改良的基于热休克蛋白的疫苗和免疫治疗的制作方法

文档序号:3555665阅读:327来源:国知局
专利名称:改良的基于热休克蛋白的疫苗和免疫治疗的制作方法
相关申请的相互参考本申请要求2004年2月12日提交的美国专利申请序号10/776,521和2004年2月13日提交的PCT专利申请PCT/US04/04340的优先权,这两个专利申请都通过引用整体结合到本文中。根据美国法典第35部第119条(e)款,本申请还要求2003年4月11日提交的临时申请序号60/462,469、2003年4月18日提交的临时申请序号60/463,746和2003年9月16日提交的临时申请序号60/503,417的优先权,所有这三个临时申请都通过引用整体结合到本文中。
导言本发明涉及在患者中诱导免疫应答的方法和组合物,其中所述患者被给予有效量的至少一种或多种定义的杂合抗原,其任选结合一种或多种热休克蛋白。这些方法和组合物可用于治疗感染性疾病和癌症。
背景技术
热休克蛋白最初被观察到在暴露于温度突然升高的哺乳动物细胞中增量表达,而大部分细胞蛋白的表达显著下降。自此以后已测定出这些蛋白可在各类压力(包括葡萄糖剥夺)作用下产生。本文使用的术语“热休克蛋白”既包括如所述明确归类的蛋白,也包括其它应激蛋白,包括组成型表达的该蛋白同源物(即没有刺激条件)。热休克蛋白的实例包括BiP(也称为grp78)、hsp70、hsc70、gp96(grp94)、hsp60、hsp40和hsp90。
热休克蛋白能够结合非天然态的其它蛋白,特别是结合核糖体上形成的或被挤入内质网的新生肽。Hendrick and Hartl,Ann.Rev.Biochem.62349-384(1993);Hartl,Nature 381571-580(1996)。而且,热休克蛋白已经被表明对蛋白质在胞质、内质网和线粒体中的正确折叠和组装起重要作用;鉴于此功能,它们被称为“分子伴侣”。Frydman et al.,Nature 370111-117(1994);Hendrick and Hartl,Ann.Rev.Biochem.62349-384(1993);Hartl,Nature 381571-580(1996)。
例如,蛋白BiP是被称为hsp70家族的一类热休克蛋白中的一员,已发现其先于重链与轻链的组装在内质网中结合新合成的未折叠μ免疫球蛋白重链。Hendershot et al.,J.Cell Biol.104761-767(1987)。另一个热休克蛋白gp96是hsp90应激蛋白家族的一员,定位于内质网中。Li and Srivastava,EMBO J.123143-3151(1993);Mazzarella and Green,J.Biol.Cltem.2628875-8883(1987)。已提出gp96可帮助多亚单位蛋白在内质网中组装。Wiech et al.,Nature358169-170(1992)。
已在实验动物中观察到由肿瘤制备的热休克蛋白能够以肿瘤特异性方式诱导免疫应答;也就是说,由特定肿瘤纯化的热休克蛋白可在实验动物中诱导免疫应答,这种应答抑制同种肿瘤的生长,但不抑制其它肿瘤的生长。Srivastava and Maki,Curr.Topics Microbiol.167109-123(1991)。还没有发现编码热休克蛋白的基因具有肿瘤特异性DNA多态性。Srivastava and Udono,Curr.Opin.Immunol.6728-732(1994)。高分辨率凝胶电泳表明,gp96在分子水平上可能是不均一的。Feldweg and Srivastava,Int.J.Cancer 63310-314(1995)。证据提示,不均一性的根源可能是粘附于热休克蛋白的数以百计的小肽群。出处同上。已提出粘附于肿瘤合成的热休克蛋白的多种肽可使这些蛋白能够在具有不同HLA表型的患者中激发免疫应答,相比之下,更传统的免疫原在其效力上稍微有些HLA-限制性。出处同上。
Nieland et al.,(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.936135-6139(1996))鉴别出一种含细胞毒性T淋巴细胞(CTL)水泡性口炎病毒(VSV)表位的抗原肽,其结合VSV-感染细胞产生的gp96。Nieland的方法阻碍了识别也可能结合gp96的任何其它肽或其它化合物,因此不能进一步表征结合gp96并可由高效液相层析检测的更高分子量的物质。
已经报道,一种含多个疟疾抗原NANP(Asp Ala Asp Pro)重复区的合成肽,其与戊二醛固定化的分枝杆菌hsp65或hsp70化学交联,能够在没有任何添加佐剂的情况下在小鼠中诱导抗体形成(即体液应答);使用大肠杆菌的热休克蛋白也观察到相似的作用。Del Guidice,Experientia 501061-1066(1994);Barrios et al.,Clin.Exp.Immunol.98224-228(1994);Barrios et al.,Eur.J.Immunol.221365-1372(1992)。抗体诱导需要合成肽与热休克蛋白交联,可能还需要戊二醛固定化。Barrios et al.,Clin.Exp.Immunol.98229-233。
PCT/US96/13363描述了含抗原结构域和热休克蛋白结合结构域的杂合抗原,该抗原以和热休克蛋白的复合物形式诱导针对抗原的免疫应答,因此该杂合抗原可用于治疗癌症和感染性疾病。PCT/US98/22335描述了其它相似用途的热休克蛋白结合结构域,以及杂合抗原单独给予时诱导免疫应答的能力。现已发现,改良杂合抗原中的至少一个抗原结构域和至少一个热休克蛋白结合结构域之间存在的肽连接体可使生物活性增加。还发现这种增加使诱导的抗杂合抗原抗原部分的免疫应答增加。本申请涉及这些改良的肽连接体、含改良的肽连接体的杂合肽及其在有和没有热休克蛋白情况下的应用。
发明概述本发明涉及在患者中诱导免疫应答的方法和组合物,其中将至少一种定义的杂合抗原任选以和热休克蛋白的复合物形式给予患者。杂合抗原包含至少一个抗原结构域和至少一个热休克蛋白结合结构域以及它们之间的至少一个肽连接体。诱导抗疾病(如感染性疾病或肿瘤)相关抗原的免疫应答用于治疗该疾病。杂合抗原的抗原性或免疫原性结构域可以是完整的蛋白或肽抗原,或者可以仅是选定抗原的一部分,例如选择的抗原表位。热休克蛋白结合结构域是结合热休克蛋白的肽,优选为7-15个氨基酸的结合热休克蛋白的肽,更优选为结合热休克蛋白的疏水性肽,最优选为7-15个氨基酸的结合热休克蛋白的疏水性肽。连接体具有以下序列中的一种Phe PheArg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg LysAsn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg LysAsn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);LysAsn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。
本发明提供给予单独的所述杂合抗原的方法,以及提供给予热休克蛋白/杂合抗原组合物的方法,后者包括(i)在杂合抗原和热休克蛋白发生结合而形成杂合抗原/热休克蛋白复合物的条件下,体外混合一种或多种热休克蛋白和一种或多种杂合抗原;和(ii)给予需要该治疗的患者有效量的结合热休克蛋白的杂合抗原。
或者,可通过给予患者杂合抗原编码核酸,任选与热休克蛋白编码核酸一起,将任选结合热休克蛋白的杂合抗原引入到患者中。
因此,在第一个方面,本发明涉及一种杂合抗原,其基本组成为感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及分隔抗原结构域和结合结构域的肽连接体,其中肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala LysVal Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。
在第二个方面,本发明涉及一种杂合抗原,其基本组成为一种或多种感染物或一种或多种肿瘤抗原的多个抗原结构域、至少一个非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及至少一个分隔抗原结构域和至少一个结合结构域的肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);PheArg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe PheArg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ IDNO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个具体实施方案中,前述杂合抗原中的至少一个抗原结构域为T辅助细胞表位。
在第三个方面,本发明涉及一种杂合抗原,其包含感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及它们之间的肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、GlnLeu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个具体实施方案中,前述杂合抗原具有分隔抗原结构域和结合结构域的肽连接体。
在第四个方面,本发明涉及一种杂合抗原,其包含一种或多种感染物或一种或多种肿瘤抗原的多个抗原结构域、至少一个非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及它们之间的至少一个肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ IDNO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ IDNO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ IDNO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe ArgLys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个具体实施方案中,至少一个抗原结构域为T辅助细胞表位。
在第五个方面,本发明涉及一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的组合物,其含有至少一种杂合抗原,该杂合抗原包含感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及它们之间的至少一个肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);PheArg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe PheArg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ IDNO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,所述组合物含有多种杂合抗原,其中一种杂合抗原可包含T辅助细胞表位。
在第六个方面,本发明涉及一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的组合物,其含有至少一种杂合抗原,该杂合抗原包含其中至少一个来自感染物或肿瘤抗原的多个抗原结构域、至少一个非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及它们之间的至少一个肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ IDNO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ IDNO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ IDNO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe ArgLys(FFRK;SEQ ID NO1000)。
在第七个方面,本发明涉及一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的组合物,其含有至少一种杂合抗原,该杂合抗原基本组成为感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及分隔抗原结构域和结合结构域的肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);PheArg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg LysAsn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala LysVal Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,前述组合物包含多种杂合抗原。在另一方面,多种杂合抗原中的至少一种含有T辅助细胞表位。
在第八个方面,本发明涉及一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的组合物,其含有至少一种杂合抗原,该杂合抗原基本组成为其中至少一个来自感染物或肿瘤抗原的多个抗原结构域、至少一个非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及分隔抗原结构域和结合结构域的至少一个肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe PheArg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg LysAsn(FRKN,SEQ ID NO002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg LysAsn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);LysAsn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在一个实施方案中,至少一个抗原结构域含有T辅助细胞表位。
在第九个方面,本发明涉及一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的方法,该方法包括给予患者热休克蛋白和杂合抗原的复合物,该杂合抗原含有至少一个感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、至少一个含非共价结合热休克蛋白的肽的结合结构域以及它们之间的肽连接体;其中所述杂合抗原和热休克蛋白非共价结合,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);PheArg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg LysAsn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala LysVal Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,复合物包含多种杂合抗原。在一个实施方案中,至少一种杂合抗原是T辅助细胞表位。在另一个实施方案中,杂合抗原含多个抗原结构域,其中至少一个抗原结构域可以是T辅助细胞表位。在再另一个实施方案中,其中复合物含多种杂合抗原,其中至少一种杂合抗原含多个抗原结构域。在本发明此方面的另一个实施方案中,热休克蛋白为hsp70。
在第十个方面,本发明涉及一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的方法,该方法包括给予患者热休克蛋白和杂合抗原的复合物,该杂合抗原基本组成为至少一个感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及分隔抗原结构域和结合结构域的肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、GlnLeu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,复合物包含多种杂合抗原。在另一个实施方案中,至少一种杂合抗原是T辅助细胞表位。在再一个实施方案中,杂合抗原含多个抗原结构域。在再另一个实施方案中,至少一个抗原结构域是T辅助细胞表位。在仍再另一个实施方案中,复合物含多种杂合抗原,其中至少一种杂合抗原含多个抗原结构域。在此方面的一个优选实施方案中,热休克蛋白为hsp70。
在第十一个方面,本发明涉及一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的方法,该方法包括给予患者至少一种杂合抗原,该杂合抗原包含至少一个感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、至少一个含非共价结合热休克蛋白的肽的结合结构域以及它们之间的至少一个肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ IDNO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ IDNO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe ArgLys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,复合物包含多种杂合抗原。在另一个实施方案中,至少一种杂合抗原是T辅助细胞表位。在另一个实施方案中,杂合抗原含多个抗原结构域。在再一个实施方案中,至少一个抗原结构域是T辅助细胞表位。在再另一个实施方案中,复合物含多种杂合抗原,其中至少一种杂合抗原含多个抗原结构域。在本发明此方面的另一个实施方案中,肽连接体分隔抗原结构域和结合结构域。
在第十二个方面,本发明涉及一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的方法,该方法包括给予患者至少一种杂合抗原,该杂合抗原基本组成为至少一个感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及分隔抗原结构域和结合结构域的肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe ArgLys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,复合物包含多种杂合抗原。在另一个实施方案中,至少一种杂合抗原是T辅助细胞表位。在另一个实施方案中,杂合抗原含多个抗原结构域。在再另一个实施方案中,至少一个抗原结构域是T辅助细胞表位。在仍再另一个实施方案中,复合物含多种杂合抗原,其中至少一种杂合抗原含多个抗原结构域。
在第十三个方面,本发明涉及一种治疗感染性疾病或癌症的方法,该方法包括给予患者热休克蛋白和杂合抗原的复合物,该杂合抗原包含至少一个与感染性疾病或癌症相关的感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、含非共价结合热休克蛋白的肽的结合结构域以及它们之间的肽连接体;其中杂合抗原和热休克蛋白非共价结合,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);ArgLys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);PheArg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala LysVal Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,复合物包含多种杂合抗原。在另一个实施方案中,至少一种杂合抗原是T辅助细胞表位。在再另一个实施方案中,杂合抗原含多个抗原结构域。在再另一个实施方案中,至少一个抗原结构域是T辅助细胞表位。在仍再另一个实施方案中,复合物含多种杂合抗原,其中至少一种杂合抗原含多个抗原结构域。在本发明此方面的一个实施方案中,肽连接体分隔抗原结构域和结合结构域。在本发明此方面的一个优选实施方案中,热休克蛋白为hsp70。
在第十四个方面,本发明涉及一种治疗感染物疾病或癌症的方法,该方法包括给予患者热休克蛋白和杂合抗原的复合物,该杂合抗原基本组成为至少一个与感染性疾病或癌症相关的感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、至少一个非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及分隔抗原结构域和结合结构域的肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala LysVal Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,复合物包含多种杂合抗原。在另一方面,至少一种杂合抗原是T辅助细胞表位。在再另一方面,杂合抗原含多个抗原结构域。在再另一方面,至少一个抗原结构域为T辅助细胞表位。在再一方面,复合物含多种杂合抗原,其中至少一种杂合抗原含多个抗原结构域。在一个优选实施方案中,热休克蛋白为hsp70。
在第十五个方面,本发明涉及一种治疗感染性疾病或癌症的方法,该方法包括给予患者至少一种杂合抗原,该杂合抗原包含至少一个与感染性疾病或癌症相关的感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、含非共价结合热休克蛋白的肽的结合结构域以及它们之间的肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ IDNO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ IDNO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ IDNO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe ArgLys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,复合物包含多种杂合抗原。在另一方面,至少一种杂合抗原是T辅助细胞表位。在再另一方面,杂合抗原含多个抗原结构域。在仍再另一方面,至少一个抗原结构域为T辅助细胞表位。在仍再另一方面,复合物含多种杂合抗原,其中至少一种杂合抗原含多个抗原结构域。在本发明此方面的一个实施方案中,肽连接体分隔抗原结构域和结合结构域。
在第十六个方面,本发明涉及一种治疗感染性疾病或癌症的方法,该方法包括给予患者至少一种杂合抗原,该杂合抗原基本组成为至少一个与感染性疾病或癌症相关的感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及分隔抗原结构域和结合结构域的肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe ArgLys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、GlnLeu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。在一个实施方案中,复合物包含多种杂合抗原。在另一个实施方案中,至少一种杂合抗原是T辅助细胞表位。在再另一个实施方案中,杂合抗原含多个抗原结构域。在仍再另一个实施方案中,至少一个抗原结构域为T辅助细胞表位。在另一个实施方案中,复合物含多种杂合抗原,其中至少一种杂合抗原含多个抗原结构域。
在第十七个方面,本发明涉及一种肽,其来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、GlnLeu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。
在第十八个方面,本发明涉及一种免疫原性多肽,其包含多个抗原结构域、至少一个热休克蛋白结合结构域以及它们之间的至少一个肽连接体,其中至少一个肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、GlnLeu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。
在第十九个方面,本发明涉及一种多核苷酸,其编码前述第一、第二、第三或第四方面中的任一种杂合抗原。
在第二十个方面,本发明涉及一种诱导抗感染性疾病或癌症的免疫应答的方法,该方法包括给予患者编码杂合抗原的多核苷酸,该杂合抗原包含与感染性疾病或癌症相关的感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、热休克蛋白结合结构域以及它们之间的肽连接体,其中肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe ArgLys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA3为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和Ala LysVal Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。
在第二十一个方面,本发明涉及一种诱导抗感染性疾病或癌症的免疫应答的方法,该方法包括给予患者编码上述杂合抗原的多核苷酸和编码热休克蛋白的多核苷酸。在一个优选实施方案中,编码的热休克蛋白为hsp70。
在本发明的任一个或所有前述方面中,感染性疾病抗原可来源于感染物,作为非限制性实例例如为细菌、病毒、原生动物、支原体、真菌、酵母、寄生物或朊病毒。作为非限制性实例,与癌症相关的癌症或肿瘤抗原可来源于肉瘤、淋巴瘤、白血病或恶性肿瘤、黑素瘤、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、结肠癌、肺癌、成胶质细胞瘤或星形细胞瘤。感染物或癌症的抗原结构域包含的抗原来源于感染性疾病或肿瘤抗原或与其相关,这使得所诱导的分别抗感染物抗原或癌症抗原的免疫应答可用于治疗对应的感染性疾病或癌症。
根据美国法典第35部第119条(e)款,本申请要求2003年4月11日提交的临时申请序号60/462,469、2003年4月18日提交的临时申请序号60/463,746和2003年9月16日提交的临时申请序号60/503,417的优先权,所有这三个临时申请都通过引用整体结合到本文中。
附图详述

图1显示了肿瘤攻击实验的结果,其中使用杂合抗原或杂合抗原与热休克蛋白的复合物进行免疫接种,7天后用表达该抗原的肿瘤攻击。
发明详述为清楚地描述但不是限制本发明,详述分为以下章节(i)杂合抗原;(ii)热休克蛋白;和(iii)给予方法。
杂合抗原本发明的杂合抗原包含至少一个抗原性(免疫原性)结构域、至少一个热休克蛋白结合结构域以及至少两个这些结构域之间的肽连接体,其中肽连接体来自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000),Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Ash(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR),Gln Leu Lys(QLK),Gln Leu Glu(QLE),Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);
或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,优选V,更优选S,最优选A;AA2为K、V或E,优选E,更优选V,最优选K;AA1为V、S、F、K、A、E或T,优选F,更优选S,最优选V。
在前述连接体中,优选Gln Leu Lys(QLK)、Arg Lys(RK)和AlaLys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001),最优选Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000)。
因此,杂合抗原起至少两个作用,即(i)其含有能够诱导所需免疫应答的表位;和(ii)其能够物理结合热休克蛋白。如下所述,这种结合可在体内发生,使得单独给予杂合抗原可诱导所需免疫应答,并提供所需的治疗作用。
本文使用的术语“抗原”是指可由氨基酸、糖、核酸或脂质单独或任意组合组成的化合物。
本文使用的术语“杂合抗原”是指这种化合物其结合一种或多种热休克蛋白,代表需要免疫应答对抗的免疫原。例如,当免疫原为流感病毒时,杂合抗原可包含流感病毒基质蛋白的肽片段。本文使用的术语“免疫原”适用于要激发针对其的免疫应答的肿瘤细胞、感染细胞、病原体或其组分,而杂合抗原包含该免疫原可激发所需免疫应答的部分和结合一种或多种热休克蛋白的部分。具体地说,选择杂合抗原的抗原结构域以激发抗特定疾病或病原体的免疫应答,该抗原结构域包括得自MHC分子、突变DNA基因产物和DNA直接产物(例如得自肿瘤细胞的DNA直接产物)的肽。
尽管本发明可用于任何类型的免疫原,但具体的目标免疫原与肿瘤疾病相关,或来源于肿瘤疾病,或预计与肿瘤疾病相关,所述肿瘤疾病包括但不限于肉瘤、淋巴瘤、白血病或恶性肿瘤,具体地说为黑素瘤、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、结肠癌、肺癌、成胶质细胞瘤或星形细胞瘤等。作为非限制性实例,选择用于本发明杂合抗原的黑素瘤抗原可见于PCT/US01/12449(WO0178655),其通过引用整体结合到本文中。此外,抑癌基因产物如p53或癌基因产物如ras的突变体也可提供用于本发明的杂合抗原。
在再一个实施方案中,免疫原可与感染性疾病相关,如所述可为细菌、病毒、原生动物、支原体、真菌、酵母、寄生物或朊病毒。非限制性地,免疫原例如可为人乳头瘤病毒(参见下文)、疱疹病毒如单纯疱疹病毒或带状疱疹病毒、逆转录病毒如人免疫缺陷病毒1或2、肝炎病毒、流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒、巨细胞病毒、腺病毒、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌、链球菌属(Streptococcus)细菌、肠球菌属(Enterococcus)细菌、梭菌属(Clostridium)细菌、埃希氏菌属(Escherichia)细菌、克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌、弧菌属(Vibrio)细菌、分支杆菌属(Mycobacterium)细菌、变形虫、疟原虫、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)等。
可通过直接由肿瘤、感染细胞、感染对象的标本、细胞培养物或生物培养物分离获得免疫原,或者可通过化学或重组技术合成免疫原。作为非限制性实例,合适的抗原肽,特别是用于杂合抗原、用于抗病毒、细菌等的抗原肽,可通过检索其序列中含HLA结合序列的MHC I类限制性肽表位进行设计,其中所述HLA结合序列例如但不限于HLA-A2肽结合序列Xaa(Leu/Met)XaaXaaXaa(Val/Ile/Leu/Thr)XaaXaa(Val/Leu)(SEQID NO2),例如得自病毒
Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile(SEQ ID NO31);Ser Gly Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Cys Leu(SEQ ID NO32);Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly(SEQ ID NO33);Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met(SEQ ID NO34);Phe Gln Pro Gln Asn Gly Gln Phe Ile(SEQ ID NO35);Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile(SEQ ID NO36);Thr Tyr Val Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu(SEQ ID NO37);Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile(SEQ ID NO38);Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu(SEQ ID NO39);Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val(SEQ ID NO40);Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr(SEQ ID NO41);Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile(SEQ ID NO42);Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile(SEQ ID NO43);Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr(SEQ ID NO44);Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met(SEQ ID NO45);Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Ala Met(SEQ ID NO46);Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met(SEQ ID NO47);Leu Tyr Gln Asn Val Gly Thr Tyr Val(SEQ ID NO48);Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu(SEQ ID NO49);Phe Glu Ser Thr Gly Asn Leu Ile(SEQ ID NO50);Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ala(SEQ ID NO51);Ile Tyr Ala Thr Val Ala Gly Ser Leu(SEQ ID NO52);Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu(SEQ ID NO53);Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val(SEQ ID NO54);Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys(SEQ ID NO55);Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile(SEQ ID NO56);
Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile(SEQ ID NO57);Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg(SEQ ID NO58);Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Lys Arg(SEQ ID NO59);Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu(SEQ ID NO60);Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val Tyr Leu(SEQ ID NO61);Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu(SEQ ID NO62);Ser Pro Gly Arg Ser Phe Ser Tyr Phe(SEQ ID NO63);Tyr Pro Ala Leu Gly Leu His Glu Phe(SEQ ID NO64);Thr Tyr Lys Asp Thr Val Gln Leu(SEQ ID NO65);Phe Tyr Asp Gly Phe Ser Lys Val Pro Leu(SEQ ID NO66);Phe Ile Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Glu Tyr Val(SEQ ID NO67);Tyr Pro His Phe Met Pro Thr Asn Leu(SEQ ID NO68);Ala Pro Thr Ala Gly Ala Phe Phe Phe(SEQ ID NO69);Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg(SEQ ID NO70);Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val(SEQ ID NO71);Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val(SEQ ID NO72);Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val(SEQ ID NO73);Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val(SEQ ID NO74);Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala(SEQ ID NO75);Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala Met(SEQ ID NO76);Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val(SEQ ID NO77);Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu(SEQ ID NO78);Arg Arg Ile Tyr Asp Leu Ile Glu Leu(SEQ ID NO79);Ile Val Thr Asp Phe Ser Val Ile Lys(SEQ ID NO80);Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Val(SEQ ID NO81);Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe(SEQ ID NO82);Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val(SEQ ID NO83);Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu(SEQ ID NO84);Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Gly Asn Pro Arg Ala(SEQ ID NO85);Asp Tyr Ala Thr Leu Gly Val Gly Val(SEQ ID NO86);Leu Leu Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val(SEQ ID NO87);Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val(SEQ ID NO88);
Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu(SEQ ID NO89);Gly Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Val(SEQ ID NO90);Pro Leu Lys Gln His Phe Gln Ile Val(SEQ ID NO91);Arg Leu Val Thr Leu Lys Asp Ile Val(SEQ ID NO92);Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe(SEQ ID NO93);Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val(SEQ ID NO94);Ser Ala Ile Asn Asn Tyr Ala Gln Lys Leu(SEQ ID NO95);His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu(SEQ ID NO96);Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu(SEQ ID NO97);Cys Lys Gly Val Asn Lys Glu Tyr Leu(SEQ ID NO98);Gln Gly Ile Asn Asn Leu Asp Asn Leu(SEQ ID NO99);Asn Asn Leu Asp Asn Leu Arg Asp Tyr(SEQ ID NO100);Ser Glu Phe Leu Leu Glu Lys Arg Ile(SEQ ID NO101);Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile(SEQ ID NO102);Ile Leu Gly Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr(SEQ ID NO103);Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys(SEQ ID NO104);Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu(SEQ ID NO105);Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile(SEQ ID NO106);Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu(SEQ ID NO107);Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu(SEQ ID NO108);Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile(SEQ ID NO109);Ile Val Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg(SEQ ID NO110);Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys(SEQ ID NO111);Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg(SEQ ID NO112);Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys(SEQ ID NO113);Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe(SEQ ID NO114);Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys(SEQ ID NO115);Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu(SEQ ID NO116);Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys(SEQ ID NO117);Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile(SEQ ID NO118);Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val(SEQ ID NO119);Val Glu Ala Glu Ile Ala His Gln Ile(SEQ ID NO120);Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu(SEQ ID NO121);Tyr Ser Gly Tyr Ile Phe Arg Asp Leu(SEQ ID NO122);Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met(SEQ ID NO123);Ile Ile Tyr Arg Phe Leu Leu Ile(SEQ ID NO124);
得自细菌Lys Tyr Gly Val Ser Val Gln Asp Ile(SEQ ID NO125);Ile Gln Val Gly Asn Thr Arg Thr Ile(SEQ ID NO126);Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu(SEQ ID NO127);得自寄生物Ser Tyr Ile Pro Ser Ala Glu Lys Ile(SEQ ID NO128);Lys Pro Lys Asp Glu Leu Asp Tyr(SEQ ID NO129);Lys Ser Lys Asp Glu Leu Asp Tyr(SEQ ID NO130);Lys Pro Asn Asp Lys Ser Leu Tyr(SEQ ID NO131);Lys Tyr Leu Lys Lys Ile Lys Asn Ser Leu(SEQ ID NO132);Tyr Glu Asn Asp Ile Glu Lys Lys Ile(SEQ ID NO133);Asn Tyr Asp Asn Ala Gly Thr Asn Leu(SEQ ID NO134);Asp Glu Leu Asp Tyr Glu Asn Asp Ile(SEQ ID NO135);Ser Tyr Val Pro Ser Ala Glu Gln Ile(SEQ ID NO136);得自癌症Phe Glu Gln Asn Thr Ala Gln Pro(SEQ ID NO137);Phe Glu Gln Asn Thr Ala Gln Ala(SEQ ID NO138);Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr(SEQ ID NO139);Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr(SEQ ID NO140);Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO141);Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala(SEQ ID NO142);Ile Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu(SEQ ID NO143);Met Leu Leu Ala Leu Leu Tyr Cys Leu(SEQ ID NO144);Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val(SEQ ID NO145);Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe(SEQ ID NO146);Phe Gly Pro Tyr Lys Leu Asn Arg Leu(SEQ ID NO147);Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu(SEQ ID NO148);Gly Pro Pro His Ser Asn Asn Phe Gly Tyr(SEQ ID NO149);和Ile Ser Thr Gln Asn His Arg Ala Leu(SEQ ID NO150)(Rammensee et al.,Immunogenetics 41178-223(1995)),Xaa(Leu/Met)XaaXaaXaaXaaXaaXaaVal(SEQ ID NO3)(Tarpey et al.,Immunology 81222-227(1994)),Xaa(Val/Gln)XaaXaaXaaXaaXaaXaaLeu(SEQ ID NO28),
例如得自病毒Tyr Gly Ile Leu Gly Lys Val Phe Thr Leu(SEQ ID NO151);Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu(SEQ ID NO152);(Barouch et al.,J.Exp.Med.1821847-1856(1995)).
前述表位仅仅是与各种感染性疾病和癌症相关的代表性可利用选择,提供这些表位没有任何限制意图。
可能还需要考虑所需的免疫应答类型。例如,在某些环境下,体液免疫应答可能合适。在其它情况下,实际上想要激发抗肿瘤细胞或感染细胞的免疫应答,此时细胞免疫应答特别合适。因此,可鉴别并选择与B细胞、T辅助细胞或细胞毒性T细胞活化相关的特定表位,将其整合到杂合抗原中。
可能还需要利用与自身免疫疾病或变态反应相关的杂合抗原。这种杂合抗原可与一种或多种热休克蛋白一起给予,给予量足以耐受或抑制患者中预先存在的抗杂合抗原的免疫应答。抑制免疫应答所需的热休克蛋白量预期要显著高于刺激所需的量。
尽管杂合抗原的大小可根据所使用的热休克蛋白而变化,但在本发明的非限制性实施方案中,杂合抗原可为具有10-500个氨基酸残基的肽,优选为具有14-100个氨基酸残基的肽,最优选为具有18-50个氨基酸残基的肽。因此,可能需要生产免疫原片段作为杂合抗原的抗原结构域,或者通过化学或重组DNA方法合成杂合抗原。
根据前述考虑因素,可制备杂合抗原,然后测试其结合热休克蛋白的能力。在某些情况下,存在至少一种可为热休克蛋白的其它蛋白可能有利于杂合抗原与特定热休克蛋白的结合。
例如,通过用可检测标记如放射性、荧光、酶或色素标记来标记杂合抗原,在预期可使结合发生的条件下混合杂合抗原和热休克蛋白,然后分离热休克蛋白,同时去除任何未结合的杂合抗原,并测定是否有任何标记的杂合抗原粘附至热休克蛋白,从而评价杂合抗原与热休克蛋白的结合。作为具体的非限制性实例,评价杂合抗原结合热休克蛋白BiP的能力如下进行于37℃在终体积50μl的含50mM Tris HCl(pH 7.5)、200mM NaCl和1mM Na2EDTA的缓冲液中混合2μg BiP和最多约1150pmol放射性标记杂合抗原30分钟。然后经1ml Sephadex-G柱以100g离心脱盐2分钟,由结合的BiP-杂合抗原中去除未结合的杂合抗原。Penefsky,J.Biol.Chem.2522891(1977)。为防止与树脂结合,柱子可先用相同缓冲溶液中的100μl牛血清白蛋白处理,并如上离心。然后通过液体闪烁计数定量结合的杂合抗原。参阅Flynn et al.,Science 245385-390(1989)。
因为ATP水解促使许多已知的热休克蛋白释放出肽,所以经常可使用ATP酶活的量定量结合热休克蛋白的杂合抗原的量。Flynn etal.,Science 245385-390(1989)提出了一个如何实施该实验的实例。
选择热休克蛋白-结合结构域,以使杂合抗原体外或体内单独结合或与辅助热休克蛋白如hsp40或hsp60联合结合热休克蛋白,如BiP、hsp70、gp96或hsp90,或前述热休克蛋白家族的成员。
如Blond-Elguindi et al.,Cell 75717-728(1993)所述,可通过淘选已知良好结合一种或多种热休克蛋白的抗原库,鉴别符合该标准的肽的非限制性实例
Leu Phe Trp Pro Phe Glu Trp Ile(SEQ ID NO153);Asp Gly Val Gly Ser Phe Ile Gly(SEQ ID NO154);Glu Ser Leu Trp Asn Pro Gln Cys(SEQ ID NO155);Leu His Phe Asp Val Leu Trp Arg(SEQ ID NO156);Cys His Leu Lys Met Val Pro Trp(SEQ ID NO157);Asn Ser Val Leu Val Cys Glu Leu(SEQ ID NO158);Asp Arg Gly His Ser Thr Tyr Ser(SEQ ID NO159);Asp Val Trp Gly Trp Val Thr Trp(SEQ ID NO160);Ile Gln Phe Arg Val Glu Leu Phe(SEQ ID NO161);Leu Trp Leu Glu Leu Ser Leu Ser(SEQ ID NO162);Val Gly Ile Cys Ala Leu Phe Gly(SEQ ID NO163);Pro Tyr Pro Ser Gly Leu Asp Ser(SEQ ID NO164);Phe Trp Gly Val Leu Pro Tyr Pro(SEQ ID NO165);Phe Thr His Gly Ile Ser Leu Tyr(SEQ ID NO166);Asn His Ser Phe Gly Gly Ser Thr(SEQ ID NO167);Val Asp Tyr Val Tyr Phe His His(SEQ ID NO168);Phe Leu Asp Ile Ile Gly Tyr Gly(SEQ ID NO169);Trp Asp Asp Leu Leu His Gly Arg(SEQ ID NO170);Leu Arg Leu Leu Gly Thr Leu Asn(SEQ ID NO171);Phe Glu Gln His Asn Gln Glu Pro(SEQ ID NO172);Phe Val Gly Thr Val Thr Trp Ser(SEQ ID NO173);Leu Trp Ala Leu Thr Tyr Arg Gly(SEQ ID NO174);Ser Trp Gly Ser Asn Gly Gly Phe(SEQ ID NO175);Asp Met Trp Arg Arg Ala Val Gln(SEQ ID NO176);Cys Arg Val Ile Tyr His Ala Thr(SEQ ID NO177);Met Val Val Ala Arg Cys Gly His(SEQ ID NO178);His Met Trp Ile Asn Trp Val Gln(SEQ ID NO179);Cys Ala Gly Arg Cys Phe Gly Tyr(SEQ ID NO180);Cys Thr His Val Leu Ala Tyr Ser(SEQ ID NO181);
Ser Trp Met Pro Trp Leu Thr Met(SEQ ID NO182);Leu Glu Trp Cys Ile Arp Arg Tyr(SEQ ID NO183);Cys Leu Ala Cys Ile Ile His Ser(SEQ ID NO184);Phe Trp Phe Pro Trp Asp Arg Ser(SEQ ID NO185);Trp Arg Thr Gly Val Phe His Gly(SEQ ID NO186);Met His Leu Arg Val Ala Asp Arg(SEQ ID NO187);Ala Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Val(SEQ ID NO188);Phe Phe Trp Phe Thr Leu Lys Glu(SEQ ID NO189);Leu Ser Phe Ala Gly Trp Gly Val(SEQ ID NO190);Met Met Met Leu Gly Arg Ala Pro(SEQ ID NO191);Trp Ser Phe Tyr Thr Trp Leu Asn(SEQ ID NO192);Phe Val Trp Met Arg Trp Ile Asp(SEQ ID NO193);Met Gln Val Asn Thr Pro Asp Asn(SEQ ID NO194);Phe Trp Gly Trp Leu Ile Pro Trp(SEQ ID NO195);Trp Gly Trp Val Trp Trp Asp(SEQ ID NO196);Trp Ile Phe Pro Trp Ile Gln Leu(SEQ ID NO197);Trp Met Phe Asn Trp Pro Trp Tyr(SEQ ID NO198);Met Asn Met Ile Val Leu Asp Lys(SEQ ID NO199);Phe Trp Gly Trp Pro Gly Trp Ser(SEQ ID NO200);Trp Leu Ile Arg Val Gly Thr Ala(SEQ ID NO201);Gly Leu Leu Thr His Leu Ile Trp(SEQ ID NO202);Leu Trp Trp Leu Asn Val His Gly(SEQ ID NO203);Trp Trp Trp Ile Asn Asp Glu Ser(SEQ ID NO204);Ala Asn Pro Ser Leu Ala Thr Tyr(SEQ ID NO205);Trp Leu Gln Gly Trp Trp Gly Trp(SEQ ID NO206);Met Met Pro Val Thr Ser Phe Arg(SEQ ID NO207);Gly Trp Met Asp Trp Trp tyr Tyr(SEQ ID NO208);Leu Ala Ser Met Arg Asn Ser Met(SEQ ID NO209);Asp Leu Met Arg Trp Leu Gly Leu(SEQ ID NO210);Tyr Phe Tyr Ala Trp Trp Leu Asp(SEQ ID NO211);Leu Gly His Leu Trp Thr Gln Val(SEQ ID NO212);Leu Trp Trp Arg Asp Val Met Ala(SEQ ID NO213);
Phe Ile Trp Trp Ala Pro Leu Ala(SEQ ID NO214);Gly Ser Val Gly Gly Gly Val Val(SEQ ID NO215);Asp Ser His Asp Asp Trp Arg Met(SEQ ID NO216);Phe Trp Arg Phe Asp Tyr Tyr Phe(SEQ ID NO217);Trp Thr Trp Trp Glu Trp Leu Ala(SEQ ID NO218);Trp Leu Trp Asp Trp Ile Val Val(SEQ ID NO219);Gly Trp Thr Trp Phe Phe Asp Met(SEQ ID NO220);Ala Trp Trp Gln His Phe Ile Val(SEQ ID NO221);Leu Trp Trp Asp Ile Ile Thr Gly(SEQ ID NO222);Phe Thr Tyr Gly Ser Arg Trp Leu(SEQ ID NO223);Phe Ser Leu Trp Pro Leu Ala Trp(SEQ ID NO224);Gly Ile Ile Leu Gly Tyr Asn Val(SEQ ID NO225);Ser Trp Met Thr Trp Ile Glu His(SEQ ID NO226);Gly Trp Trp Val Thr Trp Pro Trp(SEQ ID NO227);Val Val Ser Pro Trp Trp Leu Gly(SEQ ID NO228);Asn Val Leu Ser Arg Gly Phe Ser(SEQ ID NO229);Ser Phe Glu Ser Leu Gly Gly Leu(SEQ ID NO230);Ile Thr Lys Gly Ser Ser Phe Pro(SEQ ID NO231);Leu Asp Trp Ala Arg Lys Leu Arg(SEQ ID NO232);Thr Ala Trp Asn Leu Leu Gly Tyr(SEQ ID NO233);Phe Gly Gln Gly Ile Lys His Val(SEQ ID NO234);Asp Val Val Trp Gln Arg Leu Leu(SEQ ID NO235);Tyr Val Asp Arg Phe Ile Gly Trp(SEQ ID NO236);Lys Met Ala Arg Pro Glu Gly Asn(SEQ ID NO237);Leu Gly Arg Trp Gly His Glu Ser(SEQ ID NO238);Ser Ile Trp Ser Leu Leu Val Leu(SEQ ID NO239);Val Trp Leu Asp Leu Leu Leu Ser(SEQ ID NO240);Tyr Leu Thr Asp Ser Leu Phe Gly(SEQ ID NO241);Thr Trp Trp Pro Ser Ile Thr Trp(SEQ ID NO242);Tyr Gly Leu Trp Trp Phe Pro Trp(SEQ ID NO243);Phe Ser Pro Ala Asp Thr Arg Tyr(SEQ ID NO244);Cys Asn Arg Leu Gln Ile Asp Cys(SEQ ID NO245);
Ser Leu Val Ala Ala Arg Asn Leu(SEQ ID NO246);Phe Thr Ile His Asn Val Ala Val(SEQ ID NO247);Met Gly Pro Leu Gly Pro Leu Leu(SEQ ID NO248);Arg Gln Leu Ser Glu Leu Phe Val(SEQ ID NO249);Arg Val Val Cys Gln Ala Leu Leu(SEQ ID NO250);Trp Pro His Leu Trp Trp Leu Asp(SEQ ID NO251);Trp Met Asp Trp Val Trp His Thr(SEQ ID NO252);Trp Trp Gly Tyr Leu Ile Cys Gln(SEQ ID NO253);Phe Arg Gly Leu Ser Glu Gly Pro(SEQ ID NO254);Ser Trp Phe Asp Trp Leu Val Ala(SEQ ID NO255);Val Val Met Trp Tyr Ser Val Asp(SEQ ID NO256);Trp Gly Trp Ser Leu Ala Thr(SEQ ID NO257);Leu Gly Trp Phe Asp Arg Phe Phe(SEQ ID NO258);Ala Trp Trp Trp Pro Thr Tyr Val(SEQ ID NO259);Gly Phe Leu Ser Ser Trp Phe Leu(SEQ ID NO260);Gly Val Ile Asn Cys Ala Gly Thr(SEQ ID NO261);Val Cys Ala Arg Ala Ala His Leu(SEQ ID NO262);Gly Asn Ser Tyr Gly Asp Gly Gly(SEQ ID NO263);Gly Phe Leu Ser Ser Trp Phe Leu(SEQ ID NO264);Phe Asp Gln Pro Gly Arg Phe Leu(SEQ ID NO265);Arg Ser His Ala Thr Gly Val Val(SEQ ID NO266);Gly Tyr Trp Ala Met Met Ser Trp(SEQ ID NO267);Cys His Ser Met Trp Asp Gly Leu(SEQ ID NO268);Phe Ile Trp Arg Gly Trp Pro His(SEQ ID NO269);Leu Ser Phe Leu Gly Gly Arg Leu(SEQ ID NO270);Phe Ser Gly Val Arg Gln Pro Asn(SEQ ID NO271);Trp Gly Trp Met Pro Phe Tyr Tyr(SEQ ID NO272);Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Asp(SEQ ID NO273);Asp Leu Trp Thr Trp Leu Gly Leu(SEQ ID NO274);Cys Asp Thr Ala Ala Val Ala Asp(SEQ ID NO275);Trp Trp Val Lys His His Met Leu(SEQ ID NO276);Ile Ala Phe Leu Arg Asp Asn Arg(SEQ ID NO277);
Leu Ala Arg Pro Asp His Tyr Ser(SEQ ID NO278);Met Glu Ser Lys Arg Trp Thr Val(SEQ ID NO279);Met Ile Leu Lys Gly Tyr Ser Arg(SEQ ID NO280);Ala Pro Ser Asp Tyr Asp Glu Ser(SEQ ID NO281);His Trp Leu Arg Ser Lys Arg Thr(SEQ ID NO282);Gly Ala Arg Val Trp Asn Tyr Gln(SEQ ID NO283);Leu Ser Asn Trp Asn Met Arg Leu(SEQ ID NO284);Cys Gly Ala Ala Gln Gln Gly Met(SEQ ID NO285);和Gly Ser Ser Met Val Val Gln Arg(SEQ ID NO286).
使用此技术,Blond-Elguindi推断热休克蛋白BiP识别含具有序列Hy(Trp/X)HyXHyXHy(SEQ ID NO29)的七聚体区的多肽,其中Hy代表疏水性氨基酸残基,特别是色氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸(SEQ IDNO30),而X是任意氨基酸。整合入该基序的高亲和性热休克蛋白-结合序列包括His Trp Asp Phe Ala Trp Pro Trp(SEQ ID NO1);和Phe Trp Gly Leu Trp Pro Trp Glu(SEQ ID NO4)。
还鉴定了其它的热休克蛋白结合基序。例如,Auger et al.,NatureMedicine 2306-31O(1996)在与类风湿性关节炎相关的HLA-DR型中鉴别出两种结合热休克蛋白的五肽结合基序Gln Lys Arg Ala Ala(SEQ ID NO5)和Arg Arg Arg Ala Ala(SEQ ID NO6)。
还鉴定出由7-15个残基长的肽组成的热休克蛋白结合基序,其富集疏水性氨基酸。
Lys Arg Gln Ile Tyr Asp Leu Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys(SEQ ID NO287);Leu Ser Ser Leu Phe Arg Pro Lys Arg Arg Pro Ile Tyr Lys Ser(SEQ ID NO288);Lys Leu Ile Gly Val Leu Ser Ser Leu Phe Arg Pro Lys(SEQ ID NO289);Arg Arg Pro Ile Tyr Lys Ser Asp Val Gly Met Ala His Phe Arg(SEQ ID NO290);Cys Lys Ile Gln Ser Thr Pro Val Lys Gln Ser(SEQ ID NO291);Tyr His Cys Asp Gly Phe Gln Asn Glu(SEQ ID NO292);Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys(SEQ ID NO293);Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys(SEQ ID NO294)(Flynn et al.,Science 245385-390(1989)),
此外,其它的热休克蛋白结合肽包括Gly Lys Trp Val Tyr Ile(SEQ ID NO295);Ala Lys Arg Glu Thr Lys(SEQ ID NO296);Lys Trp Val His Leu Phe(SEQ ID NO297);Arg Leu Val Leu Val Leu(SEQ ID NO298);Trp Lys Trp Gly Ile Tyr(SEQ ID NO299);Ser Ser His Ala Ser Ala(SEQ ID NO300);Trp Gly Pro Trp Ser Phe(SEQ ID NO301);Ala Ile Pro Gly Lys Val(SEQ ID NO302);Arg Val His Asp Pro Ala(SEQ ID NO303);Arg Ser Val Ser Ser Phe(SEQ ID NO304);Leu Gly Thr Arg Lys Gly(SEQ ID NO305);Lys Asp Pro Leu Phe Asn(SEQ ID NO306);Leu Ser Gln His Thr Asn(SEQ ID NO307);Asn Arg Leu Leu Leu Thr(SEQ ID NO308);Tyr Pro Leu Trp Val Ile(SEQ ID NO309);Leu Leu Ile Ile Asp Arg(SEQ ID NO310);Arg Val Ile Ser Leu Gln(SEQ ID NO311);Glu Val Ser Arg Glu Asp(SEQ ID NO312);Ser Ile Leu Arg Ser Thr(SEQ ID NO313);Pro Gly Leu Val Trp Leu(SEQ ID NO314);Val Lys Lys Leu Tyr Ile(SEQ ID NO315);Asn Asn Arg Leu Leu Asp(SEQ ID NO316);Ser Lys Gly Arg Trp Gly(SEQ ID NO317);Ile Arg Pro Ser Gly Ile(SEQ ID NO318);Ala Ser Leu Cys Pro Thr(SEQ ID NO319);Asp Val Pro Gly Leu Arg(SEQ ID NO320);Arg His Arg Glu Val Gln(SEQ ID NO321);Leu Ala Arg Lys Arg Ser(SEQ ID NO322);
Ser Val Leu Asp His Val(SEQ ID NO323);Asn Leu Leu Arg Arg Ala(SEQ ID NO324);Ser Gly Ile Ser Ala Trp(SEQ ID NO325);Phe Tyr Phe Trp Val Arg(SEQ ID NO326);Lys Leu Phe Leu Pro Leu(SEQ ID NO327);Thr Pro Thr Leu Ser Asp(SEQ ID NO328);Thr His Ser Leu Ile Leu(SEQ ID NO329);Leu Leu Leu Leu Ser Arg(SEQ ID NO330);Leu Leu Arg Val Arg Ser(SEQ ID NO331);Glu Arg Arg ser Arg Gly(SEQ ID NO332);Arg Met Leu Gln Leu Ala(SEQ ID NO333);Age Gly Trp Ala Asn Ser(SEQ ID NO334);Arg Pro Phe Tyr Ser Tyr(SEQ ID NO335);Ser Ser Ser Trp Asn Ala(SEQ ID NO336);Leu Gly His Leu Glu Glu(SEQ ID NO337);Ser Ala Val Thr Asn Thr(SEQ ID NO338);Leu Arg Arg Ala Ser Leu(SEQ ID NO339);Leu Arg Arg Trp Ser Leu(SEQ ID NO340);Lys Trp Val His Leu Phe(SEQ ID NO341);Asn Arg Leu Leu Leu Thr(SEQ ID NO342);Ala Arg Leu Leu Leu Thr(SEQ ID NO343);Asn Ala Leu Leu Leu Thr(SEQ ID NO344);Asn Arg Leu Ala Leu Thr(SEQ ID NO345);Asn Leu Leu Arg Leu Thr(SEQ ID NO346);Asn Arg Leu Trp Leu Thr(SEQ ID NO347);Asn Arg Leu Leu Leu Ala(SEQ ID NO348);Met Gln Glu Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met(SEQ ID NO349);Leu Arg Arg Trp Ser Leu Gly(SEQ ID NO353);Lys Trp Val His Leu Phe Gly(SEQ ID NO354);Asn Arg Leu Leu Leu Thr Gly(SEQ ID NO355);Ala Arg Leu Leu Leu Thr Gly(SEQ ID NO356);Asn Ala Leu Leu Leu Thr Gly(SEQ ID NO357);
Asn Arg Leu Ala Leu Thr Gly(SEQ ID NO358);Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly(SEQ ID NO359);Asn Arg Leu Trp Leu Thr Gly(SEQ ID NO360);Asn Arg Leu Leu Leu Ala Gly(SEQ ID NO361);Gly Lys Trp Val Tyr Ile Gly(SEQ ID NO295);Ala Lys Arg Glu Thr Lys Gly(SEQ ID NO296);Lys Trp Val His Leu Phe Gly(SEQ ID NO297);Arg Leu Val Leu Val Leu Gly(SEQ ID NO298);Trp Lys Trp Gly Ile Tyr(SEQ ID NO299);Ser Ser His Ala Ser Ala(SEQ ID NO300);Trp Gly Pro Trp Ser Phe(SEQ ID NO301);Ala Ile Pro Gly Lys Val(SEQ ID NO302);Arg Val His Asp Pro Ala Gly(SEQ ID NO303);Arg Ser Val Ser Ser Phe Gly(SEQ ID NO304);Leu Gly Thr Arg Lys Gly Gly(SEQ ID NO305);Lys Asp Pro Leu Phe Asn Gly(SEQ ID NO306);Leu Ser Gln His Thr Asn Gly(SEQ ID NO307);Asn Arg Leu Leu Leu Thr Gly(SEQ ID NO308);Tyr Pro Leu Trp Val Ile Gly(SEQ ID NO309);Leu Leu Ile Ile Asp Arg Gly(SEQ ID NO310);Arg Val Ile Ser Leu Gln Gly(SEQ ID NO311);Glu Val Ser Arg Glu Asp Gly(SEQ ID NO312);Ser Ile Leu Arg Ser Thr Gly(SEQ ID NO313);Pro Gly Leu Val Trp Leu Gly(SEQ ID NO314);Val Lys Lys Leu Tyr Ile Gly(SEQ ID NO315);Asn Asn Arg Leu Leu Asp Gly(SEQ ID NO316);Ser Lys Gly Arg Trp Gly Gly(SEQ ID NO317);Ile Arg Pro Ser Gly Ile Gly(SEQ ID NO318);Ala Ser Leu Cys Pro Thr Gly(SEQ ID NO319);Asp Val Pro Gly Leu Arg Gly(SEQ ID NO320);Arg His Arg Glu Val Gln Gly(SEQ ID NO321);Leu Ala Arg Lys Arg Ser Gly(SEQ ID NO322);
Ser Val Leu Asp His Val Gly(SEQ ID NO323);Asn Leu Leu Arg Arg Ala Gly(SEQ ID NO324);Ser Gly Ile Ser Ala Trp Gly(SEQ ID NO325);Phe Tyr Phe Trp Val Arg Gly(SEQ ID NO326);Lys Leu Phe Leu Pro Leu Gly(SEQ ID NO327);Thr Pro Thr Leu Ser Asp Gly(SEQ ID NO328);Thr His Ser Leu Ile Leu Gly(SEQ ID NO329);Leu Leu Leu Leu Ser Arg Gly(SEQ ID NO330);Leu Leu Arg Val Arg Ser Gly(SEQ ID NO331);Glu Arg Arg ser Arg Gly Gly(SEQ ID NO332);Arg Met Leu Gln Leu Ala Gly(SEQ ID NO333);Age Gly Trp Ala Asn Ser Gly(SEQ ID NO334);Arg Pro Phe Tyr Ser Tyr Gly(SEQ ID NO335);Ser Ser Ser Trp Asn Ala Gly(SEQ ID NO336);Leu Gly His Leu Glu Glu Gly(SEQ ID NO337);和Ser Ala Val Thr Asn Thr Gly(SEQ ID NO338);如Gragerov et al.,J.Molec.Biol.235848-854(1994)所述。
其它的热休克蛋白结合结构域包括Phe Tyr Gln Leu Ala Leu Thr(SEQ ID NO)、Phe Tyr Gln Leu Ala Leu Thr Trp(SEQ ID NO)、Arg LysLeu Phe Phe Asn Leu Arg(SEQ ID NO)、Arg Lys Leu Phe Phe Asn LeuArg Trp(SEQ ID NO)、Lys Phe Glu Arg Gln(SEQ ID NO)、Asn Ile ValArg Lys Lys Lys(SEQ ID NO)和Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu(SEQ ID NO)。
此外,其它热休克蛋白结合结构域包括WO 9922761所述的热休克蛋白结合结构域。Xaa表示任何氨基酸。
HTTVYGAG(SEQ ID NO82);TETPYPTG(SEQ ID NO83);LTTPFSSG(SEQ ID NO84);GVPLTMDG(SEQ ID NO85);KLPTVLRG(SEQ ID NO86);CRFHGNRG(SEQ ID NO87);
YTRDFEAG(SEQ ID NO88);SSAAGPRG(SEQ ID NO89);SLIQYSRG(SEQ ID NO9D);DALMWP Xaa G(SEQ ID NO91);SS Xaa SLYIG(SEQ ID NO92);FNTSTRTG(SEQ ID NO93);TVQHVAFG(SEQ ID NO94);DYSFPPLG(SEQ ID NO95);VGSMESLG(SEQ ID NO96);F Xaa PMI Xaa SG(SEQ ID NO97);APPRVTMG(SEQ ID NO98);IATKTPKG(SEQ ID NO99);KPPLFQIG(SEQ ID NO100);YHTAHNMG(SEQ ID NO101);SYIQATHG(SEQ ID NO102);SSFATFLG(SEQ ID NO103);TTPPNFAG(SEQ ID NO104);ISLDPRMG(SEQ ID NO105);SLPLFGAG(SEQ ID NO106);NLLKTTLG(SEQ ID NO107);DQNLPRRG(SEQ ID NO108);SHFEQLLG(SEQ ID NO109);TPQLHHGG(SEQ ID NO110);APLDRITG(SEQ ID NO111);FAPLIAHG(SEQ ID NO112);SWIQTFMG(SEQ ID NO113);NTWPHMYG(SEQ ID NO114);EPLPTTLG(SEQ ID NO115);HGPHLFNG(SEQ ID NO116);YLNSTLAG(SEQ ID NO117);HLHSPSGG(SEQ ID NO118);TLPHRLNG(SEQ ID NO119);
SSPREVHG(SEQ ID NO120);NQVDTARG(SEQ ID NO121);YPTPLLTG(SEQ ID NO122);HPAAFPWG(SEQ ID NO123);LLPHSSAG(SEQ ID NO124);LETYTASG(SEQ ID NO125);KYVPLPPG(SEQ ID NO126);APLALHAG(SEQ ID NO127);YESLLTKG(SEQ ID NO128);SHAASGTG(SEQ ID NO129);GLATVKSG(SEQ ID NO130);GATSFGLG(SEQ ID NO131);KPPGPVSG(SEQ ID NO132);TLYVSGNG(SEQ ID NO133);HAPFKSQG(SEQ ID NO134);VAFTRLPG(SEQ ID NO135);LPTRTPAG(SEQ ID NO136);ASFDLLIG(SEQ ID NO137);RMNTEPPG(SEQ ID NO138);KMTPLTTG(SEQ ID NO139);ANATPLLG(SEQ ID NO140);TIWPPPVG(SEQ ID NO141);QTKVMTTG(SEQ ID NO142);NHAVFASG(SEQ ID NO143);LHAA Xaa TSG(SEQ ID NO144);TWQPYFHG(SEQ ID NO145);APLALHAG(SEQ ID NO146);TAHDLTVG(SEQ ID NO147);NMTNMLTG(SEQ ID NO148);GSGLSQDG(SEQ ID NO149);TPIKTIYG(SEQ ID NO150);SHLYRSSG(SEQ ID NO151);
YTLVQPL(SEQ ID NO152);TPDITPK(SEQ ID NO153);TYPDLRY(SEQ ID NO154);DRTHATS(SEQ ID NO155);MSTTFYS(SEQ ID NO156);YQHAVQT(SEQ ID NO157);FPFSAST(SEQ ID NO158);SSFPPLD(SEQ ID NO159);MAPSPPH(SEQ ID NO160);SSFPDLL(SEQ ID NO161);HSYNRLP(SEQ ID NO162);HLTHSQR(SEQ ID NO163);QAAQSRS(SEQ ID NO164);FATHHIG(SEQ ID NO165);SMPEPLI(SEQ ID NO166);IPRYHLI(SEQ ID NO167);SAPHMTS(SEQ ID NO168);KAPVWAS(SEQ ID NO169);LPHWLLI(SEQ ID NO170);ASAGYQI(SEQ ID NO171);VTPKTGS(SEQ ID NO172);EHPMPVL(SEQ ID NO173);VSSFVTS(SEQ ID NO174);STHFTWP(SEQ ID NO175);GQWWSPD(SEQ ID NO176);GPPHQDS(SEQ ID NO177);NTLPSTI(SEQ ID NO178);HQPSRWV(SEQ ID NO179);YGNPLQP(SEQ ID NO180);FHWWWQP(SEQ ID NO181);ITLKYPL(SEQ ID NO182);FHWPWLF(SEQ ID NO183);
TAQDSTG(SEQ ID NO184);FHWWWQP(SEQ ID NO185);FHWWDWW(SEQ ID NO186);EPFFRMQ(SEQ ID NO187);TWWLNYR(SEQ ID NO188);FHWWWQP(SEQ ID NO189);QPSHLRW(SEQ ID NO190);SPASPVY(SEQ ID NO191);FHWWWQP(SEQ ID NO192);HPSNQAS(SEQ ID NO193);NSAPRPV(SEQ ID NO194);QLWSIYP(SEQ ID NO195);SWPFFDL(SEQ ID NO196);DTTLPLH(SEQ ID NO197);WHWQMLW(SEQ ID NO198);DSFRTPV(SEQ ID NO199);TSPLSLL(SEQ ID NO200);AYNYVSD(SEQ ID NO201);RPLHDPM(SEQ ID NO202);WPSTTLF(SEQ ID NO203);ATLEPVR(SEQ ID NO204);SMTVLRP(SEQ ID NO205);QIGAPSW(SEQ ID NO206);APDLYVP(SEQ ID NO207);RMPPLLP(SEQ ID NO208);AKATPEH(SEQ ID NO209);TPPLRIN(SEQ ID NO210);LPIHAPH(SEQ ID NO211);DLNAYTH(SEQ ID NO212);VTLPNFH(SEQ ID NO213);NSRLPTL(SEQ ID NO214);YPHPSRS(SEQ ID NO215);
GTAHFMY(SEQ ID NO216);YSLLPTR(SEQ ID NO217);LPRRTLL(SEQ ID NO218);TSTLLWK(SEQ ID NO219);TSDMKPH(SEQ ID NO220);TSSYLAL(SEQ ID NO221);NLYGPHD(SEQ ID NO222);LETYTAS(SEQ ID NO223);AYKSLTQ(SEQ ID NO224);STSVYSS(SEQ ID NO225);EGPLRSP(SEQ ID NO226);TTYHALG(SEQ ID NO227);VSIGHPS(SEQ ID NO228);THSHRPS(SEQ ID NO229);ITNPLTT(SEQ ID NO230);SIQAHHS(SEQ ID NO231);LNWPRVL(SEQ ID NO232);YYYAPPP(SEQ ID NO233);SLWTRLP(SEQ ID NO234);NVYHSSL(SEQ ID NO235);NSPHPPT(SEQ ID NO236);VPAKPRH(SEQ ID NO237);HNLHPNR(SEQ ID NO238);YTTHRWL(SEQ ID NO239);AVTAAIV(SEQ ID NO240);TLMHDRV(SEQ ID NO241);TPLKVPY(SEQ ID NO242);FTNQQYH(SEQ ID NO243);SHVPSMA(SEQ ID NO244);HTTVYGA(SEQ ID NO245);TETPYPT(SEQ ID NO246);LTTPFSS(SEQ ID NO247);
GVPLTMD(SEQ ID NO248);KLPTVLR(SEQ ID NO249);CRFHGNR(SEQ ID NO250);YTRDFEA(SEQ ID NO251);SSAAGPR(SEQ ID NO252);SLIQYSR(SEQ ID NO253);DALMWP Xaa(SEQ ID NO254);SS Xaa SLYI(SEQ ID NO255);FNTSTRT(SEQ ID NO256);TVQHVAF(SEQ ID NO257);DYSFPPL(SEQ ID NO258);VGSMESL(SEQ ID NO259);F Xaa PMI Xaa S(SEQ ID NO260);APPRVTM(SEQ ID NO261);IATKTPK(SEQ ID NO262);KPPLFQI(SEQ ID NO263);YHTAHNM(SEQ ID NO264);SYIQATH(SEQ ID NO265);SSFATFL(SEQ ID NO266);TTPPNFA(SEQ ID NO267);ISLDPRM(SEQ ID NO268);SLPLFGA(SEQ ID NO269);NLLKTTL(SEQ ID NO270);DQNLPRR(SEQ ID NO271);SHFEQLL(SEQ ID NO272);TPQLHHG(SEQ ID NO273);APLDRIT(SEQ ID NO274);FAPLIAH(SEQ ID NO275);SWIQTFM(SEQ ID NO276);NTAPHMY(SEQ ID NO277);EPLPTTL(SEQ ID NO278);HGPHLFN(SEQ ID NO279);
YLNSTLA(SEQ ID NO280);HLHSPSG(SEQ ID NO281);TLPHRLN(SEQ ID NO282);SSPREVH(SEQ ID NO283);NQVDTAR(SEQ ID NO284);YPTPLLT(SEQ ID NO285);HPAAFPW(SEQ ID NO286);LLPHSSA(SEQ ID NO287);LETYTAS(SEQ ID NO288);KYVPLPP(SEQ ID NO289);APLALHA(SEQ ID NO290);YESLLTK(SEQ ID NO291);SHAASGT(SEQ ID NO292);GLATVKS(SEQ ID NO293);GATSFGL(SEQ ID NO294);KPPGPVS(SEQ ID NO295);TLYVSGN(SEQ ID NO296);HAPFKSQ(SEQ ID NO297);VAFTRLP(SEQ ID NO298);LPTRTPA(SEQ ID NO299);ASFDLLI(SEQ ID NO300);RMNTEPP(SEQ ID NO301);KMTPLTT(SEQ ID NO302);ANATPLL(SEQ ID NO303);TIWPPPV(SEQ ID NO304);QTKVMTT(SEQ ID NO305);NHAVFAS(SEQ ID NO306);LHAA Xaa TS(SEQ ID NO307);TWQPYFH(SEQ ID NO308);APLALHA(SEQ ID NO309);TAHDLTV(SEQ ID NO310);NMTNMLT(SEQ ID NO311);
GSGLSQD(SEQ ID NO312);TPIKTIY(SEQ ID NO313);SHLYRSS(SEQ ID NO314);HGQAWQF(SEQ ID NO315);和FHWWW(SEQ ID NO317).
前述热休克蛋白结合结构域仅仅是肽和非肽热休克蛋白结合分子中可用于实施本发明的各种肽的实例。在其它实施方案中,热休克蛋白结合结构域可直接结合前述哺乳动物热休克蛋白的不同部分,本发明的热休克蛋白-结合结构域不限于结合热休克蛋白分子的任何特定部分。在一个非限制性实例中,肽IFAGIKKKAERADLIAYLKQATAK(Greene et al.,1995,J.Biol.Chem.2702967-2973;SEQ ID NO331)或该肽的热休克蛋白-结合片段用于本发明的任何缀合物中,以促进预先选择的分子与热休克蛋白的结合。除了前述结合热休克蛋白的肽以外,还可以通过使用具有热休克蛋白结合活性的有机分子或化合物实现结合。例如,合适的分子包括苯醌安沙霉素抗生素成员,例如除莠霉素A、格尔德霉素、macmimycin I、米莫沙霉素(mimosamycin)和库划霉素(kuwaitimycin)(Omura et al.,1979,J.Antibiotics 32255-261;另参阅WO9922761,其通过引用整体结合到本文中),或结构相关化合物及其类似物或衍生物。这些分子可通过已确立的化学方法经肽连接体缀合至本发明的抗原结构域,以产生能够体外或体内结合热休克蛋白并激发抗其中抗原的免疫应答的杂合抗原。
如2004年2月12日提交的同时待审和共同拥有的专利申请序号10/776,521(其通过引用整体结合到本文中)所述,发现在热休克蛋白结合结构域(例如但不限于如上文所述鉴别的)的C-端加入色氨酸残基(Trp或单氨基酸密码W)增强了与热休克蛋白的结合。已经发现增强与热休克蛋白的结合增强了杂合抗原诱导抗杂合抗原抗原结构域的免疫应答的能力,无论是以和热休克蛋白的复合物形式给予还是单独给予都是如此。免疫应答增强与疾病疗效增加相关。测定亲和性的其它方法实例描述于PCT/US96/13363(WO9706821),其通过引用整体结合到本文中。
在先前选择的热休克蛋白结合结构域中,为杂合抗原(其包含抗原结构域以及在热休克蛋白结合结构域和抗原结构域之间的本发明肽连接体)一部分的本发明优选热休克蛋白结合结构域包括以下热休克蛋白结合结构域Gly Lys Trp Val Tyr Ile Gly Trp(SEQ ID NO);Ala Lys Arg Glu Thr Lys Gly Trp(SEQ ID NO);Lys Trp Val His Leu Phe Gly Trp(SEQ ID NO);Arg Leu Val Leu Val Leu Gly Trp(SEQ ID NO);Trp Lys Trp Gly Ile Tyr Gly Trp(SEQ ID NO);Ser Ser His Ala Ser Ala Gly Trp(SEQ ID NO);Trp Gly Pro Trp Ser Phe Gly Trp(SEQ ID NO);Ala Ile Pro Gly Lys Val Gly Trp(SEQ ID NO);Arg Val His Asp Pro Ala Gly Trp(SEQ ID NO);Arg Ser Val Ser Ser Phe Gly Trp(SEQ ID NO);Leu Gly Thr Arg Lys Gly Gly Trp(SEQ ID NO);Lys Asp Pro Leu Phe Asn Gly Trp(SEQ ID NO);Leu Ser Gln His Thr Asn Gly Trp(SEQ ID NO);Asn Arg Leu Leu Leu Thr Gly Trp(SEQ ID NO);Tyr Pro Leu Trp Val Ile Gly Trp(SEQ ID NO);Leu Leu Ile Ile Asp Arg Gly Trp(SEQ ID NO);Arg Val Ile Ser Leu Gln Gly Trp(SEQ ID NO);Glu Val Ser Arg Glu Asp Gly Trp(SEQ ID NO);Ser Ile Leu Arg Ser Thr Gly Trp(SEQ ID NO);Pro Gly Leu Val Trp Leu Gly Trp(SEQ ID NO);Val Lys Lys Leu Tyr Ile Gly Trp(SEQ ID NO);Asn Asn Arg Leu Leu Asp Gly Trp(SEQ ID NO);
Ser Lys Gly Arg Trp Gly Gly Trp(SEQ ID NO);Ile Arg Pro Ser Gly Ile Gly Trp(SEQ ID NO);Ala Ser Leu Cys Pro Thr Gly Trp(SEQ ID NO);Asp Val Pro Gly Leu Arg Gly Trp(SEQ ID NO);Arg His Arg Glu Val Gln Gly Trp(SEQ ID NO);Leu Ala Arg Lys Arg Ser Gly Trp(SEQ ID NO);Ser Val Leu Asp His Val Gly Trp(SEQ ID NO);Asn Leu Leu Arg Arg Ala Gly Trp(SEQ ID NO);Ser Gly Ile Ser Ala Trp Gly Trp(SEQ ID NO);Phe Tyr Phe Trp Val Arg Gly Trp(SEQ ID NO);Lys Leu Phe Leu Pro Leu Gly Trp(SEQ ID NO);Thr Pro Thr Leu Ser Asp Gly Trp(SEQ ID NO);Thr His Ser Leu Ile Leu Gly Trp(SEQ ID NO);Leu Leu Leu Leu Ser Arg Gly Trp(SEQ ID NO);Leu Leu Arg Val Arg Ser Gly Trp(SEQ ID NO);Glu Arg Arg ser Arg Gly Gly Trp(SEQ ID NO);Arg Met Leu Gln Leu Ala Gly Trp(SEQ ID NO);Age Gly Trp Ala Asn Ser Gly Trp(SEQ ID NO);Arg Pro Phe Tyr Ser Tyr Gly Trp(SEQ ID NO);Ser Ser Ser Trp Asn Ala Gly Trp(SEQ ID NO);Leu Gly His Leu Glu Glu Gly Trp(SEQ ID NO);Ser Ala Val Thr Asn Thr Gly Trp(SEQ ID NO);Phe Tyr Gln Leu Ala Leu Thr(SEQ ID NO);Phe Tyr Gln Leu Ala Leu Thr Trp(SEQ ID NO),Arg Lys Leu Phe Phe Asn Leu Arg(SEQ ID NO).
Arg Lys Leu Phe Phe Asn Leu Arg Trp(SEQ ID NO),Lys Phe Glu Arg Gln(SEQ ID NO),Asn Ile Val Arg Lys Lys Lys(SEQ ID NO),和Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu(SEQ ID NO).
用于本发明各个方面的具有末端Trp残基的这种热休克蛋白结合结构域的其它非限制性实例包括
Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly Trp(SEQ ID NO350);Phe Tyr Gln Leu Ala Leu Tyr Trp(SEQ ID NO351);Arg Lys Leu Phe Phe Asn Leu Arg Trp(SEQ ID NO352);Gly Lys Trp Val Tyr Ile Gly Trp(SEQ ID NO295);Ala Lys Arg Glu Thr Lys Gly Trp(SEQ ID NO296);Lys Trp Val His Leu Phe Gly Trp(SEQ ID NO297);Arg Leu Val Leu Val Leu Gly Trp(SEQ ID NO298);Trp Lys Trp Gly Ile Tyr Gly Trp(SEQ ID NO299);Ser Ser His Ala Ser Ala Gly Trp(SEQ ID NO300);Trp Gly Pro Trp Ser Phe Gly Trp(SEQ ID NO301);Ala Ile Pro Gly Lys Val Gly Trp(SEQ ID NO302);Arg Val His Asp Pro Ala Gly Trp(SEQ ID NO303);Arg Ser Val Ser Ser Phe Gly Trp(SEQ ID NO304);Leu Gly Thr Arg Lys Gly Gly Trp(SEQ ID NO305);Lys Asp Pro Leu Phe Asn Gly Trp(SEQ ID NO306);Leu Ser Gln His Thr Asn Gly Trp(SEQ ID NO307);Asn Arg Leu Leu Leu Thr Gly Trp(SEQ ID NO308);Tyr Pro Leu Trp Val Ile Gly Trp(SEQ ID NO309);Leu Leu Ile Ile Asp Arg Gly Trp(SEQ ID NO310);Arg Val Ile Ser Leu Gln Gly Trp(SEQ ID NO311);Glu Val Ser Arg Glu Asp Gly Trp(SEQ ID NO312);Ser Ile Leu Arg Ser Thr Gly Trp(SEQ ID NO313);Pro Gly Leu Val Trp Leu Gly Trp(SEQ ID NO314);Val Lys Lys Leu Tyr Ile Gly Trp(SEQ ID NO315);Asn Asn Arg Leu Leu Asp Gly Trp(SEQ ID NO316);Ser Lys Gly Arg Trp Gly Gly Trp(SEQ ID NO317);Ile Arg Pro Ser Gly Ile Gly Trp(SEQ ID NO318);Ala Ser Leu Cys Pro Thr Gly Trp(SEQ ID NO319);Asp Val Pro Gly Leu Arg Gly Trp(SEQ ID NO320);Arg His Arg Glu Val Gln Gly Trp(SEQ ID NO321);Leu Ala Arg Lys Arg Ser Gly Trp(SEQ ID NO322);Ser Val Leu Asp His Val Gly Trp(SEQ ID NO323);
Asn Leu Leu Arg Arg Ala Gly Trp(SEQ ID NO324);Ser Gly Ile Ser Ala Trp Gly Trp(SEQ ID NO325);Phe Tyr Phe Trp Val Arg Gly Trp(SEQ ID NO326);Lys Leu Phe Leu Pro Leu Gly Trp(SEQ ID NO327);Thr Pro Thr Leu Ser Asp Gly Trp(SEQ ID NO328);Thr His Ser Leu Ile Leu Gly Trp(SEQ ID NO329);Leu Leu Leu Leu Ser Arg Gly Trp(SEQ ID NO330);Leu Leu Arg Val Arg Ser Gly Trp(SEQ ID NO331);Glu Arg Arg ser Arg Gly Gly Trp(SEQ ID NO332);Arg Met Leu Gln Leu Ala Gly Trp(SEQ ID NO333);Age Gly Trp Ala Asn Ser Gly Trp(SEQ ID NO334);Arg Pro Phe Tyr Ser Tyr Gly Trp(SEQ ID NO335);Ser Ser Ser Trp Asn Ala Gly Trp(SEQ ID NO336);Leu Gly His Leu Glu Glu Gly Trp(SEQ ID NO337);Ser Ala Val Thr Asn Thr Gly Trp(SEQ ID NO338);Leu Arg Arg Ala Ser Leu Trp(SEQ ID NO339);Leu Arg Arg Trp Ser Leu Trp(SEQ ID NO340);Lys Trp Val His Leu Phe Trp(SEQ ID NO341);Asn Arg Leu Leu Leu Thr Trp(SEQ ID NO342);Ala Arg Leu Leu Leu Thr Trp(SEQ ID NO343);Asn Ala Leu Leu Leu Thr Trp(SEQ ID NO344);Asn Arg Leu Ala Leu Thr Trp(SEQ ID NO345);Asn Leu Leu Arg Leu Thr Trp(SEQ ID NO346);Asn Arg Leu Trp Leu Thr Trp(SEQ ID NO347);和Asn Arg Leu Leu Leu Ala Trp(SEQ ID NO348).
其它用于实施本发明的热休克蛋白结合结构域包括Phe Tyr GlnLeu Ala Leu Thr Trp(SEQ ID NO501)、Phe Tyr Gln Leu Ala Leu ThrTrp(SEQ ID NO502)、Arg Lys Leu Phe Phe Asn Leu Arg Trp(SEQ IDNO503)、Arg Lys Leu Phe Phe Asn Leu Arg Trp(SEQ ID NO504)、LysPhe Glu Arg Gln Trp(SEQ ID NO505)、Asn Ile Val Arg Lys Lys Lys Trp(SEQ ID NO506)和Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu Trp(SEQ IDNO507)。
此外,其它热休克蛋白结合结构域包括描述于WO9922761中的热休克蛋白结合结构域,为达到本发明的目的可加入末端Trp残基。Xaa代表任意氨基酸。
Tyr Thr Leu Val Gln Pro Leu Trp(SEQ ID NO1149);Thr Pro Asp Ile Thr Pro Lys Trp(SEQ ID NO1150);Thr Tyr Pro Asp Leu Arg Tyr Trp(SEQ ID NO1151);Asp Arg Thr His Ala Thr Ser Trp(SEQ ID NO1152);Met Ser Thr Thr Phe Tyr Ser Trp(SEQ ID NO1153);Tyr Gln His Ala Val Gln Thr Trp(SEQ ID NO1154);Phe Pro Phe Ser Ala Ser Thr Trp(SEQ ID NO1155);Ser Ser Phe Pro Pro Leu Asp Trp(SEQ ID NO1156);Met Ala Pro Ser Pro Pro His Trp(SEQ ID NO1157);Ser Ser Phe Pro Asp Leu Leu Trp(SEQ ID NO1158);His Ser Tyr Asn Arg Leu Pro Trp(SEQ ID NO1159);His Leu Thr His Ser Gln Arg Trp(SEQ ID NO1160);Gln Ala Ala Gln Ser Arg Ser Trp(SEQ ID NO1161);Phe Ala thr His His Ile Gly Trp(SEQ ID NO1162);Ser Met Pro Glu Pro Leu Ile Trp(SEQ ID NO1163);Ile Pro Arg Tyr His Leu Ile Trp(SEQ ID NO1164);Ser Ala Pro His Met Thr Ser Trp(SEQ ID NO1165);Lys Ala Pro Val Trp Ala Ser Trp(SEQ ID NO1166);Leu Pro His Trp Leu Leu Ile Trp(SEQ ID NO1167);Ala Ser Ala Gly Tyr Gln Ile Trp(SEQ ID NO1168);Val Thr Pro Lys Thr Gly Ser Trp(SEQ ID NO1169);Glu His Pro Met Pro Val Leu Trp(SEQ ID NO1170);Val Ser Ser Phe Val Thr Ser Trp(SEQ ID NO1171);Ser Thr His Phe Thr Trp Pro Trp(SEQ ID NO1172);Gly Gln Trp Trp Ser Pro Asp Trp(SEQ ID NO1173);Gly Pro Pro His Gln Asp Ser Trp(SEQ ID NO1174);Asn Thr Leu Pro Ser Thr Ile Trp(SEQ ID NO1175);His Gln Pro Ser Arg Trp Val Trp(SEQ ID NO1176);Tyr Gly Asn Pro Leu Gln Pro Trp(SEQ ID NO1177);
Phe His Trp Trp Trp Gln Pro Trp(SEQ ID NO1178);Ile Thr Leu Lys Tyr Pro Leu Trp(SEQ ID NO1179);Phe His Trp Pro Trp Leu Phe Trp(SEQ ID NO1180);Thr Ala Gln Asp Ser Thr Gly Trp(SEQ ID NO1181);Phe His Trp Trp Trp Gln Pro Trp(SEQ ID NO1182);Phe His Trp Trp Asp Trp Trp Trp(SEQ ID NO1183);Glu Pro Phe Phe Arg Met Gln Trp(SEQ ID NO1184);Thr Trp Trp Leu Asn Tyr Arg Trp(SEQ ID NO1185);Phe His Trp Trp Trp Gln Pro Trp(SEQ ID NO1186);Gln Pro Ser His Leu Arg Trp Trp(SEQ ID NO1187);Ser Pro Ala Ser Pro Val Tyr Trp(SEQ ID NO1188);Phe His Trp Trp Trp Gln Pro Trp(SEQ ID NO1189);His Pro Ser Asn Gln Ala Ser Trp(SEQ ID NO1190);Asn Ser Ala Pro Arg Pro Val Trp(SEQ ID NO1191);Gln Leu Trp Ser Ile Tyr Pro Trp(SEQ ID NO1192);Ser Trp Pro Phe Phe Asp Leu Trp(SEQ ID NO1193);Asp Thr Thr Leu Pro Leu His Trp(SEQ ID NO1194);Trp His Trp Gln Met Leu Trp Trp(SEQ ID NO1195);Asp Ser Phe Arg Thr Pro Val Trp(SEQ ID NO1196);Thr Ser Pro Leu Ser Leu Leu Trp(SEQ ID NO1197);Ala Tyr Asn Tyr Val Ser Asp Trp(SEQ ID NO1198);Arg Pro Leu His Asp Pro Met Trp(SEQ ID NO1199);Trp Pro Ser Thr Thr Leu Phe Trp(SEQ ID NO1200);Ala Thr Leu Glu Pro Val Arg Trp(SEQ ID NO1201);Ser Met Thr Val Leu Arg Pro Trp(SEQ ID NO1202);Gln Ile Gly Ala Pro Ser Trp Trp(SEQ ID NO1203);Ala Pro Asp Leu Tyr Val Pro Trp(SEQ ID NO1204);Arg Met Pro Pro Leu Leu Pro Trp(SEQ ID NO1205);Ala Lys Ala Thr Pro Glu His Trp(SEQ ID NO1206);Thr Pro Pro Leu Arg Ile Asn Trp(SEQ ID NO1207);Leu Pro Ile His Ala Pro His Trp(SEQ ID NO1208);Asp Leu Asn Ala Tyr Thr His Trp(SEQ ID NO1209);
Val Thr Leu Pro Asn Phe His Trp(SEQ ID NO1210);Asn Ser Arg Leu Pro Thr Leu Trp(SEQ ID NO1211);Tyr Pro His Pro Ser Arg Ser Trp(SEQ ID NO1212);Gly Thr Ala His Phe Met Tyr Trp(SEQ ID NO1213);Tyr Ser Leu Leu Pro Thr Arg Trp(SEQ ID NO1214);Leu Pro Arg Arg Thr Leu Leu Trp(SEQ ID NO1215);Thr Ser Thr Leu Leu Trp Lys Trp(SEQ ID NO1216);Thr Ser Asp Met Lys Pro His Trp(SEQ ID NO1217);Thr Ser Ser Tyr Leu Ala Leu Trp(SEQ ID NO1218);Asn Leu Tyr Gly Pro His Asp Trp(SEQ ID NO1219);Leu Glu Thr Tyr Thr Ala Ser Trp(SEQ ID NO1220);Ala Tyr Lys Ser Leu Thr Gln Trp(SEQ ID NO1221);Ser Thr Ser Val Tyr Ser Ser Trp(SEQ ID NO1222);Glu Gly Pro Leu Arg Ser Pro Trp(SEQ ID NO1223);Thr Thr Tyr His Ala Leu Gly Trp(SEQ ID NO1224);Val Ser Ile Gly His Pro Ser Trp(SEQ ID NO1225);Thr His Ser His Arg Pro Ser Trp(SEQ ID NO1226);Ile Thr Asn Pro Leu Thr Thr Trp(SEQ ID NO1227);Ser Ile Gln Ala His His Ser Trp(SEQ ID NO1228);Leu Asn Trp Pro Arg Val Leu Trp(SEQ ID NO1229);Tyr Tyr Tyr Ala Pro Pro Pro Trp(SEQ ID NO1230);Ser Leu Trp Thr Arg Leu Pro Trp(SEQ ID NO1231);Asn Val Tyr His Ser Ser Leu Trp(SEQ ID NO1232);Asn Ser Pro His Pro Pro Thr Trp(SEQ ID NO1233);Val Pro Ala Lys Pro Arg His Trp(SEQ ID NO1234);His Asn Leu His Pro Asn Arg Trp(SEQ ID NO1235);Tyr Thr Thr His Arg Trp Leu Trp(SEQ ID NO1236);Ala Val Thr Ala Ala Ila Val Trp(SEQ ID NO1237);Thr Leu Met His Asp Arg Val Trp(SEQ ID NO1238);Thr Pro Leu Lys Val Pro Tyr Trp(SEQ ID NO1239);Phe Thr Asn Gln Gln Tyr His Trp(SEQ ID NO1240);Ser His Val Pro Ser Met Ala Trp(SEQ ID NO1241);
His Thr Thr Val Tyr Gly Ala Trp(SEQ ID NO1242);Thr Glu Thr Pro Tyr Pro Thr Trp(SEQ ID NO1243);Leu Thr Thr Pro Phe Ser Ser Trp(SEQ ID NO1244);Gly Val Pro Leu Thr Met Asp Trp(SEQ ID NO1245);Lys Leu Pro Thr Val Leu Arg Trp(SEQ ID NO1246);Cys Arg Phe His Gly Asn Arg Trp(AEQ ID NO1247);Tyr Thr Arg Asp Phe Glu Ala Trp(SEQ ID NO1248);Ser Ser Ala Ala Gly Pro Arg Trp(SEQ ID NO1249);Ser Leu Ile Gln Tyr Ser Arg Trp(SEQ ID NO1250);Asp Ala Leu Met Trp Pro XAA Trp(SEQ ID NO1251);Ser Ser XAA Ser Leu Tyr Ile Trp(SEQ ID NO1252);Phe Asn Thr Ser Thr Arg Thr Trp(SEQ ID NO1253);Thr Val Gln His Val Ala Phe Trp(SEQ ID NO1254);Asp Tyr Ser Phe Pro Pro Leu Trp(SEQ ID NO1255);Val Gly Ser Met Glu Ser Leu Trp(SEQ ID NO1256);Phe XAA Pro Met Ile XAA Ser Trp(SEQ ID NO1257);Ala Pro Pro Arg Val Thr Met Trp(SEQ ID NO1258);Ile Ala Thr Lys Thr Pro Lys Trp(SEQ ID NO1259);Lys Pro Pro Leu Phe Gln Ile Trp(SEQ ID NO1260);Tyr His Thr Ala His Asn Met Trp(SEQ ID NO1261);Ser Tyr Ile Gln Ala Thr His Trp(SEQ ID NO1262);Ser Ser Phe Ala Thr Phe Leu Trp(SEQ ID NO1263);Thr Thr Pro Pro Asn Phe Ala Trp(SEQ ID NO1264);Ile Ser Leu Asp Pro Arg Met Trp(SEQ ID NO1265);Ser Leu Pro Leu Phe Gly Ala Trp(SEQ ID NO1266);Asn Leu Leu Lys Thr Thr Leu Trp(SEQ ID NO1267);Asp Gln Asn Leu Pro Arg Arg Trp(SEQ ID NO1268);Ser His Phe Glu Gln Leu Leu Trp(SEQ ID NO1269);Thr Pro Gln Leu His His Gly Trp(SEQ ID NO1270);Ala Pro Leu Asp Arg Ile Thr Trp(SEQ ID NO1271);Phe Ala Pro Leu Ile Ala His Trp(SEQ ID NO1272);Ser Trp Ile Gln Thr Phe Met Trp(SEQ ID NO1273);
Asn Thr Trp Pro His Met Tyr Trp(SEQ ID NO1274);Glu Pro Leu Pro Thr Thr Leu Trp(SEQ ID NO1275);His Gly Pro His Leu Phe Asn Trp(SEQ ID NO1276);Tyr Leu Asn Ser Thr Leu Ala Trp(SEQ ID NO1277);His Leu His Ser Pro Ser Gly Trp(SEQ ID NO1278);Thr Leu Pro His Arg Leu Asn Trp(SEQ ID NO1279);Ser Ser Pro Arg Glu Val His Trp(SEQ ID NO1280);Asn Gln Val Asp Thr Ala Ara Trp(SEQ ID NO1281);Tyr Pro Thr Pro Leu Leu Thr Trp(SEQ ID NO1282);His Pro Ala Ala Phe Pro Trp Trp(SEQ ID NO1283);Leu Leu Pro His Ser Ser Ala Trp(SEQ ID NO1284);Leu Glu Thr Tyr Thr Ala Ser Trp(SEQ ID NO1285);Lys Tyr Val Pro Leu Pro Pro Trp(SEQ ID NO1286);Ala Pro Leu Ala Leu His Ala Trp(SEQ ID NO1287);Tyr Glu Ser Leu Leu Thr Lys Trp(SEQ ID NO1288);Ser His Ala Ala Ser Gly Thr Trp(SEQ ID NO1289);Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Trp(SEQ ID NO1290);Gly Ala Thr Ser Phe Gly Leu Trp(SEQ ID NO1291);Lys Pro Pro Gly Pro Val Ser Trp(SEQ ID NO1292);Thr Leu Tyr Val Ser Gly Asn Trp(SEQ ID NO1293);His Ala Pro Phe Lys Ser Gln Trp(SEQ ID NO1294);Val Ala Phe Thr Arg Leu Pro Trp(SEQ ID NO1295);Leu Pro Thr Arg Thr Pro Ala Trp(SEQ ID NO1296);Ala Ser Phe Asp Leu Leu Ile Trp(SEQ ID NO1297);Arg Met Asn Thr Glu Pro Pro Trp(SEQ ID NO1298);Lys Met Thr Pro Leu Thr Thr Trp(SEQ ID NO1299);Ala Asn Ala Thr Pro Leu Leu Trp(SEQ ID NO1300);Thr Ile Trp Pro Pro Pro Val Trp(SEQ ID NO1301);Gln Thr Lys Val Met Thr Thr Trp(SEQ ID NO1302);Asn His Ala Val Phe Ala Ser Trp(SEQ ID NO1303);Leu His Ala Ala Xaa Thr Ser Trp(SEQ ID NO1304);Thr Trp Gln Pro Tyr Phe His Trp(SEQ ID NO1305);
Ala Pro Leu Ala Leu His Ala Trp(SEQ ID NO1306);Thr Ala His Asp Leu Thr Val Trp(SEQ ID NO1307);Asn Met Thr Asn Met Leu Thr Trp(SEQ ID NO1308);Gly Ser Gly Leu Ser Gln Asp Trp(SEQ ID NO1309);Thr Pro Ile Lys Thr Ile Tyr Trp(SEQ ID NO1310);Ser His Leu Tyr Arg Ser Ser Trp(SEQ ID NO1311);和His Gly Gln Ala Trp Gln Phe Trp(SEQ ID NO1312).
在所有前述热休克蛋白结合肽中,本发明杂合抗原中的热休克蛋白结合结构域最优选Asn Leu Leu Arg Leu Thr Gly Trp(SEQ IDNO350)。但是,前述热休克蛋白结合结构域仅仅是肽和非肽热休克蛋白结合分子中可用于实施本发明的各种部分的示例。
本发明的杂合抗原整合了至少一个抗原性(免疫原性)结构域和至少一个热休克蛋白结合结构域,它们由本文所述的至少一个肽连接体分隔。本发明的杂合抗原可使用化学肽合成法合成,或者可通过表达核酸构建物合成,该构建物含编码抗原结构域和热休克蛋白结合结构域的连接序列。一种适宜的技术利用预分离PCR扩增反应生产单独的编码两个结构域的DNA节段,每个结构域都具有连接至一个末端的连接体片段,接着再用PCR步骤融合两个扩增的产物。该技术被称为连接体加尾(linker tailing)。还可以将合适的限制位点改造入目的区域中,此后利用限制消化和连接生产所需的杂合抗原-编码序列。
如本文所述,通过给予患者,编码本发明杂合抗原的核酸也适于治疗用途,其中体内表达产生的杂合抗原能够诱导免疫应答。
热休克蛋白本文使用的术语“热休克蛋白”是指任何在细胞承受压力时在细胞中表达增加的蛋白。在优选的非限制性实施方案中,热休克蛋白来源于真核细胞;在更优选的实施方案中,热休克蛋白来源于哺乳动物细胞。非限制性地,可用于本发明的热休克蛋白例如包括BiP(也称为grp78)、hsp70、hsc70、gp96(grp94)、hsp60、hsp40和hsp90以及其家族成员。特别优选的热休克蛋白是下文例举的BiP、gp96和hsp70。最优选hsp70家族成员。天然或重组来源的热休克蛋白突变体也可用于本发明。非限制性地,本发明例如提供突变以促使其分泌出细胞的热休克蛋白的用途(例如突变或缺失促使内质网再捕获的元件如KDEL或其同源物;这种突变体描述于PCT申请序号PCT/US96/13233(WO 97/06685),其通过引用结合到本文中)。
对于将热休克蛋白和杂合抗原以蛋白/肽复合物形式直接给予患者的本发明实施方案,可使用标准技术由天然来源制备热休克蛋白,例如如Flynn et al.,Science 245385-390(1989)所述,或者使用重组技术如在合适宿主细胞(如细菌、酵母或哺乳动物细胞)中表达热休克蛋白编码载体制备热休克蛋白。如果担心热休克蛋白预先加载了宿主生物肽,则可将热休克蛋白与ATP温育,然后再纯化。下文提出了制备重组热休克蛋白的方法的非限制性实例。
编码热激热休克蛋白的核酸可有效连接至表达必须或需要的元件,然后用其表达需要的热休克蛋白,以此作为用于蛋白疫苗的热休克蛋白的生产方法,或用于核酸疫苗。表达必须或需要的元件包括但不限于启动子/增强子元件、转录起始和终止序列、聚腺苷酸化信号、翻译起始和终止序列、核糖体结合位点、信号序列等。非限制性地,已克隆并测序的各种热休克蛋白基因例如包括但不限于gp96(人Genebank检索号X15187;Maki et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.875658-5562(1990);小鼠Genebank检索号M16370;Srivastava et al.,Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.843807-3811(1987))、BiP(小鼠Genebank检索号U16277;Haas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852250-2254(1988);人Genebank检索号M19645;Ting et al.,DNA 7275-286(1988))、hsp70(小鼠Genebank检索号M35021;Hunt et al.,Gene87199-204(1990);人Genebank检索号M24743;Hunt et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.826455-6489(1995))和hsp40(人Genebank检索号D49547;Ohtsuka K.,Biochem.Biophys.Res.Commun.197235-240(1993))。
给予方法可使用肽型、蛋白型或核酸疫苗,将本发明的杂合抗原或杂合抗原与热休克蛋白的复合物给予患者,使得在患者中产生的复合物的量在患者中有效诱导治疗性免疫应答。
所述患者可以是人类或非人类患者。
本文使用的术语“治疗性免疫应答”是指根据标准技术检测,抗杂合抗原的体液和/或细胞免疫增强。优选但非限制性地,诱导的抗杂合抗原的体液免疫水平至少比给予患者本发明组合物前抗该抗原的体液免疫水平高4倍,优选至少高16倍。还可以通过适于体外或体内实验的方法定量检测免疫应答,其中患者的肿瘤或感染性疾病进展停滞或缓解被认为是表示诱导出治疗性免疫应答。
热休克蛋白/杂合抗原的具体给予量取决于众多因素,包括具体疫苗组合物的免疫原性、患者的免疫能力、患者的大小以及给予途径。测定任何给定组合物的合适给予量是一项常规筛选工作。
此外,在单独给予杂合抗原(即没有热休克蛋白)的研究中鉴定出显著的免疫效力。尽管申请人没有义务公开实施本发明的理论,但不囿于理论,这些研究的结果提示杂合抗原在注射给患者时结合内源热休克蛋白,因此不需要为了效力而伴随给予热休克蛋白。本发明扩展至本发明杂合抗原的这种应用,而且,扩展至伴随疗法或治疗,即全身性或在要给予本发明杂合抗原的部位增加内源热休克蛋白水平。这种伴随疗法或治疗包括但不限于局部施用热,或局部或全身施用增加局部组织热休克蛋白表达的药剂。这种药剂和方法是本领域已知的。
在没有共给予热休克蛋白的情况下给予(即没有以和热休克蛋白的复合物形式给予)的杂合抗原包含至少一个抗原结构域和至少一个热休克蛋白结合结构域,并包含上文提及的其中一种肽连接体。
在本发明的具体非限制性实施方案中,可能需要包含一种以上的热休克蛋白和/或一种以上的杂合抗原,以便使免疫应答最佳。这种方案可能对治疗癌症或治疗特征为导致免疫应答逃避的突变快速发展的感染特别有利。而且,本发明的杂合抗原可包括一个以上的免疫原性结构域或一个以上的表位。
含以上提出的杂合抗原/热休克蛋白或单独杂合抗原的组合物在本文被称为“疫苗”。术语“疫苗”用于表示本发明的组合物可用于诱导预防性或治疗性免疫应答。本发明的疫苗可包含具有单一抗原结构域或表位的杂合抗原,或具有多个抗原结构域或表位的杂合抗原。而且,疫苗可包含具有单个或多个抗原结构域或表位的杂合抗原的混合物,或前述的任意组合。如上所述,杂合抗原或其混合物在给予前可与一种或多种热休克蛋白复合,或者可以在没有热休克蛋白的情况下给予。
可皮上、皮下、皮内、静脉、肌内、胃肠外、肺内、阴道、直肠、鼻内或局部给予含一种或多种杂合抗原的本发明疫苗组合物,其中所述杂合抗原任选复合一种或多种热休克蛋白。疫苗组合物可通过注射、颗粒轰击、口服或气溶胶传递。
将热休克蛋白和杂合抗原在溶液中温育在大多数情况下足以将抗原加载到热休克蛋白上。但是,在某些情况下可能需要加入可有助于加载抗原的物质。
加热温育热休克蛋白和杂合抗原一般可使抗原加载到热休克蛋白上。但是,在某些情况下可能需要加入另外的物质帮助加载。例如,hsp40可促进肽加载到hsp70上。Minami et al.,J. Biol.Chem.27119617-19624(1996)。可使用变性剂如盐酸胍或尿素部分或可逆地使热休克蛋白不稳定,以使肽结合袋更易于接近抗原。
详细地讲,含热休克蛋白的本发明疫苗优选还包含腺苷二磷酸(ADP),以促进热休克蛋白和热休克蛋白结合结构域在复合物达到其目标之前结合。可单独或与ADP组合使用其它具有相似能力的化合物。
本发明的疫苗组合物还可包含各种其它物质,例如药物可接受的载体。合适的载体包括任何标准的药物可接受载体,例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳浊液如油/水乳浊液或甘油三酯乳浊液、各类湿润剂、片剂、包衣片剂和胶囊。用于静脉和腹膜内给予化合物的可接受甘油三酯乳浊液的实例为商品名称为Intralipid的甘油三酯乳浊液。通常这类载体包含赋形剂,例如淀粉、乳、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸、滑石粉、植物脂或植物油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这种载体还可以包括调味剂和着色剂或其它成分。
本发明的疫苗组合物还可以包含合适的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这种组合物可为液体或冻干形式或其它无水制剂,可包含具有各种缓冲成分(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂、防止吸附至表面的添加剂如白蛋白或明胶、变性剂(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆酸盐)、增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苄醇、对羟基苯甲酸酯)、填充物或张力调节剂(例如乳糖、甘露醇)、聚合物如聚乙二醇与蛋白共价连接、与金属离子络合,或将物质加入到特定的聚合化合物制品如聚乙酸、聚乙醇酸、水凝胶等之中或之上,或将物质加入到脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层囊泡、红细胞影或原生质球上。这种组合将影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。组合物的选择取决于疫苗的物理和化学特性。例如,衍生自膜结合型蛋白的产物可能需要含变性剂的制剂。控释或缓释组合物包括在亲脂库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明还包括用聚合物(例如泊洛沙姆或Poloxamine)包衣的颗粒组合物,其偶联抗组织特异性受体、配体或抗原的抗体,或偶联组织特异性受体的配体。本发明组合物的其它实施方案加入了用于各种给予途径(包括肌内、胃肠外、肺部、鼻或口)的颗粒形式的保护膜、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂。
作为直接给予杂合抗原(任选复合热休克蛋白)的替代性方法,可给予一种或多种可表达形式的编码杂合抗原以及任选编码热休克蛋白的多核苷酸构建物。使用先体外后体内或体内方法将可表达的多核苷酸构建物导入患者细胞中。合适的方法包括直接注射入组织和肿瘤中、使用脂质体转染(Fraley et al.,Nature 370111-117(1980))、受体介导的胞吞作用(Zatloukal et al.,Ann.NY Acad.Sci.660136-153(1992))、粒子轰击介导的基因转移(Eisenbraun et al.,DNA&Cell Biol.12792-797(1993))和使用肽呈现噬菌体的转染(Barry et al,NatureMedicine 2299-305(1996)。还可将多核苷酸疫苗体外导入到合适的细胞中,然后将其导入患者中。
为构建可表达的多核苷酸,如上所述制备编码热休克蛋白和/或杂合抗原的区域,将其插入到哺乳动物表达载体中,该载体可有效连接至合适的启动子,例如SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。然后将获得的构建物用作基因免疫接种疫苗。还可将核酸聚合物克隆入病毒载体中。合适的载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、痘苗病毒载体、痘病毒载体和腺相关病毒载体。适用于本发明的具体载体为pCDNA3(In Vitrogen)、质粒AH5(其含有SV40复制起点和腺病毒主要晚期启动子)、pRC/CMV(In Vitrogen)、pCMU II(Paabo et al.,EMBO J.51921-1927(1986))、pZip-Neo SV(Cepko et al.,Cell 371053-1062(1984))和pSRα(DNAX,Palo Alto,CA)。
WO9706821和WO9922761公开了各种制备热休克蛋白和杂合抗原的方法,这两个文献通过引用整体结合到本文中。
在以下的实施例和整个申请中,氨基酸可用如下的其单字母密码表示A丙氨酸C半胱氨酸D天冬氨酸
E谷氨酸F苯丙氨酸G甘氨酸H组氨酸I异亮氨酸K赖氨酸L亮氨酸M甲硫氨酸N天冬酰胺P脯氨酸Q谷氨酰胺R精氨酸S丝氨酸T苏氨酸V缬氨酸W色氨酸Y酪氨酸参考以下非限制性实施例可以更好地理解本发明,本发明为举例而提供该实施例。提出以下的实施例是为了更全面地阐述本发明的优选实施方案。但是,不能以任何方式将其解释为限制本发明的广泛范围。
实施例1制备各种杂合抗原,每个都包含热休克蛋白结合结构域和癌症抗原表位或卵清蛋白的I类H2-Kb表位模型SIINFEKL。两个结构域之间包含肽连接体。用于这些实验的热休克蛋白结合结构域如下HWDFAWPW、NLLRLTGW、FYQLALTW和RKLFFNLRW。连接体是上文描述的连接体。
癌症和表位模型如以下
使用标准的固相肽合成,应用F-moc化学法,合成各种方向的含热休克蛋白结合结构域、癌症表位以及它们之间的肽连接体的杂合抗原。
实施例2通过标准Scatchard分析,测定参比的标记杂合抗原(氚化或荧光化ALFDIESKVGSGHWDFAWPW)与hsp70的结合亲和性(Kd分别为22.64μM和10.75μM),相对于该结合亲和性,通过结合抑制实验(Hill图)测定重组人或鼠热休克蛋白70(hsp70)与上文提及的各种热休克蛋白结合结构域和抗原肽之间以及与含上述抗原肽和热休克蛋白结合结构域的杂合抗原之间的结合亲和性。结合研究在39%PBS;20mMTHAM,pH 8;37mM NaCl,5mM MgCl2和1mM ADP中进行。
实施例3为在小鼠中进行免疫研究,使用得自卵清蛋白的鼠MHC H2-K(b)表位SIINFEKL(氨基酸257-264)和得自水泡性口炎病毒(VSV)核蛋白的H2-K(b)肽RGYVYQGL(氨基酸52-59)制备杂合抗原。下表提供了单独的和在杂合抗原中的表位的序列和对hsp70的亲和性。
实施例4用单独的hsp70、复合SIINFEKL的hsp70以及有或没有HSP70的杂合SIINFEKL肽在尾根部皮下免疫接种小鼠。调整剂量,以使每一接种都含有等量的SIINFEKL,单独的hsp70除外。7天后,收集脾脏并富集CD8+T细胞,对其进行先体外后体内IFN-γELISPOT实验。用SIINFEKL脉冲后的应答(“SIINFEKL”)记录于下表,包括剂量、每4×105CD8T细胞的斑点数(平均值±标准偏差),共进行4次或4次以上的实验,每组至少3只小鼠。对照包括单独的培养基(“培养基对照”)、无脉冲T细胞(“无脉冲对照”)、用得自VSV的非免疫肽RGYVYQGL脉冲T细胞(“VSV对照”)以及接触伴刀豆球蛋白A的阳性对照(“Con A阳性对照”)。
在同一实验中,使用SIINFEKL脉冲的靶细胞进行上述的51Cr-释放实验。当效应细胞/靶细胞比率为200∶1时,获得的致死百分比结果示于下表的最右栏。
(200-10)
实施例5进行一个类似于上述的实验,其还包括没有hsp70的杂合抗原。
(200-11)
实施例6再进行一个类似于上述的实验。
(200-12)
实施例7如先前的体内实验一样,以不同剂量皮下免疫接种B6小鼠,以评价使用其它短肽连接体制备的hsp70与杂合抗原的复合物,其中所述短肽连接体包括(使用单字母氨基酸密码)FFRK、RK、AKVL、QLK和FR。如上所述进行先体外后体内IFN-γELISPOT实验。包括对照值的结果如下。
(200-13)
200-21
200-23
实施例8使用未加入hsp70的制剂在B6小鼠中进行类似于上述的体内研究。结果如下。
(200-17)
实施例9使用有或没有hsp70的制剂在B6小鼠中进行类似于上述的体内研究。另外,进行一个杂合抗原与游离的热休克蛋白结合结构域肽(NLLRLTGW)共给予的研究。结果如下。
(VSV-72-02)
实施例10在许多前述实验中VSV表位RGYVYQGL用作对照,在制备其它的本发明杂合抗原时使用其作为表位,并以类似于上述的实验评价对免疫应答的诱导。
(VSV-72-02)
实施例11为了评价前述杂合抗原及其和hsp70的复合物对治疗疾病的效力,使用将修饰成表达卵清蛋白的20,000个E7肿瘤细胞(称为E.G7)皮下植入B6小鼠的模型。每个治疗组使用10只小鼠。该模型描述于例如Moroi et al.,2000,Proc.Nat.Acad.sci.USA 973485-3490。患肿瘤的小鼠数目随时间变化的结果示于图1。31天后,用hsp70NLLRLTGWFFRKSIINFEKL接种的10只小鼠均没有出现肿瘤,用Titermax佐剂乳化的SIINFEKL接种的小鼠也没有出现肿瘤。用单独的NLLRLTGWFFRKRSIINFEKL(没有hsp70)接种的10只小鼠有3只出现肿瘤。用hsp70SIINFEKL接种的10只小鼠有5只出现肿瘤,而用Titermax和缓冲液单独接种的10只小鼠有9只出现肿瘤。
实施例12进一步使用上述的体外抗原提呈实验,以便评价本发明的制剂。无论是以制剂形式还是以可内源获得形式提供,在杂合抗原更具体地说是其抗原进入抗原提呈路径时,本发明的杂合抗原都需要hsp70,为证实这一点,用以下制剂进行实验,并显示了结果。
(200-MF-41)
实施例13Firat et al.,1999,“H-2 class I knockout,HLA-A2.1-transgenic micea versatile animal model for preclinical evaluation of antitumorimmunotherapeutic strategies,”Eur J Immunol.293112-21描述了携带人HLA-A2复合物的HHD II小鼠模型,使用该模型在以下实验中评价本发明杂合抗原中的人HLA-A2表位。用低和高剂量的本发明杂合抗原在HHD II模型中评价人黑素瘤抗原gp100的“IMD”肽表位IMDQVPFSV。使用类似于以上描述的方法进行ELISPOT实验,测试肽是IMD肽,对照为得自黑素瘤抗原酪氨酸酶的肽YMDGTMSQV(“YMD”)。结果示于下表。
(HDD II 200-72-02)
使用YMD作为杂合抗原中的表位,以和hsp70的复合物在HDDII小鼠中进行相似的实验,结果如下。
(200-72-01)
实施例14同上文类似,用本发明的杂合抗原在B6小鼠中评价仙台病毒(SdV)表位FAPGNYPAL。结果如下。
(200-18)
实施例15进行体内实验,将本发明的两种杂合抗原和hsp70共给予B6小鼠。混合含卵清蛋白的SIINFEKL和VSV的RGYVYQGL的杂合抗原,与hsp70一起接种。结果如下。
(OVA-VSV-72-01)
实施例16如上所述,在本发明的一个方面,含多种具有不同抗原表位的杂合抗原的制剂可与一种或多种热休克蛋白一起配制,用于接种人,以激发有效治疗或预防疾病的免疫应答。例如,为治疗人黑素瘤,将含8种不同黑素瘤表位的制剂制备为杂合抗原,与例如hsp70配制。在该具体制剂中,所有表位的N-端都使用热休克蛋白结合结构域NLLRLTGW,使用肽连接体FFRK将其连接至表位的C-端。本文包含其它的结合结构域和连接体。此具体制剂可用于治疗HLA-A2单倍型患者。制剂含有以下的杂合抗原和hsp70
在一个实施方案中,可将大约等量的前述8种杂合抗原与hsp70复合,在盐水中给予。在另一个实施方案中,制剂包含所列出的前5种杂合抗原。含热休克蛋白的前述制剂的盐水溶液任选包含稳定复合物的ADP以及其它组分,例如上文提及的赋形剂、稀释剂和载体。在另一个实施方案中,将前述8种杂合抗原或所列出的前5种杂合抗原的混合物配制在盐水中,在没有热休克蛋白的情况下给予。
实施例17本实验评价初免方案。使用NLLRLTGWFFRKSIINFEKL杂合抗原,或者没有共给予hsp70,以下的5种方案为1)第0天给予,第7天分析;2)第0天和第7天给予,第21天分析;3)第0天给予,第21天分析;4)第0天和第14天给予,第28天分析;和5)第0天给予,第28天分析。每400,000个细胞的斑点数结果如下。
(200-28-72-01a、-01b、-01c)
实施例18用杂合抗原混合物如上再进行实验,以证实激发出针对组分抗原的免疫应答。在该实验中,使用含SIINFEKL和VSV肽RGYVYQGL的杂合抗原。
(VSV/OVA-72-02)
实施例19如实施例17所述,对含热休克蛋白结合结构域NLLRLTGW、抗原结构域SIINFEKL(得自卵清蛋白)或RGYVYQGL(得自VSV蛋白)以及实施例32提出的各种连接体的杂合抗原的结合亲和性进行检测。单独的抗原结构域对hsp70结合的Kd分别为235μM和82μM。结果示于以下。
实施例20进一步进行研究来评价杂合抗原单独给予B6小鼠而没有与hsp70共给予时的免疫原性。评价方法如上所述使用IFN-γELISPOT。
(对照200-24和200-30)
NT未测试实施例21制备含由上述连接体分隔的两种抗原的杂合抗原,以使杂合抗原具有以下通用结构(热休克蛋白结合结构域)-(连接体)-(抗原1)-(连接体)-(抗原2)。
尽管在此实施例中热休克蛋白结合结构域在杂合抗原的N端部分,但这种情况不是必须的,本发明也包括热休克蛋白结合结构域在C-端或在两个抗原结构域之间的杂合抗原。而且,尽管在以下的实施例中在抗原结构域之间以及抗原结构域和邻近的热休克蛋白结合结构域之间使用相同的连接体肽,但这种情况不是必须的,可以使用不同的连接体肽。而且,任选在一个或两个位置存在连接体。再进一步,可使用三个或更多个抗原肽。为简单起见,将这种具有两个或更多个抗原结构域的杂合抗原称为串联杂合抗原。这种串联杂合抗原组合物、一种或多种串联杂合抗原与热休克蛋白的复合物,以及通过给予一种或多种串联杂合抗原或至少一种热休克蛋白和至少一种串联杂合抗原的复合物激发免疫应答或预防或治疗疾病的方法,完全包含在本文中。
以下的实施例对比了两种杂合抗原的混合物和含相同抗原的串联杂合抗原的免疫原性以及剂量效应研究。在一个实验中,包括含两个连接体和表位但没有热休克蛋白结合结构域的肽。
(对照-200-72-01)
(S200-72-02)
(S200-72-12)
在本实施例及其它实施例中,邻近热休克蛋白结合结构域的表位表现出最强的免疫应答,因此选择用于本发明疫苗制剂的选定表位可定位于对制剂的整体免疫原性具有最大贡献的位置,无论是在没有热休克蛋白的情况下给予还是作为与热休克蛋白的复合物给予都是如此。
实施例22在以下的实验中,评价串联杂合抗原混合物的免疫原性。除了来自卵清蛋白(SIINFEKL)和来自VSV(RGYVYQGL)的H2-KbI类肽之外,还使用H2-Kbβ-酪蛋白肽IAYFYPEL和仙台病毒肽FAPGNYPAL。在另一个实验中,混合具有交替构型的相同抗原肽的两种串联杂合抗原。激发出针对4种表位的强免疫应答。
本文所有的制剂都含有1mM ADP。在一个下述实验中,ADP被省去。
(200-72-04)
5 S200-72-13
S200-72-13
S200-72-13,无ADP
实施例23在以下的实验中,当以两种串联杂合抗原和单个杂合抗原的混合物给予B6小鼠时,传入多达5种抗原肽,并在没有共给予HSP70的情况下诱导免疫原性。串联杂合抗原在一个抗原中含VSV和卵清蛋白肽,在另一个抗原中含β-酪蛋白和仙台病毒肽。单个杂合抗原含NS2-114流感病毒肽(RTFSFQLI)。
S200-72-15
实施例24在没有热休克蛋白的情况下给予前述的单个杂合抗原,评价单个杂合抗原连同杂合抗原中存在辅助T细胞表位时的免疫原性。在大多数实验中,使用卵清蛋白H2-KbII类表位的氨基酸323-339TEWTSSNVMEERKIKV(即杂合抗原序列为NLLRLTGWFFRKTEWTSSNVMEERKIKV)。含II类肽的杂合抗原将抗I类表位的应答平均增加至约7倍。
(250-72-08)
实施例25在没有热休克蛋白的情况下,评价杂合抗原与各种含H2-Kb II类肽的杂合抗原共给予对免疫原性的影响。I类肽为SSWDFITV或DAPIYTNV;II类肽包括上文提及的卵清蛋白肽、得自破伤风类毒素的II类肽NNFTVSFWLRVPKVSASHL(即杂合抗原序列为NLLRLTGWFFRKNNFTVSFWLRVPKVSASHL)或HBVc(氨基酸128-140)肽TPPAYRPPNAPIL。
250-72-13
因此,辅助T细胞表位可包含在杂合抗原中作为唯一的表位,与其它含I类表位的杂合抗原一起以混合物给予,或者辅助T细胞表位可包含在串联杂合抗原中作为表位之一。这些仅仅是关于本发明杂合抗原组合物众多变化的示例。
实施例26以和前述实施例相似的方式,评价在有和没有与含卵清蛋白II类肽的杂合抗原共给予时串联杂合抗原的免疫原性。
S250-72-12
250-72-15
实施例27另外,在没有与热休克蛋白共给予的情况下,共给予含辅助T细胞表位的杂合抗原与至少一种串联杂合抗原,进行类似的实验。
250-72-12
实施例28如上所述使用含人I类(HLA-A2)表位的杂合抗原在HHD II小鼠中进行免疫研究。用由5μg hsp70和33μgNLLRLTGWFFRKYMDGTMSQV制备的复合物接种小鼠。每300,000个细胞中的ELISPOT结果是培养基,1.33±0.58;脾细胞1±0;脾细胞+YMDGTMSQV 123±13;脾细胞+IMDQVPFSV 4±1。
实施例29在另一个使用HHDII小鼠的实验中,使用Trp-2的免疫原性HLA-A2表位(SVYDFFVWL)。因为该表位也是H2-Kb表位,而HHDII小鼠建立在B6小鼠(H2-Kb)基础上,所以诱导出抗Trp-2肽的免疫应答表明在小鼠模型中打破了对自身表位的耐受。该实验的结果证实对自身表位的耐受被打破,本发明进一步涉及通过给予本发明的杂合抗原和复合物打破耐受的方法。
HHDII-200-72-03
实施例30使用HHDII小鼠评价hsp70与三种杂合抗原的复合物的免疫原性,这三种杂合抗原含实施例27提出的某些HIV病毒组分表位。
HDDII-200-72-07
NT=未测试实施例31如上所述,评价与hsp70复合的含H2-Kb表位的杂合抗原混合物在B6小鼠中的免疫原性。
OBS-72-01
实施例32用B6小鼠研究与hsp7复合的串联杂合抗原的免疫原性。
S200-72-01
本发明不限于本文所述具体实施方案的范围。实际上,除了本文描述的这些之外,根据前文描述以及附图,本发明的各种修改对本领域技术人员来说是显而易见的。这种修改属于所附权利要求书的范围。
本文引用的各种出版物其内容都通过引用整体结合到本文中。
权利要求
1.一种杂合抗原,所述抗原包含至少一个感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、至少一个非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及它们之间的至少一个肽连接体,所述肽连接体选自Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln LeuGlu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);以及AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,AA2为K、V或E,AA3为V、S、F、K、A、E或T。
2.一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的组合物,所述组合物包含至少一种权利要求1的杂合抗原。
3.一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的组合物,所述组合物包含至少一种热休克蛋白和至少一种权利要求1的杂合抗原的复合物。
4.权利要求3的组合物,其中所述热休克蛋白为hsp70。
5.一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的方法,所述方法包括给予患者至少一种权利要求1的杂合抗原。
6.一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的方法,所述方法包括给予患者以下(a)和(b)的复合物(a)权利要求1的杂合抗原;和(b)热休克蛋白;其中所述杂合抗原和热休克蛋白非共价结合。
7.权利要求6的方法,其中所述热休克蛋白为hsp70。
8.一种治疗感染性疾病或癌症的方法,所述方法包括给予患者至少一种权利要求1的杂合抗原,所述杂合抗原中至少一个抗原结构域得自感染性疾病或癌症。
9.一种治疗感染性疾病或癌症的方法,所述方法包括给予患者以下(a)和(b)的复合物(a)权利要求1的杂合抗原,其中至少一个抗原结构域得自感染性疾病或癌症;和(b)热休克蛋白;其中所述杂合抗原和热休克蛋白非共价结合。
10.权利要求9的方法,其中所述热休克蛋白为hsp70。
11.一种杂合抗原,所述抗原基本组成为至少一个感染物或肿瘤抗原的抗原结构域、至少一个非共价结合热休克蛋白的结合结构域以及它们之间的至少一个肽连接体,其中肽连接体选自Phe Phe ArgLys(FFRK;SEQ ID NO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ ID NO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ ID NO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln LeuGlu(QLE)、Ala Lys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);以及AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,AA2为K、V或E,AA3为V、S、F、K、A、E或T。
12.一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的组合物,所述组合物包含至少一种权利要求11的杂合抗原。
13.一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的组合物,所述组合物包含至少一种热休克蛋白和至少一种权利要求11的杂合抗原的复合物。
14.权利要求13的组合物,其中所述热休克蛋白为hsp70。
15.一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的方法,所述方法包括给予患者至少一种权利要求11的杂合抗原。
16.一种诱导抗感染物或肿瘤抗原的免疫应答的方法,所述方法包括给予患者以下(a)和(b)的复合物(a)权利要求11的杂合抗原;和(b)热休克蛋白;其中所述杂合抗原和热休克蛋白非共价结合。
17.权利要求16的方法,其中所述热休克蛋白为hsp70。
18.一种治疗感染性疾病或癌症的方法,所述方法包括给予患者至少一种权利要求11的杂合抗原,所述抗原中至少一个抗原结构域得自感染性疾病或癌症。
19.一种治疗感染性疾病或癌症的方法,所述方法包括给予患者以下(a)和(b)的复合物(a)权利要求1的杂合抗原,其中抗原结构域得自感染性疾病或癌症;和(b)热休克蛋白;其中所述杂合抗原和热休克蛋白非共价结合。
20.权利要求19的方法,其中所述热休克蛋白为hsp70。
21.一种肽,所述肽为Phe Phe Arg Lys(FFRK;SEQ IDNO1000);Phe Arg Lys(FRK);Phe Arg Lys Asn(FRKN,SEQ IDNO1002);Arg Lys Asn(RKN);Phe Phe Arg Lys Asn(FFRKN,SEQ IDNO1003);Phe Arg(FR)、Gln Leu Lys(QLK)、Gln Leu Glu(QLE)、AlaLys Val Leu(AKVL;SEQ ID NO1001);Lys Asn(KN);Arg Lys(RK);或AA1-AA2-AA3-亮氨酸,其中AA1为A、S、V、E、G、L或K,AA2为K、V或E,AA3为V、S、F、K、A、E或T。
全文摘要
本发明描述了杂合抗原,其包含至少一个抗原结构域、至少一个热休克蛋白结合结构域以及它们之间的至少一个改进的肽连接体,所述杂合抗原当单独或以和至少一种热休克蛋白的复合物形式给予时用于诱导针对抗原结构域的免疫应答。杂合抗原及复合物可用于治疗表达抗原结构域抗原的感染性疾病和癌症。
文档编号C07K2/00GK1816348SQ200480015764
公开日2006年8月9日 申请日期2004年4月9日 优先权日2003年4月11日
发明者J·B·弗莱奇特纳, K·普赖恩斯-科汉, S·梅塔, P·斯卢萨勒奇茨, S·安德杰利克, B·H·巴伯 申请人:抗基因公司
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