元)。它们具有保守酪氨酸残基，在受体连接时经受快速但瞬时的磷酸化反应，并活化或终止信号转导路径(Isakov 1998“ITAMsimmunoregulatoryscaffolds that link immunoreceptors to their intrace llular signalingpathways”Receptors Channels 5243)。经常发现免疫球蛋白(Ig)结构域参与配体-受体交互作用。在膜蛋白NFAT活化受体中同时存在Ig结构域和ITAM基元以及在免疫组织及细胞中的优先表达明显表明，NFAT活化受体在免疫系统中起活化受体的作用。
通过在HMC-1(一人类肥大细胞系)进行荧光素酶报道基因分析已测试出，三种常见转录因子(NFAT、NF-κB及AP-1)为NFAT受体信号路径的潜在下游靶，其中通过实时PCR分析发现NFAT活化受体受到适度表达。典型荧光素酶分析如下实施将HMC-1以每毫升培养基0.2×106个细胞的密度种在一24孔培养板中。荧光素酶(启动子区域含有NFAT、AP-1或NF-κB结合位点)、NFAT活化受体表达质粒及pRL-SV40这三种质粒共转染于HMC-1细胞中。在转染后40至46小时收集细胞并溶解在被动溶胞缓冲液(Promega公司)中。用双荧光素酶分析套组(Promega公司)通过TD-20光度计(Turner Design)分析萤火虫和Renila荧光素酶活性。结果示于表2至7中。
表2NFAT-荧光素酶报道基因分析质粒 相对荧光素活性仅载体 1.0V5-353 79.8V5-353Y1A 0.6V5-353Y2A 1.6V5-353Y12A 0.8表3NF-κB-荧光素酶报道基因分析质粒 相对荧光素酶活性仅载体 1.0V5-353 1.0V5-353Y1A0.7V5-353Y2A0.3V5-353Y12A 0.3MEKK3233.0表4AP-1-荧光素酶报道基因分析质粒 相对荧光素酶活性仅载体 1.0V5-353 1.5V5-353Y1A 1.1V5-353Y2A 1.6V5-353Y12A 1.4MEKK3 200.0表5IL-13-荧光素酶报道基因分析质粒 相对荧光素酶活性仅载体 1.0V5-353 19.2V5-353Y1A 1.3V5-353Y2A 1.5V5-353Y12A 1.3表6TNF-α-荧光素酶报道基因分析质粒 相对荧光素酶活性仅载体 1.0V5-353 5.1V5-353Y1A1.3V5-353Y2A1.5V5-353Y12A 1.2表7CsA对NFAT的抑制-荧光素酶报道基因分析抑制剂CsA的浓度(μM) 相对荧光素酶活性0.0 31.70.5 8.41.0 6.42.0 7.54.0 5.58.0 4.8参照表2至7，数据表明，NFAT活化受体V5-353的超表达以约80倍活化NFAT(表2)，但不活化NF-κB(表3)或AP-1(表4)。将仅载体的转染用作负对照；负对照不活化这三种转录因子中的任一种(表2、3和4)。在为NF-κB及AP-1的情况下，将MEKK 3用自正对照，已知MEKK3能够活化NF-κB及AP-1(表3和4)。
为证实所分离出的多核苷酸为一NFAT活化受体，实施另外两个实验1)NFAT活化受体的超表达对NFAT调节基因(IL-13及TNF-α)的转录的作用，及2)一习知钙/NFAT信号路径抑制剂对NFAT活化受体介导的NFAT活化的作用。之所以选择IL-13及TNF-α，是因为二者在免疫系统中起关键作用。将IL13或TNF-α的启动子区域(含NFAT结合位点)插入不含启动子的荧光素酶报道基因质粒载体(DB Bioscience Clontech)中，然后将该载体共转染入HMC-1中。结果发现，与仅载体的对照相比，NFAT活化受体的超表达可有效地将IL-13及TNF-α的转录分别上调约19和5倍(表5和6)。此外，一已知NFAT抑制剂环胞素A(CsA)可显著降低NFAT活化受体的刺激活性(表7)。概言之，这些数据表明，NFAT活化受体的超表达可活化NFAT。
实例7NFAT活化受体的NFAT活化作用通过ITAM基元介导已通过对不同受体亚单位的结构-功能分析鉴别出不同抗原和Fc受体的胞质尾区中的ITAM。这些受体以酪氨酸磷酸化依赖性方式运作并利用Syk/ZAP-70PTK来转导活化信号(Cambier 1995 “Antigen and Fc receptor signaling”J Immunol 1553281)。据显示，本发明的NFAT活化受体起一活化受体作用，其具有一在胞质尾区的预测ITAM基元(氨基酸220-235)。为确定该推定ITAM基元是否介导信号转导，我们通过将ITAM基元中的两种酪氨酸(Y220和Y231，分别指定为Y1和Y2)单独或组合突变成一丙氨酸来产生三种NFAT活化受体突变体(Y1A、Y2A及双突变体Y12A)。所有突变均由PCR定向诱变产生。所用引物序列如下Y1A 正5′-AGAATCTGTCGCCACAGCTCTG反5′-GCAGAGCTGTGGCGACAGATTCTGY2A 正-AGACCGAGGTCGCTGCCTGCATCG反5′-CGATGCAGGCAGCGACCTCGGTC然后将突变cDNA单个地进一步克隆至pCDNA表达载体(Invitrogen)中。然后实施类似的荧光素酶报道基因分析，以测定每一酪氨酸至丙氨酸突变体的超表达对NFAT的活化及NFAT调节基因(IL-13及TNF-α)的转录的作用。结果发现，三种突变体中每一个突变体的NFAT活化活性均实质被去除，所获得的荧光素酶报道基因信号与仅载体的对照相当(表2、4和5)。这些结果表明，NFAT活化受体的活化信号经由ITAM基元。
本说明书中揭示本发明的典型较佳实施例，尽管采用了特定术语，但这些术语仅以普通及描述意义使用而非用于限制本发明。本发明的范围列于随附权利要求书中。显然，借助于上述教示内容可对本发明实施多种修改及改变。因此，应理解，可在随附权利要求书的范围内以不同于所描述具体内容的方式实施本发明。
序列表<110>唐纳士公司<120>活化T细胞核因子受体<130>Case 1001<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>810<212>DNA<213>人<400>1atggagaacc agcctgtgag gtggcgggcc ctgccaggcc tcccacgccc tcctgggctc 60cccgcagccc cctggctcct ccttggcgtg ctgctgctgc ccgggaccct gcgactggca 120ggaggacagt cagtgaccca caccggcctg cccatcatgg cctccctggc caacacagct 180atctccttca gctgcaggat cacctatcca tacactcccc aattcaaggt tttcacagtc 240agctactttc atgaagatct ccagggacag aggagcccta agaagccaac aaactgccac 300cctggactgg gcacagagaa ccagagccac accctggact gccaggtcac ccttgtgctg 360ccgggagcat cggccactgg cacctactac tgctctgtcc actggccaca ctccacggtg 420agaggcagcg gcaccttcat cctggtcaga gacgcagggt accgagagcc cccgcagagt 480ccacagaagc tcctgctctt tggcttcacc ggcctcctga gtgtcctgag tgtagtgggc 540acggccctgc tgctctggaa caagaagcgg atgcggggtc cagggaagga ccccaccagg 600aagtgcccag atccaagatc tgccagcagc cccaagcagc atccttcaga atctgtctac 660acagctctgc agcgccgcga gaccgaggtc tatgcctgca tcgagaatga ggatggcagc 720tcacccaccg ccaagcagag ccccctctcc caggagagac cgcatagatt cgaagatgat 780ggcgaactta acctggtcta tgaaaatctc 810<210>2<211>270<212>PRT<213>人<220>
<221>细胞外Ig-结构域<222>{43}..(150)<223>
<400>2Met Glu Asn Gln Pro Val Arg Trp Arg Ala Leu Pro Gly Leu Pro Arg1 5 10 15Pro Pro Gly Leu Pro Ala Ala Pro Trp Leu Leu Leu Gly Val Leu Leu20 25 30Leu Pro Gly Thr Leu Arg Leu Ala Gly Gly Gln Ser Val Thr His Thr
35 40 45Gly Leu Pro Ile Met Ala Ser Leu Ala Asn Thr Ala Ile Ser Phe Ser50 55 60Cys Arg Ile Thr Tyr Pro Tyr Thr Pro Gln Phe Lys Val Phe Thr Val65 70 75 80Ser Tyr Phe His Glu AsP Leu Gln Gly Gln Arg Ser Pro Lys Lys Pro85 90 95Thr Asn Cys His Pro Gly Leu Gly Thr Glu Asn Gln Ser His Thr Leu100 105 110Asp Cys Gln Val Thr Leu Val Leu Pro Gly Ala Ser Ala Thr Gly Thr115 120 125Tyr Tyr Cys Ser Val His Trp Pro His Ser Thr Val Arg Gly Ser Gly130 135 140Thr Phe Ile Leu Val Arg Asp Ala Gly Tyr Arg Glu Pro Pro Gln Ser145 150 155 160Pro Gln Lys Leu Leu Leu Phe Gly Phe Thr Gly Leu Leu Ser Val Leu165 170 175Ser Va1 Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Trp Asn Lys Lys Arg Met Arg180 185 190Gly Pro Gly Lys Asp Pro Thr Arg Lys Cys Pro Asp Pro Arg Ser Ala195 200 205Ser Ser Pro Lys Gln His Pro Ser Glu Ser Val Tyr Thr Ala Leu Gln210 215 220Arg Arg Glu Thr Glu Val Tyr Ala Cys Ile Glu Asn Glu Asp Gly Ser225 230 235 240Ser Pro Thr Ala Lys Gln Ser Pro Leu Ser Gln Glu Arg Pro His Arg245 250 255Phe Glu Asp Asp Gly Glu Leu Asn Leu Val Tyr Glu Asn Leu260 265 270
权利要求
1.一种纯化多肽，其包含一选自由下述组成之群的氨基酸序列SEQ ID NO2；SEQ ID NO2的一变型体；SEQ ID NO2的一片段；一氨基酸序列，所述氨基酸序列由一经分离的多核苷酸编码，其中该多核苷酸包含一选自由下述组成之群的核苷酸序列SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的一变型体；及SEQ ID NO1的一片段。
2.如权利要求1所述的纯化多肽，其中所述多肽是一种激动剂或拮抗剂，其能够特异性结合于NFAT活化受体上并抑制或激活该等受体的表达或作用。
3.如权利要求2所述的纯化多肽，其中所述多肽是一种拮抗剂，其选自由可溶形式的NFAT活化受体及衍生自NFAT活化受体的细胞外结构域且能够结合于所述NFAT活化受体的可溶性多肽组成之群。
4.如权利要求3所述的纯化多肽，其包含一氨基酸序列，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO2的氨基酸43至150或其拮抗剂片段组成之群。
5.如权利要求2所述的纯化多肽，其中所述拮抗剂是一种抗体。
6.如权利要求5所述的纯化多肽，其中所述抗体选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、双特异性抗体及杂共轭抗体组成之群。
7.如权利要求5所述的纯化多肽，其中所述抗体是一种单克隆抗体。
8.一种经分离的多核苷酸，其包含一选自由下列组成之群的核苷酸序列SEQ ID NO1；SEQ ID NO1的一变型体；SEQ ID NO1的一片段；一核苷酸序列，所述核苷酸序列编码一具有选自由下述组成之群的氨基酸序列之多肽SEQ ID NO2；SEQ ID NO2的一变型体；SEQ ID NO2的一片段。
9.如权利要求8所述的经分离多核苷酸，其包含一核苷酸序列，所述核苷酸序列编码一多肽，所述多肽具有一选自由SEQ ID NO2的氨基酸43至150或其拮抗剂片段组成之群的氨基酸序列。
10.一种包含如权利要求8所述的核苷酸序列之表达载体。
11.一种经分离的宿主细胞，所述宿主细胞选自由一包含如权利要求10所述的表达载体之宿主细胞、一包含如权利要求8所述的核苷酸序列之宿主细胞以及一包含如权利要求9所述的核苷酸序列之宿主细胞组成之群。
12.一种用于鉴别NFAT活化受体激动剂及拮抗剂的筛选方法，所述方法包括将一NFAT活化受体暴露于一潜在的NFAT激动剂/NFAT拮抗剂；及确定所述潜在的激动剂/拮抗剂是否结合于所述受体。
13.一种在将药物投与一动物以治疗预期症状时用来确定该等药物是否可能引起与降低或增加细胞因子及细胞受体产生相关的不期望副作用之筛选方法，所述方法包括将NFAT活化受体暴露于一药物；及确定所述药物是否结合于所述受体或通过使细胞因子的生成发生变化来模拟所述受体配体的生物功能。
14.一种通过干扰一DNA或RNA多核苷酸的转录或转译来阻断或调节细胞内NFAT活化受体表达的方法，其中所述DNA或RNA多核苷酸能够编码所述NFAT活化受体，所述方法包括将一能够表达一NFAT活化受体的细胞暴露于一分子，所述分子能够干扰一编码所述NFAT活化受体的DNA或RNA多核苷酸之转录或转译。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述分子选自由能够干扰一编码所述NFAT活化受体的DNA或RNA多核苷酸之正确转录或转译的反义核苷酸、RNAi核苷酸及核酶组成之群。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述分子是一能够干扰一编码所述NFAT活化受体的DNA或RNA多核苷酸之正确转录或转译的反义核苷酸。
17.一种用于诊断一患者是否具有形成由未经调节的细胞因子表达造成的疾病之倾向，所述方法包括收集一细胞、组织或体液样品，已知所述样品中包含少量(如果有)来自一患者的NFAT活化受体；分析所述组织或体液，以确定所述组织中是否存在NFAT活化受体；及根据所述组织或体液中是否存在NFAT活化受体来预测所述患者是否具有患某些免疫疾病之倾向。
18.一种用于诊断一患者是否具有形成由未经调节的细胞因子表达造成的疾病之倾向，所述方法包括收集一细胞、组织或体液样品，已知所述样品中包含一定义量来自一患者的NFAT活化受体；分析所述组织或体液，以确定所述组织中存在的NFAT活化受体量；及根据所述组织或体液中的NFAT活化受体相对于为正常细胞、组织或体液所建立的一定义量或测试量之变化量来预测所述患者是否具有患某些免疫疾病之倾向。
19.一种用于预防或治疗一哺乳动物中由NFAT蛋白质介导的疾病之方法，所述方法包括将一疾病预防或治疗量的NFAT活化受体激动剂或拮抗剂投予所述哺乳动物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述NFAT活化受体激动剂或拮抗剂是一抗体。
21.一种用于产生一结合于NFAT活化受体的抗体之方法，所述方法包括一种选自由下列组成之群的方法使用经分离的NFAT活化受体或其抗原片段作为一抗原；及使用能够表达重组NFAT活化受体的宿主细胞作为一抗原；及使用DNA表达载体作为一抗原来产生抗体，其中所述DNA表达载体包含表达所述受体的受体基因。
22.一种使用如权利要求21所述的方法产生的抗体。
23.如权利要求22所述的抗体，所述抗体选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、双特异性抗体及杂共轭抗体组成之群。
24.一种用于检测表达于特定细胞、组织或体液中的NFAT活化受体之诊断方法，所述方法包括将细胞、组织或体液或其成份暴露于如权利要求22所述的抗体；及测定所述细胞、组织或体液或其成份是否结合于所述抗体。
25.一种自重组细胞培养物、杂质及天然环境中分离及纯化NFAT活化受体的方法，所述方法包括将一包含NFAT活化受体及杂质的组合物暴露于一能够结合于所述受体的抗体；使所述NFAT活化受体结合于所述抗体；自所述杂质中分离所述抗体-受体复合物；及自所述复合物回收所述NFAT活化受体。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述抗体是一种如权利要求22所述的抗体。
27.一种用于在一可能经历一不期望免疫响应的哺乳动物中引发耐受性的方法，所述方法包括以足以抑制NFAT蛋白质移位于细胞核中并抑制其随后与转录因子活化蛋白1相互作用的量将一NFAT活化受体拮抗剂施于一患者。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述拮抗剂是一种抗体，所述抗体能够结合于一NFAT活化受体并能防止NFAT蛋白质移位至细胞核中以及与AP-1的相互作用。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述抗体是一种如权利要求22所述的抗体。
30.一种转基因剔除动物，在所述动物基因组的内源NFAT活化受体基因中包含一杂合或纯合破坏，所述破坏能够抑制或防止具有生物功能的NFAT活化受体蛋白质之表达。
全文摘要
本发明涉及新颖的活化T细胞核因子(“NFAT”)活化受体，该受体用于产生激动剂和拮抗剂抗体，以调节细胞因子及细胞受体在细胞内的产生及表达。该受体是一种含有270个氨基酸的I型跨膜蛋白质，其计算分子质量约为30kD。该受体具有一在N末端的推定信号肽(氨基酸1－42)、在细胞外区域内的Ig－结构域(氨基酸43－150)、一预测跨膜结构域(氨基酸164－186)及在细胞质区域内的预测ITAM部分(氨基酸220－235)。该受体可活化NFAT、IL－13及TNFα启动子报道基因活性。
文档编号C07K14/435GK1688601SQ03822133
公开日2005年10月26日 申请日期2003年9月19日 优先权日2002年9月19日
发明者姚正彬, 胡光辉, 李康, 杨建华 申请人:唐纳士公司