用于治疗因黄病毒科病毒感染的组合物的制作方法

文档序号:3553859阅读:300来源:国知局
专利名称:用于治疗因黄病毒科病毒感染的组合物的制作方法
技术领域
本发明是关于在哺乳动物中治疗黄病毒科病毒感染的化合物、组合物、用途及方法。更具体地,本发明是关于用途及治疗方法,其包括给予选自大环肽化合物属的化合物。
现有技术病毒的黄病毒科是有包膜正链RNA病毒,它包括多种人类致病病毒,譬如肝类病毒属的病毒,包括C型肝炎,黄热病毒属的病毒,包括登革热病毒、脑炎病毒、西尼罗河脑炎(West Nile)病毒及黄热病病毒,及粘膜疾病病毒属的病毒,包括牛病毒腹泻病毒与边缘疾病(border disease)病毒,这两种均为动物病原。最新发现的病毒,G型肝炎病毒(HGV)与GB型肝炎病毒(GBV-A,B,C),也暂时地被认为是黄病毒科的成员,归属于不同的属。
登革热病毒,黄病毒科的成员,通过蚊子传染。有四种会造成广范围人类疾病的血清型,其中一种会引起登革热出血热,而生活在世界的热带与亚热带区域中的约有40%人口,处于有感染的危险。每年1百万例出血热病中,约5%是为致死的。目前没有有效的疫苗或抗病毒的药物以防止登革热疾病。
粘膜疾病病毒,譬如牛腹泻病毒(BVDV)、经典猪热病毒(CSFV)及边缘疾病病毒(BDV),包括感染牛、猪及绵羊的经济上重要动物病原群。这些正感RNA病毒在黄病毒科中分类为单独属。
GB-病毒已分类为黄病毒科的成员,但尚未基于基因组序列分析而被指定为特定属。这些RNA病毒,除了会感染人类以外,可在实验上受感染的狨(tamarins)中造成急性可分离的肝炎。
在黄病毒科内的病毒具有许多类似性,而不管在其成员中的相对较低整体序列的类同性。这些病毒的基因组是小的单股RNA(≈10千基长度)具有单一开放解读译码(ORF)。ORF编码一种约3000个氨基酸的多蛋白,该多蛋白在其5′末端含有结构蛋白质,及在其3′末端有非结构(NS)蛋白质。多蛋白是通过病毒与宿主编码的蛋白酶以蛋白分解方式处理成为成熟多肽,对HCV是如下NH2-{C-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B}-COOH。核蛋白或核壳(C)及两种包膜糖蛋白(E1与E2)是表示病毒体的构成的结构蛋白。这些结构蛋白是接着非结构性(NS)蛋白,其至少部分是被认为是病毒RNA复制所必须的。
酶活性已被归因于多种这些NS蛋白。特别是,NS3蛋白含有类似于粘膜疾病病毒与黄病毒的丝氨酸蛋白酶与核苷三磷酸结合的蜗牛酶的序列。序列排列的分析已预测类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶区存在于黄-、粘膜疾病-、肝-及GB-病毒的N-末端区域内。在黄病毒科病毒的NS3蛋白分解区间的序列类似性,经良好确认(Ryan MD等人,1998)。HCV NS3蛋白酶区在HCV基因型中是共有序列类似性为约77-90%,并与黄病毒科的其他成员的序列类似性为约25-50%,关于三维结构,各种结晶的HCV与登革热NS3蛋白酶的可用原子配位,显示整体结构,其特征是类胰蛋白酶折叠(Kim等人,1996,Love等人,1996;Murthy等人,1999)。许多研究现已坚定地确认NS3区的N-末端部分编码丝氨酸蛋白酶,其在黄病毒科病毒内的多蛋白处理中具有极专一并起关键的作用。在肝炎病毒、粘膜疾病病毒及GB病毒中,多蛋白处理显示需要下游NS4A蛋白质。NS4A蛋白质充作加强NS3蛋白酶分裂效率的辅因子(Lin等人,1995;Kim等人,1996;Steinkuler等人,1996)。在黄病毒中,对于加强NS3蛋白酶活性的必要条件,是通过上游NS2B蛋白质提供。GBV-B与HCV的基因组织与结构是相似的,而不管在GBV-B与HCV的多蛋白序列间的顺序类同性为约25至30%的事实。
在黄病毒科病毒内的病毒的表观类似性下,一般期望发展有效抵抗黄病毒科病毒的治疗剂,而更具体地,是有效抵抗黄病毒科致病成员的治疗剂。

发明内容
因此,本发明的第一方面,是提供一种抗黄病毒科病毒的组合物,其包含结合式(I)化合物的药物上可接受的载体,
式(I)其中A是选自C1至C6烷基,与C3至C6环烷基;及B是选自苯基或噻唑基,这两者视情况被选自NH(R1)与NH(CO)R1的基团取代,其中R1为C1至C6烷基;R为OH或磺酰胺衍生物,或其药物上可接受的盐。
在第二方面,本发明提供一种治疗被黄病毒科病毒感染的哺乳动物的方法,其包括对该受感染的哺乳动物投予一种药物组合物,其包含结合治疗上有效量的如上文定义的式(I)化合物的药物上可接受的载体。
在第三方面,本发明提供一种治疗被黄病毒科病毒感染的哺乳动物的方法,其中一种药物组合物,包含结合治疗上有效量的如上文定义的式(I)化合物的药物上可接受的载体,与至少一种其他药剂,选自抗病毒剂、免疫调节剂、HCV抑制剂、HIV抑制剂、HAV抑制剂及HBV抑制剂;共同投予受感染的哺乳动物。
在第四方面,本发明是提供一种药物组合物,用于治疗或预防因黄病毒科病毒所引起的哺乳动物感染,其包含结合治疗有效量的式(I)化合物的药物上可接受的载体,及至少一种选自抗病毒剂、免疫调节剂、HCV抑制剂、HIV抑制剂、HAV抑制剂及HBV抑制剂的其他药剂。
在本发明的第五方面,提供如上文定义的式(I)化合物在制造用于治疗黄病毒科病毒感染的药剂的用途。
在本发明的第六方面,提供一种制造产品,其包含包装材料,在其中包含一种有效抑制黄病毒科病毒的组合物,且此包装材料包含标签,其指出该组合物可用于治疗因黄病毒科病毒的感染,且其中该组合物包含如上文定义的式(I)化合物。
虽然不希望被任何特定作用模式所束缚,但一般认为上文所提出的式(I)所表示的大环肽化合物族群,在NS3蛋白酶区中的保持基质结合位点处相互作用。晶体结构研究确认本发明大环化合物是在HCV NS3区内的基质结合位点处相互作用,其是在黄病毒科病毒中功能性保持的一个区。
本发明的其他目的、优点及特征,在阅读下述优选实施方案的非限制性描述,并参考附图与其中的后,将更为明了,其中表的简述表4-8是提供黄热病毒科成员间的序列类似性比较。
附图简述

图1提供属于黄病毒科的病毒的多蛋白比较(取自Ryan等人,1998,J.Gen.Virology,79,947-959);图2为在HCV基因型与亚型间的NS3蛋白酶区的序列比较;图3A-B为根据式(I)的大环肽化合物分别抵抗HCV基因型1a与1bNS3-NS4A蛋白酶的IC50曲线;图4A-B为图3的大环肽抵抗HCV基因型1a NS3-NS4A蛋白酶的Dixon与Cornish-Bowden图形;图5A-B为图3大环肽抵抗HCV基因型1b NS3-NS4A蛋白酶的Dixon与Cornish-Bowden图形;图6是说明通过根据式(I)的大环肽在在培养物的狨肝细胞中抑制GBV-B复制;图7是以图示说明通过图6的大环肽(III)抑制GBV-B复制的剂量依赖性;及图8说明与根据式(I)的大环肽络合的HCV NS3-NS4A肽结构的3-维晶体结构。
发明详述定义除非另有指出,否则本文中所使用的科学与技术术语及命名法,均具有和一般熟悉本发明有关技术者平常所明了的相同意义。一般,关于细胞培养、感染、分子生物学方法等程序,是本领域使用的一般方法。这种标准技术可参阅,例如Sambrook等人(1989)与Ausubel等人(1994)的参考手册。
“黄病毒科”一词,在本文中所用的是指称病毒族时,是包括肝炎病毒属的病毒,如C型肝炎,黄病毒属的病毒,如登革热病毒、脑炎病毒、西尼罗河脑炎病毒及黄热病病毒,而粘膜疾病毒属的病毒,如牛病毒腹泻病毒与边缘疾病病毒。G型肝炎病毒(HGV)与GB型肝炎病毒也包含在这种病毒属中,虽然这些病毒的种属尚未决定。再者,上述病毒的所有亚型与基因型,也包括在黄病毒科内,包括例如HCV 1a、HCV 1b、HCV 2a-c、HCV 3a-b、HCV 4a、HCV 5及HCV 6a,h,d&k以及GBV-A,B&C。
“哺乳动物”一词,当其在本文中使用时,包括容易被黄病毒科病毒感染的人类以及非人类哺乳动物,包括家畜动物,譬如乳牛、猪、马、狗与猫及绵羊。
关于在治疗黄病毒科感染中所给予的式(I)化合物,于本文中使用的“C1-6烷基”或“C1-C6”术语,无论是单独或与另一种取代基结合,是指含有一至六个碳原子的非环状、直链或支链烷基取代基,且包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔-丁基、己基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基。
于本文中使用的“C3-6环烷基”一词,无论是单独或与另一种取代基结合,是指含有三至六个碳原子的环烷基取代基,且包括环丙基、环丁基、环戊基及环己基。
“药物上可接受的盐”一词,是指式(I)化合物的盐,其在安全可靠的医学判断的范围内,是适用于与人类及低等动物的组织接触,而没有不适当的毒性、刺激性、过敏性应答等,伴随着合理利益/风险比,一般为水溶性或油溶性或可分散性,并对其所要的用途是有效的。这术语包括药物上可接受的酸加成盐,与药物上可接受的碱加成盐。适当盐的明细表可参阅例如S.M.Birge等人,J.Pharm.Sci.,1977,66,第1-19页。
“药物上可接受的酸加成盐”一词,是指保持自由态碱的生物有效性与性质的盐类,且其在生物学上或在其他方面没有不期望的,与无机酸及有机酸形成的盐,无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨磺酸、硝酸、磷酸等,而有机酸如醋酸、三氯醋酸、三氟醋酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、丁酸、樟脑酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、二葡萄糖酸、乙磺酸、谷氨酸、乙醇酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、甲酸、富马酸、2-羟基乙烷磺酸(羟乙磺酸)、乳酸、马来酸、羟基马来酸、苹果酸、丙二酸、苯乙醇酸、1,3,5-三甲苯磺酸、甲烷磺酸、萘磺酸、烟酸、2-萘磺酸、草酸、双羟萘酸、果胶酯酸、苯基醋酸、3-苯基丙酸、苦味酸、三甲基醋酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、对-甲苯磺酸、十一烷酸等。
“药学上可接受的碱加成盐”一词,是指保持自由态酸的生物有效性与性质的盐类,且其在生物学上或在其他方面没有不期望的,与无机碱类形成的盐,如氨或铵或金属阳离子如钠、钾、锂、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等的氢氧化物、碳酸盐或重碳酸盐。特佳的为铵、钾、钠、钙及镁盐。由药物上可接受的有机无毒碱衍生的盐,包括以下的盐,伯、仲及叔胺类、季胺化合物,经取代的胺,包括天然存在的经取代的胺类,环胺类及碱性离子交换树脂,譬如甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡碱、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基铵化合物、四乙基铵化合物、吡啶、N,N-二甲苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺、N,N′-二苄基乙二胺、聚胺树脂等。特佳的有机无毒碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡碱。
在本文中使用的“磺酰胺衍生物”一词,是指式-NHSO2-R2的磺酰胺基团,其中R2为-(C1-8)烷基、-(C3-7)环烷基或{-(C1-6)烷基-(C3-6)环烷基},其全部均视情况被卤基、氰基、硝基、O-(C1-6)烷基、酰氨基、氨基或苯基取代1至3次,或R2为C6或C10芳基,其是视情况可被卤基、氰基、硝基、(C1-6)烷基、O-(C1-6)烷基、酰氨基、氨基或苯基取代1至3次。
在本文中使用的“抗病毒剂”一词,是指一种药剂(化合物或生物产品),其有效抑制在哺乳动物中病毒的形成及/或复制。其包括在哺乳动物中干扰对病毒的形成及/或复制所必须的无论是宿主或病毒机制的药剂。抗病毒剂包括例如三唑核苷、金刚烷胺、VX-497(美利美波迪(merimepodib),Vertex药物)、VX-498(Vertex药物)、列弗维林(Levovirin)、维拉嘧啶(Viramidine)、西普连(Ceplene)(美可萨胺(Maxamine))、XTL-001及XTL-002(XTL生物药物)。
在本文中使用的“免疫调节剂”一词,是指有效提高或加强哺乳动物中免疫系统应答的药剂(化合物或生物制剂)。免疫调节剂包括例如I类干扰素(譬如α-、β-及ω干扰素,τ-干扰素、同感干扰素及脱唾液酸干扰素),II类干扰素(譬如γ-干扰素)及经PEG化(聚乙二醇化)的干扰素。
在本文中使用的“HCV NS3蛋白酶的抑制剂”一词,是指一种在哺乳动物中有效抑制HCV NS3蛋白酶功能的药剂(化合物或生物制剂)。HCV NS3蛋白酶的抑制剂包括例如在WO 99/07733、WO 99/07734、WO 00/09558、WO 00/09543或WO 00/59929、WO 03/064416、WO 03/064455、WO 03/064456中所述的化合物,及经确认为VX-950的Vertex预先发展的选择物。
在本文中使用的“HCV抑制剂”一词,是指一种在哺乳动物中有效抑制HCV的形成及/或复制的药剂(化合物或生物制剂)。其包括干扰对HIV在哺乳动物中形成及/或复制所必要的无论是宿主或病毒机制的药剂。HCV的抑制剂包括例如抑制选自以下标的的药剂NS3蛋白酶、NS3蜗牛酶、HCV聚合酶、NS2/3蛋白酶或IRES。HCV抑制剂的特殊实例包括ISIS-14803(ISIS医药)。
在本文中使用的“HCV聚合酶的抑制剂”一词,是指一种在哺乳动物中有效抑制HCV聚合酶功能的药剂(化合物或生物制剂)。其包括例如HCVNS5B聚合酶的抑制剂。HCV聚合酶的抑制剂包括非核苷类,例如在以下所述的化合物·WO 03/010140(Boehringer Ingelheim),·WO 03/010141(Boehringer Ingelheim),·WO 03/007945(Boehringer Ingelheim),-WO 02/100846A1与WO 02/100851 A2(均为Shire),-WO 01/85172 A1与WO 02/098424 A1(均为GSK),-WO 00/06529与WO 02/06246 A1(均为Merck),-WO 01/47883与WO 03/000254(均为日本烟草),及-EP 1256 628 A2(Agouron)。
再者,HCV聚合酶的其他抑制剂也包括核苷类似物,例如在以下所述的化合物-WO 01/90121 A2(Idenix),-WO 02/069903 A2(Biocryst医药公司),及-WO 02/057287 A2与WO 02/057425 A2(均为Merck/Isis)。
HCV聚合酶抑制剂的特殊实例包括JTK-002/003、JTK-109(日本烟草)及NM283(Idenix)。
在本文中使用的“HIV抑制剂”一词,是指一种有效抑制HIV在哺乳动物中形成及/或复制的药剂(化合物或生物制剂)。其包括干扰HIV在哺乳动物中对形成及/或复制所必要的无论是宿主或病毒机制的药剂。HIV抑制剂包括例如核苷抑制剂、非核苷抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂及整合酶抑制剂。
于本文中使用的“HAV抑制剂”一词,是指一种有效抑制HAV在哺乳动物中形成及/或复制的药剂(化合物或生物制剂)。其包括干扰对HAV在哺乳动物中形成及/或复制所必须的无论是宿主或病毒机制的药剂。HAV抑制剂包括A型肝炎疫苗,例如Havrix_(GlaxoSmithKline)、VAQTA_(Merck)及Avaxim_(Aventis Pasteur)。
在本文中使用的“HBV抑制剂”一词,是指一种有效抑制HBV在哺乳动物中形成及/或复制的药剂(化合物或生物制剂)。其包括干扰对HBV在哺乳动物中形成及/或复制所必要的无论是宿主或病毒机制的药剂。HAV抑制剂包括例如抑制HBV病毒DNA聚合酶或HBV疫苗的药剂。HBV抑制剂的特殊实例包括拉米五定(lamivudine)(Epivir-HBV_)、德福韦二叔戊酰氧甲酯(Adefovir Dipivoxil)、安替卡伐(Entcavir)、FTC(Coviracil_)、DAPD(DXG)、L-FMAU(Clevudine_)、AM365(Amrad)、Ldt(Telbivudine)、单缬胺-LdC(Valtorcitabine)、ACH-126,443(L-Fd4C)(Achillion)、MCC478(EliLilly)、拉西伐(Racivir)(RCV)、氟-L与D核苷、洛拔塔黄酮(Robustaflavone)、ICN2001-3(ICN)、Bam 205(Novelos)、XTL-001(XTL)、亚氨基-糖类(壬基-DNJ)(Synergy)、HepBzyme;及免疫调节剂产物,譬如干扰素α2b、HE2000(Hollis-Eden)、舍拉迪根(Theradigm)(Epimmune)、EHT899(EnzoBiochem)、胸腺素α-1(Zadaxin_)、HBV DNA疫苗(PowderJect)、HBV DNA疫苗(Jefferon中心)、HBV抗原(OraGen)、BayHep B_(Bayer)、Nabi-HB_(Nabi)及抗B型肝炎(Cangene);及HBV疫苗产物,譬如下列Engerix B、RecombivaxHB、GenHevac B、Hepacare、Bio-HepB、TwinRix、Comvax、Hexavac。
在本文中使用的“I类干扰素”一词,是指一种选自全部结合至受体I型的干扰素组的千扰素。其包括天然与合成方式生产的I类干扰素。I类干扰素的实例包括α-、β-、δ-、ω干扰素、τ-干扰素、同感干扰素、非唾液酸干扰素。
在本文中使用的“II类干扰素”一词,是指一种选自全部结合至受体II型的干扰素组的干扰素。II类干扰素的实例包括γ-干扰素。
再者,“治疗上有效量”一词,是当其以式I化合物在本文中使用时,是指有效治疗黄病毒科病毒感染的化合物的量,即抑制或至少减少病毒复制,而不是对被治疗哺乳动物具有有毒的量,或在其他方面在哺乳动物中具有造成显著不利作用的量。
“载体”一词是指用于结合本发明治疗化合物的化合物或化合物的混合物,其有助于其投药及/或加强治疗化合物抑制黄病毒科病毒的功能,包括例如稀释剂、赋形剂、佐剂及媒剂。稳定剂、着色剂、调味剂、抗微生物剂等,也可与治疗化合物结合。再者,在一些情况下,制剂的pH值可以用药物上可接受的酸、碱或缓冲剂进行调整,以提高配制化合物或其输送形式的稳定性。其他适当添加剂包括熟识本领域技术中用以改良本发明组合物的特征,而对其功能没有不利影响的。关于适合与本发明治疗化合物混合的载体可参考“Remington氏医药科学”,第17版,Mack出版公司,Easton Penn.,1985。“药学上可接受”一词,是当其在本文中以载体化合物使用时,表示该载体适于投予哺乳动物,即当以适当作为载体的量使用时为无毒性,且不会引起任何不利的作用。
优选实施方案抗黄病毒科病毒组合物在本发明的第一个实施方案中,是提供一种有效治疗被黄病毒科病毒感染的哺乳动物的组合物。这组合物包含结合使用式(I)化合物的药物上可接受的载体 式(I)其中
A是选自C1至C6烷基,与C3至C6环烷基;及B是选自苯基或噻唑基,这两者视情况可被选自NH(R1)与NH(CO)R1的基团取代,其中R1为C1至C6烷基;R为OH或磺酰胺衍生物,或其药学上可接受的盐。
在一实施方案中,式(I)的A为支链的C4至C6烷基或C4至C6环烷基。在一项优选的实施方案中,A为环戊基或叔-丁基。
在另一项实施方案中,式(I)的B为在2位被NH(R1)或NH(CO)R1取代的苯基或噻唑,其中R1为C1至C4烷基。在一优选的实施方案中,B为在2位被NH(R1)或NH(CO)R1取代的噻唑,其中R1为C1至C4烷基。更优选的B为于2位被NH(CO)CH3或被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑。
在再一个优选实施方案中,式(I)的R是OH或式-NHSO2-R2的磺酰胺基,其中R2是-(C1-6)烷基、-(C3-6)环烷基。两者任选地可被卤素或苯基取代1或2次,或R2是视情况可被卤素或(C1-6)烷基取代1或2次。更优选地,R是OH或磺酰胺基,其中R2是甲基、环丙基或苯基。
在一更优选的实施方案中,本发明是以式(I)化合物进行,其中A为叔-丁基,且B为苯基,如下式(II)化合物所示 在另一更佳的实施方案中,本发明是以式(I)化合物进行,其中A为叔-丁基,且B为在其2位上被NH(CO)CH3取代的4-噻唑,如下式(III)化合物所示
在一项最佳实施方案中,本发明是以式(I)化合物进行,其中A为环戊基,且B为在其2位上被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑,如下式(IV)化合物所示 在最佳的实施方案中,本发明是以式(I)化合物进行,其中A是环戊基,且B是在其2位上被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑,且R是磺酰氨基,其中R2是苯基,如下式(VI)化合物所示 在最佳的实施方案中,本发明是以式(I)化合物进行,其中A是环戊基,B是在其2位上被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑,且R是磺酰氨基,其中R2是甲基,如下式(VII)化合物所示
在最佳的实施方案中,本发明是以式(I)化合物进行,其中A是环戊基,B是在其2位上被NHCH(CH3)2取代的4-噻唑,且R是磺酰氨基,其中R2是环丙基,如下式(VIII)化合物所示 治疗方法在本发明的第二方面,是提供一种用于治疗被黄病毒科病毒感染的哺乳动物的方法,其包括对受感染的哺乳动物给予一种药物组合物,其包含结合使用治疗上有效量的具有如上文定义的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物的药学上可接受的载体。
根据本发明的方法,是将治疗上有效量的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物投予被黄病毒科病毒感染的哺乳动物。为治疗上有效,对受感染的哺乳动物给予每天约0.01与约100毫克/公斤体重之间,优选每天约0.1与约50毫克/公斤体重间的化合物剂量。通常,该方法涉及化合物的投药,其量为每天约1至约5次,或者,以连续灌注方式。这种投药可作为慢性或急性疗法使用。
正如本领域技术人员所了解的,可以需要比上文所列的较低或较高的剂量。特定剂量与治疗服用法是决定于多种因素,包括所采用的特定化合物的活性,受感染哺乳动物的年龄、体重、一般健康状态、性别及饮食,投药时间、排泄速率、感染的严重性与过程、患者对感染的倾向及治疗医师的判断。一般而言,治疗是以实质上低于该肽最适宜剂量的更小剂量起始。然后,通过以小增量而增加剂量,直到在这种情况下达到最适宜效果为止。一般而言,这化合物最好以一般性提供治疗作用而不会造成任何伤害或有害副作用的浓度含量进行投药。
治疗化合物在治疗黄病毒科病毒感染上的投药,可通过多种途径中的任一种,包括口服、非经肠或经由植入的储器进行投药。在本文中使用的“非经肠”一词,包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内及病灶内注射或灌注技术。口服投药或通过注射投药是优选的。口服可接受的剂量形式包括但不限于胶囊、片剂及含水悬浮液与溶液。
如上所述,式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物是与一种或多种药物上可接受的载体组合投药。载体的性质当然是随着剂量形式而改变。因此,在供口服使用的片剂情况中,常用的载剂包括乳糖与玉米淀粉。一般地添加润滑剂,如硬脂酸镁。对于以胶囊形式进行口服投药,可使用的稀释剂包括乳糖与干燥的玉米淀粉。当含水悬浮液以口服方式投予时,将活性成份与乳化剂及悬浮剂组合。若需要,可添加某些增甜剂及/或调味剂及/或著色剂。可注射制剂,包括可注射水性或油性悬浮液,是根据现有技术中已知的技术,使用适当分散剂或润湿剂,如Tween 80与悬浮剂进行调配。
与载剂物质组合以产生单一剂量形式的本发明治疗化合物的量是随着待治疗的宿主及特定投药模式而改变。典型制剂是含有约5%至约95%的治疗化合物(w/w)。这种制剂优选是含有约20%至约80%治疗化合物。
在另一方面,组合疗法是使其中式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物或药物上可接受的盐是与至少一种其他药剂共同投药,其它药剂选自抗病毒剂、免疫调节剂、HCV抑制剂、HIV抑制剂、HAV抑制剂、HBV抑制剂及有效治疗病毒感染病征的治疗剂。这种药剂的实例是为本技术领域所熟知的。这些其他药剂可与本发明化合物组合以产生单一药物剂型。或者,这些其他药剂可分开投予受感染病患者,作为多重剂型的一部分,例如使用套件。这种其他药剂可在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)治疗化合物或其药学上可接受的盐投药之前、同时或之后投予病患者。
当使用组合疗法时,本发明化合物与其他治疗及/或预防剂两者,在单次治疗服用法中正常投药的剂量以约10至100%之间,且更优选为约10与80%间的剂量程度下存在。
制造制品于本发明的另一方面,是提供一种制造制品,其包含包装材料,其中包含一种有效治疗被黄病毒科病毒感染的哺乳动物的组合物,且此包装材料包含有标签,其指示该组合物可用以治疗被黄病毒科病毒的感染,其中该组合物包含如上文定义的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(VI)、(VII)或(VIII)的化合物。
黄病毒科病毒特别是,本发明的不同实施方案可针对不同病毒,特别是在哺乳动物中致病的病毒。优选的是,上文所提及的组合物的化合物可用于治疗肝病毒属,譬如C型肝炎。HCV病毒的优选实例是选自以下基因型1、2、3、4、5及6。HCV病毒的更佳实例是选自基因型2、3、4、5及6。优选地,HCV病毒选自亚型HCV 1a、HCV 1b、HCV 2a-c、HCV 3a-b、HCV 4a、HCV 5及HCV 6a,h,d&k。更佳的HCV病毒选自亚型HCV 1a,HCV 2a-c、HCV 3a-b、HCV 4a、HCV 5及HCV 6a,h,d&k。
或者,本发明化合物可针对抵抗黄病毒属的病毒。如登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河脑炎病毒及黄热病病毒。本发明优选是针对在人类中因登革热病毒所造成病毒疾病的治疗。本发明优选是针对在人类中因日本脑炎病毒所造成病毒疾病的治疗。或者,本发明是针对在人类中因黄热病病毒所造成的病毒疾病的治疗。或者,本发明是针对在人类中因西尼罗河脑炎病毒所造成的病毒疾病的治疗。
此外,本发明可针对因粘膜疾病病毒属的病毒所造成的病毒疾病的治疗,譬如牛病毒腹泻病毒(BVDV)、经典猪热病毒(CSFV)及边缘疾病病毒(BDV)。本发明优选是针对在牛中因BVDV所造成病毒疾病的治疗。或者,本发明是针对在猪中因CSFV所造成病毒疾病的治疗。或者,本发明是针对在绵羊中因BDV所造成病毒疾病的治疗。
再者,GB病毒也可用本发明组合物治疗。包含在这病毒属中的是G型肝炎病毒(HGV)与GB型肝炎病毒。优选实例是选自GBV-A,B&C。本发明优选是针对在人类中因GBV-C所引起病毒疾病的治疗。或者,本发明是针对在人类中因GBV-A所引起的病毒疾病的治疗。或者,本发明是针对在人类中因HGV所引起的病毒疾病的治疗。
本发明的实施方案以下述具体实施例例举,其并不解释为对其限制。
实施例在实施例中所用的略语有Abu氨基丁酸;DABCYL4-((4-二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸;DMEMDulbecco改性Eagle培养基;DMSO二甲砜;EDANS5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸;HPLC高效液体色谱;IPTG异丙基-b-D-硫代半乳糖苷;LBLuria-Bertoni(如LB肉汤)Nva正缬氨酸;Penstrep青霉素/链霉素;PCR聚合酶链反应;r.m.s均方根;RT-PCR聚合酶链反应的真实时间;和TCEP三(2-羧乙基)膦氯化氢。
式(I)化合物的合成式(I)化合物是使用在2000年10月12日公告的WO 00/059929中所详述的方案制备。特别是,参考第89页实施例34C关于化合物(IV)的制备。
实施例1-通过化合物II、III及IV抑制不同基因型的HCV NS3-NS4A蛋白酶HCV NS3/4A 1a与1b为生产HCV基因型1b NS3-NS4A异种二聚体蛋白质,通过RT-PCR,使用由感染个人血清的HCV基因型1b提取的RNA(由Bemard Willems博士提供,Hopital St-Luc,Montreal,Canada),克隆全长HCV cDNA。编码NS3-NS4A异种二聚体蛋白质的DNA区,由全长HCV cDNA进行PCR-放大(正向引物′CTCGGATCCGGCGCCCATCACGGCCTAC3′f序列ID.No1);逆向引物5′CTCTCTAGATCAGCACTCTTCCATTTCATCGAA3′(序列ID No2)),并亚克隆为pFastBacTMHTa杆状病毒表达载体(Gibco/BRL)。对HCV基因型1a,编码NS3-NS4A异种二聚体蛋白质的DNA,是由HCV基因型1a菌种H77(由ViroPharma公司提供,Exton,PA,US)进行PCR-放大(正向引物5′CTCTCTAGATCAGCACTCTTCCATTTCATCGAACTC3′(序列ID No3);逆向引物5′CTCGGATCCGGCGCCCATCACGGCCTACTCCCAA3′(序列IDNo4)),并如上述进行亚克隆。克隆进pFastBacTMTHa杆状病毒表达载体中,产生一种含有包含六组氨酸标记与rTEV蛋白酶分裂位点的另一个N-末端28个残基的重组融合蛋白质。使用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统(Gibco/BRL)以产生用于蛋白质表达的重组杆状病毒。
His-标记的NS3-NS4A异种二聚体蛋白酶是通过以重组体杆状病毒,在感染的多重性为0.1-0.2下,于27℃下,在106个细胞/毫升的密度下,感染Sf21昆虫细胞(Invitrogen),而进行表达的。48至64小时后,通过离心分离,在4℃下采集受感染培养物。使细胞沉淀物在50mM磷酸钠,pH7.5,40%甘油(w/v),2mMβ-巯基乙醇中均化。然后,以1.5%NP-40,0.5%Triton X-100,0.5M NaCl从细胞溶胞产物,萃取His-NS3-NS4A异种二聚体蛋白酶及DNase处理。在超离心分离(100,000x克,30分钟,在4℃下)后,使可溶性萃取物在50mM NaPO4,pH7.5,0.5M NaCl中稀释4-倍,并装载在Pharmacia Hi-TrapNi+2-螯合柱中。His-NS3-NS4A异种二聚体蛋白质,使用在50mM磷酸钠,pH7.5,10%(w/v)甘油,0.1%NP-40,0.5M NaCl中制备的50至400mM咪唑梯度液洗脱。成熟NS3与NS4A蛋白质络合物的共纯化,是通过经纯化蛋白质的Western氏斑点分析,使用内部(inhouse)产生的抗-NS3与抗-NS4A抗血清证实。
使用纯化的NS3蛋白酶区与肽H2N-PDREVLYREFDEMEEC-OH(序列ID No5),以使兔子免疫,用于产生分别对NS3与NS4A专一的抗血清。两种蛋白质的适当N-末端氨基酸,是通过N-末端氨基酸定序(PE Biosystems491/491C Procise定序器)确认。纯化的酶是在-80℃下,储存在50mM磷酸钠,pH7.5,10%(w/v)甘油,0.5M NaCl,0.25M咪唑,0.1%NP-40中。
HCV NS3/4A 2b与3aHCV基因型2b与3a的NS3-NS4蛋白酶基因是由HCV-感染病患者的临床试样分离的RNA,使用RT-PCR放大,该试样得自G.Steimann博士(德国)。用于RT-PCR的引物为5′CTCGGATCCGGCTCCCATTACTGCTTAC3′(序列IDNo6)作为正向引物,而5′GACGCGTCGACGCGGCCGCTCAGCACTCTTCCATTTCACTGAA3′(序列ID No7)作为逆向引物,用于HCV基因型2b的NS3-NS4A,及5′CTCGGATCGGGCCCCGATCACAGCATACGCC3′(序列IDNo8)作为正向引物,而5′CACCGCTCGAGTCAGCATTCTTCCATCTCATCATATTGTTG3′(序列ID No9)作为逆向引物,用于HCV基因型3a。各引物含有用于在细菌表达载体pET11a中克隆片段的独特限制位点。克隆进载体中产生一种含有另一种包含六组氨酸标记与rTEV蛋白酶分裂位点的N-末端28个残基的重组体融合蛋白质。这重组体质粒是用于转变菌株BL21 DE3 pLysS以使蛋白质表达,而重组体蛋白质表达是通过添加IPTG而诱导的。在表达后,细胞是通过离心,在4℃下收集,并使细胞沉淀溶解于含有50mM磷酸钠,0.5M NaCl,40%甘油,1.5%NP-40,0.5%Triton X-100的缓冲剂中,并使可溶性蛋白质部分通过上述的5毫升HiTrap螯合亲和柱。聚(U)-琼脂糖纯化步骤可视情况进行,以移除降解产物与污染物。
活体外HCV NS3蛋白酶检测用以评估HCV 1a,1b,2b,2a-c及3a NS3-NS4A异种二聚体蛋白质的蛋白酶活性的抑制的萤光原缩肽(depsipeptide)基质,为氨茴基-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-NO2)TW-OH(序列ID No10)。这基质是在氨基丁酸(Abu)与丙氨酸残基之间分裂。序列DDIVPAbu-AMYTW(序列ID No11)是由相应于NS5A/NS5B天然分裂位点的序列DDIVPC-SMSYTW(序列ID No12)所衍生。在位点P1引入氨基丁酸残基,会造成N-末端产物抑制作用的显著降低,而删除位点P3的丝氨酸残基会改良内部淬灭效率。蛋白酶活性是在50mM Tris-HCl,pH8.0,0.25M柠檬酸钠,0.01%正-十二基-β-D-麦芽苷,1mM TCEP中检测。这检测是在Microfluor_2白色U-底部Microtiter_板中进行。将5μM基质与不同浓度的待测化合物,和1.5nM HCV1a或1b NS3-NS4A异种二聚体蛋白质,在23℃下,于温和搅拌下,一起培养45分钟。最后DMSO含量不超过5.25%。通过在pH5.8下添加1M2-[N-吗啉基]乙烷磺酸溶液,而使反应终止。
萤光是以320毫微米的激发滤光器,与405毫微米的发射滤光器使用BMG POLARstar Galaxy 96-孔板读取器监测。含有待测化合物的各孔的抑制程度(%抑制),是以下列方程式(FU=萤光单位)计算而得 然后,使用所计算的%抑制值,通过SAS的非线性回归例行NLIN程序,使用下列方程式,而测定IC50、斜率因数(n)及最大抑制(Imax) 抑制常数(Ki)测定与抑制模式使用萤光原缩肽基质氨茴基-D(d)EIVP-Nva[C(O)-O]AMY(3-NO2)TW-OH(序列ID No13),以评估化合物(IV)对HCV NS3-NS4A蛋白酶的抑制机制与抑制常数。它是在正缬氨酸与丙氨酸残基之间分裂。基质工作溶液是在DMSO中,在200μM浓度下,由基质储备溶液(2mM,在DMSO中,储存于-20℃下)制备。在检测中的最后基质浓度,是从0.25改变至8μM。化合物(IV)的抑制常数(Ki),是使用稳定态速度方法(Morrisson等人,1985)测定。蛋白酶活性是通过使用SLM-AMINCO 8100分光萤光计(在325毫微米下发射,及在420毫微米下激发)监视和内部淬灭萤光原基质分裂有关的萤光变化而测得。分裂反应是在0.25至8μM基质,0.3nM HCV 1a或1b NS3-NS4A异种二聚体蛋白质,及待测化合物IV在50mM Tris-HCl,pH8.0,0.25M柠檬酸钠,0.01%正-十二基-β-D-麦芽苷,1mM TCEP中的不同浓度存在下进行监测。抑制HCV基因型1a与1b NS3-NS4A异种二聚体蛋白酶的稳定状态分析,是使用Dixon与Cornish-Bowden图解方法进行。在Dixon图解方法中,是将速度倒数1/V对待测化合物浓度,在数种基质浓度(S)下进行作图。在Cornish-Bowden图解方法中,是将比例S/V对待测化合物浓度,在数种S浓度下进行作图。对两种方法,点在各S值下是位于直线上。对竞争性待测化合物,Dixon图形显示在不同S值下的直线,相交在单一点上,而Cornish-Bowden图形显示在不同S值下的平行线。通过将数据配合至描述竞争性结合的方程式中,而估计KiV=kcat·[E]·[S]Km·(1+[I]/Ki)+[S]]]>HCV NS3蛋白酶的抑制HCV基因型1a,1b,2b,2a-c及3a NS3/NS4A异种二聚体蛋白酶的活性,是在有化合物(IV)存在下,使用活体外的酶催萤光原检测进行测定。IC50曲线是单个地通过SAS NLIN程序进行分析。对HCV1a NS3-NS4A蛋白酶,平均IC50值4.3nM是由两批化合物(IV)的分析得到。平均IC50值3.4nM是在有HCV 1b NS3-NS4A蛋白酶存在下,由两批化合物(IV)的分析而得到。
表1不同NS3蛋白酶抑制剂在不同基因型的HCV中的IC50

n/d=未进行图3a与3b是分别说明化合物(IV)对HCV 1a与1b NS3-NS4A蛋白酶的IC50曲线。
在以GraFit将数据配合至描述竞争性结合的方程式后,并也由Dixon与Cornish-Bowden图解方法,发现化合物(IV)是一种HCV基因型1a与1bNS3-NS4A蛋白酶的竞争性待测化合物。对两种HCV基因型酶,Dixon图形显示在不同S值下的直线是在一个点处相交,然而Cornish-Bowden图形显示在不同S值下的平行线。对化合物(IV),以HCV基因型1a NS3-NS4A蛋白酶由稳定状态速度分析,获得0.30nM的Ki,而0.66nM的Ki是以HCV基因型1b NS3-NS4A蛋白酶而获得,90nM、86nM及83nM的Ki,是分别以HCV基因型3a、2a-c及2b获得。图4与5是化合物(IV)的分别对HCV基因型1a与1b NS3-NS4A蛋白酶的Dixon与Cornish-Bowden图形。
实施例2-HCV复制子1a及/或1b的抑制细胞基的HCV 1a与1b RNA复制子检测HCV RNA复制是在含HCV 1a与1b复制子的Huh-7-衍生的细胞系中证实,该细胞系是在Boehringer Ingelheim(Canada)公司,R&D处发展(WO02/052015)。这些细胞是用于对测试候选待测化合物建立敏感性HCV RNA复制细胞基的检测。
稳定保持亚基因组HCV复制子的Hun7细胞,是如以前所述进行建立(Lohman等人,1999;WO 02/052015)。将这些细胞接种在96孔细胞培养物群集体中,在每孔1×104个细胞下,在补充有10%FBS,PenStrep(生命技术)与1微克/毫升基因素的DMEM中。细胞是在5%CO2培养器中,于37℃下培养,直到添加不同浓度的待测化合物为止。
按下述制备待测化合物,以用于检测。添加100%DMSO中的待测化合物,在检测培养基中稀释,以提供最后DMSO浓度为0.5%,并将此溶液用声处理15分钟,并经过0.22微米微孔滤器单元过滤。使用检测培养基(含有0.5%DMSO)制备待测化合物的系列稀释液。
将细胞培养基由含有细胞的96-孔板吸出,并将待测化合物在检测培养基中的适当稀释液转移至细胞培养板的单独的井中,将其在37℃下,以5%CO2培养。
在3天培养期后,将细胞以PBS洗涤,并以由Qiagen得到的RNeasy Minikit_与Qiashredder_,萃取全部细胞RNA。将得自各孔的RNA在50微升H2O中淋洗。RNA是通过光密度,在260毫微米下,于Cary 1E UV-可见分光光度计上定量。HCV RNA复制子拷贝数目是通过即时RT-PCR,使用AbiPrism_7700序列检测系统评估。TAQMAN EZ RT-PCR组件提供用于检测与分析RNA的系统。以没有下游处理的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物的直接检测,是通过监测染料标识的DNA探针的萤光的增加而完成。引物与探测剂的核苷酸序列,是位于HCV基因组的5′区域。然后,使用以在相同反应混合物中检测的已知量的复制子拷贝(经补充50毫微克野生型Huh-7RNA),所制成的标准曲线,评估复制子拷贝数目。下述热循环参数是用于在ABI Prism7700序列检测系统上的RT-PCR反应。条件是对HCV检测是最佳化。定量是基于阀值循环,其中放大图形是横越界定的萤光阀值。阀值循环的比较是提供在不同试样中相对模板浓度的高度敏感性量度。当PCR限度在其最高时在早期循环期间的监测,提供正确定量的精确数据。相对模板浓度可利用HCV的标准曲线与已知拷贝数目,而转化成实数。
以SAS的NLIN程序配合的EC50曲线含有待测化合物的各孔的抑制程度(%抑制)是以下列方程式(CN-HCV复制子拷贝数目)计算而得

然后,使用所计算的%抑制值,通过SAS的非线性回归例行NLIN程序,使用下列方程式,以测定EC50、斜率因数(n)及最大抑制(Imax)

表2不同NS3蛋白酶抑制剂在不同基因型的HCV中的EC50(nM)

在HCV复制子细胞基的检测中,化合物(IV)显示使用基因型1a与1b的含HCV复制子细胞,分别以EC50为2.1nM与1nM的HCV RNA复制的剂量依存性抑制。在浓度高于1000nM下,未发现细胞毒性。这些结果显示化合物(II、III、IV、VI、VII和VIII)是细胞基的HCV RNA复制的有效且专一的抑制剂。化合物V是不同类的化合物但结构上相关,并且抵抗NS3蛋白酶也具有活性但效力较差。这化合物在以下将用作对比以比较抑制活性程度。化合物VI、VII与VIII具有下式结构 合物化(VI) 化合物(VII) 化合物(VIII)
实施例3 GBV-B NS3/4A蛋白酶通过化合物II、III与IV的抑制GBV-B NS3/NS4A蛋白酶的克隆全长GBV-B NS3/NS4A蛋白酶基因是由受感染狨血清中分离。全部RNA是使用Qiangen_病毒RNA萃取组件,根据标准方案,从血清分离。用于反转录酶的引物与PCR反应的选择,是基于已发表的序列(Muerhoff,A.S等人,1995)及基因库登记号U22304(正向5′CGCATATGGCACCTTTTACGCTGCAGTGTC3′(序列ID No.14);逆向5′CGCGCGCTCGAGACACTCCTCCACGATTTCTTTC3′(序列ID NO.15))进行选择。使放大的RT-PCR产物克隆进含多组氨酸标记的介于Ndel与Xhol位点之间的pET-29质粒中。此构建物产生一种在其C-末端具有多His标记的重组蛋白质。使质粒转变成BL21 DE3 pLysS,以用于蛋白质表达。
使大肠杆菌克隆pGBV-B在LB培养基中生长至细胞密度(OD600)为0.6,这时在0.2mM的浓度下添加IPTG。这诱导期是在23℃下进行4小时。GBV-BNS3/NS4A-His蛋白质,是根据Zhong等人,1999所述的程序纯化。使可溶性部分在Pharmacia_Hi-Trap Ni+2-螯合亲和柱上,使用50至400mM咪唑梯度液进行纯化。接着这步骤是在Superdex200凝胶过滤柱上的蛋白质制剂的色层。蛋白质制剂的浓度通过Bradford蛋白质检测进行测定。
活体外GBV-B NS3蛋白酶检测用以评估GBV-B NS3-NS4A异种二聚体蛋白质的蛋白酶活性的抑制的缩肽基质,是Ac-DED(EDANS)EE-Abu[C(O)-O]ASK(DABCYL)-NH2(序列IDNo.16)。这基质是在氨基丁酸(Abu)和丙氨酸残基之间分裂,且反应的产物是通过HPLC分析。蛋白酶活性是在50mM Tris-HCl,pH8.0,0.25M柠檬酸钠,0.01%正-十二基-β-D-麦芽苷,1mM TCEP中检测。检测是在Microfluor_2白色U-底部Microtiter_板中进行。使5μM基质与不同浓度的待测化合物,以0.4nM GBV-B NS3-NS4A异种二聚体蛋白质,在23℃下,在温和搅拌下培养2小时。最后DMSO含量不超过5.25%。通过添加1M 2-[N-吗啉基]乙磺酸溶液,在pH5.8下,使反应终止。为进行定量,将分裂产物与基质通过在Perkin-Elmer 3×3CR C8柱上的HPLC分离。分离是以下述方式进行,首先以3.5毫升/分钟下,用含有0.05%磷酸与3mM SOD的水溶液进行洗脱。然后,将在0.05%磷酸中的0至45%乙腈的线性梯度液,施加10分钟。在210毫微米下检测吸光率。
这检测是在待测化合物II、III、IV及V存在下进行。在有GBV-B NS3-4A蛋白质存在下,对各待测化合物获得的IC50,示于表3中。
表3

化合物V为结构上相关的不同类的化合物,且也具有抵抗NS3蛋白酶的活性,但比化合物II、III与IV的活性较低。包括这化合物,以证实化合物II、III与IV的活性等级,是保持在HCV与GBV-B之间。
在培养物中的狨肝细胞中抑制GBV-B复制将从未被感染的狨分离的肝细胞保持在确定成分培养基的培养物中数天。该细胞培养模式是如Beames等人,2000所述。在平板培养后三天,使细胞以含有GBV-B的血浆感染。于病毒吸附后,移除病毒,并使细胞于候选待测化合物以10μM浓度存在与不存在的情况下培养。感染后7天采集细胞。GBV-B RNA的含量,是由全部细胞RNA,通过使用所识别部分GBV-B壳体基因的引物-探针组合物的快速PCR检测进行定量(Beames等人,2000)。
尽管在这酶检测中获得较低的IC50,示于图6的结果显示当细胞在有化合物III存在下培养时,观察到在病毒RNA含量上超过3-对数的降低,而在有化合物V存在下为2-对数的降低(当该结果以g.e(基因组当量)/微克RNA表示时)。以这种更具有代表性病毒复制检测所获得的结果,证实这些化合物是有效抗病毒剂,以降低GBV-B病毒产生。
实施例4-在黄病毒科内的NS3蛋白酶的序列比较由病毒的黄病毒科的其他病毒的蛋白酶序列,是由BLAST分析(Altschul等人,1997)NCBI,接着分类学报告而得到。蛋白酶序列的研究是使用特定标准进行,将回收具有类似于HCV蛋白酶的所有黄病毒科序列,但排除HCV顺序本身。当可能时,得自NCBI的“NP_”的序列是用于表示有关病毒的特定组,因为这些“NP_”序列是“参考”序列(RefSeq)。再者,在不知道时,对蛋白酶的NS3N-末端与C-末端是由类似于HCV NS3蛋白酶测得。
对六种抵抗不同病毒组的HCV菌株的蛋白酶的序列排列,是使用基于CLUSTALW的ALIGNX(VectorNTI_)(Thompson,JD等人,1994)进行。
由这些排列,类似性的百分比是在所有单个序列之间计算,并表示于表4-8中。类似性是基于下列氨基酸;[ILVM]、[FWY]、[KR]、[DE]、[GA]、[NQ]、[ST]。
表4表示HCV的数种基因型与亚型间的同一性与类似性。人们可见其同一性范围在70%与89%之间,而类似性范围在77%与95%之间,这证实NS3蛋白酶在HCV中是高度地保存。而且,从各种代表性HCV基因型的NS3蛋白酶区的氨基酸序列排列(图2)及保存的残基在三维结构中的位置(图8),人们可看到在活性位点的残基在HCV基因型与亚型中,是高度地保存。
表5为在GB病毒NS3蛋白酶与HCV NS3蛋白酶区间的类似性分析。类似性范围在43与49%之间,而在HCV与粘膜疾病病毒NS3区间的类似性范围是从25至30%(表6)。在HCV与登革热病毒间的类似性范围,也为约30%(表7),以及在HCV与黄病毒间的类似性(表8)也是。
相反,表9显示HCV的NS3蛋白酶区与人类细胞肥大病毒(HCMV)的蛋白酶间的类似性,约在20%左右。HCMV为疱疹病毒科的病毒,且具有一种具有不同于黄病毒科蛋白酶的催化分体的丝氨酸蛋白酶。因此,HCMV病毒蛋白酶不被认为是类似于黄病毒科NS3蛋白酶。在黄病毒科与HCMV中与本发明抑制剂接触的氨基酸之间进行类似性的比较时这种对比进一步说明。
实施例5-三维结构晶体研究为进一步分析黄病毒科间的类似性,故获得与抑制剂络合的HCV NS3蛋白酶的晶体结构,并分析在其他黄病毒科中直接与抑制剂接触的氨基酸,以评估这些重要接触点的类似性程度。
获得与大环化合物(II)络合的HCV NS3蛋白酶-NS4A肽的共晶体,其衍射的X-射线至2.75A解析度。发现大环化合物II是在NS3蛋白酶活性位置处,并明显地限定在不同电子密度内。这结构揭示待测化合物如何与活性位点相互作用的分子细节,并提供HCV NS3蛋白酶抑制机制内的其他见解。
与待测化合物II络合的NS3蛋白酶的结构(图8)是更好地界定本发明基质基的待测化合物系列的结合位点。由这共络合物的结构,直接与待测化合物接触的残基,即在3_(H57、G137、S139、A156及A157)内,是活性位点的象征,正如通过抑制的竞争性模式,及通过HCV基因型与各种亚型的代表性序列中,在这位点的保存所预测的。
在待测化合物的4A内接触的其他残基,示于表10中。比较分析显示这些氨基酸是高度地保存在59%与76%间范围的黄病毒科中,这些残基在黄病毒科中的保存,是HCV NS3蛋白酶的抑制剂也将抑制病毒黄病毒科的其他成员的象征。相反,表10的HCMV蛋白酶催化位点与接触点的类似性程度,是在整个蛋白酶类似性的同样范围内(~20%),这再一次说明来自非黄病毒科的其他丝氨酸蛋白酶,不会成为式(I)化合物标的事实。
在HCV与登革热病毒蛋白酶区之间进行的其他结构研究,已证实C-末端区抑制剂结合位点的所有六股链,是强烈地保存,并具有可比拟的长度。Den2蛋白酶(残基87-167)与包括表10中的大部分残基(残基69-189)的HCV的C-末端区的68α碳原子的叠加,产生0.9A的r.m.s.偏差(Murthy等人,1999)。
讨论在黄病毒科内的病毒具有许多类似性(图1),而不管在其成员中的相对较低的整体序列类同性(表4-8)。特别是,NS3蛋白质含有类似于粘膜疾病病毒与黄病毒的蛋白酶与核苷三磷酸结合蜗牛酶的序列。HCV NS3蛋白酶区,在HCV基因型中是共有序列类似性为约77-95%(图1),而与黄病毒科的其他成员的序列类似性为约25-50%(表4-8)。此外,GBV-B与HCV的基因组构建与结构是类似的,而不管在GBV-B与HCV的多蛋白序列间的序列类同性为约25至30%的事实。但是,这种低类似性是因以下事实而突出,与抑制剂接触的残基在黄病毒科的蛋白酶区内是高度地保存,这强烈指出这化合物族也将结合至其他黄病毒科。抵抗GBV-B所获得的化合物IV的活性,是该假说的正面证实。
关于三维结构,各种已结晶的HCV与登革热NS3蛋白酶的可用原子配位,表示整体构建,其特征是似胰蛋白酶折叠。许多研究目前已牢固地确立NS3区的N-末端部分编码丝氨酸蛋白酶,其在黄病毒科内处理的病毒多蛋白中,具有极专一且是关键性的作用。
于上述实验中产生的所有结果,都倾向于支持式(I)化合物具有抵抗病毒黄病毒科成员的活性的论点·6种相关化合物已被证实对抵抗HCV 1b具有活性,且具有抵抗HCV1a的类似活性(表2);·这些化合物的3种也被测试抵抗HCV 3a、2a-c及2b,且也发现具有活性(表1);·这些3种同样化合物是在抵抗GBV-B的酶检测中测试,且发现具有活性(表3);·这些化合物中的1种是在狨细胞中抵抗GBV-B的复制的细胞培养物中测试,且发现具有活性(图6);·这些化合物中的1种证实结合模式,它是位在黄病毒科所有成员间的高度保存区域中(图8);·研究已证实在HCV与登革热病毒NS3蛋白酶间的强功能性与结构的类似性。
给出病毒黄病毒科内的病毒的所有类似性,似乎高度可能的是,式(I)化合物是有效抵抗病毒的黄病毒科的成员,且更特别是,是有效抵抗黄病毒科的致病成员。
参考资料-Altschul S.F.等人1997,Nucleic Acids Res.25,3389-3402.
-Ausubel等人,1994,分子生物学的现行拟案,Wiley,New York.
-Beames,B.等人,2000,J.Virol.,74,11764-11772-Butriewicz,N.等人,2000,J.Virol.,74,4291-4301-Kim JL,等人(1996),Cell;87343-355.
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-Thompson等人,1994,Nucleic Acids Res.224673-4680-Zhong W.等人,1999,病毒学,261,216-226表4-在NS3蛋白酶间的同一性与类似性

获得类似性评分,限于下列氨基酸类似性[ILVM],[FWY],[KR],[DE],[GA],[NQ],[ST]不同HCV基因型与亚型的区(180aa)
表5-HCV NS3蛋白酶区(181AA)与来自黄病毒科的GB NS3蛋白酶的类似性的%

基质[ILVM],[FWY],[KR],[DE],[GA],[NQ],[ST]表6-HCV NS3蛋白酶区(181AA)与来自黄病毒科的粘膜疾病病毒NS3蛋白酶的类似性的%

BVDV-2=牛病毒腹泻病毒表7-HCV NS3蛋白酶区(181AA)与来自黄病毒科的蚊子所带的黄病毒NS3蛋白酶的类似性的%

表8-HCV NS3蛋白酶区(181AA)与得自黄病毒科的黄病毒NS3蛋白酶的类似性的%


WVN=West Nile西尼罗脑炎病毒JEV=日本脑炎病毒Kunjin=Kunjin病毒YFV=黄热病病毒MVEV=Murray Vally脑炎病毒表9-HCV蛋白酶区(181AA)与人类细胞肥大病毒蛋白酶区(256AA)的类似性的%

表10-在(在抑制剂的4A内)黄病毒科病毒中,在NS3蛋白酶抑制剂结合区中的氨基酸差异

HCV40_1bHCV 1b分离物的序列,其用于这项分析的参考物n在研究中使用的所有基因型的HCV序列数目An含有这变性物的HCV序列数目%Sim%类似性+根据基质[ILVM],[FWY],[KR],[DE],[GA],[NQ],[ST]的类似性=对于GBV组的GBV-B成员为独特的类似性GBVa在粗体中的aa为关于GBV-BNS3蛋白酶所发现的残基bGBV-B的%类似性序列表<110>贝林格尔.英格海姆国际有限公司(Boehringer IngelheimInternational GmbH)<120>用于治疗被黄病毒科病毒感染的组合物<130>13/118<140>US 60/442,769<141>2003-01-27<150>US 60/421,900<151>2002-10-29<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ctcggatccg gcgcccatca cggcctac 28<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ctctctagat cagcactctt ccatttcatc gaa33<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3ctctctagat cagcactctt ccatttcatc gaactc 36<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ctcggatccg gcgcccatca cggcctactc ccaa 34<210>5<211>16<212>PRT<213>HCV肽<400>5Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys1 5 10 15<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6ctcggatccg gctcccatta ctgcttac 28<210>7<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gacgcgtcga cgcggccgct cagcactctt ccatttcact gaa 43<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8ctcggatcgg gccccgatca cagcatacgc c 31<210>9<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9caccgctcga gtcagcattc ttccatctca tcatattgtt g 41
<210>10<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在位1的Asp为连接至邻氨基苯甲酰基<223>在位6的xaa为氨基丁酸[C(O)-O]<223>在位9的xaa为(3-硝基)酪氨酸<400>10Asp Asp Ile Val Pro Xaa Ala Met Xaa Thr Trp1 5 10<210>11<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在位6的xaa为氨基丁酸<400>11Asp Asp Ile Val Pro Xaa Ala Met Tyr Thr Trp1 5 10<210>12<211>12<212>PRT<213>HCV肽<400>12Asp Asp Ile Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp1 5 10<210>13<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在位1的xaa为邻氨基苯甲酰基-Asp<223>在位2的xaa为(d)Glu<223>在位6的xaa为正缬氨酸[C(O)-O]<223>在位9的xaa为(3-硝基)酪氨酸<400>13Xaa Xaa Ile Val Pro Xaa Ala Met Xaa Thr Trp1 5 10<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>14cgcatatggc accttttacg ctgcagtgtc30<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15cgcgcgctcg agacactcct ccacgatttc ttc33<210>16<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在位1的xaa为乙酰化-Asp<223>在位3的xaa为Asp(EDANS)<223>在位6的xaa为氨基丁酸[C(O)-O]<223>在位9的xaa为Lys[DABCYL]<400>16Xaa Glu Xaa Glu Glu Xaa Ala Ser Xaa1 权利要求
1.一种式(I)化合物的用途 式(I)其中A选自C1至C6烷基,与C3至C6环烷基;及B是选自苯基或噻唑基,这两者视情况被选自NH(R1)与NH(CO)R1的基团取代,其中R1为C1至C6烷基;R为OH或式-NHSO2-R2的磺酰胺基,其中R2是-(C1-8)烷基,-(C3-7)环烷基或{-(C1-6)烷基-(C3-6)环烷基},其全部可任选地被卤素、氰基、硝基、O(C1-6)烷基、酰氨基、氨基或苯基取代1到3次或R2是C6或C10芳基,其任选地被卤素、氰基、硝基、(C1-6)烷基、O(C1-6)烷基、酰氨基、氨基或苯基取代1~3次;或其药物上可接受的盐,它用于制备用于治疗哺乳动物受黄病毒的感染的药物。
2.根据权利要求1的用途,其中式(I)的A为支链C4至C6烷基或C4至C6环烷基,及式(I)的B为苯基或噻唑,它于位2被NH(R1)或NH(CO)R1取代,其中R1为C1至C4烷基,R是OH或式-NHSO2R-的磺酰胺基,其中R2是-(C1-6)烷基、-(C3-6)环烷基,两者可任选地被卤素或苯基取代1或2次,或R2是C6芳基,其任选地被卤素或(C1-6)烷基取代1或2次。
3.根据权利要求1或2的用途,其中A为环戊基或叔-丁基,且B为噻唑,其在位2被NH(R1)或NH(CO)R1取代,其中R1为C1至C4烷基,R是OH或磺酰胺基,其中R2是甲基、环丙基或苯基。
4.根据权利要求1~3中任一项的用途,其中所述化合物是其中R是OH的化合物。
5.根据权利要求1~3中任一项的用途,其中R是式-NHSO2R2的磺酰氨基,其中R2是-(C1-6)烷基、-(C3-6)环烷基,两者可任选地被卤素或苯基取代1或2次或R2是C6芳基,其可任选地被卤素或(C1-6)烷基取代1或2次。
6.根据权利要求1~3中任一项的用途,其中A为环戊基,B为噻唑,在其2位被NHCH(CH3)2取代,且R是OH或磺酰氨基,其中R2是甲基、环丙基或苯基。
7.根据权利要求1~5中的任一项的用途,其中所述哺乳动物为人类,该黄病毒科选自黄热病毒、西尼罗河脑炎病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒,GB病毒A或C和肝炎G病毒。
8.根据权利要求1~5中任一项的用途,其中所述哺乳动物为牛,该黄病毒科为选自BVDV,边缘疾病病毒。
9.根据权利要求1~5中之一项的用途,其中所述哺乳动物为猪,该黄病毒科为传统猪热病毒。
10.根据权利要求5的用途,其中所述哺乳动物是人类,并所述黄病毒科病毒是肝类C病毒。
11.根据权利要求6的用途,其中所述哺乳动物是人类,并所述黄病毒科病毒是选自黄热病毒,西尼罗河脑炎病毒,登革热病毒,日本大脑炎病毒、GB病毒A或C和肝炎G病毒。
12.根据权利要求6的用途,其中所述哺乳动物是牛,而所述黄病毒科病毒是选自BVDV、边缘疾病病毒。
13.根据权利要求6的用途,其中所述哺乳动物是猪,而所述黄病毒科病毒传统的猪热病毒。
14.根据权利要求1~9中之一项的用途,其中所述黄病毒科病毒包含NS3蛋白酶,其包含的氨基酸残基,选自H57、G137、S139、A156及A157。
15.制造包含包装材料的制品,其中含有有效抑制黄病毒科病毒的组合物,并且包装材料包含一种标记,它指出组合物可用于治疗受黄病毒科病毒的感染,并且其中所述组合物包含权利要求1中所限定的式1化合物。
全文摘要
本发明是提供用于治疗被黄病毒科病毒感染的哺乳动物的组合物、用途、制造的制品及方法,其包括对受感染的哺乳动物投予具有式I的化合物其中A是选自C
文档编号C07K5/08GK1708509SQ200380102436
公开日2005年12月14日 申请日期2003年10月24日 优先权日2002年10月29日
发明者丹尼尔·拉马尔, 利斯特·拉加斯 申请人:贝林格尔·英格海姆国际有限公司
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