共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗的制作方法

专利名称：共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的重组活载体疫苗。
背景技术：
猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。2型猪圆环病毒(PCV2)有致病性，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，它是一种新的传染病。1991年加拿大首次暴发该病，随后世界上许多国家和地区都有该病的报道，给养猪业造成严重的经济损失。在我国台湾、大陆的江苏、河北等也有报道其猪群中有PMWS存在。PMWS不但给猪的生产带来相当大的经济损失，而且对公共健康也存在着潜在的威胁，特别谈到异种移植时，评估新的不呈现特色的猪致病原的危险性很有必要。因此加强PCV2防治，研制切实可行的PCV2疫苗和治疗药物是科研工作者的严峻课题。
PCV在分类上属于圆环病毒科，圆环病毒科是国际病毒分类委员会上(ICTV)第六次学术报告新命名的一个科，该科病毒的共同特征为病毒是一种小的、二十面体对称、无囊膜、单股呈圆环状的DNA链组成。PCV是目前发现的最小的自我复制哺乳动物病毒，由衣壳蛋白和基因组组成。PCV-2基因组有11个阅读框，即ORF1~ORF11，各个阅读框大小相差悬殊，其中ORF1、ORF5、ORF7、ORF10，5’~3’方向相同；ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11，5’~3’方向相同。这些阅读框架表现为重叠基因，从而尽可能经济地利用圆环病毒有限的遗传物质，这可能是生物进化过程中自然选择的结果。
PCV-2ORF1有945个碱基，编码314个氨基酸，PCV-2ORF2有702个碱基，编码234个氨基酸。从氨基酸序列推测，ORF1有3个糖基化位点，ORF2和ORF5各有1个糖基化位点。在11个阅读框中，研究较深入的为ORF1和ORF2，目前对ORF2的研究已成为PCV2研究的热点。Liu Q等用免疫荧光方法研究了PCV-2ORF2在细胞中的定位，发现ORF2蛋白N端41个氨基酸大多是碱性氨基酸，且序列比较保守。进一步分析表明第12到第18个，第34个至第41个氨基酸域在核中的定位起着重要作用。
Mahe D等用杆状病毒系统表达了ORF1和ORF2，发现PCV-1ORF2虽与PCV-2ORF2抗原性相关，但只有ORF2蛋白可以被PCV2多抗识别。Lir Q等将ORF2基因连接到MBP-His(8)-tag基因3’端，在细菌中表达了ORF2融合蛋白，该融合蛋白可以与PCV2的多抗反应。这表明可以用ORF2来区分PCV-1与PCV-2。TruongC等用接种有PCV2猪群中收集的抗血清做实验，通过酶联免疫吸附检测(ELISA)鉴定PCV2-ORF2编码蛋白与免疫相关的B细胞线性表位。也利用ORF2抗原表位作为PCV试验猪及自然感染猪血清学检测的标志。还有Dominique Mahe等报道两个病毒ORF1编码蛋白有抗原相关性，然而它们的ORF2编码的蛋白却对抗PCV2多克隆抗体的识别不同。而且PEPSCAN对ORF1、ORF2、ORF3编码部分基因的重叠片段进行了分析，发现了五个与免疫相关的决定区，其中一个位于ORF1，而另四个位于ORF2中。并且发现仅仅一些ORF2多肽是区别病毒型的免疫相关表位。从而暗示使用源于ORF2的抗原作为诊断工具有很大的潜能。正是由于ORF2的以上特性，使其成为临床上分子水平上诊断PCV的理想抗原。因此，ORF2也将在PCV-2血清学调查中发挥出具大的作用。
到目前为止关于本病的发病机制并不十分清楚。Allan等认为应当重视PCV-2和猪小核糖核酸病毒共同作用。由于猪小核糖核酸病毒在猪的免疫细胞中增殖，很可能诱发免疫抑制，促进PCV-2的增殖，或者猪小核糖核酸病毒活化了对PCV-2的感受性。
本病无有效的治疗方法，国内外无有效疫苗可利用。自从Wloff等发现裸DNA这项新型技术以来，许多研究已经表明DNA能诱导保护性免疫反应来抵抗动物模型中的病毒。以前调查中也发现注射编码伪狂犬病毒糖蛋白的质粒DNA到猪肌肉中能产生保护性反应抵抗致死性感染；协同编码猪白介素能提高免疫反应，产生一种免疫佐剂效应。故本研究将构建核酸疫苗与活载体重组病毒基因工程苗，以期获得预防PCV2的理想疫苗，为进一步开发高效、安全的新型疫苗奠定基础。
口蹄疫病毒的基因组为单股RNA，由大约8500个核苷酸组成，其分子量约为2.6×106Da，可分为5’端非编码区、P1区、P2区、P3区以及3’端非编码区。其中P1区编码主要的结构蛋白，P2区和P3区编码与病毒复制、翻译，以及完整病毒粒子装配有关的非结构蛋白。
结构蛋白P1区核苷酸序列全长为2154nt，由1A、1B、1C和1D 4个基因编码序列组成，长度依次为167、648、660和639nt，分别编码85、218、220和213个氨基酸的结构多肽。1B、1C和1D位于衣壳表面，为外衣壳蛋白。其中1D蛋白编码多肽VP1，其大部分暴露在病毒表面，是决定病毒抗原性的主要成分。但其他三种结构多肽也都参与免疫原性的构成。不同血清型病毒的抗原位点有所不同，O型病毒有5个位点抗原位点1由1D GH环(1133-1157)和200-213个氨基酸的线性表位组成。此位点是FMDV最主要的抗原位点，也是FMDV抗原位点的关键所在。
鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)表达载体系统是类似于金丝雀痘病毒载体的又一种动物病毒载体。FPV作为载体具有与金丝雀痘病毒载体相同的优点，此外，相比于金丝雀痘病毒载体，其基因组结构更为庞大，能容纳较大的外源基因而不丧失其感染性；被表达的外源蛋白，在感染细胞中，能忠实地进行修饰，如糖基化、羧基化等；外源基因的表达产物具有良好的免疫原性，可诱导机体产生持续时间较长的细胞免疫和体液免疫；严格的胞浆内复制，避免了病毒基因重组入宿主细胞染色体的可能性，消除了重组病毒应用后对人畜的潜在威胁。FPV的宿主特异性使重组FPV(Recombinant FPV，rFPV)接种哺乳动物后仅产生流产性感染，但仍然可在较广范围的动物中正确表达外源基因，在细胞膜表面产生构像正确的抗原，从而诱发机体产生保护性免疫，且安全、有效，尤其是对免疫缺陷和免疫低下的动物是更为理想的载体。所以，FPV不仅可以用于研制禽类的基因工程活疫苗，而且可以作为非复制型病毒载体，研制哺乳动物基因工程活疫苗，用于禽类以外的动物乃至人类的免疫。因此，FPV载体的研究，尤其是FPV作为非复制型载体的研究日益受到人们的重视。

发明内容
本发明的目的在于提供两种分别共表达2型猪圆环病毒(PCV2)中国流行株衣壳蛋白ORF2或ORF2-ORF1(复制蛋白)融合蛋白与O型口蹄疫病毒(FMDV)中国流行株NY00株结构蛋白前体P1的重组鸡痘病毒，作为预防我国PCV2和FMDV感染的二联基因工程活载体疫苗。
本发明建立一个新的猪圆环病毒基因组文库应用PCR方法将中国PCR2流行株nm2002的全基因分段扩增并克隆到pMD18-T和pGEM-T Easy载体中，构建了pMD18T-ORF2与pGEMT-XS两个质粒，拼接而得到中国PCV2流行株nm2002的全基因组序列；
再将免疫相关基因从构建的DNA文库中亚克隆到表达载体中，在宿主细胞中表达出相应基因，作为预防或诊断奶仔猪多系统衰竭综合征的蛋白质、基因重组体或重组免疫原。
本发明将FMDV O-NY00株的P1区基因从pKS-P1载体上用HindIII和SalI双酶切后插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL P7.5串联启动子下游，形成中间载体pUTALP1，同时将中国流行株PCV2nm2002的PCV2 ORF2基因从载体pMD18T-ORF2上用HincII和SmaI双酶切后，插入到鸡痘病毒表达载体pUTALP1ATI-P7.5复合启动子下游，构建了共表达PCV2ORF2与FMDV O-NY00 P1重组鸡痘转移质粒。
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pUTALPl-ORF2-ORF1的基因序列是atg acg tat cca agg agg cgt tac cgg aga aga aga cac cgc ccc cgc 48Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg1 5 10 15agc cat ctt ggc cag atc ctc cgc cgc cgc ccc tgg ctc gtc cac ccc 96Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro20 25 30cgc cac cgt tac cgc tgg aga agg aaa aat ggc atc ttc aac acc cgc144Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg35 40 45ctc tcc cgc acc ttc gga tat act atc aag cga acc aca gte aaa acg192Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr50 55 60ccc tcc tgg gcg gtg gac atg atg aca ttc aat att aat gac ttt ctt240Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Thr Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu65 70 75 80ccc cca gga ggg ggc tca aac ccc cgc tct gtg ccc ttt gaa tac tac288Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr85 90 95aga ata aga aag gtt aag gtt gaa ttc tgg ccc tgc tcc ccg atc acc336Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr100 105 110cag ggt gac agg gga gtg ggc tcc agt gct gtt att cta gat gat aac384Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn115 120 125ttt gta aca aag gcc aca gcc ctc acc tat gac ccc tat gta aac tac432Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
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本发明的优点及积极效果1、本发明得到的二株重组鸡痘病毒可同时表达PCV2衣壳蛋白和FMDV P1结构蛋白，且表达的蛋白可分别与相应的抗体发生特异性反应。
2、本发明得到的二株重组鸡痘病毒可刺激小鼠产生有效的体液免疫和细胞免疫。
3、本发明得到的两株重组鸡痘病毒对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。
4、本发明得到的两株重组鸡痘病毒具有很好的遗传稳定性，经多次传代后外源基因不丢失，且可在非禽属动物(如哺乳动物)细胞中表达外源蛋白。
5、本发明所使用的目的基因为中国流行株O_NY00株FMDV的P1基因以及PCV2衣壳蛋白ORF2、复制蛋白ORF1基因，从而构建的重组鸡痘病毒可作为预防2型猪圆环病毒和O型口蹄疫病毒的二联基因工程活载体疫苗。


图1是本发明重组质粒pUTALP1-ORF2构建流程图；图2是本发明重组质粒pUTALP1-ORF2-ORF1构建流程图。
具体实施例方式1.大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)相关章节进行。
1.1大肠杆菌感受态细胞的制备在无菌条件下，挑取冻存于-70℃冰箱的菌种，划线接种于不含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板上，37℃倒置培养16h左右。挑取单个菌落，接种到3ml不含抗生素的LB培养液中，37℃振摇培养过夜。次日无菌吸取1ml细菌培养液加入到预热至37℃的100ml不含Amp的LB培养液中，37℃剧烈振摇(200r/min)培养。培养至OD600＝0.4～0.5(约2.5～3h)后，冰浴15min，使培养物冷却至0℃。在无菌条件下(注意，以下操作均需严格无菌且在冰水浴中进行)，将细菌培养液转移到2个无菌且冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，4℃条件下离心(4000r/min)10min，弃上清；回收细菌沉淀，每管加入10ml冰预冷的75mmol/LCaCl2、10mmol/L Tris·Cl(pH6.5)溶液重悬沉淀，冰浴10min，4℃4000r/min离心10min，彻底弃上清；每管用2ml冰浴冷的CaCl2保存液[75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris·Cl pH6.5、15％(v/v)甘油]将菌体沉淀悬起。将重悬好的感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管100l，置-70℃超低温冰箱或于液氮中冻存备用。
1.2 PCR产物的连接将PCR产物与T载体(pMD18-T、pGEM-T Easy T载体连接，按照试剂盒(pGEM-Teasy Vector Kit，Promega公司)说明进行操作。T载体(30ng/l)2l，T4连接酶1l，回收DNA片段适量并加水补至10l，于4℃反应14～16h。
1.3转化在冰水中融化一支感受态细胞，将2l连接产物加入其中并轻轻混匀，冰浴30min，42℃热冲击90s后，立即冰浴10min，加250l LB培养基(室温条件)，37℃振摇225r/min 1h。取50l和200l加到预先涂有一定量的X-Gal(50mg/ml)和IPTG(200mg/ml)的LB(含25g/ml kana或50g/ml Amp)琼脂板，均匀涂布后，待菌液吸干后，置于37℃培养过夜。
1.4质粒的提取1.4.1质粒的小量制备(碱裂解法)在无菌条件下，用无菌牙签挑取单个转化菌落，接种于3ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃250r/min振摇培养过夜，将培养物转入1.5ml的微量离心管中，6000r/min离心3min，将管倒置于吸水纸上，尽可能地吸去残留的培养液。用100l冰预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl pH8.0，10mmol/L EDTA)重悬细菌沉淀。加入200l新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，颠倒数次混匀，加入150l冰预冷的溶液III(3mol/L KAC，5mol/L冰乙酸)，颠倒混匀，冰浴5min，4℃12000r/min离心10min。取上清分别加等量饱和酚、饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，最后取上清加2倍体积冷无水乙醇与1/10体积3M NaAc，混合均匀，0℃放置2h以上，12000r/min离心10min，弃上清，将沉淀用70％冷乙醇洗涤两次(注意沉淀不要被洗丢)，室温干燥，用20l含终浓度20g/ml的无DNA酶的RNA酶(10mg/ml)的TE(10mmol/L Tris·Cl pH8.0，1mmol/L EDTA)溶解沉淀，37℃水浴30min，琼脂糖凝胶电泳鉴定后，置-20℃保存备用。
1.4.2质粒的大量提取与纯化将含有目的质粒的细菌接种于250ml的LB培养基(含相应抗生素)中，37℃200r/min振摇培养16～18h，4℃4000r/min离心10min，弃上清，沉淀用50ml冰预冷的STE(0.1mmol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl pH8.0，50mmol/L EDTA)重悬沉淀，4℃4000r/min离心10min，弃上清，沉淀用5ml冰预冷的溶液I重悬沉淀，加入10ml新配制的溶液II，充分混匀，加入7.5ml冰预冷的溶液III，轻轻混匀，冰浴10～15min，4℃7000r/min离心15min，上清经4层纱布过滤至50ml无菌离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，充分混匀，室温中放置30min，10000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，干燥。加适量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加等体积5mol/L LiCl，充分混匀，冰浴放置10min，12000r/min离心10min，取上清，加等量异丙醇充分混匀，10000r/min离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤，室温干燥，以适量TE(pH8.0)溶解沉淀，加无DNA酶的RNA酶(10mg/ml)至终浓度20g/ml，37℃水浴30min，加等体积含13％(w/v)聚乙二醇溶液(PEG8000)的1.6mol/L NaCl，充分混匀，置4℃过夜，4℃12000r/min离心10min，弃上清，加400l TE(pH8.0)溶解沉淀，用等体积饱和酚、酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，加100l NaAC，2倍体积冷无水乙醇，混匀后置-20℃存放30min以上，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤，室温干燥，溶于TE(pH8.0)中，计算质粒DNA浓度，贮存于-20℃。
1.5质粒DNA的定量以TE(pH8.0)为空白对照，用TZK-800Z型紫外分光光度计测定波长260nm和280nm的核酸溶液光密度(OD)值。OD260＝l相当于含质粒大约50g/ml，双链DNA纯品的OD260/OD280值为1.8，若OD260/OD280值明显低于1.8，则可能有蛋白质或酚污染，需进一步纯化。
1.6限制性内切酶的消化单酶酶切反应将1.0g的质粒DNA与适量水混匀，使其总体积为20l，加入2～3ul限制性内切酶及2l相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度水浴2～3h，取5l反应液进行琼脂糖凝胶电泳检查。对大量质粒DNA的酶切反应，相应扩大限制性内切酶用量和反应体积，取少量反应液电泳检查，完全酶切后，于-20℃保存，以备进一步鉴定或回收片段之用。
双酶酶切反应选择两种酶反应活性均在75％～100％的同一缓冲系统进行双酶切反应，其反应的具体方法同单酶切。若温度或缓冲系统不同，则按先低温后高温，先低盐后高盐的顺序进行。或第一酶切完成后，酚、仿抽提DNA后，乙醇沉淀，再进行第二酶切反应。
1.7从病料中提取DNA1)将病死猪的脏器反复冻融三次，取2g腹股沟淋巴结或肠系膜淋巴结充分研磨，磨碎使其成组织匀浆。
2)37℃水浴1小时，匀浆置于离心管中。
3)5000rpm离心10分钟，取上清液，在其中加入300ug/mL蛋白酶K和1％SDS，56℃消化2小时，再用苯酚、氯仿抽提2-3次。
4)小心吸上清于洁净离心管中，加入1/10体积的NaAC和2倍体积的无水乙醇。
5)12000rpm离心15分钟，将沉淀溶于适量TE缓冲液中，-20℃保存备用。1.8PCR反应首先配置PCR反应液，包括10×Ex Taq Buffer(无Mg2+)、MgCl2(25mM)、Ex TaqTMDNA聚合酶、上游引物(20pM)、下游引物(20pM)及去离子水，按适当的组分进行混合，再加入上述DNA模板产物。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性1min；51℃退火1min；72℃延伸1min；30个循环后，72℃再延伸10min。
1.9 PCR产物的电泳与回收纯化PCR产物于1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以两种核苷酸分子量Marker(DL-2000和λ-EcoT14 I digest)确定目的条带的大小。具体方法是1×TAE(40mmol/L Tris-乙酸，1mmol/L EDTA)缓冲液配成所需浓度的琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解之后，加溴化乙锭(5mg/ml EB)至终浓度为0.5g/ml，混匀后倒入根据需要选定好的电泳胶模中，凝胶厚度在3～5mm之间(快速鉴定时可适当厚些)，插入宽度相当的梳子，梳子距底板大约0.5～1mm。待凝胶完全凝固后(约30～45min)，小心拔出梳子，将凝胶放入装有0.5×TAE的电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳缓冲液刚没过胶面(约1mm)。然后取适量待电泳的DNA样品滴在Parafilm膜上与1/6体积的电泳上样缓冲液(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，40％蔗糖)混匀，用微量加样器将混合样品加到加样槽中，以5V/cm的电压电泳。当溴酚蓝电泳至适当位置后，用长波紫外灯观察并记录结果。
用DNA片段快速提取/回收试剂盒(Vitagene公司产品)对目的片段进行回收纯化。具体操作是(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100l)；(2)根据凝胶浓度，加入充足量DE-A溶液，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于45℃加热)，间断混合，直至凝胶块完全熔化(约6-8分钟)；(3)加0.5个DE-A体积的DE-B溶液，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入异丙醇至终浓度为20％；(4)吸取(3)中的混合液，转移到DNA制备管，3600rpm离心1min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1min，弃滤液；(5)将制备管置回离心管，加0.5mlW1溶液，3600rpm离心30s，弃滤液；(6)将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用0.7mlW2溶液洗涤一次；(7)将制备管置于离心管中，最高速度离心1min；(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25l水或洗脱液，室温静置1min。最高速度离心1min洗脱DNA。
2.重组表达质粒的构建2.1融合基因ORF2-ORF1中间质粒的构建用限制性内切酶SpeI、SmaI双酶切pMD18T-ORF1质粒后，回收PVC2 ORF1基因，同时用SpeI、SmaI双酶切pMD18T-ORF2质粒后，回收含PCV2 ORF2基因的大片段。将后者与ORF1基因定向连接，构建含融合基因的中间质粒pMD18T-ORF2ORF1。
2.2含FMDV P1基因重组鸡痘病毒载体中间质粒的构建将用Spe I消化的pKSP1质粒获得P1基因，经补平、末端去磷后，用ClaI消化的pKS线性载体补平、末端去磷后，两者连接转化后对重组质粒pKSP1鉴定方向以确保HindIII位于上游。用HindIII/SalI消化重组质粒pKSP1获得P1基因，将其与用相同酶消化的pUTA2-16Lac Z后的pUTA2L连接得到重组质粒pUTA2LP1。
2.3共表达重组鸡痘病毒载体转移质粒的构建分别用HincII和SmaI双酶切质粒pMD18T-ORF2和pMD18T-ORF2ORF1，回收ORF2基因和ORF2ORF1融合基因，分别与经SmaI酶切并去磷的pUTALP1相连接，构建ORF2基因和ORF2-ORF1融合基因分别与P1共表达重组鸡痘病毒载体转移质粒pUTALP1-ORF2，pUTALP1-ORF2ORF1。
3.同源重组及重组病毒的筛选、纯化3.1 FPV毒价测定用于同源重组的FPV经细胞传代复壮，计算空斑形成单位(PFU)，并用HE染色，鉴定病毒。将FPV按102~106稀释倍数接种于传代生长的6×30mm培养板CEF单层，补加含1％甲基纤维素和1％小牛血清(FCS)的MEM作为维持液，37℃，5％CO2培养120h后，弃培养液，PBS(pH7.2)洗2次，室温下1％甲醛固定15min，自来水洗涤，0.1％结晶紫染色5min，自来水洗涤，统计病毒空斑数计算出每毫升病毒液中所含的空斑形成单位(Plaque forming units，PFU)。
PFU＝(病毒空斑数×稀释倍数)/染毒体积(ml)3.2体内同源重组转移质粒转染细胞采用脂质体法于6×30mm培养板中接种传代的CEF 1×105~3×105个/ml，当细胞长至80％融合时，感染0.1MOI(Multiplicity ofinfection)的FPV，37℃，5％CO2吸附2h后，与在室温下作用15~30min的转染试剂DOTAP和重组质粒的混合物共转染。即在500μl MEM中，加入8μlLipofectamineTMReagent，轻轻混匀，另取500μl MEM加入重组质粒DNA 10μg混匀。然后将后者滴加于前一液体中轻轻混匀，温室下作用15~30min。转染后12~18h，更换新鲜配制的含2％FCS的MEM，继续培养48~72h，收获病毒。测重组病毒的毒价。
3.3重组病毒的筛选和纯化在6×30mm培养板制备CEF单层，在接毒前24小时用含40μg/ml BUdR(5-溴脱氧核糖尿苷)的MEM营养液培养，然后按10MOI接种重组表达质粒转染后收获的病毒，5％CO2吸附2h后，再用含40μg/ml BUdR的MEM营养液培养120h，收获细胞。重复上述实验，然后将收获细胞反复冻融三次，在无BUdR的营养液中培养，待细胞出现病变后，分别挑出单个病毒蚀斑，纯化3次后，分别进行扩毒。用无BudR的MEM营养液培养，待出现细胞病变后挑出单个病毒蚀斑，并分别进行扩毒。
4.重组病毒的PCR鉴定细胞刮子将细胞刮下，4000rpm离心5min，收集细胞。用PBS(pH7.4)重悬细胞，指弹，重复两次。将4ul 100ug/m蛋白酶K加入400ul细胞裂解液(1％SDS，10mM NaCl，10mM EDTA，10mM Tris-HCl pH8.0)中，56℃水浴24h至裂解液透亮。然后用等体积酚/仿抽提，12,000rpm离心10min。上清液中加入800ul无水乙醇和80ulNH4AC，-20℃过夜。4℃12,000rpm离心10min，晾干后用适量RTE 37℃作用1小时，电泳观察。PCR时从其中取1～5ul即可。PCR反应条件为95℃预变性5min后，按94℃变性60s，61℃退火60s，72℃延伸1min共30个循环，最后72℃延伸10min。
5.重组病毒表达产物的检测5.1间接免疫荧光鉴定重组病毒取适量初步筛选并纯化的重组病毒，接种于飞片上CEF单层细胞，同时设FPV和细胞对照。37℃，5％CO2感作2h，加入含2％FCS的MEM培养液，继续培养到细胞出现明显病变后，取出飞片，PBS(pH7.2)洗一次，4％多聚甲醛固定30min-3小时，PBST冲洗。再用3％牛血清白蛋白缓冲液PBST(1*PBS，0.05％Tween20)溶液封闭2h后，与猪PCV2阳性血清(1∶300)反应2h，PBST洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗猪IgG(1∶100-1∶400)反应2h，PBST洗涤3~5次，载玻片上加一滴甘油缓冲液(50％甘油/PBST)，将载有细胞的飞片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察和拍照。
进行FMDV P1的间接免疫荧光检测时，一抗为兔抗FMDV多克隆抗体，二抗为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG，其余试剂及步骤同上。
5.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将扩增后的纯化重组病毒，以10MOI分别接种于10ml培养瓶1×106个/mlCEF细胞中，同时设FPV对照和细胞对照，至细胞出现明显病变时，弃培养液，用1ml 37℃预热的TEN(40mmol/L Tris·Cl pH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/LNaCl)洗脱细胞，收集于Eppendorf管中，3000r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗一次，加60μl裂解缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.4，1mmol/LMgCl2，0.5％NP40，20μg/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000r/min离心5min，-20冻存。
取30μl细胞裂解液与等量2×样品缓冲液(100mmol/L Tris·Cl，pH6.8，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，使用前加入2.5％β-巯基乙醇)混匀，于10％凝胶进行SDS-PAGE电泳。
5.3免疫印迹(Western blot)经SDS-PAGE分离蛋白后，将其电转移至硝酸纤维素膜上。5％脱脂乳或3％牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)37℃封闭2h，洗涤缓冲液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗涤3次，每次5~10min，2型猪圆环病毒阳性血清用封闭缓冲液稀释(1∶20)覆盖膜上，室温感作2h，洗涤3~5次，辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(1∶300)室温感作2h，洗涤3~5次后，每次5~10min，用10mlDAB缓冲液(在9ml的10mM Tris.HCl(pH7.6)溶液中溶解6mg二氨基联苯胺(DAB)，加入1ml0.3％(w/v)的NiCl2/CoCl2，用Whatmanl号滤纸过滤底物溶液以除去可能形成的沉淀物，加入15l 30％H2O2，)，混匀后立即使用。将洗涤过的膜移入浅托盘中，按0.1ml/cm2加入DAB底物反应液，于室温平缓摇动进行温育显色。显色5～20分钟后将硝酸纤维素膜移至蒸馏水中或用浓硫酸，终止显色，观察结果。
进行FMDV P1的Western blot检测时，一抗为兔抗FMDV多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，其余试剂及步骤同上。
6.重组病毒表达外源蛋白的稳定性将获得的重组病毒，用CEF细胞连续传10代，分别用第5和第10代重组病毒以10MOI的量接种同等量的CEF细胞，对收获的细胞总蛋白作SDS-PAGE和Western blot分析，检测目的蛋白的相对表达量。
7.重组病毒表达产物的检测结果筛选获得的重组鸡痘病毒vPUTAL-P1-ORF2和vPUTAL-ORF2ORF1-P1接种鸡胚成纤维细胞后，在感染细胞的细胞浆和细胞膜等处，均可观察到特异的黄绿色荧光，说明表达产物是特异的；经Western blot分析重组毒接种的细胞培养物分析，出现了可与抗口蹄疫病毒抗体结合的大小为79kD的特异带，证明了P1蛋白在鸡胚成纤维细胞中得到了表达；重组毒接种的细胞培养物分析，出现了可与抗猪圆环病毒多抗相结合的不同大小的特异性条带(约25kD、65kD)。8.重组病毒的免疫原性研究8.1重组病毒免疫小鼠重组病毒接种CEF单层细胞，培养40h，收取感染细胞。4℃3000r/min离10min，细胞沉淀(培养液上清待用)悬浮于10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液，于冰上超声波破碎4×15秒，将此悬液4℃3000r/min离心10min，取上清测定病毒PFU，调整病毒的滴度使其达到107PFU/100ul。
BALB/c雌性小鼠36只，体重18～20g，随机分3组，采取足垫皮下注射方式，分别注射重组鸡痘病毒vUTAL-P1-ORF2和vUTAL-P1-ORF2ORF1，和不含任何外源基因的FPV野生毒各0.1ml。上述各组均免疫三次，间隔20天，最后一次免疫后的第10天摘眼球取血，颈椎脱臼处死，凝血分离血清供ELISA检测抗PCV2抗原的IgG抗体。无菌取其脾脏用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚类的数量。
8.2脾脏免疫学指标的检测8.2.1脾脏单淋巴细胞悬液制备颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于盛有PBS培养基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，1500r/min，离心5min，弃上清。用Hanks液离心洗细胞两次，重悬于含10％NBS的RPMI 1640培养液中，计数，调至2×107个/ml备用。
8.2.2脾T淋巴细胞亚类数量的检测取脾细胞悬液0.1ml，加5ml PBS，1500r/min，离心10min，洗细胞两次，在0.5ml PBS细胞悬浮液中分别加荧光标记大鼠抗小鼠CD4+和CD8+单克隆抗体(此抗体用PBS按1∶10稀释)4温避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min离心10min，将管底细胞用200μl PBS悬浮，待上流式细胞仪检测。FACS检测10000个细胞，所得数据进行统计学处理。
8.2.3脾细胞特异性CTL细胞毒活性检测靶细胞的制备首先构建质粒pDISPLAY-P1。将口蹄疫病毒P1基因片段插入到质粒pDISPLAY启动子CMV下游的多克隆位点，构建重组质粒pDISPLAY-P1，用于靶细胞的制备。将该质粒5g与脂质体8l轻柔混合后转染P815细胞进行培养。
G418浓度的确定将转染P815细胞在含有10％胎牛血清的1640培养液中培养3天后，将不同稀释度的G418加入到培养液进行加压筛选，观察细胞的生长状态，获得合适的G418添加浓度。
转有目的基因质粒细胞的加压筛选转染后的细胞进行传代培养，并在其培养液中加入已确定合适浓度的G418，继续培养。反复多次加压筛选后，直到细胞能够正常生长，且细胞达到足以作为靶细胞和刺激细胞的数量。如果暂时不用，可以在液氮中贮存备用。
刺激细胞的制备 应用丝裂霉素(80μg/ml)对上述制备的靶细胞作用4h后，调整到1×106个/ml，备用。
脾细胞的制备 将小鼠捕杀、采血、取脾、研磨、过滤，最后一次用Hank′s液洗涤，弃上清，再用含有10％犊牛血清的1640培养液(IL-2，2μg/ml；Con A，20ng/ml)1ml重悬脾细胞，上板，37℃培养1天后，按10∶1加入刺激细胞作用24～48h，再调整脾细胞数到1×107个/ml(注意一定要将刺激细胞和脾细胞充分混匀)，继续培养4-5天。
CTL活性检测1)效应细胞的记数将每个样品板中的效应细胞进行记数，最后吸取细胞数达到1×106个/ml。
2)靶细胞的记数将经G418加压筛选的靶细胞进行记数，计算细胞数量。
3)脾细胞与靶细胞的处理将两种细胞均用Hank′s液洗涤一次后，最后一次用5％犊牛血清的1640培养液重新悬浮细胞。
4)上板将经过上述处理的效应细胞(4×106个细胞/ml)和靶细胞分别加入96孔细胞培养板板中，每个样品设8个孔，其中4个孔加靶细胞，按效应细胞∶靶细胞分别为100∶1和50∶1。设置实验测试孔及对照孔，具体方法见下表。

5)CTL杀伤活性检测(1)将上述37℃、5％CO2培养箱中至少培养4h后，尽量使脾细胞和靶细胞充分接触。
(2)在待检测前45min，向含有100l的靶细胞孔内加入10l裂解液(10×)，作为对照的靶细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)最大释放值计算。(注意如果靶细胞裂解不完全，可再加入裂解液4l)(3)待作用完全后(即4h后)，250g离心4min。
(4)用移液器小心从96孔板每一孔中移出50l液体，分别加入另外一块ELISA板的相应孔内(注意样品顺序)，再加入预先用底物缓冲液配置的底物混合物50l作用30min(注意底物及底物混合物用完后迅速置于-20℃冰箱内，不得长时间放置于37℃条件下；二者作用过程中，须用铂纸等遮光)。
(5)作用30min后，加入硫酸终止液50l，充分混合后在酶标仪上进行检测。
(6)根据测得数据计算每组脾细胞的杀伤活性 8.3 ELISA试剂盒测定免疫小鼠血清中抗PCV2抗体ELISA试剂盒中的包被抗原为杆状病毒表达的ORF2衣壳蛋白，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体。
在“U”型的多孔板内，将每一份被检血清制备成2份50l，两倍连续稀释的血清稀释液，起始滴度为1∶4，向每一孔内加入相应的一抗，在37℃孵育1h，血清的稀释度一直上升到1∶64；用PBS液将ELISA板洗涤5次；每孔加羊抗小鼠免疫球蛋白辣根过氧化物酶的二抗结合物，置于旋转震荡器上37℃孵育1h，洗板；显色 每孔加50l含有0.05％H2O2(30％W/V)的联苯二胺溶液；终止 用50l 1.25M硫酸溶液终止反应15min。
测定 在酶联免疫仪620nm测量各孔OD值。
对照 对照由下列各项组成对于每一个使用的抗原，用4～8孔，不加血清只加50l用PBS(含有0.05％Tween-20和酚红指示剂)稀释的抗原，相应的小鼠抗血清，2倍连续稀释，每个稀释度2孔；阴性小鼠血清，2倍连续稀释，每个稀释度2孔。
结果判定 抗体滴度以被检血清能达到与无被检血清的病毒对照孔光吸收平均值的50％的最终稀释度来表示。滴度超过1∶40为阳性，滴度接近1∶40时，应使用病毒中和实验进行重检。
9.重组病毒在本体动物猪的免疫学研究同小鼠的免疫学和检测方法。
检测结果获得的两株重组鸡痘病毒vPUTAL-ORF2-P1和vPUTAL-ORF2ORF1-P1提取基因组后进行PCR扩增，均得预期大小的目的片段。间接免疫荧光试验和Westernblot检测均为阳性结果，说明构建的重组鸡痘病毒可分别表达口蹄疫病毒结构蛋白前体P1和猪圆环病毒衣壳蛋白及复制蛋白。两株重组鸡痘病毒均可在非禽属动物细胞中表达，且重组病毒具有良好的遗传稳定性。将重组鸡痘病毒大量扩增后进行小鼠免疫实验，可在免疫小鼠血清中检测到抗FMDV结构蛋白和PCV2衣壳蛋白的抗体，表明重组病毒刺激小鼠机体产生了特异性体液免疫。免疫小鼠脾T细胞亚类数量的检测及CTL杀伤试验结果均显示小鼠产生了特异性细胞免疫。将重组鸡痘病毒进行猪免疫实验，得到了同样的结论。
研究结果表明，二株重组鸡痘病毒是一种安全、有效的基因工程活载体疫苗，具有开发成为用于断奶仔猪多系统衰竭综合征和口蹄疫预防性和治疗性疫苗的良好前景。
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权利要求
1.一种共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗，其特征在于建立一个新的猪圆环病毒基因组文库应用PCR方法将中国PCR2流行株nm2002的全基因分段扩增并克隆到pMD18-T和pGEM-T Easy载体中，构建了pMD18T-ORF2与pGEMT-XS两个质粒，拼接而得到中国PCV2流行株nm2002的全基因组序列；再将免疫相关基因从构建的DNA文库中亚克隆到表达载体中，在宿主细胞中表达出相应基因，作为预防或诊断奶仔猪多系统衰竭综合征的蛋白质、基因重组体或重组免疫原。
2.根据权利要求1所述的共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗，其特征在于将FMDV O-NYOO株的P1区基因从pKS-P1载体上用HindIII和SalI双酶切后插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL P7.5串联启动子下游，形成中间载体pUTALP1，同时将中国流行株PCV2nm2002的PCV2ORF2基因从载体pMD18T-ORF2上用HincII和SmaI双酶切后，插入到鸡痘病毒表达载体pUTALP1ATI-P7.5复合启动子下游，构建了共表达PCV2ORF2与FMDV O-NYOOP1重组鸡痘转移质粒pUTALP1-ORF2。
3.根据权利要求2所述的共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗，其基因序列是atg acg tat cca agg agg cgt tac cgg aga aga aga cac cgc ccc cgc 48Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg1 5 10 15agc cat ctt ggc cag atc ctc cgc cgc cgc ccc tgg ctc gtc cac ccc 96Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro20 25 30cgc cac cgt tac cgc tgg aga agg aaa aat ggc atc ttc aac acc cgc144Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg35 40 45ctc tcc cgc acc ttc gga tat act atc aag cga acc aca gtc aaa acg192Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr50 55 60ccc tcc tgg gcg gtg gac atg atg aca ttc aat att aat gac ttt ctt240Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Thr Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu65 70 75 80ccc cca gga ggg ggc tca aac ccc cgc tct gtg ccc ttt gaa tac tac288Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr85 90 95aga ata aga aag gtt aag gtt gaa ttc tgg ccc tgc tcc ccg atc acc336Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr100 105 110cag ggt gac agg gga gtg ggc tcc agt gct gtt att cta gat gat aac384Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn115 120 125ttt gta aca aag gcc aca gcc ctc acc tat gac ccc tat gta aac tac432Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr130 135 140tcc tcc cgc cat acc ata acc cag ccc ttc tcc tac cac tcc cgc tac480Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr145 150 155 160ttt acc ccc aaa cct gtc cta gat tcc act att gat tac ttc caa cca528Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro165 170 175aac aac aaa aga aat cag ctg tgg ctg aga cta caa act gct gga aat576Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn180 185 190gta gac cac gta ggc ctc ggc act gcg ttc gaa aac agt ata tac gac624Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp195 200 205cag gaa tac aat atc cgt gta acc atg tat gta caa ttc aga gaa ttt672Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe210 215 220aat ctt aaa gac ccc cca ctt aac ccc taa702Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro225 230
4.根据权利要求1所述的共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗，其特征在于将FMDV O-NYOO株的P1区基因从pKS-P1载体上用HindIII和SalI双酶切后插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL P7.5串联启动子下游，形成中间载体pUTALP1，同时将中国流行株PCV2 nm2002的ORF2-ORF1融合基因的中间质粒pMD18T-ORF2-ORF1用HincII和SmaI双酶切后，插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL ATI-P7.5复合启动子下游，构建共表达PCV2ORF2-ORF1与FMDV O-NYOO P1重组鸡痘转移质粒pUTALP1-ORF2-ORF1。
5.根据权利要求4所述的共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗，其基因序列是atg acg tat cca agg agg cgt tac cgg aga aga aga cac cgc ccc cgc48Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg1 5 10 15agc cat ctt ggc cag atc ctc cgc cgc cgc ccc tgg ctc gtc cac ccc96Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro20 25 30cgc cac cgt tac cgc tgg aga agg aaa aat ggc atc ttc aac acc cgc 144Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg35 40 45ctc tcc cgc acc ttc gga tat act atc aag cga acc aca gtc aaa acg 192Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr50 55 60ccc tcc tgg gcg gtg gac atg atg aca ttc aat att aat gac ttt ctt240Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Thr Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu65 70 75 80ccc cca gga ggg ggc tca aac ccc cgc tct gtg ccc ttt gaa tac tac288Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr85 90 95aga ata aga aag gtt aag gtt gaa ttc tgg ccc tgc tcc ccg atc acc336Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile 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6.根据权利要求1所述的共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗，其特征在于相关蛋白可以在植物杆状病毒表达载体中从昆虫细胞中得到表达，也可以是动物病毒表达载体或其它真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达。
全文摘要
一种共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的二联重组活载体疫苗，属于生物技术领域，特别是涉及一种共表达猪圆环病毒及口蹄疫病毒的重组活载体疫苗。本发明的目的在于提供两种分别共表达2型猪圆环病毒(PCV2)中国流行株衣壳蛋白ORF2或ORF2－ORF1(复制蛋白)融合蛋白与O型口蹄疫病毒(FMDV)中国流行株NY00株结构蛋白前体P1的重组鸡痘病毒，作为预防我国PCV2和FMDV感染的二联基因工程活载体疫苗。本发明得到的二株重组鸡痘病毒可刺激小鼠产生有效的体液免疫和细胞免疫，并且两株重组鸡痘病毒对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。
文档编号C07K14/005GK1749397SQ20041001104
公开日2006年3月22日 申请日期2004年8月18日 优先权日2004年8月18日
发明者金宁一, 秦晓冰, 郑敏, 尹革芬, 金扩世, 夏志平, 李昌, 费东亮, 金洪涛 申请人:金宁一