专利名称：新型功能性肽核酸及其产生方法
技术领域：
本发明涉及使用赖氨酸制备功能性肽核酸寡聚体及其中间体的新方法。
背景技术：
核酸由控制活的生物体遗传信息的DNA和RNA组成。相反，肽核酸(PNA)指经修饰的核酸，其中核酸的糖-磷酸盐骨架已经转换为N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架(
图1)。虽然在中性条件下DNA/RNA的糖-磷酸盐骨架带负电荷而导致互补链之间静电排斥，但PNA的主链结构本身不具电荷。因此不存在静电排斥。所以与常规核酸比较，PNA具有更高的双链形成能力同时具有强的碱基序列识别能力。此外，由于PNA对活体中的核酸酶和蛋白酶极端稳定并不为它们降解，所以对其作为反义分子用于基因治疗开展了研究。
在通常使用DNA为媒介的技术中应用PNA的结果表明，那些迄今因使用DNA而难以克服的缺点可能得以弥补。例如，PNA可应用于快速而大量的遗传信息系统分析的“DNA微阵列技术”和最近发展的“分子信标”中，后者作为探针利用荧光发射检测碱基序列的特异性识别。因为这两种技术均利用缺乏酶抵抗力的DNA作为媒介，当使用这些技术时需要严格地取样。这些技术达到更高水平关键在于满足这样要求。
从另一个角度而言，因为PNA完全对酶抵抗，因此在DNA微阵列技术和分子信标中通过以PNA替代DNA使用，前面提到的技术性缺点可得到克服，从而预期可进一步利用这些技术优点。
虽然除DNA微阵列技术和分子信标以外，存在众多其他领域，其中PNA的使用预期将导致它们进一步发展，然而在这些领域中需要设计新型PNA单体以使PNA高效地发挥作用，即实现向PNA单体中高效地导入官能分子。
因为PNA寡聚体合成方法可使用常规的固相肽合成方法，根据PNA主链结构PNA单体单元的分类由两种类型即Fmoc型PNA单体单元和Boc型PNA单体单元组成(图2)。
合成Fmoc型PNA单体单元的合成方法已经建立，并且因为可用常规DNA自动合成仪进行它们的寡聚体合成，所以可按如下途径进行小规模合成[化学品4] (其中X代表鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或腺嘌呤)此外，Fmoc指9-芴基甲氧羰基，Boc指叔丁氧基羰基而Alloc指烯丙氧基羰基。
首先，使用如以下显示的那些Boc型PNA单体单元[化学品5] Michael Egholm，Ole Buchardt，Peter E.Nielsen，和Rolf H.BergJ.Am.Chem.Soc.1992，114，1895-1897.而后建立更高效率的合成方法。
然而因为已开发了前述的可供更便捷操作的Fmoc型PNA单体单元，Boc型的利用频率正在下降。
但是，当引入一个不为四种核酸碱基鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和腺嘌呤的官能分子如当引入光官能分子时，存在众多这样的情形，其中欲导入的官能分子在碱性条件下不稳定，因此不在碱性条件下应用的Boc型PNA主链就十分有用。本发明的发明人已经提交了“产生叔丁氧基羰基氨基乙基胺及氨基酸衍生物的方法”日本专利申请号2000-268638的专利申请。
此外，在现有技术中还存在光功能性寡PNA单体单元合成的五个例子。虽然这些方法全都使用了上述途径，但是它们的产率或者未见描述或者极端低下(Peter E.Nielsen，Gerald Haaiman，Anne B.Eldrup PCT国际申请(1998)WO 985295 A1 19981126、T.A.Tran，R.H.Mattern，B.A.Morgan(1999)J.Pept.Res，53，134-145、Jesper Lohse等人，(1997)Bioconjugate Chem.，8，503-509、Hans-georg Batz，Henrik FrydenlundHansen等人，PCT国际申请(1998)WO 9837232 A2 19980827、BruceArmitage，Troels Koch等人，(1998)Nucleic Acid Res.，26，715-720)。另外，因为所用化合物的结构在碱性条件下相对稳定，因此如果在碱性条件下附着不稳定发色团时，使用与上面提到的现有技术方法相似的方法，即随后的途径A，它们预计不能得以高效地产生。
因此，由于一般地存在多数情况其中官能分子如光官能分子是昂贵的，所以已经在寻找更适宜的功能性PNA的合成方法，即为(1)在功能性PNA单体单元的设计中向PNA主链结构有效引入诸官能分子，(2)考虑成本的合成途径和(3)适合作为基因诊断性药物的应用而极其快速地引入这些官能分子的方法。
考虑了上述诸问题，本发明的发明人发现了产生功能性单体的新方法，该方法如随后的途径B中所示，为对PNA主链结构中通过利用叔丁氧羰基氨基乙基胺衍生物6与1的含五氟苯基的活性酯形式5缩合而近乎定量地合成光功能性PNA单体4。
而且，本发明的发明人发现了在PNA主链结构中用苄氧基羰基-ω-氨基酸衍生物替代上述的叔丁氧基羰基氨基乙基胺衍生物6合成功能性PNA单体的不同方法(途径C)。已对这些方法提出专利申请。
因此，正在工业规模地建立由利用根据上述途径B或C的方法合成功能性PNA单体，然后聚合这些单体组成的最终合成功能性PNA的方法。也就是说，应用现成的功能性PNA合成方法工业规模地合成大量用作PNA探针的功能性PNA正成为可能。
另一方面，对产生功能性PNA的方法同样一直在进行改进以改善成本表现和允许超高速地引进官能分子。例如，作为不同于以上已述的利用功能性单体单元的方法，利用如下的前体PNA单体单元以合成后方式使诸官能分子引入PNA寡聚体的方法已经报道(Oliver Seitz；Tetrahedron Letters1999，40，4161-4164)。
在该方法中，在向PNA寡聚体中引入上述的前体PNA单体单元后，通过额外地导入官能分子合成功能性PNA。
然而，该方法具有对可引入的官能分子类型存在限制的不利之处。
例如，如以下显示，将无法引入商业上可获得的光官能分子琥珀酰亚胺酯。虽然必须首先引入一个连接物如Fmoc-Gly以导入该光官能分子，但是作为这样处理的结果上述化合物变得难以利用。
然而，本发明的发明人惊奇地发现可以合成涵盖范围极广的功能性PNA，该功能性PNA能够解决前面提到的现有技术的诸问题，具有优越的成本表现同时通过优化前体PNA单体单元的结构能够超高速地引入官能分子。
也就是说，本发明的发明人通过具有受保护基保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的PNA单体单元与如下显示的Fmoc-ω-氨基酸-BocPNA-OH(IV)反应，然后向所合成的PNA寡聚体内以合成后方式引入具有游离羧酸的官能分子而成功合成了PNA寡聚体。
(其中，n代表1至15的一个整数)。
前面提到的合成方法能够在已经导入官能分子后，引入不同类型的官能分子。此外，所引入的官能分子的特征在于可从光反应性官能分子、膜透过性官能分子、器官选择性官能分子、杀菌性官能分子、分子摧毁性官能分子、粘附性官能分子或分子识别性官能分子之中选择。
此外，因为不必需使用商业上可获得的琥珀酰亚胺酯作为欲导入的官能分子，以及可毫无困难地使用和定量地引入一种化合物，只要所述化合物具有羧酸，所以前面提到的合成方法具有极优越的成本表现。
而且，在向功能性PNA寡聚体中引入前面提到的前体PNA单体单元后，通过分割树脂，可向每一份树脂中引入不同的官能分子，因此有可能开发一种极其快速的功能性PNA寡聚体合成方法。
随后的通式(V)代表的化合物是根据这种方法高效合成的功能性PNA寡聚体的例子[化学品13] (其中每一个B相互独立地代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，其可以相同或者不同，每一个R相互独立地代表Fmoc基或功能性羧酸衍生物，其可以相同或不同，R1代表氢原子或功能性羧酸衍生物，a至h代表0至10的整数，X1至X3、Y1、Y2和Z1至Z5全部代表0或者大于0的整数，并且Z1+Z2+Z3+Z4+Z5≥0，条件是X1+X2+X3和Z1+Z2+Z3+Z4+Z5不同时为0，并且当X1+X2+X3＝0时，R1代表功能性羧酸衍生物)，其中Z1+Z2+Z3+Z4+Z5＝0而R1代表氢原子。
然而，虽然已经用DNA寡聚体、RNA寡聚体和PNA寡聚体作为荧光探针引入细胞，为了将这些寡聚物引入细胞，它们必须自然地通过细胞膜。然而，因细胞膜表面带负电荷，因此引入本身带有负电荷的DNA/RNA寡聚体极端困难。
另一方面，虽然PNA寡聚体具有电中性，但是这仍导致通过细胞膜困难。因此，当向细胞中导入PNA寡聚体时，预先处理膜表面以促进引入或者利用转染剂强行导入PNA寡聚体。
然而，在通过进行上述处理已经引入PNA寡聚体的情况下，即便寡聚体的探针功能已经得以表现，却仍然不能保证探针完全精确地表现机体天然展示的行为方式。而且，对单细胞如此，对多细胞(单个机体)应用时情况更是如此。
依据目前情况和观点，认为开发具有膜透过性功能的荧光PNA探针是有用的。
应当指出已经存在具有膜透过性功能的荧光PNA探针。这些探针的例子包括(1)其中具有膜透过性功能的寡肽与PNA结合的探针和2)其中具有膜透过性功能的磷脂与PNA结合的探针。但是，因为在穿透细胞膜后，这些探针的非PNA部分受到细胞内诸酶如蛋白酶的降解，预计它们将滞留在细胞内部。由于已经不能捕获目标的多余PNA探针丧失了它的膜透过性功能并难以经随后的冲洗步骤转移到细胞外，这意味着探针将不能精确地展示细胞本身所具有的基因表达系统。
然而，本发明的发明人成功通过利用包含Fmoc-ω-氨基酸-BocPNA-OH的前体PNA寡聚体以合成后方式引入具有膜透过性功能的氨基酸衍生物而设计了能够精确展示基因表达系统而无需复杂的前处理或后处理即直接使用活细胞的新型荧光PNA探针。
然而，这种Fmoc-ω-氨基酸-BocPNA-OH并不是唯一对这种前体PNA寡聚体有效的物质，相反其作用可同样由作为一种必需氨基酸的赖氨酸衍生物实现，同时据预测在未来考虑了设计操作简易性和获得方便的新型荧光PNA探针是必不可少的。
因此，本发明的目的是提供功能性PNA的新型合成方法、其中所用的化合物、以及新型功能性PNA，所述方法具有优越的成本表现并能够超高速地导入官能分子。
发明内容
作为考虑了前面提到的诸问题的深入研究结果，本发明的发明人惊奇地发现可以合成涵盖范围极广的功能性PNA，该PNA能够解决前面提到的现有技术的诸困难并且通过优化前体PNA单体单元的结构而涵盖极广范围，因此导致完成如下描述的本发明
(1)产生功能性PNA寡聚体的方法，该方法包括将受保护基保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的PNA单体单元与通式(I)的Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH(其中Fmoc代表9-芴基甲氧羰基)或通式(II)的Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH(其中Fmoc代表9-芴基甲氧羰基，Boc代表叔丁氧基羰基，且Alloc代表烯丙氧基羰基)反应，然后向所述PNA寡聚体中引入具有游离羧酸的官能分子以及保护基的脱保护。
(2)根据以上(1)的产生功能性PNA寡聚体的方法，其中在已经引入了官能分子后引入不同类型的官能分子。
(3)根据以上(1)的方法，其中导入的官能分子选自光反应性官能分子、膜透过性官能分子、器官选择性官能分子、杀菌性官能分子、分子摧毁性官能分子、粘附性官能分子或分子识别性官能分子。
(4)根据以上(2)或(3)的方法，其中引入的官能分子包含光官能分子和膜透过性官能分子。
(5)根据以上(4)的方法，其中光官能分子为下述的Cy3、Cy5、Bodipy、芘、萘二甲酰亚胺(naphthalimide)、萘二甲酰二亚胺(naphthaldiimide)、FAM、FITC、ROX、TAMRA或Dabcyl，同时膜透过性官能分子为水溶性氨基酸衍生物。
Cy3或Cy5[化学品15] 芘[化学品17] 萘二甲酰亚胺[化学品18] 萘二甲酰二亚胺[化学品19] [化学品21] [化学品22] [化学品23] (6)根据以上(1)至(5)中任一项所述的方法，其中保护腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的保护基为苄氧基羰基(Z基团)(7)根据以上(1)至(6)中任一项所述的方法，其中PNA寡聚体的合成包括使用供Boc和Fmoc方法的固相支持物在PNA链中的缩合和延伸。
(8)根据以上(1)至(7)中任一项所述的方法，其中供Boc方法的固相支持物为甲基二苯甲基胺(methylbenzhydrylamine；MBHA)树脂，该树脂用于以固相Boc方法的肽合成。
(9)根据以上(1)至(7)任意方法，其中供Fmoc方法的固相支持物为MBHA、其中聚苯乙烯得以氯甲基化的树脂(Merrifield树脂)、经4-羟苄基醇修饰的Merrifield树脂(Wang树脂)、与Boc-氨基酸连接物结合的氨甲基树脂(PAM树脂)、与N-Fmoc-N-甲氧基连接物结合的氨甲基树脂(Weinreb树脂)、其中对硝基二苯甲酮肟(p-nitrobenzophenonoxime)结合至聚苯乙烯的树脂(Oxime树脂)或聚苯乙烯经三苯甲基化的树脂(Trityl树脂)。
(10)根据以上(1)至(9)中任一项所述的方法，其中通过与在Boc方法中经哌啶处理Fmoc基或在Fmoc方法中经乙酸锌溶液处理Alloc基的选择性脱保护获得的伯氨基脱水缩合引入具有游离羧酸的官能分子。
(11)根据以上(2)的方法，其包括对下述a)至d)进行一次或两次及两次以上的a)和b)或进行一次或两次及两次以上的c)和d)a)在向PNA寡聚体中导入Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH的步骤中，通过将PNA单体单元与Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH反应产生PNA寡聚体；b)在前面提到的由PNA寡聚体产生功能性PNA寡聚体的步骤中，通过与经哌啶处理Fmoc基选择性脱保护得到的伯氨基脱水缩合向PNA寡聚体中导入官能分子；c)在向PNA寡聚体中导入Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH的步骤中，通过将PNA单体单元与Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH反应产生PNA寡聚体；d)在前面提到的由PNA寡聚体产生功能性PNA寡聚体的步骤中，通过与经乙酸锌溶液处理Alloc基选择性脱保护得到的伯氨基脱水缩合向PNA寡聚体中导入官能分子。
(12)下述通式(III)代表的化合物 (其中每一个B独立地代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，它们可以相同或者不同，每一个R独立地代表Fmoc基或功能性羧酸衍生物，R1代表氢原子或功能性羧酸衍生物，R2代表含有氢原子、氨基、羟基或巯基的衍生物或功能性羧酸衍生物，a至f代表0至∞的整数，X1至X3、Y1、Y2和Z1至Z6全部代表0或者大于0的整数，X1+X2+X3≥0，Y1+Y2＞0和Z1+Z2+Z3+Z4+Z5≥0，条件是X1+X2+X3且Z1+Z2+Z3+Z4+Z5不同时为0，且当X1+X2+X3＝0时，R1代表功能性羧酸衍生物)。
(13)根据以上(12)的化合物，其中X1+X2+X3＝3且Y1+Y2＝15。
(14)根据以上(13)的化合物，其中X1＝3且Y1＝15。
(15)根据以上(14)的化合物，其中R或R1代表细胞膜透过性官能分子衍生物。
(16)根据以上(15)的化合物，其中R1代表功能性羧酸衍生物。
(17)根据以上(15)或(16)的化合物，其中X1＝Z1＝1。
(18)根据以上(15)至(17)中任一项所述的化合物，其中Y1≥2且Z2＝1。
(19)根据以上(15)至(18)中任一项所述的化合物，其中a≤6，b≤4且f≤6。
(20)根据以上(15)至(19)中任一项所述的化合物，其中R1代表光功能性羧酸衍生物。
本发明通过在导入Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH或Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH的PNA寡聚体中以合成后方式导入官能分子而能够成功地近乎定量合成光功能性PNA寡聚体。
而且，Fmoc、Boc、Alloc的每一个优点即如作为解释证据的以上(1)所显示。
根据前面提到的特征，在本发明的产生方法中，不必使用商业上可获得的琥珀酰亚胺酯作为欲导入的官能分子，同时可毫不困难地利用和定量导入任何化合物，只要该化合物具有羧酸。因此，根据本发明的产生方法具有极端优越的成本表现。
此外，在向功能性PNA寡聚体中导入前面提到的前体PNA单体单元后，通过分割树脂，不同的官能分子可导入每一份树脂中，因此根据本发明的产生方法，可开发极其快速的功能性PNA寡聚体合成方法。
如下述通式(III)代表的化合物是根据本发明的方法高效合成的功能性PNA寡聚体的例子[化学品25] (其中每一个B独立地代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，它们可以相同或者不同，每一个R独立地代表Fmoc基或功能性羧酸衍生物，它们可以相同或不同，R1代表氢原子或功能性羧酸衍生物，R2代表含有氢原子、氨基、羟基或巯基的衍生物或功能性羧酸衍生物，a至f代表0至∞的整数，X1至X3、Y1、Y2和Z1至Z6全部代表0或者大于0的整数，X1+X2+X3≥0，Y1+Y2＞0且Z1+Z2+Z3+Z4+Z5≥0，条件是X1+X2+X3和Z1+Z2+Z3+Z4+Z5不同时为0，并且当X1+X2+X3＝0时，R1代表功能性羧酸衍生物)，其中Z1+Z2+Z3+Z4+Z5＝0且R1代表氢原子。
根据本发明，在如前面提到的通式(I)代表的化合物中多个任意位置上可导入相同或者不同的官能分子。也就是说，虽然这是实施了哌啶处理或乙酸锌溶液处理以及在用前述的前体PNA单体单元导入PNA寡聚体后以合成后方式导入官能分子的综合结果，这对于快速地设计提高PNA寡聚体细胞膜透过功能的触角足(在触角或感觉器结合部形成腿部的基因组)极其重要。就这一点而言，根据本发明的方法极具优势。
以这种方式产生的化合物例子为这样的化合物，其中在前面提到的通式(I)中Z1+Z2+Z3+Z4+Z5＞0，且R代表细胞膜透过性官能分子衍生物，R1代表功能性羧酸衍生物。
该探针可大体上分为荧光标记区、细胞膜透过性功能区和分子识别区并且具有这种形式，其中每一部分通过连接物部位(下标Z1至Z5代表的部分)结合。
可商业获得的产品和前面已经由本发明的发明人提交PCT申请的新型荧光标记PNA单体单元可用作荧光标记的化合物。
用可商业获得的PNA单元合成分子识别位点。它们的特征在于将作为前体单元的Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH或Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH用于膜透过功能区从而以合成后方式导入官能分子。所提到的前体单元可商业地获得，其特征为在连续导入众多这样的单元后，可如前述同时导入同样的官能分子。
因此，根据本发明，多种官能分子可轻易并且极端高效地引入PNA同时对光官能分子无任何限制。
这些功能分子的例子包括诸如Cy3、Cy5、Bodipy、萘二甲酰亚胺、萘二甲酰二亚胺、黄素、Dabcyl、生物素、FAM、罗丹明、TAMRA、ROX、HABA、芘和香豆素类的光功能性单体单元、膜透过性官能分子、器官选择性官能分子、杀菌性官能分子、分子摧毁性官能分子、粘附性官能分子和分子识别性官能分子。
也就是说本发明中的术语“功能性”不仅指光功能性，同时也指通过进行特定修饰而新近赋予化合物的多种功能的总称，包括膜透过性、器官选择性、杀菌活性、分子摧毁性、粘附性和分子识别。
而且，本发明中的术语“功能性PNA”不仅指将相应的PNA单体直接结合至2-(N-氨乙基)甘氨酸骨架的PNA，同时也包括其间导入了烃链和官能分子的前体赖氨酸骨架。
附图简述图1是代表DNA和PNA中结构和电荷状态不同的示图。
图2是代表两种类型的PNA单体单元的结构示图。
在此详细阐明本发明方法的特征。
实施本发明的最佳方式根据本发明合成寡-PNA的一般途径如以下化学式26和化学式27显示。
Fmoc-ω-氨基酸 Fmoc-ω-氨基酸-BocPNA-OPfp [化学式27] 进一步，MBHA指用于固相Boc肽合成的甲基二苯甲基胺树脂，而Wang指经4-羟苄基醇修饰的Merrifield树脂，并且这些树脂都在 和 中得以描述。
其次，在与[化学式26]有关的产生步骤中，如下[化学式28]中所示利用Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH合成寡聚体Ia。
更具体地，将具有以如Z基(苄氧基羰基)等保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的PNA单体单元与前体PNA单体单元反应并利用Boc固相支持物使PNA链相继地缩合和延伸。
在缩合PNA链时，虽然必须事先去除Boc基，但对实现该目标的方法无限制，故使用了常规的方法。利用一般的缩合剂如HATU、HBTU或BOP进行缩合。
此外，虽然对固相支持物无特殊限制，只要其可用于Boc方法即可，但是特别优选地使用MBHA。
接下来，在与[化学品26]有关的生产步骤中，如下图所示通过哌啶处理选择性脱保护Fmoc基以获得氨基而得到Ib，[化学品29] 其后通过具有游离羧酸的官能分子与所述Ib中前面提到的氨基脱水并缩合得到如下述[化学品30]显示的Ic。
虽然对前面提到的羧酸无特殊限制，因为脂肪族羧酸能够提高产率而就反应性而言脂肪族羧酸反应性超过芳香族羧酸，故优选地使用脂肪族羧酸。
此外，哌啶处理的Fmoc基脱保护优选地通过给予一定量时间进行。20至40分钟的时间段尤其为优选，而30分钟时间段最为优选。
对缩合剂的类型无特殊限制，并且与前面提到的PNA链缩合相似，使用一般的缩合剂如HATU、HBTU或BOP。
更进一步，可在已经缩合了Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH，或已经连续地缩合了所有包含Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH的PNA单体单元之后立即导入官能分子。
最后，在与[化学品26]有关的生产步骤中，如下图所示通过同时进行从支持物树脂上的切出和Z基脱保护，获得所需要的PNA寡聚体Id。
对切割和脱保护条件无特殊限制只要它们在Fmoc基脱保护后进行即可。例如，优选地在常规条件如TFA/TFMSA/对甲酚/苯硫基甲烷＝60/25/10/10下进行切割和脱保护。
其次，在与[化学品27]有关的生产步骤中，如下图所示利用Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH合成寡聚体IIa。
更具体地，将具有以如Boc基等保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的PNA单体单元与前体PNA单体单元反应，然后利用Fmoc固相支持物进行PNA链的连续缩合和延伸。
在缩合PNA链时，虽然必须事先清除Fmoc基，但对实现该目标的方法无限制，故使用了常规的方法。利用一般的缩合剂如HATU、HBTU或BOP进行后续缩合。
此外，虽然对固相支持物无特殊限制，只要其可用于Fmoc方法即可，但是特别优选地使用Wang。
再者，在与[化学品27]有关的生产步骤中，通过乙酸锌溶液处理选择性脱保护Fmoc基以获得氨基而得到如下述[化学品33]显示的IIb，[化学品33] 其后通过具有游离羧酸的官能分子与所述IIb中前面提到的氨基脱水并缩合得到如下述[化学品34]显示的IIc。
虽然对前面提到的羧酸无特殊限制，基于因脂肪族羧酸就反应性而言超过芳香族羧酸故脂肪族羧酸能够提高产率的事实，脂肪族羧酸的使用为优选。
此外，乙酸锌溶液处理的Alloc基脱保护优选地通过给予一定量的时间进行。10分钟至1小时的时间段为优选。
对缩合剂的类型无特殊限制，与前面提到的PNA链缩合相似，使用一般的缩合剂如HATU、HBTU或BOP。
更进一步，可在已经缩合了Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH或已经连续地缩合了所有包含Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH的PNA单体单元之后立即导入官能分子。
最后，在与[化学品27]有关的生产步骤中，通过同时进行从支持物树脂上的切割和Boc基脱保护，获得所需要的如下述[化学品35]显示的PNA寡聚体IId。
对切割和脱保护的条件无特殊限制，只要它们在Fmoc基脱保护后进行即可。例如，优选地在常规条件如TFA/对甲酚＝95/5下进行切割和脱保护。
已经如以上所描述，在根据本发明的方法中，不同于需要合成现有技术的功能性单体合成中所用活性酯的方法，官能分子可直接使用。此外，一旦IIa已经合成即可导入多种官能分子，从而使迅速而平行地合成多种PNA探针成为可能，而这在现有技术中是困难的。
根据本发明的方法，该方法包括将Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH或Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH与具有PNA链的分子进行反应，如下通式(III)代表的化合物即可作为示例[化学品36] (其中每一个B独立地代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，它们可以相同或者不同，每一个R独立地代表Fmoc基或功能性羧酸衍生物，它们可以相同或不同，R1代表氢原子或功能性羧酸衍生物，R2代表含有氢原子、氨基、羟基或巯基的衍生物或功能性羧酸衍生物，a至f代表0至∞的整数，X1至X3、Y1、Y2和Z1至Z6全部代表0或者大于0的整数，X1+X2+X3≥0，Y1+Y2＞0且Z1+Z2+Z3+Z4+Z5≥0，条件是X1+X2+X3和Z1+Z2+Z3+Z4+Z5不同时为0，并且当X1+X2+X3＝0时，R1代表功能性羧酸衍生物)，其中Z1+Z2+Z3+Z4+Z5＝0且R1代表氢原子。
此外，在如前面提到的通式(III)代表的化合物中，对于其中例如R或R1代表细胞膜透过性官能分子衍生物的化合物可优选地作为其中导入多个官能分子的化合物而合成。此类化合物的一般例子为其中R代表细胞膜透过性功能分子衍生物且R1代表功能性羧酸衍生物例如光官能分子，也就是说在该化合物中包括末尾部分的众多位点上导入了多种官能分子，并且因此赋予众多的功能。如下所示为此类化合物的例子的略图代表[化学品37] 此类化合物是例如在前面提到的通式(III)中X1＝Z1＝Z2＝1且Y1≥2的化合物。就合成的难易度、合成成本等等诸方面而言这类化合物更为优选。
虽然对前面提到的化合物无特殊限制，只要a、b、f分别都是0至10的一个整数，即使例如a≤6、b≤4和f≤6，就合成或实际运用而言不存在任何特殊的困难。
导入连接物部位可阻止功能性部位与碱基序列识别区之间的干扰，并且使分子功能更可靠地得到表现。本说明书中的术语PNA、PNA单体和PNA寡聚体包括那些在它们的末端和/或中部含有连接物部位的PNA、PNA单体和PNA寡聚体。
除了前面提到的连接物部位外，按照需要选择通式(III)中的f至h也可阻止这些部位或区域之间相互干扰。
虽然组成连接部位的基团的例子包括直链烃或支链烃及它们的醚形式，就导入的难易度和成本而言优选直链烃基，并且尤其优选具有1至6个碳原子的直链烃基。就它们的通用性而言优选醚形式。前面提到的其中已经导入多个官能分子的化合物优选地用例如Koch，T.；Hansen，H.F.；Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G.；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88.的方法合成。
利用众多类型可商业获得的PNA单体通过固相合成将碱基序列识别部位转换为寡聚体。能利用可商业获得的Boc-7-氨基庚酸或Boc-6-氨基己酸等等作为连接物部位。
若光官能分子作为通式(III)的官能分子导入，可荧光标记该分子并且也可合成带有其他功能的化合物。虽然能对此类型荧光标记部位使用可商业获得的活性酯型荧光标记化合物例如可商业获得的Cy3、Cy5、Bodipy、芘、萘二甲酰亚胺、萘二甲酰二亚胺、FAM、FITC、ROX、TAMRA和Dabcyl从而选择多种荧光发射波长，但是可导入的荧光标记化合物不限于这些化合物。
向本发明的化合物中导入另一种功能的例子包括膜透过性功能。该类型的膜透过性功能位点可利用在以前专利中由前面提到的通式(III)代表的化合物以类似方式导入。精氨酸是能够提高膜透过性的官能分子的例子之一，而水溶性氨基酸如赖氨酸和丝氨酸同样可优选地使用。
此外，通过使用Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH或Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH也可导入众多氨基酸。这种合成的例子如实施例1所示。但是，根据本发明前面提到的化合物只是具有膜透过性功能的荧光PNA探针的模型化合物，本发明不限于此。
这些探针的特征在于具有完全的酶抵抗性，因为它们完全为PNA型探针。也就是说，虽然以前具有膜透过性功能的探针主要由PNA和具有膜透过性功能的肽链或磷脂共价结合的探针组成，并且这些已知的探针具有优越的膜渗透功能，但是一旦它们进入细胞，肽链或磷脂预计将由酶降解。因此这些探针的不利之处在于不识别目标而被降解的探针不能在洗涤步骤中完全去除。
相反，这里设计的探针能精确地定量测定表达的基因的量，因为作为在细胞内不易受酶降解的结果，不识别目标的探针能够在洗涤步骤中完全去除。
更进一步，除了具有这些功能的化合物外，根据本发明也可以无限制地导入器官选择性官能分子例如乳糖和tris-X、杀菌性官能分子例如艾菊苦素(tanatin)和Secropin、分子识别官能分子例如Viologen、分子摧毁性官能分子例如N-甲基异羟肟酸，并且这些化合物可以极其低的成本提供实用。
实施例虽然下面应用实施例提供了对本发明更为详细的阐述，但本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1-合成具有膜透过性功能的荧光PNA探针[化学品38]
首先根据标准的Boc方法(参考Koch，T.；Hansen，H.F.；Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G.；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88)在固相支持物MBHA(50mg)上利用胸腺嘧啶PNA单体单元(7.7mg，20mmol)、缩合剂HBTU(7.6mg，20mmol)和DIEA(3.5ml，20mmol)进行依次的延伸反应(碱基序列识别区的设计)。
其次，用缩合剂HBTU(7.6mg，20mmol)和DIEA(3.5mg，20mmol)依次缩合连接物ω-氨基酸-Boc-7-氨基庚酸(5.2mg，20mmol)、Fmoc-Ahx-BocPNA-OH(10.0mg，20mmol)和再次缩合Boc-7-氨基庚酸(连接物部位和膜透过性功能区的设计)。
在依次缩合所有单元后，用哌啶处理(在DMF中20％哌啶，室温3分钟)脱保护Fmoc基。接下来，用缩合剂HBTU(15.2mg，40mmol)和DIEA(7.0ml，40mmol)缩合功能性羧酸衍生物的天然存在形式Fmoc-Arg(Mts)-OH(23.1mg，40mmol)以在所需要的位点导入官能分子(导入膜透过性功能)。
在经哌啶处理(在DMF中20％哌啶，室温3分钟)脱保护Fmoc基后，再次用缩合剂HBTU(15.2mg，40mmol)和DIEA(7.0ml，40mmol)缩合天然存在的Fmoc-Arg(Mts)-OH(23.1mg，40mmol)以在所需要的位点导入官能分子。然后重复该过程多次(膜透过性功能的额外导入)。
在经TFA处理(95％TFA/5％间甲酚)脱保护Boc基后，在DIEA(17.4mg，100mmol)存在时室温搅拌12小时以荧光标记FITC(9.3mg，25mg)(荧光标记位点的设计)。
最后，经哌啶处理(2-哌啶D，室温3分钟)脱保护仍存在的Fmoc基后，按常规的方法(TFA/TFMSA/对甲酚/苯硫基甲烷＝60/25/10/10))将荧光PNA探针从固相支持物上切下，然后进行后处理以获得所需要的产物。MALDI-TOF MS计算分子量6373.0231(M+H+)。
实施例2-合成具有膜透过性功能的荧光PNA探针 首先根据标准的Boc方法(参考Koch，T.；Hansen，H.F.；Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G.；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88)在固相支持物MBHA(50mg)上利用胸腺嘧啶PNA单体单元(7.7mg，20mmol)、缩合剂HBTU(7.6mg，20mmol)和DIEA(3.5ml，20mmol)进行依次的延伸反应(碱基序列识别区的设计)。
接下来，用缩合剂HBTU(7.6mg，20mmol)和DIEA(3.5mg，20mmol)依次缩合连接物ω-氨基酸-Boc-7-氨基庚酸(5.2mg，20mmol)、Fmoc-Ahx-BocPNA-OH(10.0mg，20mmol)和再次缩合Boc-7-氨基庚酸(连接物部位和膜透过性功能区的设计)。
在依次缩合所有单元后，用哌啶处理(在DMF中20％哌啶，室温3分钟)脱保护Fmoc基。接下来，用缩合剂HBTU(15.2mg，40mmol)和DIEA(7.0ml，40mmol)缩合功能性羧酸衍生物的天然存在形式Fmoc-Arg(Mts)-OH(23.1mg，40mmol)以在所需要的位点导入官能分子(导入膜透过性功能)。
在经哌啶处理(在DMF中20％哌啶，室温3分钟)脱保护Fmoc基后，再次用缩合剂HBTU(15.2mg，40mmol)和DIEA(7.0ml，40mmol)缩合天然存在的Fmoc-Arg(Mts)-OH(23.1mg，40mmol)以在所需要的位点导入官能分子。然后该过程重复多次(膜透过性功能的额外导入)。
在经TFA处理(95％TFA/5％间甲酚)脱保护Boc基后，在DIEA(17.4mg，100mmol)存在时室温搅拌12小时以荧光标记FITC(9.3mg，25mg)(荧光标记位点的设计)。
最后，经哌啶处理(2-哌啶D，室温3分钟)脱保护仍存在的Fmoc基后，按常规的方法(TFA/TFMSA/对甲酚/苯硫基甲烷＝60/25/10/10))将荧光PNA探针从固相支持物上切下，然后进行后处理以获得所需要的产物。MALDI-TOF MS计算分子量6373.0231(M+H+)。
工业可应用性根据本发明，因为可将不限于光官能分子的多种官能分子轻易地和高效地导入PNA，使得构建多种用于基因治疗等的PNA成为可能，因此本发明可在医学和制药工业的广泛领域得以应用。
权利要求
1.产生功能性PNA寡聚体的方法，该方法包括将具有受保护基保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的PNA单体单元与根据通式(I)的Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH(其中Fmoc代表9-芴基甲氧羰基)或根据通式(II)的Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH(其中Fmoc代表9-芴基甲氧羰基，Boc代表叔丁氧基羰基，Alloc代表烯丙氧基羰基)反应合成PNA寡聚体，然后向所述PNA寡聚体导入具有游离羧酸的官能分子及保护基的脱保护。[化学品1] Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH(I)[化学品2] Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH (II)
2.根据权利要求1所述的方法，其中在已经导入了官能分子后，再导入不同类型的官能分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中欲导入的官能分子选自光反应性官能分子、膜透过性官能分子、器官选择性官能分子、杀菌性官能分子、分子摧毁性官能分子、粘附性官能分子和分子识别性官能分子。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中欲导入的官能分子包含光官能分子和膜透过性官能分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中光官能分子为Cy3、Cy5、Bodipy、芘、萘二甲酰亚胺、萘二甲酰二亚胺、FAM、FITC、ROX、TAMRA或Dabcyl，且膜透过性官能分子为水溶性氨基酸衍生物。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中保护腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的保护基为苄氧基羰基(Z基团)。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其中合成PNA寡聚物包括使用Boc方法和Fmoc方法所用的固相支持物对PNA链进行缩合和延伸。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的方法，其中Boc方法所用的固相支持物为在固相Boc方法中用于肽合成的甲基二苯甲基胺(MBHA)。
9.根据权利要求1至7中任意一项所述的方法，其中Fmoc方法所用的固相支持物为MBHA、其中聚苯乙烯被氯甲基化的树脂(Merrifield树脂)、经4-羟苄基醇修饰的Merrifield树脂(Wang树脂)、与Boc-氨基酸连接物结合的氨甲基树脂(PAM树脂)、与N-Fmoc-N-甲氧基连接物结合的氨甲基树脂(Weinreb树脂)、其中对硝基二苯甲酮肟结合至聚苯乙烯的树脂(Oxime树脂)或经三苯甲基化的聚苯乙烯树脂(Trityl树脂)。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的方法，其中通过与在Boc方法中经哌啶处理Fmoc基或在Fmoc方法中经乙酸锌溶液处理Alloc基而选择性脱保护得到的伯氨基脱水缩合而导入具有游离羧酸的官能分子。
11.根据权利要求2的方法，其包括对下述a)至d)进行一次或两次及两次以上的a)和b)或进行一次或两次及两次以上的c)和d)a)在向PNA寡聚体中导入Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH的步骤中，通过将PNA单体单元与Boc-赖氨酸(Fmoc)-OH反应产生PNA寡聚体；b)在前面提到的由PNA寡聚体产生功能性PNA寡聚体的步骤中，通过与经哌啶处理Fmoc基选择性脱保护得到的伯氨基脱水缩合向PNA寡聚体中导入官能分子；c)在向PNA寡聚体中导入Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH的步骤中，通过将PNA单体单元与Fmoc-赖氨酸(Alloc)-OH反应产生PNA寡聚体；d)在前面提到的由PNA寡聚体产生功能性PNA寡聚体的步骤中，通过与经乙酸锌溶液处理Alloc基选择性脱保护得到的伯氨基脱水缩合向PNA寡聚体中导入官能分子。
12.下述通式(III)代表的化合物[化学品3] (其中每一个B独立地代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，它们可以相同或者不同，每一个R独立地代表Fmoc基或功能性羧酸衍生物，它们可以相同或不同，R1代表氢原子或功能性羧酸衍生物，R2代表含有氢原子、氨基、羟基或巯基的衍生物或功能性羧酸衍生物，a至f代表0至∞的整数，X1至X3、Y1、Y2和Z1至Z6全部代表0或者大于0的整数，X1+X2+X3≥0，Y1+Y2＞0且Z1+Z2+Z3+Z4+Z5≥0，条件是X1+X2+X3和Z1+Z2+Z3+Z4+Z5不同时为0，并且当X1+X2+X3＝0时，R1代表功能性羧酸衍生物)。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中X1+X2+X3＝3且Y1+Y2＝15。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中X1＝3且Y1＝15。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中R或R1代表细胞膜透过性官能分子衍生物。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中R1代表功能性羧酸衍生物。
17.根据权利要求15或16所述的化合物，其中X1＝Z1＝1。
18.根据权利要求15至17中任意一项所述的化合物，其中Y1≥2且Z2＝1。
19.根据权利要求15至18中任意一项所述的化合物，其中a≤6，b≤4且f≤6。
20.根据权利要求15至19中任意一项所述的化合物，其中R1代表光功能性羧酸衍生物。
全文摘要
通过使用产生功能性PNA寡聚体的方法可极端迅速地并且以优越的成本表现导入官能分子，该方法包括通过将具有保护基保护的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶的PNA单体单元与Boc－赖氨酸(Fmoc)－OH或Fmoc－赖氨酸(Alloc)－OH反应，然后将具有游离羧酸的官能分子导入所述的PNA寡聚体中及保护基的脱保护。而且，根据所述方法可以产生所述化合物以及作为前体PNA单体单元的Boc－赖氨酸(Fmoc)－OH或Fmoc－赖氨酸(Alloc)－OH。
文档编号C07K2/00GK1806045SQ20048001662
公开日2006年7月19日 申请日期2004年4月15日 优先权日2003年4月15日
发明者外崎圆, 池田寿文 申请人:创新生命化学日本株式会社