专利名称：鬼臼脂素类化合物及其应用与制备方法
技术领域：
本发明涉及一类新的鬼臼脂素类化合物，以及这种化合物的用途和这种化合物的合成方法。
背景技术：
鬼臼毒素(Podophylltoxin)及相关木脂素是一类具有显著细胞毒性的天然活性物质。自二十世纪四十年代，King和Shliivan首次报道鬼臼毒素具有类似秋水仙碱的作用以来(Stahelin H.F.，Eur.J.Cancer，1970，6，303)，虽然因其毒副作用，曾在一段时间内限制了其在临床上的应用。之后，许多化学家和药物学家对其结构进行了修饰，以期获得抗肿瘤活性好且毒副作用小的鬼臼脂素类药物。二十世纪六七十年代，山道士公司相继发现4′-去甲表鬼臼脂素的β-D-葡萄糖衍生物VP-16(etopside)和VM-26(teniposide)具有强烈的抑制肿瘤细胞的活性，1983年VP-16由美国FDA正式批准上市(New YorkAcademic Press Inc.，1984)。VP-16主要合成路线可参见1)北京制药工业研究所一室，北京医药工业，211，1984；2)日本公开特许公报，61-134396；3)中国专利CN 1057054A；WO 93/02094；4)中国专利CN 1337402A)。Etopophos(Brit 19892207674)是VP-16的4′-磷酸酯二钠盐，已于1996年在美国上市。另还有NK-611(日本公开特许88-10789；Drug Fut 1991，16(2)，113)、TOP-53(Drug Fut 1996，21，1136；Cancer Res 1996，56，2809)、GL-331(Mol Pharmacol 1996，49，721)等几个药物已经进入临床II期或III期实验，不久将要上市。试验表明，VP-16等鬼臼脂素类药物对小细胞肺癌，非何杰氏病，急性单核细胞白血病，遂性单核细胞白血病，乳腺癌，膀胱癌，睾丸癌等众多肿瘤细胞有较好的治疗效果，但却存在着耐药性强，水溶性差，严重的骨髓抑制以及口服效果差等缺点，寻找新的抗肿瘤活性好且毒副作用小的鬼臼类药物，仍然是药学界的一大热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新型抗肿瘤细胞化合物，这类新的化合物预期具有水溶性好，有较低的毒性和较高的抗肿瘤作用。同时本发明提供这种这类新化合物的用途及其制备方法。
本发明的化合物的分子式如下 式I中R可以是氢，或甲基，或异丙基，或甲硫亚甲基，或新丁基，或异丁基，或苄基，或羟甲基，或2-羟基乙基，或对羟基苄基；n＝3或4或5。
经相关试验表明，式I的化合物对HL-60人白血病肿瘤细胞生长有独特的抑制作用，而且其中的部分化合物还对A-549人肺癌肿瘤细胞生长有显著的抑制作用。因此本发明的化合物可用于制备抗肿瘤的药物。
本发明的制备方法是将N-保护的氨基酸钾盐与N1-溴代烷基5-Fu在干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，KI催化反应，脱去保护基，形成氨基酸的N1-5-Fu基-烷醇酯盐酸盐。把上述盐酸盐加入到二氯甲烷中，加入等量的三乙胺室温搅拌反应，蒸除溶剂纯化得到L-氨基酸5-Fu醇酯类化合物，所用方法参见文献方法(赵儒林等，高等学校化学学报，1989，10，605及Brenner M，Huber W.Helv. Chim.Acta.1953，36，1109)；将鬼臼在干燥的溴化氢作用下制备4β-Br-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼脂素，所用方法参见Kuhn M.et al.，Helv.Chim.Acta.1969，52，944；再将4β-Br-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼脂素溶解在四氢呋喃中，再加入L-氨基酸5-Fu醇酯类化合物和三乙胺进行反应，反应完全后，过滤沉淀，减压蒸除溶剂并柱层析，用二氯甲烷-丙酮或二氯甲烷-甲醇混合液洗脱，得式I化合物。反应中可在室温至回流温度下进行。随着反应温度的升高，反应时间减短，产率提高。
相关的反应参见反应式1和反应式2。
反应式1 反应式2上反应式1和2中R可以是氢，或甲基，或异丙基，或甲硫亚甲基，或新丁基，或异丁基，或苄基，或羟甲基，或2-羟基乙基，或对羟基苄基。式中n＝3或4或5，也就是说5-Fu基醇酯可以是5-Fu基丙醇酯，或者5-Fu基丁醇酯，或者5-Fu基戊醇酯。
本发明的最佳制备方法是将4β-Br-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼脂素0.3mmol溶解在10ml四氢呋喃中，加入1.3当量的氨基酸5-Fu醇酯类化合物，并加入等量的三乙胺反应，反应在回流条件进行。
由本发明的化合物可见，它是将鬼臼脂素的C环4位以氨基酸(5-Fu基)醇酯类化合物取代。由于鬼臼类药物具有多样性。鬼臼毒素能和纯化的微管蛋白结合，抑制细胞微管的聚合，致使复制后的染色体不能分裂，细胞分裂停止．而5-Fu属于氟代嘧啶类代谢物，对上皮组织的实体瘤等有效，能与烷化剂，抗肿瘤抗生素和其它抗代谢肿瘤药物合用。同时，L-氨基酸在体内可以主动传送，可以作为药动团连接于药效团上，而且肿瘤在某个发育阶段合成蛋白质的速度较快，要求氨基酸在癌细胞内快速浓集，有利于吸收和转运，因此，本发明的化合物会比单一化合物的抗肿瘤效果更好；而且若使用得当，还可能减少或延缓耐药性的产生，加之鬼臼衍生物与5-Fu具有不同的抗癌机理，前者具有亲脂性，后者有良好的水溶性；再加上L-氨基酸在人体中具有特殊的生理活性，因此将4′-去甲表鬼臼衍生物与5-Fu通过L-氨基酸联结成一个新的药物分子，可以得到高效低毒、脂水分配系数适当，特别是能定点释放的药物。这样药物分子在体内运输过程中相对稳定，逐渐分解，最后在肿瘤细胞靶点定位释放，达到更佳的治疗效果。而且本发明还可以克服5-Fu醇酯类化合物的首过代谢显著，亲脂性低，口服吸收不完全，直肠吸收更差，生物利用度低的不足，并在一定程度上克服服药恶心、呕吐、腹泻和脱发等缺点。本发明的相关试验证明此类化合物对HL-60人白血病肿瘤细胞生长有独特的抑制作用，部分化合物对A-549人肺癌肿瘤细胞生长有显著的抑制作用。与现有抗肿瘤化合物相比，本发明的化合物含有水溶性的氨基酸和5-氟尿嘧啶，却不含有葡萄糖的复杂结构。除此以外，本发明的化合物合成方法简单，不涉及4′-去甲表鬼臼脂素的官能团保护与脱保护，原料廉价易得。
具体实施例方式
本发明提供以下的实施例实施例14β-4-脱氧-氮取代的缬氨酸(5-Fu基)丙醇酯的4′-去甲表鬼臼脂素取10mmol乙酰乙酸乙酯保护的氨基酸钾盐与等量的N1-溴代丙基5-Fu溶解在干燥的DMF中，加入痕量的KI室温反应24小时。滤除KBr，滤液减压蒸除DMF，加70ml乙酸乙酯溶解，再加50ml1M的碳酸氢钠和2×50ml水洗涤，并用无水硫酸钠干燥过夜。减压蒸除溶液，加入20ml1M的氯化氢的甲醇溶液室温搅拌2小时，减压蒸除溶剂，用15ml水溶解，并用2×15ml乙酸乙酯萃取，水层减压蒸溜，得氨基酸的N1-5-Fu基-丙醇酯的盐酸盐。把上述盐酸盐加入到20ml二氯甲烷中，并加入等量的三乙胺室温搅拌4小时，蒸除溶剂柱层析，得粘稠状的L-氨基酸(5-Fu基)丙醇酯。本反应步骤与赵儒林等人发明于高等学校化学学报，1989，10，605及Brenner M，Huber W.Helv.Chim.Acta.1953，36，1109所公开的方法相同。
取6.6g鬼臼溶于60ml二氯乙烷和6ml乙醚中，冷却至0℃并通入16.5g干燥的HBr，然后在0℃放置19h，在浴热不超过25℃的情况下减压蒸除溶剂，加10.5ml丙酮纯化得白色固体4β-Br-4′-去甲表鬼臼脂素。本发明中制备4β-Br-4′-去甲表鬼臼脂素的这一方法系Kuhn M.et al.，Helv.Chim.Acta.1969，52，944文献所公开的方法。
称取140mg4β-Br-4′-去甲表鬼臼脂素(0.3mmol)溶解在10ml四氢呋喃中，加入1.3当量的L-缬氨酸(5-Fu基)丙醇酯，并加入等当量的三乙胺反应。用TLC检查，待反应结束后，过滤生成的沉淀Et3NBr。减压蒸除溶剂并柱层析，得白色固体4β-4-脱氧-氮取代的缬氨酸(5-Fu基)丙醇酯的4′-去甲表鬼臼脂素，并用甲醇进行重结晶。产物的检测数据如下产率24％；m.p.122-124℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)7.29(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.4Hz)，6.50(s，1H，H-5)，6.49(s，1H，H-8)，6.23(s，2H，H-2，6)，5.96(d，2H，OCH2O，J＝5.4Hz)，5.40(br，1H，4’-OH)，4.54(d，1H，H-1，J＝5.1Hz)，4.31(t，2H，OCH2，J＝3.9Hz)，4.23(m，1H，H-4)，3.97(m，1H，H-11a)，3.82(t，2H，CH2-5Fu，J＝6.9Hz)，3.75(s，6H，OCH3)，3.60(m，1H，H-11b)，3.47(s，1H，OH)，3.41(dd，1H，H-2，J＝14.1Hz，5.1Hz)，3.22(d，1H，CH*CHMe2，J＝4.8Hz)，2.87(m，1H，H-3)，2.32(m，1H，CH*Me2)，2.08(t，2H，-CH2-)，0.83(s，3H，CH3)，0.81(s，3H，CH3)；IR(KBr)υcm-1，3433，2962，1711，1482，1231，1114；HRMS(ESI)C33H36O11N3F，理论值(M+H)，670.2407，实测值，670.2404；[α]D25℃＝-83°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为Ia。
实施例2
4β-4-脱氧-氮取代的苯丙氨酸5-Fu丙酯的4′-去甲表鬼臼脂索实验步骤与实施例1同，仅以苯丙氨酸代替缬氨酸。反应所得产物检测数据如下产率33％；m.p.113-115℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)9.34(br，1H，CONH*CO)，7.32~7.09(m，5H，Ar-H)，7.03(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.1Hz)，6.45(s，1H，H-5)，6.33(s，1H，H-8)，6.22(s，2H，H-2′，6′)，5.95(d，2H，OCH2O，J＝1.8Hz)，5.46(br，1H，OH)，4.45(d，1H，H-1，J＝5.4Hz)，4.26(d，2H，H-11，J＝8.7Hz)，4.10(t，2H，OCH2，J＝6.0Hz)，4.02(d，1H，H-4，J＝3.9Hz)，3.74(s，6H，OCH3)，3.50(t，2H，CH2-5Fu，J＝6.6Hz)，3.38(t，CH*CH2Ar，J＝6.9Hz)3.16(dd，1H，H-2，J1＝13.5，5.4Hz)，3.01(m，2H，ArCH2-)，2.75(m，1H，H-3)，1.85(m，2H，-CH2-)；IR(KBr)υcm-1，3440，2918，1772，1697，1481，1230，1112；HRMS(ESI)C37H36O11N3F，理论值(M+Na)，740.2226，实测值，740.2237；[α]D25℃＝-55°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为Ib。
实施例34β-4-脱氧-氮取代的异亮氨酸5-Fu丙酯的4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，仅以异亮氨酸代替实施例1的缬氨酸。反应所得产物检测数据如下产率38％；m.p.118-120℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)8.84(br，1H，CONH*CO)，7.28(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.4Hz)，6.65(s，1H，H-5)，6.50(s，1H，H-8)，6.24(s，2H，H-2′，6′)，5.97(d，2H，OCH2O，J＝5.4Hz)，5.41(br，1H，OH)，4.55(d，1H，H-1，J＝5.7Hz)，4.33(s，1H，OCHa)，4.30(s，1H，OCHb)，4.23(m，1H，H-4)，3.95(d，1H，H-11a)，3.82(t，2H，CH2-5Fu，J＝6.0Hz)，3.76(s，6H，OCH3)，3.60(m，1H，H-11b)，3.47(s，1H，OH)，3.42(dd，1H，H-2，J＝13.8，5.4Hz)，3.29(d，1H，CH*COO，J＝5.4Hz)，2.85(m，1H，H-3)，2.32(m，1H，CHMe2)，2.08(m，2H，-CH2-)，1.74(m，1H，EtCH*Me)，1.41(m，1H，MeCHa*CHMe)，1.19(m，1H，MeCHb*CHMe)0.89(m，6H，2CH3)；IR(KBr)υcm-1，3439，2963，1773，1714，1481，1231，1114；HRMS(ESI)C34H38O11N3F，理论值(M+H)，684.2563，实测值，684.2562；[α]D25℃＝-81°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为Ic。
实施例44β-4-脱氧-氮取代的甲硫氨酸5-Fu丙酯的4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，仅以甲硫氨酸代替实施例1的缬氨酸。反应所得产物检测数据如下产率27％；m.p.109-111℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)7.29(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.4Hz)，6.65(s，1H，H-5)，6.49(s，1H，H-8)，6.23(s，2H，H-2，6)，5.96(d，2H，OCH2O，J＝5.4Hz)，5.40(br，1H，NH)，4.54(d，1H，H-1，J＝5.1Hz)，4.31(t，2H，OCH2，J＝3.9Hz)，4.23(m，1H，H-4)，3.97(m，1H，H-11a)，3.82(t，2H，CH2-5Fu，J＝6.9Hz)，3.75(s，6H，OCH3)，3.60(m，1H，H-11b)，3.47(s，1H，OH)，3.41(dd，1H，H-2，J1＝14.1Hz，J2＝5.4Hz)，3.22(d，1H，CH*CHMe2，J＝4.8Hz)，2.87(m，1H，H-3)，2.32(m，1H，CHMe2)，2.08(t，2H，-CH2-)，0.83(s，3H，CH3)，0.81(s，3H，CH3)；IR(KBr)υcm-1，3438，2915，1773，1698，1481，1231，1113；HRMS(ESI)C33H36O11N3FS，理论值(M+H)，702.2127，实测值，702.2125；[α]D25℃＝-85°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为Id。
实施例5
4β-4-脱氧-氮取代的缬氨酸5-Fu丁酯的4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，仅以N1-溴代丁基5-Fu代替实施例1中的N1-溴代丙基5-Fu。反应所得产物检测数据如下产率18％；m.p.129-130℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)7.34(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.1Hz)，6.65(s，1H，H-5)，6.49(s，1H，H-8)，6.24(s，2H，H-2′，6′)，5.96(d，2H，OCH2O，J＝5.4Hz)，5.41(br，1H，OH)，4.54(d，1H，H-1，J＝5.4Hz)，4.29(t，2H，OCH2，J＝3.9Hz)，4.19(m，2H，H-11)，3.96(t，2H，CH2-5Fu，J＝6.9Hz)，3.90(s，1H，H-4)，3.76(s，6H，OCH3)，3.62(s，1H，NH)，3.42(dd，1H，H-2，J1＝14.1Hz，J2＝5.4Hz)，3.22(d，1H，CH*CHMe2，J＝4，8Hz)，2.87(m，1H，H-3)，1.99(m，1H，CHMe2)，1.60(t，4H，-CH2CH2-)，0.93(s，3H，CH3)，0.91(s，3H，CH3)；IR(KBr)υcm-1，3443，2960，1774，1715，1481，1231，1114；HRMS(ESI)C34H38O11N3F，理论值(M+H)，684.2563，实测值，684.2582；[α]D25℃＝-94°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为IIa。
实施例64β-4-脱氧-氮取代的苯丙氨酸5-Fu丁酯的4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，但以苯丙氨酸代替缬氨酸，以N1-溴代丁基5-Fu代替N1-溴代丙基5-Fu。反应所得产物检测数据如下产率46％；m.p.111-113℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)7.31(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.4Hz)，7.28~7.06(m，5h，Ar-H)，6.48(s，1H，H-5)，6.33(s，1H，H-8)，6.21(s，2H，H-2′，6′)，5.94(s，2H，OCH2O)，4.54(d，1H，H-1，J＝5.1Hz)，4.27(s，1H，H-11a)，4.24(s，1H，H-11b)，4.08(m，2H，COOCH2)，3.92(m，1H，H-11a)，3.82(t，2H，CH2-5Fu，J＝6.9Hz)，3.75(s，6H，OCH3)，3.64(m，2H，CH2-5Fu)3.60(m，1H，H-11b)，3.51(t，1H，ArCH2CH*，J＝6.9Hz)，3.16(dd，1H，H-2，J1＝14.1Hz，J2＝5.4Hz)，3.00(d，2H，CHCH*2Ar，J＝6.9Hz)，2.80(m，1H，H-3)，1.58(m，4H，-CH2CH2-)；IR(KBr)υcm-1，3442，2920，1773，1698，1481，1230，1112；HRMS(ESI)C38H38O11N3F，理论值(M+H)，732.2563，实测值，732.2555；[α]D25℃＝-53°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为IIb。
实施例74β-4-脱氧-氮取代的异亮氨酸5-Fu丁酯的4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，但以异亮氨酸代替缬氨酸，以N1-溴代丁基5-Fu代替N1-溴代丙基5-Fu。反应所得产物检测数据如下产率40％；m.p.115-118℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)8.84(br，1H，CONH*CO)，7.31(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.1Hz)，6.64(s，1H，H-5)，6.49(s，1H，H-8)，6.24(s，2H，H-2′，6′)，5.89(d，2H，OCH2O，J＝5.4Hz)，5.42(br，1H，OH)，4.75(m，2H，OCH2)，4.55(t，1H，H-1，J＝6.0)，4.33(s，1H，H-1)4.29(m，1H，H-4)，4.18(m，2H，H-11a)，3.94(t，2H，CH2-5Fu，J＝6.0Hz)，3.76(s，6H，OCH3)，3.61(s，1H，H-11b)，3.42(dd，1H，H-2，J＝13.5，5.4Hz)，3.28(d，1H，CH*COO，J＝4.8Hz)，2.77(m，1H，H-3)，1.76(m，4H，-CH2CH2-)，1.42(m，1H，MeCHa*CHMe)，1.20(m，1H，MeCHb*CHMe)0.88(m，6H，2CH3)；IR(KBr)υcm-1，3460，2962，1773，1714，1482，1231，1115；HRMS(ESI)C33H36O11N3F，理论值(M+H)，698.2720，实测值，698.2705；[α]D25℃＝-77°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为IIc。
实施例84β-4-脱氧-氮取代的甲硫氨酸5-Fu丁酯的4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，但以甲硫氨酸代替缬氨酸，以N1-溴代丁基5-Fu代替N1-溴代丙基5-Fu。反应所得产物检测数据如下产率35％；m.p.99-102℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)8.86(br，1H，CONHCO)，7.28(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.4Hz)，6.68(s，1H，H-5)，6.49(s，1H，H-8)，6.25(s，2H，H-2′，6′)，5.96(s，2H，OCH2O)，5.40(br，1H，OH)，4.54(d，1H，H-1，J＝5.1Hz)，4.32(t，2H，OCH2，J＝6.0Hz)，4.25(m，1H，H-11a)，4.15(m，1H，H-11b)，4.01(d，1H，H-4，J＝4.8Hz)，3.78(t，2H，CH2-5Fu，J＝7.2Hz)，3.66(s，6H，OCH3)，3.60(t，1H，CH*CO，J＝4.8Hz)，3.44(dd，1H，H-2，J＝14.1，5.7Hz)，2.80(m，1H，H-3)，2.51(t，2H，CH2S，J＝7.2Hz)2.09(s，3H，SCH3)2.01(m，1H，CHa)，1.83(m，1H，CHb)1.73(m，4H，-CH2CH2-)；IR(KBr)υcm-1，3356，2916，1772，1696，1482，1230，1113；HRMS(ESI)C34H38O11N3FS，理论值(M+H)，716.2284，实测值，716.2287；[α]D25℃＝-68°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为IId。
实施例94β-氮取代的缬氨酸5-Fu戊醇酯的4-脱氧-4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，但以N1-溴代戊基5-Fu代替N1-溴代丙基5-Fu。反应所得产物检测数据如下产率15％；m.p.112-114℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)8.88(br，1H，CONHCO)，7.25(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.4Hz)，6.65(s，1H，H-5)，6.49(s，1H，H-8)，6.24(s，2H，H-2，6)，5.96(s，2H，OCH2O，)，5.42(br，1H，OH)，4.55(d，1H，H-1，J＝5.1Hz)，4.30(t，2H，OCH2，J＝3.9Hz)，4.15(m，1H，H-11a)，3.95(d，1H，H-4，J＝4.8Hz)，3.75(s，6H，OCH3)，3.69(t，2H，CH2-5Fu，J＝6.9Hz)，3.60(m，1H，H-11b)，3.47(s，1H，OH)，3.41(dd，1H，H-2，J1＝13.5Hz，J2＝5.1Hz)，3.20(d，1H，CH*CHMe2，J＝4.8Hz)，2.85(m，1H，H-3)，1.96(m，1H，CHMe2)，1.73(m，4H，CH2)，1.48(m，2H，-CH2-)，0.95(s，3H，CH3，J＝6.9Hz)，0.88(d，3H，CH3，J＝7.2Hz)；IR(KBr)υcm-1，3434，2958，1773，1715，1482，1231，1115；HRMS(ESI)C35H40O11N3F，理论值(M+H)，698.2720，实测值，698.2716；[α]D25℃＝-103°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为IIIa。
实施例104β-氮取代的苯丙氨酸5-Fu戊醇酯的4-脱氧-4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，但以苯丙氨酸代替缬氨酸，以N1-溴代戊基5-Fu代替N1-溴代丙基5-Fu。反应所得产物检测数据如下产率21％；m.p.125-128℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)9.34(br，1H，CONH*CO)，7.32~7.09(m，5H，Ar-H)，7.03(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.1Hz)，6.45(s，1H，H-5)，6.33(s，1H，H-8)，6.22(s，2H，H-2′，6′)，5.98(d，2H，OCH2O，J＝3.0Hz)，5.39(br，1H，OH)，4.43(d，1H，H-1，J＝5.4Hz)，4.26(d，2H，H-11，J＝8.7Hz)，4.10(t，2H，OCH2，J＝6.0Hz)，4.02(d，1H，H-4，J＝3.9Hz)，3.74(s，6H，OCH3)，3.76(t，CH*CH2Ar，J＝5.7Hz)3.67(t，2H，CH2-5Fu，J＝7.5Hz)，3.26(dd，1H，H-2，J1＝13.5，5.4Hz)，3.05(m，1H，ArCHa-)，2.87(m，1H，ArCHb-)2.75(m，1H，H-3)，1.66(m，4H，-CH2-)，1.32(m，2H，CH2)；IR(KBr)υcm-1，3443，2938，1774，1714，1482，1231，1114；HRMS(ESI)C39H40O11N3F，理论值(M+H)，746.2720，实测值，746.2705；[α]D25℃＝-80°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为IIIb。
实施例11
4β-氮取代的异亮氨酸5-Fu戊醇酯的4-脱氧-4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，但以异亮氨酸代替缬氨酸，以N1-溴代戊基5-Fu代替N1-溴代丙基5-Fu。反应所得产物检测数据如下产率27％；m.p.106-108℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)8.84(br，1H，CONH*CO)，7.25(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.1Hz)，6.65(s，1H，H-5)，6.47(s，1H，H-8)，6.22(s，2H，H-2′，6′)，5.95(d，2H，OCH2O，J＝5.4Hz)，5.45(br，1H，OH)，4.53(d，1H，H-1，J＝5.1Hz)，4.31(m，1H，H-4)，4.15(m，2H，COOCH2)3.95(d，1H，H-11a)，3.77(s，3H，OCH3)，3.73(s，3H，OCH3)，3.70(t，2H，CH2-5Fu，J＝7.2Hz)，3.46(m，1H，H-11b)，3.40(dd，1H，H-2，J＝13.8，5.4Hz)，3，26(d，1H，CH*COO，J＝4.8Hz)，2.79(m，1H，H-3)，1.72(m，4H，-CH2-)，1.51(m，1H，EtCH*Me)，1.42(m，2H，CH2)1.17(m，2H，CH2*MeCHMe)，0.89(m，6H，2CH3)；IR(KBr)υcm-1，3427，2960，1774，1716，1482，1231，1113；HRMS(ESI)C36H42O11N3F，理论值(M+H)，712.2876，实测值，712.2885；[α]D25℃＝-81°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为IIIc。
实施例124β-氮取代的甲硫氨酸5-Fu戊醇酯的4-脱氧-4′-去甲表鬼臼脂素实验步骤与实施例1同，但以甲硫氨酸代替缬氨酸，以5-Fu戊醇酯代替5-Fu丙醇酯。反应所得产物检测数据如下产率36％；m.p.102-104℃；1HNMR(CDCl3，TMS，300MHz)7.32(d，1H，H-6(5-Fu)，J＝5.4Hz)，6.48(s，1H，H-5)，6.42(s，1H，H-8)，6.23(s，2H，H-2，6)，5.95(d，2H，OCH2O，J＝5.4Hz)，5.40(br，1H，OH)，4.53(d，1H，H-1，J＝5.4Hz)，4.11(t，2H，OCH2，J＝4.5Hz)，4.23(m，1H，H-4)，3.97(m，1H，H-11a)，3.70(t，2H，CH2-5Fu，J＝6.9Hz)，3.75(s，6H，OCH3)，3.60(m，1H，H-11b)，3.41(dd，1H，H-2，J1＝14.1Hz，J2＝5.4Hz)，2.80(m，1H，H-3)，2.49(s，2H，CH2S)，2.08(s，3H，SCH3)，1.99(m，1H，CH*aCH2SMe)，1.82(m，1H，CH*bCH2SMe)，1.71(m，4H，CH2)，1.40(t，2H，-CH2-)，；IR(KBr)υcm-1，3427，2917，1773，1695，1481，1230，1113；HRMS(ESI)C35H40O11N3FS，理论值(M+H)，730.2440，实测值，730.2439；[α]D25℃＝-79°(c＝0.5，CH3COCH3)。
进行后述对肿瘤细胞抑制率实验中，本实施例样品编号为IIId。
相关的药理实验方法及结果本发明的药理实验采用四氮唑盐还原法(MTT分析法)以代谢还原3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2.5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)为基础。在实验中活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的(Formazan)，死细胞此酶消失，不被还原。用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在550nm波长处检测吸光度。
磺酰罗丹明B(sulforhodamineB，SRB)蛋白染色法SRB是一种蛋白结合染料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞数呈良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。
实验方法为(1)取培养4-5天，处于指数生长期的细胞培养一瓶，加入适量Trypsin-EDTA液，使贴壁细胞脱落，用10ml含5％胎牛血清的RPMI1640培养液配成悬液。(2)用台盼蓝染色后在血球记数板上作细胞记数。(3)用细胞培养基稀释喜报悬液，配成每100ml含10000或20000个细胞。(4)取96孔平板，每孔加细胞悬液100ul。并将平板置37℃CO2(5％)温箱24小时。(5)受试化合物作5个稀释度，依次为10-4，10-5，10-6，10-7，10-8mol/L。(6)将平板在37℃，含5％CO2空气及100％湿度的温箱中孵育2-3天。(7)MTT用无血清RPMI1640培养液配成1mg/ml溶液，每孔加50ul，37温育4小时，使MTT还原为甲替。(8)吸取上清液，加入150ulDMSO使甲替溶解，用平板摇床摇匀。(9)用自动化分光光度平板读数计在550nm处测定每个小孔的吸光度。
体外药理实验结果见下表对HL-60人白血病和A-549人肺癌肿瘤细胞生长的抑制率％。
表一对HL-60人白血病肿瘤细胞生长的抑制率％
注(1)筛选方法四氮唑盐还原法；(2)作用时间；48小时。
表二对A-549人肺癌肿瘤细胞生长的抑制率％
注(1)筛选方法磺酰罗丹明B蛋白染色法；(2)作用时间72小时体外实验证明，其中十一个化合物对白血病细胞株(HL-60)有强效，其抑制率比VP-16强2-3倍；五个化合物对A-549人肺癌为强效。该类化合物合成方法简单，原料廉价易得，药理活性显著，有望成为拥有我国自主知识产权的一类治疗HL-60白血病和A-549人肺癌的新型药物。
对比例疗效对比一类新型抗肿瘤细胞化合物，4β-4-脱氧-氮取代的氨基酸5-Fu醇酯的4′-去甲表鬼臼脂素类化合物与VP-16、5-氟尿嘧啶等对比，新型抗肿瘤细胞化合物对白血病细胞株(HL-60)有特效，部分新型抗肿瘤细胞化合物对肺癌细胞株(A-549)有强效。
权利要求
1.式I的化合物 式I中的R可以是氢，或甲基，或异丙基，或甲硫亚甲基，或新丁基，或异丁基，或苄基，或羟甲基，或2-羟基乙基，或对羟基苄基；n＝3或4或5。
2.据权利要求1所述的式I化合物的应用，用于制备抗肿瘤药物。
3.据权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于将N-保护的氨基酸钾盐与N1-溴代烷基5-Fu在干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，KI催化反应，脱去保护基，形成氨基酸的N1-5-Fu基-烷醇酯盐酸盐，把所得盐酸盐加入到二氯甲烷中，加入等量的三乙胺室温搅拌反应，蒸除溶剂纯化得到L-氨基酸5-Fu醇酯类化合物；将由鬼臼制得的4β-Br-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼脂素；再将4β-Br-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼脂素溶解在四氢呋喃中，再加入L-氨基酸5-Fu醇酯类化合物和三乙胺进行反应，反应完全后，过滤沉淀，减压蒸除溶剂并柱层析，用二氯甲烷-丙酮或二氯甲烷-甲醇混合液洗脱，得式I化合物。
全文摘要
本发明公开一类新的鬼臼脂素类化合物，以及这种化合物的用途和这种化合物的制备方法。本发明的化合物是4β－4－脱氧－氮取代的氨基酸5－Fu酯的4′－去甲表鬼臼脂素。本发明的方法是将N－保护的氨基酸钾盐与N
文档编号C07D493/04GK1563011SQ200410026068
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者陈世强, 田瑄, 涂永强 申请人:兰州大学