多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物及其制备方法

专利名称：多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种聚乙二醇(PEG)与蛋白质或多肽的结合物及其制备方法，更具体地说，涉及一种多臂树杈型PEG与蛋白质或多肽的结合物及其制备方法。
背景技术：
各种天然和重组的蛋白质和多肽都具有医药有用性，但是在治疗应用时，有许多因素都使其很容易从体内循环中清除出去蛋白酶的酶解作用、肾脏的过滤作用、以及免疫系统的抗原抗体反应。在这其中，肾脏的过滤作用以及血液中的各种酶(特别是酯酶的水解作用)是蛋白类药物在血液中停留时间过短的主要原因。
将蛋白质或多肽与聚合物如PEG结合，可以克服这些问题。Davis等人在美国专利4,179,337中公开了将PEG与蛋白质或多肽(如酶和胰岛素)结合以得到结合物，其中蛋白质免疫原性较小并保留了大部分生理活性。Nakagawa等人在美国专利4,791,192中公开了将PEG与胰岛素结合以降低副作用和免疫原性的方法。Veronese等人(Applied Biochem and Biotech，11，141-152，1985)公开了用氯甲酸苯酯类化合物活化PEG以修饰核糖核酸酶和过氧化物酶。PEG是一种形式为乙二醇缩合形成的聚醚，有良好的生物相容性，能很好地溶解于水相和有机相，无毒，并且排泄动力学特性良好。目前常用的PEG有线型的和带两臂的分叉型两种，如Shearwater公司的Monfardini和J.Milton Harris公开的一种二臂型PEG(Bioconjugate Chem.，V6(1)，62-69，1995)等。
众所周知，蛋白质类药物与高分子结合物的性能和所用高分子材料的结构、分子量、分子量分布以及高分子的构型有关。目前一般的PEG和蛋白质或多肽的结合物因为其结构、构型、溶解度和表观分子量存在的局限性，使蛋白质类药物的生理作用没有被充分发挥，在体内还是很容易被各种酶分解和被肾小球过滤清除。

发明内容
本发明的目的是提供一种多臂树杈型PEG与蛋白质或多肽的结合物及其制备方法，以更加有效地改善蛋白质类药物的药理学半衰期、免疫原性及生物活性保留值。
为了实现这一目的，本发明利用通过三官能团小分子化合物和相应的化学反应形成的多臂树杈型PEG与蛋白质或多肽进行连接反应，通过合理选择控制反应的缓冲体系、蛋白质或多肽与多臂树杈型PEG的摩尔比例、反应温度、反应时间等，并进行提纯，从而制备出3臂至8臂的树杈型PEG蛋白质或多肽结合物纯品。具体地讲，本发明提供了如下式所示的多臂树杈型PEG与蛋白质或多肽结合物 蛋白质或多肽其中Z＝3-8；m为1-2，蛋白质或多肽都具有一个以上的-NH2基团，即本发明中多臂树杈型PEG的作用位点。每个蛋白质或多肽可以结合一个以上的多臂树杈型PEG。本发明中m优选为1。
PEGZ为多臂树杈型PEG，优选以下9种形式



其中，R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18是用来封闭PEG的单末端羟基的惰性基团；10个碳以下的直链烷基，异丙基或苄基都能够用来封闭PEG的单末端羟基，不会改变PEG的性质，其中优选为甲基；Rs1、Rs2、Rs3、Rs4、Rs5、Rs6、Rs7、Rs8、Rt1、Rt2、Rt3、Rt4、Rt5、Rt6、Rt7、Rt8、Rv1、Rv2、Rv3、Rv4、Rv5、Rv6、Rv7、Rv8、Rm1、Rm2、Rm3、Rm4、Rm5、Rm6、Rm7为-H或4个碳以下的低级烷基；优选为甲基；Rk1、Rk2、Rk3、Rk4、Rk5、Rk6、Rk7、Rk8是PEG的另外一个末端羟基在活化过程中形成的；Rn1、Rn2、Rn3、Rn4、Rn5、Rn6、Rn7、Rn8、Rn9、Rn10为三功能团的内部连接基团。这些基团可以是0-10碳的低级亚烷基，优选地为-CH2-、-CH2CH2-、-(CH2)3-、-CH(CH3)2-、-(CH2)4-、-CH(CH3)(CH2CH3)-、-C(CH3)2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-；W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W11、W12、W13、W14、W15、W16为是活化后的PEG与三功能团结合所形成的基团，可以是-O-、-S-、-NH-、-NHCH2-、-NHCH2CH2-、-NH(CH2)3-、-NHCH(CH3)2-、-NH(CH2)4-、-NHCH(CH3)(CH2CH3)-、-NHC(CH3)2CH2-、-NHCH(CH3)CH2CH2-、-NHCH2CH(CH3)CH2-，优选地为-NH-和-NHCH2-；
x1、y1、z1、x2、y2、z2、x3、y3、z3、x4、y4、z4、x5、y5、z5、x6、y6、z6、x7、y7、z7、x8、y8和z8为任意数字组合，使得多臂树杈型PEG的分子量为4000-100000道尔顿的范围内。
如其中的一个八臂树杈型PEG-胰岛素结合物 其他多臂PEG蛋白质或多肽结合物具有与上述结合物相类似的结构，具体结构主要根据具体臂数及具体药物的不同而有所不同。具有生理活性的任何蛋白质或多肽都可用于制备与上述PEG的结合物，只要上述蛋白质或多肽含有至少一个可供缩合的氨基。
本发明的多臂树杈型PEG与蛋白质或多肽的结合物和相同分子量的线性和两臂PEG与蛋白质或多肽的结合物相比，其一，由于多臂树杈型PEG的流体力学体积大，当它与蛋白质或多肽的某个部位结合后，由于空间位阻的作用，其他部位就很难与另一分子的多臂树杈型PEG反应，从而提高对结合部位的选择性，而且这样蛋白质类药物的生物活性保留值更高；其二，由于多臂结构的存在，使得多臂树杈型PEG能更有效地阻止接近蛋白质或多肽表面的大分子或细胞，从而进一步提高结合物在体内循环的时间，减少免疫反应的发生；其三，由于多臂树杈型PEG的流体力学体积大，本发明的多臂树杈型PEG与蛋白质或多肽结合物的肾脏清除速率大大降低，因而大大地提高了结合物的体内作用时间。


图1本发明的实施例2中三臂树杈型PEG-粒细胞集落刺激因子的MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/离子化质谱)谱图。
图2本发明的实施例1、4-11中三臂树杈型PEG-蛋白质结合物的SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠一聚丙稀酰胺凝胶电泳)图。
图3本发明的实施例20中四臂树杈型PEG-重组人干扰素β的MALDI-TOF谱图。
图4本发明的实施例49中未修饰的干扰素、PEG-INTRON、三臂树杈型PEG-干扰素以尾静脉注射方式在大鼠体内的浓度衰减曲线图。
图5本发明的实施例50中四臂树杈型PEG-粒细胞集落刺激因子对小鼠实验的药效图。
具体实施例方式
下面，通过具体实施例对本发明作进一步说明。这些实施例只是为了进行说明，而不是用来限定本发明的范围。
实施例1三臂树杈型PEG(分子量为13.3K，分子式如下)-干扰素α2b结合物的制备 将赖氨酸(439mg，3mmol)溶于20ml pH值8.0-8.3的水中，然后在3小时内向其中分6批均匀加入mPEG2CO2PhNO2(二臂单甲氧基PEG对硝基苯酚酯，分子量11,000，其中一臂为5,400，另一臂为5,600，11g，1mmol，其中单甲氧基PEG可缩写为mPEG)，同时用0.2N的NaOH来维持体系的pH在8.3。在室温搅拌过夜后，将反应物冷却到0℃，并用2N的盐酸将体系的pH值调节到3。先用乙醚从水中提取杂质，再用氯仿连续提取三次，提取液浓缩后加入无水乙醚，得白色沉淀，所得的沉淀经乙醇两次重结晶后，得到mPEG2单取代的赖氨酸(mPEG2-mono-Lysine)。
向溶有上述产品(9.9g，0.9mmol)的无水二氯甲烷(20ml)中，加入三乙胺(TEA)直至pH值达到8。mPEGCO2PhNO2(线型mPEG对硝基苯酚酯，分子量2300，2.415g，1.05mmol)在3个小时之内分6批均匀加入反应液中，同时用TEA维持体系的pH值在8左右。反应物回流72小时后，冷却至室温，浓缩后，过滤，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重结晶。过量的mPEGCO2PhNO2在pH9-10的Na2CO3缓冲液中搅拌过夜后被水解，溶液冷却至0℃，并用2N的盐酸将体系的pH值调节到3。然后通过乙醚提取溶液中的对硝基苯酚。再用氯仿连续提取三次，提取液经干燥、浓缩后用无水乙醚沉淀，然后用无水乙醇重结晶。所得产物用QAE Sephadex A50柱(5×80cm，淋洗液pH8.9的硼砂缓冲液)进一步纯化，得mPEG3CO2H。
将本实施例所制备的mPEG3CO2H(7.98g，0.6mmol)溶于无水二氯甲烷(20ml)中，冷却至0℃后，向其中加入N-羟基丁二酰亚胺(0.138g，1.2mmol)和二环己基碳二亚胺(DCC，0.48g，1.2mmol)，室温搅拌过夜后，过滤，滤液经浓缩后用无水乙醚沉淀，再经乙酸乙酯重结晶，得纯产物mPEG3CO2Su产物。
将上述mPEG3CO2Su(100mg)在室温条件下加入到干扰素-α2b(浓度为5mg/ml，4ml，缓冲液体系为pH7.0的50mM磷酸缓冲液)中，反应1小时后，加入1M的甘氨酸100μl终止反应，得到三臂树杈型PEG-干扰素α2b结合物粗产物。
三臂树杈型PEG-干扰素α2b结合物粗产物用TSK-GEL Super SW3000分子筛柱纯化两次。将层析柱用pH7.5的50mM NaCl溶液平衡后上样，上样为柱体积的2％，280nm检测，收集第一个洗脱峰，得到三臂树杈型PEG-干扰素α2b结合物纯品。
实施例2三臂树杈型PEG(分子量为15K，分子式如下)-粒细胞集落刺激因子(G-CSF)结合物的制备
按照实施例1的方法，以分子量为10K的mPEG2CO2PhNO2和分子量为5K的mPEGCO2PhNO2为原料，制备得到分子量为15K的mPEG3CO2Su；经PEG修饰的粒细胞集落刺激因子用这个试剂按照实施例1中所述方法来制备。
所制备的结合物经MALDI-TOF质谱测定(测试方法参考MichaelGrace，J.of interferon and cytokine research，2001，1103-1115)，测定结果如图1所示。图中m/z 34641峰为结合物的单电荷峰；m/z 18966峰为极其微量的G-CSF的单电荷峰；m/z 17500为结合物的双电荷峰；因为G-CSF含量很低，所以其双电荷峰在图中不能显示出来。由图可见，三臂树杈型PEG和G-CSF已经成功地连接在一起。按照文献(Michael Grace，J.of interferon andcytokine research，2001，1103-1115)方法，可以得出结论此结合物的纯度非常高，为99％以上。
实施例3三臂树杈型PEG(分子量为90K，分子式如下)-干扰素α2b结合物的制备 按照实施例1的方法，以分子量为60K的mPEG2CO2PhNO2和分子量为30K的mPEGCO2PhNO2为原料，制备得到分子量为90K的mPEG3CO2Su。经PEG修饰的干扰素用这个试剂按照实施例1中所述方法来制备。
实施例4-13


并且对实施例1、4-11中的产物进行SDS-PAGE电泳检测(实验方法参考汪家政，蛋白质技术手册，科学技术出版社，第一版)，以证明结合物的成功制备，具体见图2，其中按照从左至右的次序，各条带(lane)依次为lane1实施例7中的三臂树杈型PEG-重组人干扰素β结合物；lane2实施例4中的三臂树杈型PEG-重组人干扰素α1a结合物；lane3实施例6中的三臂树杈型PEG-重组人干扰素α2a结合物；lane4实施例5中的三臂树杈型PEG-重组人干扰素α1b结合物；lane5实施例1中的三臂树杈型PEG-重组人干扰素α2b结合物；lane6实施例9中的三臂树杈型PEG-重组人粒细胞集落刺激因子结合物；lane7实施例8中的三臂树杈型PEG-重组人干扰素γ结合物；lane8实施例10中的三臂树杈型PEG-重组人白细胞介素2结合物；lane9低分子量标记(marker)，分子量分别为14k，20k，31k，43k，66k，97k；lane10实施例11中的三臂树杈型PEG-重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子结合物；由图可知，上述结合物都已经成功制备得到。
实施例14四臂树杈型PEG(分子量16K，分子式如下)-重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)结合物的制备

将赖氨酸盐酸盐(365mg，2mmol)溶于100ml pH值为8.0的硼砂缓冲液中，然后向其中加入mPEG2CO2Su(分子量8,000，32g，4mmol)，同时用0.2N的NaOH来维持体系的pH在8.0。在室温搅拌24小时后，将反应物用去离子水连续提取三次，提取液浓缩后滴加入无水乙醚中，得到白色沉淀，所得沉淀经乙醇两次重结晶后，得到mPEG4CO2H粗产物。粗产物经DEAESephadex FF柱分离后，得到纯的mPEG4CO2H。
将上述mPEG4CO2H(9.6g，0.6mmol)溶于无水二氯甲烷(20ml)中，冷却至0℃后，按照实施例1的方法制备得到纯产物mPEG4CO2Su。
将上述mPEG4CO2Su(100mg)在室温条件下加入到G-CSF(浓度为4mg/ml，5ml，缓冲液体系为pH6.5的50mM磷酸缓冲液)中，反应1小时后加入1M的甘氨酸50μl终止反应，得到四臂树杈型PEG-G-CSF结合物粗产物，并按照实施例1的方法提纯。
实施例15四臂树杈型PEG(分子量4K，分子式如下)-G-CSF结合物的制备

按照实施例14的方法，以分子量为2K的mPEG2CO2Su为原料制备得到分子量为4K的mPEG4CO2Su；并按照按实施例14方法制备得到经此试剂修饰的G-CSF。
实施例16-24


其中实施例20中的四臂树杈型PEG-重组人干扰素β结合物经MALDI-TOF质谱测定，结果如图3所示，其中m/z 36652为结合物的单电荷峰；m/z 20282为少量残留的干扰素β的单电荷峰；m/z 18277为结合物的双电荷峰；m/z 10135为少量残留的干扰素β的双电荷峰。由图中可见，四臂树杈型PEG和重组人干扰素β已经成功地连接在一起。按照文献(Michael Grace，J.of interferon andcytokine research，2001，1103-1115)方法，可以得出结论此结合物的纯度非常高，大约为98％。
实施例25四臂树杈型PEG(分子量为40K，分子式如下)-链激酶结合物的制备 按照实施例1方法制备得到纯产物mPEG3CO2PhNO2(分子量30K，单臂长分别为10K)，然后再制备得到mPEG3单取代的赖氨酸(mPEG3-mono-lysine)。向溶有mPEG3-mono-lysine(15g，0.5mmol)的无水二氯甲烷(20ml)中，加入TEA直至pH值达到8.0，mPEGCO2PhNO2(分子量为10K，6g，0.6mmol)在3个小时之内分6批均匀加入反应液中，同时用TEA维持体系的pH值在8左右。反应物回流72小时后，冷却至室温，浓缩后过滤，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重结晶。过量的mPEGCO2PhNO2在pH9-10的Na2CO3缓冲液中搅拌过夜后被水解，溶液被冷却至0℃，并用2N的盐酸将体系的pH调节到3。然后通过乙醚提取溶液中的对硝基苯酚。再用氯仿连续提取三次，提取液经干燥，浓缩后用无水乙醚沉淀，然后用无水乙醇重结晶。所得产物用QAE Sephadex A50柱(5×80cm，淋洗液pH8.9的硼酸缓冲液)进一步纯化，得分子量为40K的mPEG4CO2H。
将本实施例所制备的mPEG4CO2H(20g，0.5mmol)溶于无水二氯甲烷(20ml)中，冷却至0℃后，向其中加入N-羟基丁二酰亚胺(0.115g，1.0mmol)和DCC(0.40，1.0mmol)，按照实施例1方法得纯产物mPEG4CO2Su。
将本实施例所制备的mPEG4CO2Su(100mg)在室温条件下加入到链激酶(浓度为5mg/ml，4ml，缓冲液体系为pH7.0的50mM磷酸缓冲液)中，反应1小时后加入1M的甘氨酸30μl终止反应，得到四臂树杈型—链激酶结合物粗产物。四臂树杈型PEG-链激酶结合物按照实施例1的方法提纯。
实施例26四臂树杈型PEG(分子量100K，分子式如下)蛋白质或多肽结合物的制备 按照实施例25的方法，以分子量为70K的mPEG3CO2PhNO2和分子量为30K的mPEGCO2PhNO2为原料，制备得到分子量为100K的mPEG4CO2Su。并按照实施例25的方法制备得到经此试剂修饰的蛋白质或多肽。
实施例27五臂树杈型PEG(分子量23.3K，分子式如下)-IL-2结合物的制备 白细胞介素2又称为白介2，记IL-2。
按照实施例1方法制备mPEG3单取代的赖氨酸(分子量13.3K，臂长分别为5.6K，5.4K，2.3K，mPEG3-mono-lysine)。向溶有mPEG3-mono-lysine(2.66g，0.2mmol)的无水二氯甲烷(20ml)中，加入TEA直至pH值达到8.0，mPEG2CO2PhNO2(分子量为10K，2.5g，0.25mmol)在3个小时之内分6批均匀加入反应液中，同时用TEA维持体系的pH值在8左右。反应物回流72小时后，被冷却至室温，浓缩后，过滤，用乙醚沉淀，然后用少量乙醇重结晶。过量的mPEG2CO2PhNO2在pH9-10的Na2CO3缓冲液中搅拌过夜后被水解，溶液被冷却至0℃，并用2N的盐酸将体系的pH调节到3。然后通过乙醚提取溶液中的对硝基苯酚。再用氯仿连续提取三次，提取液经干燥、浓缩后用无水乙醚沉淀，然后用无水乙醇重结晶。所得产物用QAE SephadexA50柱(5×80cm，淋洗液pH8.9的硼酸缓冲液)进一步纯化，得mPEG5CO2H。
在0℃，向溶有上述mPEG5COOH(分子量为23.3K，4.66g，0.2mmol)的无水二氯甲烷(20ml)中加入对硝基苯酚(0.167g，1.2mmol)和DCC(0.48g，1.2mmol)，室温搅拌过夜后，过滤，滤液经浓缩后用无水乙醚沉淀，再经乙酸乙酯重结晶，得纯产物mPEG5COOPhNO2。
将上述mPEG5CO2PhNO2(120mg)在室温条件下加入到IL-2(浓度为2mg/ml，10ml，缓冲液体系为pH8.0的50mM磷酸缓冲液)中，反应1小时后加入1M的甘氨酸50μl终止反应，得到五臂树杈型PEG-IL-2结合物粗产物。五臂树杈型PEG-IL-2结合物按照实施例1的方法提纯。
实施例28五臂树杈型PEG(分子量为6K，分子式如下)蛋白质或多肽结合物的制备 按照实施例27的方法，以分子量为4K的mPEG3CO2PhNO2和分子量为2K的mPEG2CO2PhNO2为原料制备得到分子量为6K的mPEG5CO2PhNO2；并由实施例27的方法制备得到经此试剂修饰的蛋白质或多肽结合物。
实施例29五臂树杈型PEG(分子量为90K，分子式如下)蛋白质或多肽结合物的制备
按照实施例27的方法，以分子量为60K的mPEG3CO2PhNO2和分子量为30K的mPEG2CO2PhNO2为原料，制备得到分子量为90K的mPEG5CO2PhNO2。并按照实施例27方法制得经此试剂修饰的蛋白质或多肽结合物。
实施例30五臂树杈型PEG(分子量为25K，分子式如下)-ser125IL-2结合物的制备 按照实施例14，以mPEG2CO2H(分子量为10K，每条臂分子量为5K，30g，3mmol)制备mPEG4CO2H。
按照实施例27，以本实施例所制备的mPEG4CO2H(26g，1.3mmol)和mPEGCO2PhNO2(分子量为5K，7.5g，1.5mmol)制备得到mPEG5PhNO2。
按照实施例27，mPEG5CO2PhNO2(分子量为25K，120mg)和IL-2(浓度为2mg/ml，10ml)制备得到五臂树杈型PEG-ser125IL-2结合物纯品。
实施例31五臂树杈型PEG(分子量为5K，分子式如下)蛋白质或多肽结合物的制备
按照实施例30的方法，以分子量为4K的mPEG4CO2PhNO2和分子量为1K的mPEGCO2PhNO2为原料，制备得到分子量为5K的mPEG5PhNO2；并由实施例30的方法制得经此试剂修饰的蛋白质或多肽结合物。
实施例32五臂树杈型PEG(分子量为100K，分子式如下)蛋白质或多肽结合物的制备 以分子量为80K的mPEG4CO2PhNO2和分子量为20K的mPEGCO2PhNO2为原料，制备得到分子量为100K的mPEG5PhNO2。并由实施例30的方法制得经此试剂修饰的蛋白质或多肽结合物。
实施例33六臂树杈型PEG(分子量24K，分子式如下)-人红细胞生长素(EPO)结合物的制备 按照实施例1，以mPEG2CO2PhNO2(分子量10K，其中一臂为5K，另一臂为5K，10g，1mmol)，和mPEGCO2PhNO2(分子量2K，2.1g，1.05mmol)制备mPEG3CO2Su(分子量12K)。
按照实施例14，以本实施例所制备的mPEG3CO2Su(10.8g，0.9mmol)得到mPEG6CO2Su(分子量为24K)。
将上述mPEG6CO2Su(240mg)在室温条件下加入到EPO(浓度为2mg/ml，10ml，缓冲液体系为pH8.0的50mM磷酸缓冲液)中，反应1小时后加入1M的甘氨酸30μl终止反应，得到六臂树杈型PEG(分子量为24K)-EPO结合物的粗产物。六臂树杈型PEG-EPO结合物用实施例1的方法提纯。
实施例34六臂树杈型PEG(分子量为24K，分子式如下)-EPO结合物的制备 按照实施例14，以mPEG2CO2H(分子量为8K，40g，5mmol)制备mPEG4CO2H。继续按照实施例27以本实施例所制备的mPEG4CO2H(分子量16K，32g，2mmol)和mPEG2CO2PhNO2(分子量为8K，17.6g，2.2mmol)制备得到mPEG6PhNO2。按照实施例33方法制备和提纯六臂树杈型PEG-EPO结合物。
实施例35七臂树杈型PEG(分子量20K，分子式如下)-肿瘤坏死因子α结合物的制备
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是能够引起肿瘤组织出血坏死、并且具有多方面的细胞因子。
按照实施例1，以mPEG2CO2PhNO2(分子量8K，8g，1mmol)和mPEGCO2PhNO2(分子量2K，2.1g，1.05mmol)制备得到mPEG3-mono-lysine(分子量为10K)。
按照实施例14，以mPEG2CO2Su(分子量5K，20g，4mmol)制备得到mPEG4CO2PhNO2(分子量为10K)。
继续按照实施例27，以mPEG3-mono-lysine(分子量为10K，2g，0.2mmol)和mPEG4CO2PhNO2(分子量为10K，2.5g，0.25mmol)制备得到mPEG7CO2PhNO2(分子量20K)。
将上述mPEG7CO2PhNO2(分子量为20K，240mg)在室温条件下加入到TNFα(浓度为2mg/ml，10ml，缓冲液体系为pH8.0的50mM磷酸缓冲液)中，反应1小时后加入1M的甘氨酸30μl终止反应，得到七臂树杈型PEG-TNFα结合物粗产物。七臂树杈型PEG-TNFα结合物用实施例1的方法提纯。
实施例36七臂树杈型PEG(同实施例35)-TNFβ结合物的制备按照实施例35的方法，以mPEG7CO2PhNO2(200mg)和TNFβ(浓度为4mg/ml，5ml，缓冲液体系为pH8.0的50mM磷酸缓冲液)制备得到七臂树杈型PEG-TNFβ结合物。
实施例37八臂树杈型PEG(分子量40K，分子式如下)-胰岛素结合物的制备 按照实施例14的方法，制备mPEG4COSu(分子量为20K)，以所制备的mPEG4COSu为原料，将赖氨酸盐酸盐(365mg，2mmol)溶于200ml pH值为8.0的硼砂缓冲液中，然后向其中加入mPEG4CO2Su(80g，4mmol)，同时用0.2N的NaOH来维持体系的pH在8.0。在室温搅拌24小时后，将反应物用去离子水连续提取三次，提取液浓缩后滴加入无水乙醚中，得到白色沉淀，所得沉淀经乙醇两次重结晶后，得到mPEG8CO2H粗产物。粗产物经DEAE Sephadex FF柱分离后，得到纯的mPEG8CO2H。将上述mPEG8CO2H(24g，0.6mmol)溶于无水二氯甲烷(40ml)中，按照实施例1的方法制备mPEG8CO2Su。
将上述mPEG8CO2Su(100mg)在室温条件下加入到胰岛素(浓度为6mg/ml，1ml，缓冲液体系为pH6.5的50mM磷酸缓冲液)中，反应1小时后加入1M的甘氨酸50μl终止反应，得到八臂树杈型PEG-胰岛素结合物粗产物。八臂树杈型PEG-胰岛素结合物用实施例1的方法进行提纯。
实施例38八臂树杈型PEG(分子量6K，分子式如下所示)蛋白质或多肽结合物的制备

按照实施例37的方法，以分子量为4K的mPEG5CO2PhNO2和分子量为2K的mPEG3CO2PhNO2为原料，制备得到分子量为6K的mPEG8CO2Su；并按照实施例37的方法制备得到经此试剂修饰的蛋白质或多肽结合物。
实施例39八臂树杈型PEG(分子量100K，分子式如下所示)蛋白质或多肽结合物的制备

按照实施例37的方法，以分子量为70K的mPEG5CO2PhNO2和分子量为30K的mPEG3CO2PhNO2为原料，制备得到分子量为100K的mPEG8CO2Su。并按照实施例37的方法制备得到经此试剂修饰的蛋白质或多肽结合物。
实施例40-48


实施例49多臂树杈型PEG-蛋白质或多肽结合物的药动学实验这里以实施例1中制备的三臂树杈型PEG(分子量为13.3K)-干扰素IFNα2b结合物为例，检测了经多臂树杈型PEG修饰后，对药物在体内的衰减时间及衰减曲线的影响。
以未修饰的rhIFNα2b为阴性对照组，PEG-INTRON(Schering-PloughCorporation公司产品，所连接的为分子量为12K的线型PEG)为阳性对照组进行药动学研究。实验对象为150-170g的大鼠，尾静脉注射，注射剂量为400μg/ml。阴性对照组为连续4天注射；试验组和阳性对照组为单剂量注射。酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测，检测所用的抗体为抗-rhIFNα，药动学分析模型为权重w＝1/CC的二室模型。
实验发现，以三臂树杈型PEG修饰干扰素得到的PEG3-IFN结合物的半衰期为IFN的4.02倍，为Shering-Plough公司的PEG-INTRON的202％，具体结果如表1所示。

表1三种物质的半衰期比较表实验还发现，药物在大鼠体内的浓度衰减曲线也非常明显地显示了三臂PEG-IFN相对于其他两种对照物，在体内的循环时间延长，平均血药浓度提高了，具体结果见图4。
实施例50多臂树杈型PEG-蛋白质或多肽结合物的药效实验这里分别以实施例1和实施例14中制备的多臂树杈型PEG-蛋白质或多肽结合物为例，检测了经多臂树杈型PEG修饰后，对蛋白质或多肽的药效的影响。
1.三臂树杈型PEG-干扰素α2b结合物的抗病毒活性检测依照《细胞因子研究方法学》(孙卫民，人民卫生出版社，1999)对rhIFNα2b、三臂树杈型PEG-IFN的抗病毒活性进行检测。发现未修饰的干扰素的比活为3.45×107IU/mg，经三臂树杈型PEG修饰的干扰素的比活为4.0×106IU/mg，很明显，修饰后干扰素IFN的抗病毒活性大约增加了10倍。
2.四臂树杈型PEG-G-CSF药效检测集落刺激因子是能够诱导人(或小鼠)骨髓细胞或造血细胞在半固体琼脂系统中呈克隆生长的因子。集落刺激因子中能促进造血细胞形成粒细胞集落的称为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。对于G-CSF的动物体内药效学检测方法是在小鼠体内注射后，检测小鼠血液中白细胞的增加。以注射后白细胞的增加作为有效性的检测指标。
小鼠静脉注射四臂PEG-G-CSF(记PEG4-G-CSF)，剂量为250μg/kg，单剂量注射；同时以G-CSF为阴性对照组，以缓冲液作为背景对照组，以两臂PEG(每条臂长分子量为5K)-G-CSF(记PEG2-G-CSF，按照Phillippe，American J of hematology，2001，245-251方法制备)为阳性对照组，连续四天注射，剂量相同。小鼠注射后，眼眶取血，进行白细胞计数。最后一次注射记为第0天，取血时间分别是第0天注射前，第1天，第2天，第3天，第4天，第5天，第6天，第7天。所有的小鼠，在注射前测定白细胞数量，以此数量为基数；以后测定的数据为白细胞增加的倍数测定数/基数，从白细胞计数结果，发现PEG4-G-CSF的体内半衰期大于7天，而G-CSF在体内迅速衰减。实验同时表明PEG4-G-CSF在小鼠体内的药效相对PEG2-G-CSF的药效有大幅度的提高(具体见图5四臂树杈型PEG-粒细胞集落刺激因子对小鼠的药效图)。
所以从以上两个实施例可以看出，三臂树杈型PEG-干扰素和四臂树杈型PEG-G-CSF结合物和原蛋白质及单、双臂PEG-蛋白质结合物相比，由于多臂结构的存在，流体力学体积大，一方面，蛋白质类药物的生物活性保留值更高，另一方面，在体内的浓度衰减可以趋缓，清除率降低，在体内的循环时间延长，药效提高非常明显；而且，随着多臂树杈型PEG的臂数增多，其流体力学体积进一步增大，显而易见，其他的多臂树杈型PEG与蛋白质或多肽结合物也能增加循环时间、促进药效，能够用于制备相应的治疗和预防疾病的药物；并且还可以利用治疗惰性载体对本发明的多臂树杈型PEG与蛋白质或多肽结合物进行修饰，制备相应的药物组合物，用于制备相应的治疗和预防疾病的药物，这些都是本领域的公知知识，在这里就不再赘述。
权利要求
1.一种多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物，其特征在于，所述结合物的通式为 蛋白质或多肽其中m为1或2；PEGZ为多臂树杈型聚乙二醇，Z为臂数，为3-8。
2.如权利要求1所述的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物，其特征在于，所述PEGZ为以下9种形式之一 其中R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18为10个碳以下的直链烷基、异丙基或苄基；Rs1、Rs2、Rs3、Rs4、Rs5、Rs6、Rs7、Rs8、Rt1、Rt2、Rt3、Rt4、Rt5、Rt6、Rt7、Rt8、Rv1、Rv2、Rv3、Rv4、Rv5、Rv6、Rv7、Rv8、Rm1、Rm2、Rm3、Rm4、Rm5、Rm6、Rm7为-H或4个碳以下的低级烷基；Rk1、Rk2、Rk3、Rk4、Rk5、Rk6、Rk7、Rk8、Rn1、Rn2、Rn3、Rn4、Rn5、Rn6、Rn7、Rn8、Rn9、Rn10为0到10个碳的低级亚烷基；W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W11、W12、W13、W14、W15、W16为-O-、-S-、-NH-、-NHCH2-、-NHCH2CH2-、-NH(CH2)3-、-NHCH(CH3)2-、-NH(CH2)4-、-NHCH(CH3)(CH2CH3)-、-NHC(CH3)2CH2-、-NHCH(CH3)CH2CH2-、-NHCH2CH(CH3)CH2-；x1、y1、z1、x2、y2、z2、x3、y3、z3、x4、y4、z4、x5、y5、z5、x6、y6、z6、x7、y7、z7、x8、y8和z8为任意数字组合，使得多臂树杈型PEG的分子量在4000-100000道尔顿的范围内。
3.如权利要求2所述的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物，其特征在于，所述的R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18为甲基。
4.如权利要求2所述的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物，其特征在于，所述的Rs1、Rs2、Rs3、Rs4、Rs5、Rs6、Rs7、Rs8、Rt1、Rt2、Rt3、Rt4、Rt5、Rt6、Rt7、Rt8、Rv1、Rv2、Rv3、Rv4、Rv5、Rv6、Rv7、Rv8、Rm1、Rm2、Rm3、Rm4、Rm5、Rm6、Rm7为-H。
5.如权利要求2所述的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物，其特征在于，所述的Rk1、Rk2、Rk3、Rk4、Rk5、Rk6、Rk7、Rk8、Rn1、Rn、Rn3、Rn4、Rn5、Rn6、Rn7、Rn8、Rn9、Rn10为-CH2-、-CH2CH2-、-(CH2)3-、-CH(CH3)2-、-(CH2)4-、-CH(CH3)(CH2CH3)-、-C(CH3)2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-或-CH2CH(CH3)CH2-。
6.如权利要求2所述的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物，其特征在于，所述的W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W11、W12、W13、W14、W15、W16，为-NH-或-NHCH2-。
7.如权利要求1～6中任一项所述的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物，其特征在于，所述的蛋白质或多肽为重组人干扰素、重组白细胞介素、重组人红细胞生长素、重组人抗肿瘤坏死因子、重组人集落刺激因子、重组精氨酸脱亚胺酶、重组链激酶或重组人胰岛素。
8.一种权利要求1所述的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤将3-8臂树杈型PEG先和蛋白质或多肽进行连接反应，再由反应混合物中提纯出多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物。
9.权利要求1所述的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物在制备用于治疗或预防疾病的药物中的应用。
10.一种药物组合物，该组合物包含权利要求1所述的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物和治疗惰性载体。
全文摘要
本发明公开了一种新型的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物及其制备方法，利用由三官能团小分子化合物通过相应的化学反应形成的多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽进行连接反应，制备得到多臂树杈型聚乙二醇与蛋白质或多肽的结合物并提纯。这种结合物在体内循环时间长，水溶性好，保留了修饰前的蛋白质或多肽的生物活性，而且不易产生修饰前的蛋白质或多肽的不利免疫反应。
文档编号C07K14/62GK1569892SQ20041003519
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月30日 优先权日2004年4月30日
发明者胡小剑, 张映辉, 温华欢, 陈剑, 魏晓慧, 卢洁, 周向军, 黄骏廉, 徐宇虹, 徐敏 申请人:新峰生物科技(上海)有限公司