花青染料标记试剂的制作方法

专利名称：花青染料标记试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及标记试剂领域，具体地涉及具有在其上连接的一个或多个水溶性基团的活性花青染料，以及使用这种染料的方法。
已经确立了荧光标记作为微阵列分析中的检测方式的选择。有许多不同方法用于生产被荧光染料标记的核酸探针。这些方法包括使用逆转录酶酶系统将被染料标记的核苷酸直接结合到cDNA中。一个替代方法为间接标记法，并且利用化学活性核苷酸类似物(如，氨基烯丙基-dUTP)或生物素化核苷酸类似物，其在合成过程中结合在第一链cDNA中，随后用活性的或亲合性的染料标记物进行后标记，所述标记物共价或非共价结合于待修饰的核苷酸。微阵列分析中的后标记策略有可能提供改善的检测灵敏度，特别是对于低表达的靶，并且能够使用较少的mRNA。然而，仍需要超灵敏的检测方法，例如可通过使用多重标记物得到的，或者通过核酸分子的化学品标记，或者通过使用抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素偶联物。
花青染料提供与其它荧光染料相比的许多优点。花青染料的激发和发射光谱横跨450nm到800nm范围的可见光谱和NIR光谱。此外，花青染料的特征在于具有很高的消光系数、有利的量子产率和良好的光稳定性。参见例如，美国专利6048982、5268486、5569587(Waggoner，A.S.等人)。虽然后标记可以将高水平的花青染料结合到cDNA、或抗生物素蛋白链菌素中，然而，某些染料在溶液中或在固液界面的自我缔合趋势引起荧光量子产率降低(Mishra，A.等人，Chem.Rev.，(2000)，100(6)，1973-2012；Gruber，H.等人，Bioconjugate Chemistry，(2000)，11，696-704)。
WO 02/26891(Molecular Probes Inc.)描述了改性的羰花青染料和它们与靶物质的偶联物，其中有至少一种取代的二氢吲哚环系统，其中二氢吲哚环3-位上的取代基包含化学活性基团或被偶联的物质。据报道，WO 02/26891的改性染料克服了花青染料自我缔合(即，堆叠)的趋势，并且据报道，用改性染料标记的染料偶联物比用在结构上类似的羰花青染料标记的偶联物更具荧光性。
美国专利6083485(Licha等人)描述了使用以下结构所示的染料的基于近红外辐射(NIR)的体内诊断方法 其中基团X和Y包括基团-C(CH2R32)(CH2R33)，基团R20到R29、R32和R33可被取代基取代，所述取代基包括具有最多10个碳原子的羟基、羧基、磺酸基、羧烷基、烷氧羰基、或烷氧基氧代烷基，或包含最多4个碳原子的磺基烷基。
日本专利申请5313304(Fuji Photo Film Co.Ltd.)公开了卤化银照相感光材料，其结合了包含多个磺酸盐基团并由下式表示的染料 其中Ra和Rb可为羧酸烷基酯或磺酸烷基酯部分。
现有技术文件中没有一个公开了具有一个或多个与二氢吲哚环系统3-位连接的磺酸或膦酸水溶性基团的花青染料，在该染料中还提供了适合靶材料直接共价或非共价标记的至少一个基团。现在已经发现，一类新的花青染料标记试剂可用于标记和检测生物材料和其它材料。已经发现与二氢吲哚环3-位连接的一个和优选多个水溶性基团的存在减少染料-染料相互作用，特别是其中多个染料分子连接于组分如核酸、蛋白质、抗体等时。结果，通常与多重标记组分有关并由染料-染料堆叠所致的荧光强度下降被减少。
因此，在第一方面中，提供下式(I)表示的化合物
其中基团R3和R4连接于Z1环结构，基团R5和R6连接于Z2环结构，并且n＝1、2或3；Z1和Z2独立地表示使一个环或两稠和环芳香系统完整所需的碳原子；基团R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少一个为基团-E-F，其中E为单键或具有含1-20个连接原子的链的间隔基团，连接原子选自碳、氮和氧原子，F为靶结合基团；基团R11、R12、R13和R14中的一个或多个独立地选自基团-(CH2)k-W，其中W为磺酸或膦酸，并且k为1到10的整数；当基团R1和R2中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R1和R2独立地选自C1-C6烷基、未取代的或被磺酸取代的苄基、和基团-(CH2)k-W，其中W和k定义如上；当基团R3、R4、R5和R6中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R3、R4、R5和R6独立地选自氢和磺酸；当基团R11、R12、R13和R14中的任一个不是所述基团-(CH2)k-W时，则所述剩余的基团R11、R12、R13和R14独立地为C1-C6烷基；剩余的基团R7为氢，或者两个R7与以下基团一起 形成具有5或6个原子的烃环系统。
适当地，第一方面的化合物包括一个或多个抗衡离子，其可为阳离子或阴离子，以平衡染料发色团上的形式电荷(或多个形式电荷)。抗衡离子的性质不是本发明的内容，并且其可为许多已知离子之一如NH4+、K+、Na+、三氟乙酸根(F3C-CO2-)、高氯酸根(ClO4-)、Br-、或I-。在本发明的环境下，应该理解，术语“磺酸”和“膦酸”还分别包括基团“磺酸根”和“膦酸根”，因为它们是母体酸的离子化形式。
适当地，基团R11、R12、R13和R14中的至少两个为基团-(CH2)k-W。在优选实施方案中，基团R11和R12之一、基团R13和R14之一为基团-(CH2)k-W，其中W和k定义如上。在这些实施方案中，剩余的基团R11或R12以及R13或R14优选为甲基。在优选实施方案中，本发明的化合物为其中W为磺酸的那些。优选地，k为3或4。特别优选的-(CH2)k-W选白-(CH2)3-SO3H和-(CH2)4-SO3H。
适当地，当基团R1和R2中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R1和R2可选自C1-C6烷基、未取代的或被磺酸取代的苄基、和基团-(CH2)k-W，其中W和k定义如上。优选地，所述剩余的基团R1和R2可选自C1-C6烷基、磺基苄基和基团-(CH2)k-W。优选的烷基为甲基和乙基。
在第一方面的染料中，当R7被基团-E-F取代时，优选R7在间位被取代，这意味着连接杂环结构的聚甲炔链中的中心R7基团可被靶结合基团取代。存在于聚甲炔链中的任何剩余的R7基团为氢。
适当地，Z1和Z2独立地选自苯基和萘基。对应于式(I)化合物并且具有一个或两个稠环芳香系统的花青染料的具体例子表示为表1中所列的结构(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)。
表1
其中基团R7形成烃环系统的化合物的例子如表2中的结构(VII)和(VIII)所示。在结构(II)到(VIII)中，基团R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R13、R14和n定义如上。
表2 连接部分E将靶结合基团F与式(I)化合物的发色团部分连接。在一个实施方案中，靶结合基团F可直接连接于染料的R3、R4、R5、R6或R7位置，在这种情况中，E为单键共价键。在另外的优选实施方案中，靶结合基团F可通过间隔基团间接地共价连接于染料的R1、R2、R3、R4、R5、R6或R7位置。在这种实施方案中，E适当地为具有1到20个包含碳、氮和氧原子的连接原子的直链或支链。优选地，间隔基团E选自-(CHR′)p-Q-(CHR′)r-其中Q选自-CHR′-、-NR′-、-O-、-CR′＝CR′-、-Ar-、-C(O)-NR′-和-C(O)-O-；R′为氢或C1-C4烷基，p为0-5，并且r为1-5。
特别优选的连接部分为其中Q选自以下的那些-CHR′-、-C(O)-NH-，和 其中R′定义如上。
本发明的染料包含至少一个基团-E-F，通常不超过两个，优选为一个。在一个实施方案中，靶结合基团F为与靶组分的互补基团反应的基团，在染料和所述组分之间形成共价键。在这种实施方案中，结合基团的选择根据要待标记组分上的可利用基团而定，并且因此为本领域技术人员所公知。例如，靶结合基团可为可以在适当的条件下与组分的互补官能团反应的活性基团。存在于组分如蛋白质、肽、核酸、碳水化合物等中的官能团的例子包括羟基、氨基、巯基、羰基(包括醛和酮)和硫代磷酸酯基(thiophosphates)。或者，靶结合基团F可为官能团，并且靶可包含、或经过衍生化以包含活性成分，使得染料的官能团可以在适当的条件下与靶组分的活性基团反应。在两种情况中，组分都被式(I)的染料标记。适当地，活性基团F可选自羧基、琥珀酰亚胺基酯、磺基琥珀酰亚胺基酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺、酰卤、酰肼、乙烯基砜、二氯三嗪和亚磷酰胺(phosphoramidite)。优选地，活性基团为羧酸的琥珀酰亚胺基酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺或亚磷酰胺。当F为官能团时，其适当地选自羟基、氨基、巯基、羰基(包括醛和酮)和硫代磷酸酯基。依靠这些活性基团和官能团，式(I)的化合物可与靶组分反应并与其共价结合。
式(I)化合物中的活性基团R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7的例子和可与基团R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7反应的基团的例子在表3中提供。在替代方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7可为表3中的官能团，其与靶组分的活性基团反应。
表3可能的活性取代基和可与所述活性取代基反应的官能团
特别优选用于标记靶组分并具有可利用的氨基和羟基官能团的特别优选的活性基团R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7包括 特别优选用于标记靶组分并具有可利用的硫醇官能团的特别优选的活性基团R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7包括 基团-E-F的特别优选的例子为包括羧基戊基基团E的那些，例如 在另一个实施方案中，靶结合基团F可为能够与其互补特异性结合配对体(partner)特异性地非共价结合的亲和标记物。特异性结合配对体对的例子包括但不限于生物素/抗生物素蛋白、生物素/抗生物素蛋白链菌素、聚组氨酸标记物-次氮基三乙酸(如Ni2+∶NTA)的金属离子复合物。互补的特异性结合配对体可为用于检测靶组分的标记复合物的一个组分。因此，在一种优选的标记形式中，具有四个用于生物素标记的连接位点的抗生物素蛋白链菌素可被用作桥，连接靶组分上的生物素基团与本发明的其中基团F为生物素、亚胺生物素或脱硫生物素的染料。应该理解，在本发明的情况下，可使用其中一个对另一个具有特异性结合亲合性的任两个原子或分子。亲合标记物的优选例子选自生物素、亚胺生物素和脱硫生物素。
在另外的实施方案中，本发明的荧光花青染料可包含一个或多个另外的磺酸基团。在一个实施方案中，适当地，一个或多个磺酸基团可直接连接于Z1和/或Z2环结构。在选择性的实施方案中，R1和/或R2位置可被磺基苄基或基团-(CH2)k-W直接取代，其中W和k定义如上。在这种实施方案中，染料可任选地进一步被一个或多个直接连接于R3、R4、R5和R6位置的磺酸基团取代。因此，本发明的染料可被最多五个或更多个磺酸基团取代，优选被三到五个磺酸基团取代。使用被三个或更多个磺酸基团取代的花青染料标记生物靶分子产生被标记的产品，在该产品中染料-染料聚集减少、激发态相互作用可被忽略，并因此染料-染料淬灭和荧光损失最小化。用本发明优选的染料如此标记的分子的荧光发射强度随着共价连接的染料数的增加而增加。此外，二氢吲哚3-位用磺酸基团取代不仅增加染料分子上的总电荷，而且增加空间体积，从而有助于减少染料-染料聚集。
卤素和卤代基团选自氟、氯、溴和碘。
以下为本发明的花青染料的更具体的例子，如表4中所示。
表4 在结构(IX)、(X)和(XI)中，n＝1、2或3；基团R1、R2、R3和R5中的至少一个为基团-E-F，其中E和F定义如上；当基团R1和R2中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R1和R2独立地选自甲基、乙基、和基团-(CH2)k-W，其中W为磺酸，并且k为3或4；当基团R3和R5中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R3和R5独立地选自氢和磺酸，优选磺酸。
在结构(IX)、(X)和(XI)中，基团-E-F适当地为烷基羧酸的琥珀酰亚胺基酯衍生物，优选为5-羧基戊基N-羟基琥珀酰亚胺基酯、或5-羧基戊基N-羟基-磺基琥珀酰亚胺基酯。
本发明第一方面的染料的具体例子如下i)2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐；ii)2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-1，3-双(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐；iii)2-{(1E，3E，5E，7E)-7-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]庚-1，3，5-三烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐；iv)2-{(1E，3E，5E，7E)-7-[5-(羧基甲基)-3-甲基-1，3-双(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]庚-1，3，5-三烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐；和v)1-苄基-2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐。
本发明还涉及标记法，其中本发明的至少包括与定义如上的R1到R7位置连接的基团F的化合物可用于标记靶组分并由此赋予靶组分以荧光性质。具体地，它们可用于生物分子的多重标记和检测，生物分子如核酸、DNA、RNA、低聚核苷酸、核苷酸、蛋白质、肽、抗体等。因此，在第二方面中，提供标记组分的方法，该方法包括i)将所述组分与式(I)化合物接触
其中基团R3和R4连接于Z1环结构，基团R5和R6连接于Z2环结构，并且n＝1、2或3；Z1和Z2独立地表示使一个环或两稠和环芳香系统完整所需的碳原子；基团R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少一个为基团-E-F，其中E为单键或具有含1-20个连接原子的链的间隔基团，连接原子选自碳、氮和氧原子，F为靶结合基团；基团R11、R12、R13和R14中的一个或多个独立地选自基团-(CH2)k-W，其中W为磺酸或膦酸，并且k为1到10的整数；当基团R1和R2中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R1和R2独立地选自C1-C6烷基、未取代的或被磺酸取代的苄基、和基团-(CH2)k-W，其中W和k定义如上；当基团R3、R4、R5和R6中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R3、R4、R5和R6独立地选自氢和磺酸；当基团R11、R12、R13和R14中的任一个不是所述基团-(CH2)k-W时，则所述剩余的基团R11、R12、R13和R14独立地为C1-C6烷基；剩余的基团R7为氢，或者两个R7与以下基团 一起形成具有5或6个原子的烃环系统；和ii)将所述荧光染料与所述组分在适合结合于所述组分并从而标记所述组分的条件下培养。
在一个实施方案中，靶结合基团F可为适合在式(I)化合物和靶组分之间形成共价键的基团，例如如上定义的活性基团或官能团。在替代方案中，靶结合基团F为亲和标记物，如生物素、脱硫生物素或亚胺生物素，并且染料通过非共价结合与靶结合。该方法包括将待标记组分与一定量的本发明的化合物在使得染料结合于组分的条件下培养。形成染料与靶组分的偶联物或复合物的方法为本领域技术人员公知的。例如蛋白质的共价标记典型地在水性缓冲介质中进行，适当地为pH 9.0的碳酸氢盐，在环境温度下典型地进行1小时。反应通常在暗处进行。可以将被标记的蛋白质通过尺寸排阻色谱法与任何未反应的染料分离，例如使用SephadexTM作为固定相和使用磷酸盐缓冲剂pH7.0作为洗脱液。对于靶生物分子的多重标记，应该适当地调节染料与靶材料的量或浓度的比例。适当的靶生物组分包括但不限于抗体；脂质；蛋白质；肽；碳水化合物；包含、或被衍生化以包含氨基、巯基、羰基、羟基、和羧基以及硫代磷酸酯基中一个或多个的核苷酸；和包含、或被衍生化以包含氨基、巯基、羰基、羟基、羧基和硫代磷酸酯基中一个或多个的有氧多核酸(oxy polynucleic acids)和脱氧多核酸(deoxy polynucleic acids)；微生物材料；药物；激素；细胞；细胞膜；和毒素。
除了上述的一步标记法之外，本发明还涉及两步标记法，其中在第一步骤中，本发明的染料结合于第一组分，如抗体、蛋白质、DNA探针等，从而标记第一组分。在标记法的第二步骤中，然后将被荧光标记的第一组分用作检测第二组分的探针，第二组分如抗体特异性抗原。
本发明的化合物还可用于测定系统中特定蛋白质或其它组分的浓度。如果已知蛋白质上可与探针反应的活性基团的数目，则可以知道每分子的荧光并且可以通过系统的总荧光强度测定系统中这些分子的浓度。这种特殊方法可用于使用微量滴定板读板器或其它已知的免疫荧光检测系统测量多种被标记的被分析物的浓度。还可以使用例如荧光偏振检测仪器测定被荧光标记的物质的浓度。
本发明的化合物也可用于以下检测方法其中将多种荧光染料共价结合于多个不同的第一组分如抗体上，每种第一组分对于不同的第二组分如抗原为特异性的，以鉴定在第二组分混合物中的多种第二组分中的每一种。根据这种使用方法，第一组分中的每一种都分别地被与标记其它第一组分所用的染料分子相比较具有不同的光吸收波长和发射波长特征的荧光染料标记。然后将被标记的第一组分加入到包含第二组分如抗原的制剂中，并允许第一组分连接于它们具有选择性的各自的第二组分。
可通过例如洗涤从制剂除去任何未反应的探针材料，以防止其干扰分析。然后将制剂经历包括特定荧光化合物的吸收波长的一系列激发波长。然后使用荧光显微镜或其它荧光检测系统，例如具有滤光器或单色仪以选择激发波长的射线和选择荧光波长的流式细胞仪或荧光分光光度计，测定对应于所使用的荧光化合物的发射波长的强度，荧光强度表示已经与被特别标记的第一组分结合的第二组分的量。已知的进行多参数荧光研究的技术包括例如多参数流式细胞测量法。在某些情况下，可使用单激发波长以从其中各自在不同波长发荧光的混合物中的两种或多种材料激发荧光，并且可以通过在其各自发射波长处的单独的荧光强度测量各种被标记物质的量。如果期望，还可使用光吸收法。
本发明的检测方法可用于其中有可能产生有荧光性的第一组分的任何系统。例如，可以将适当活性的荧光性化合物偶联于DNA或RNA片段，然后使得到的偶联物结合于DNA或RNA的互补靶链。然后可使用适当的荧光检测设备检测已经结合的荧光性偶联物的存在。
本发明涉及用于制备式(I)染料的中间体和方法，式(I)的染料适当地通过包括以下步骤的方法制备a)将由下式(A)表示的第一中间体化合物 其中Z1、R1、R3、R4、R11和R12定义如上；b)可与第一中间体化合物相同或不同的由式(B)表示的第二中间体化合物
其中Z2、R2、R5、R6、R13和R14定义如上，和c)适合形成第一和第二化合物之间的连接的第三化合物(C)反应；条件是基团R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为基团-E-F，其中E和F定义如上；并且条件是基团R11、R12、R13和R14中的一个或多个独立地选自基团-(CH2)k-W，其中W选自磺酸和膦酸基团，并且k为1到10的整数。
优选地，-(CH2)k-W选自-(CH2)3-SO3H和-(CH2)4-SO3H。
根据该方法，中间体化合物(A)、(C)和(B)可以单步骤工艺或多步骤工艺反应，从而形成式(I)的化合物。可适当地通过将式(A)(或(B))的化合物以两摩尔比与含1、3或5个碳原子并被基团取代以形成定义如上的R7的适当的双官能甲炔片段反应，制备其中结构(A)和(B)相同的式(I)的对称化合物。例如，可以使用取代的N，N′-二苯基甲脒或原酸酯作为制备三甲炔花青染料类似物所用的第三化合物(C)。在相应的方式中，可以使用被适当取代的丙二醛双苯胺用于制备五甲炔花青染料类似物，使用戊烯二醛用于制备七甲炔花青染料类似物。反应通常在有机溶剂如吡啶中并且在被加热到回流条件下进行。随后将混合物冷却并倾入有机溶剂如醚中。得到的固体或半固体可通过硅胶柱色谱法纯化，使用一系列甲醇/氯仿溶剂洗脱。
其中结构(A)与(B)不同的式(I)的不对称化合物可以两步骤工艺方便地制备。在这种工艺中，首先形成中间体化合物，通过将式(A)的二氢吲哚化合物与适合形成连接的化合物如被适当取代的N，N′-二苯基甲脒或丙二醛双苯胺在乙酸酐的存在下反应，形成2-苯胺基乙烯基或4-苯胺基-1，3-丁二烯季盐。中间体季盐可与第二个2-甲基二氢吲哚季盐反应，以得到式(I)的化合物。用于形成连接杂环系统的聚甲炔连接的替代性中间体为已知的并且在例如Hamer，F.M.，″The CyanineDyes and Related Compounds″，Interscience(1964)中描述。
应该容易理解，本发明的某些染料可用作通过本领域技术人员公知的方法转化为其它染料的中间体。本发明的染料可以通过本文公开的方法合成。通过选择适当的前体、或通过用已知的方法修饰得到的化合物以在多个位置包括官能团而制备了具有特定应用的所述化合物的衍生物。可以选择基团R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7使得本发明的染料具有不同的波长特征，从而提供多种相关染料，用于其中单个样品中不同化合物的存在和量可基于多个检测荧光发射波长进行区分的多参数分析。
CyTM为Amersham Biosciences UK Limited的商标。
通过参考以下实施例和附图进一步说明本发明，其中

图1(A和B)为表示对于化合物2和化合物5，染料/蛋白质比对施加的NHS酯的量的图。
图2为对于五甲炔花青染料，在恒定抗体浓度下相对荧光强度对染料/蛋白质比的图。
图3表示在低染料/蛋白质比和高染料/蛋白质比下，化合物5和化合物2的IgG偶联物的吸收光谱。
图4表示在高染料/蛋白质比下，化合物3、4的IgG偶联物与化合物6的IgG偶联物相比较的吸收光谱。
图5为表示七甲炔花青染料的相对荧光强度对染料/蛋白质比的图。
图6为用化合物2标记的cDNA的光谱扫描(200-700nm)。
图7为用化合物5标记的cDNA的光谱扫描(200-700nm)。
图8为用化合物6标记的cDNA的光谱扫描(200-700nm)。
图9为表示在120小时内间隔测量的化合物2、5和6的UV吸光度的图。
实施例1. 2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(化合物1)
1.1 5-(乙氧羰基)-5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸钠氢化钠(60重量％，12g≡0.3摩尔NaH)在无水DMF(100摩尔)成淤浆，得到的悬浮液在搅拌下冷却到0℃，向其中加入2-甲基乙酰乙酸乙酯(50g，0.346摩尔)在DMF(25ml)中的溶液，滴加以保持温度＜10℃并控制冒泡，当加入完毕并停止生成氢气时，混合物在温水浴中回温直到生成透明的淡黄色溶液，将其再冷却到0℃，在15分钟内加入1，4-丁磺酸内酯(45g，0.33摩尔)在DMF(25ml)中的溶液，保持温度＜10℃，滴加完毕时，混合物在50℃加热16小时，然后真空蒸发溶剂至干；残余物在水和乙醚之间分配，保留水层；有机层用新鲜水萃取，然后弃去，合并的水提取物用新鲜醚洗，然后真空蒸发得到产品，为蜡状固体。
1H-NMR(D2O)δ4.23(2H，q)，2.9(2H，app t)，2.26(3H，s)，2.0-1.6(6H，m)，1.36(3H，s)和1.26(3H，t)。
1.2 5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸上述物质在90℃在浓盐酸(200ml)中加热，直到TLC显示反应完全(～3小时)，然后真空蒸发溶剂；残余物通过闪色谱法纯化(二氧化硅，乙醇/二氯甲烷混合物)，得到49.6g的5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸。
1H-NMR(D2O)δ2.9(2H，app t)，2.68(1H，m)，2.2(3H，s)，1.8-1.3(6H，m)和1.18(3H，d)。
1.3 2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸
4-肼基苯磺酸(7.5g)、5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸(11.0g)和乙酸(50ml)在氮气下加热回流6小时，在该期间所有悬浮的固体溶解，然后真空蒸发溶剂，残余物与2-丙醇在80℃研磨，得到悬浮形式的浅棕色固体，将混合物冷却到环境温度，过滤收集固体，用2-丙醇和乙醚洗并真空干燥，产物通过HPLC纯化，收集在270nm检测到的主要的峰。(Phenomenex Jupiter 15μ C18 300A，250×50mm.100ml/min.0.5g/运行，恒溶剂洗脱液水+0.1％ TFA)，收集产物级分并蒸发，得到11.1g。
UV/Vis(水+0.1％TFA)269，229nm1H-NMR(D2O)δ0.9(2H，m)，1.6(3H，s+2H，m)，2.15(2H，m)，2.75(2H，m)，2.8(CH3主要发生交换的单峰)，7.8(1H，d)，8.0(1H，dd)和8.1(1H，d)。
LC-MS实测值362，MH+＝C14H20NO6S2理论值362。
1.4 2，3-二甲基-3-(4-磺酸根合丁基)-3H-吲哚-5-磺酸二钠 2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸(3.6g，9.8毫摩尔)溶于水(50ml)，得到的溶液用乙酸钠中和到pH～7，然后真空蒸发溶剂，粘稠的残余物与甲醇共蒸发，然后与醚研磨，得到细固体，在五氧化二磷下在高真空干燥，得到标题化合物二钠盐，其无需纯化，直接使用。
1H-NMR(D2O)δ0.6-0.8(2H，m)，1.4(3H，s)，1.6(2H，m)，1.9-2.15(2H，宽m+s，乙酸盐归属)2.35(CH3主要发生交换的单峰)，2.75(2H，app t)，7.6(1H，d)和7.83(2H，m)。
1.5 1-乙基-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐 2，3-二甲基-3-(4-磺酸根合丁基)-3H-吲哚-5-磺酸二钠(1g)、对甲苯磺酸乙酯(0.95ml；5.56毫摩尔)和四亚甲基砜(10ml)一起在140℃加热12小时，TLC(二氧化硅；2∶1的MeOH；EtOAc)显示形成了新的产物点(rf＝0.8)，其放置时变成品红色，产物在乙酸乙酯中沉淀，然后过滤并真空干燥，得到粗产物，为暗紫色固体；1.5g。产物通过HPLC进行多次纯化(Vydac protein & peptide C18(250mm×25mm)；流速10ml/min；梯度0-25％B在30分钟内；洗脱液A＝0.1％TFA在水中，洗脱液B＝0.1％TFA在乙腈中；检测在220nm进行)。收集含所需产物的级分，减压蒸发溶剂，获得产物，为浅粉色油状物(400mg)。
LC-MS(ES+)实测值390，MH+＝C16H24NO6S2)理论值390。
1H NMR(D2O)δ0.86(m，2H)，1.56(t，3H)，1.75(2xs，5H)，2.36(m，2H)，2.75(m，2H)，4.60(q，2H)，7.96，8.10(dd，2H)，8.15(s，1H)。
1.6 1-(5-羧基戊基)-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐
2，3-二甲基-3-(4-磺酸根合丁基)-3H-吲哚-5-磺酸二钠(1g)、6-溴己酸(3.2g，16.41毫摩尔)和四亚甲基砜(5ml)一起在110℃在氮气下加热14小时，然后加入另外的小份(3.2g，16.41毫摩尔)溴己酸并继续加热12小时，然后加热另外的小份(1.6g，8.21毫摩尔)6-溴己酸并再继续加热12小时，反应产物冷却到室温然后倾入到乙酸乙酯中，过滤产物，用乙酸乙酯洗，然后在40℃真空干燥，得到褐色固体(2.71g)，产物根据需要通过HPLC纯化(Vydac protein & peptide C18(250mm×25mm)；流速10ml/min；梯度0-25％B在30分钟内；洗脱液A＝0.1％三乙胺在水中，洗脱液B＝0.1％三乙胺在甲醇中；检测在220nm进行)。收集含有所需产物的级分并减压蒸发溶剂获得产物，为黄褐色油状物，从粗品(100mg)得到经过纯化的产物，为三乙基铵盐(56mg)。
LC-MS(ES+)实测值476，MH+＝C20H30NO8S2理论值476。
1H NMR(D2O)δ0.85(m，2H)，1.3(t，27H)，1.50(m，2H)，1.62(m，9H)，2.00(m，2H)，2.25(m，4H)，2.39(m，1H)，2.75(m，2H)，3.20(q，18H)，4.55(t，2H)，7.95，8.10(dd，2H)，8.14(s，1H)。
1.7 2-[(1E，3E)-4-苯胺基丁-1，3-二烯基]-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐
1-乙基-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐，粗品(1.1g)、丙二醛二(苯基亚胺)HCl(0.5g)和乙酸(20ml)在氮气下在130℃加热8小时，得到暗橙红色溶液。然后真空蒸发溶剂；残余物在水/二氯甲烷/甲醇混合物中分配，UV/Vis分析(乙醇)证实在上层水层中存在产物(λmax＝524nm)，而丙二醛起始产物仅存在下层有机层中(λmax＝384nm)。真空蒸发水层，通过HPLC纯化(水/0.1％TFA和乙腈/0.1％TFA洗脱液)，收集含有产物的级分并蒸发，最后在五氧化二磷下在高真空干燥，得到标题产物。
UV/Vis(水+0.1％TFA)520nm。
MS(MALDI-TOF)M+518。
1.8 2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐在90℃，2-[(1E，3E)-4-苯胺基丁-1，3-二烯基]-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(71mg)溶于吡啶(45)乙酸(45)乙酸酐(10)的混合物中(5ml)。向该溶液中加入粗品1-(5-羧基戊基)-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐，以20分钟间隔分份加入，直到UV/Vis分析表明不完全染料(half-dye)组分(λmax＝524，430nm)完全转化为Cy5染料产物(λmax＝653nm)，然后真空蒸发溶剂，残余物通过HPLC纯化(RPC18.水/甲醇/三乙胺，然后为水/乙腈/TFA)。
UV/Vis(水+0.1％TFA)653nm。
MS(MALDI-TOF)实测值902，MH+＝C39H53N2O14S4理论值901。
2. 2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯}-3-甲基-1，3-二(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(化合物2) 2.1 2，3-二甲基-1，3-二(4-磺酸根合丁基)-3H-吲哚-5-磺酸二钠 2，3-二甲基-3-(4-磺酸根合丁基)-3H-吲哚-5-磺酸二钠(1.0g)和1，4-丁磺酸内酯(10ml)混合并在氮气下在150℃加热52小时，得到暗紫色淤浆。冷却后，混合物与乙酸乙酯研磨过滤收集固体部分，用乙酸乙酯和乙醚洗，然后在五氧化二磷下在高真空干燥，得到标题产物(1.45g)，其无需纯化，直接使用。
2.2 2-[(1E，3E)-4-苯胺基丁-1，3-二烯基]-3-甲基-1，3-二(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐 2，3-二甲基-1，3-二(4-磺酸根合丁基)-3H-吲哚-5-磺酸二钠，粗品(1.0g)和丙二醛二(苯基亚胺)HCl(1.0g)和乙酸(10ml)在氮气下在130℃加热10小时，得到暗橙红色溶液，然后真空蒸发溶剂；残余物在水/二氯甲烷/甲醇混合物中分配，UV/Vis分析(乙醇)证实在上层水层中存在产物(λmax＝524nm)，而丙二醛起始产物(λmax＝384nm)主要在下层有机层中存在。真空蒸发水层，通过HPLC纯化(水/0.1％TFA和乙腈/0.1％TFA洗脱液)。收集含有产物的级分并蒸发，从水溶液冷冻干燥，最后在五氧化二磷下在高真空得到标题产物，得到240mg，为红色泡沫。
UV/Vis(水+0.1％TFA)520nm。
MS(MALDI-TOF)实测值627，MH+＝C27H35N2O9S3理论值627。
1H-NMR(D2O)δ0.65(1H，宽m)，0.95(1H，宽m)，1.6(2H，m)，1.7(3H，s)，1.9(4H，m)，2.3(2H，m)，2.7(2H，app t)，3.0(2H，t)，4.1(2H，app t)，6.4(2H，m)，7.2-7.6(6H，m)，7.8-8.0(2H，m)，8.15(1H，t)和8.2(1H，d)。
2.3 2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-1，3-二(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐在90℃，2-[(1E，3E)-4-苯胺基丁-1，3-二烯基]-3-甲基-1，3-二(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(70mg)溶于吡啶(45)乙酸(45)乙酸酐(10)的混合物(5ml)。向该溶液中加入粗品1-(5-羧基戊基)-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐，以20分钟间隔分份加入，直到UV/Vis分析表明不完全染料组分(λmax＝524，430nm)完全转化为Cy5染料产物(λmax＝656nm)，然后真空蒸发溶剂，残余物通过HPLC纯化(RPC18.水/乙腈/TFA)。
UV/Vis(水+0.1％TFA)656nm。
MS(MALDI-TOF)实测值1010，MH+＝C41H57N2O17S5理论值1009。
3. 2-{(1E，3E，5E，7E)-7-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]庚-1，3，5-三烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(化合物3) 1-乙基-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(100mg)和N-[5-(苯基氨基)-2，4-戊-二烯亚基)苯胺一盐酸盐(60mg)一起在乙酸(5ml)、乙酸酐(5ml)和三乙胺(0.5ml)的混合物中在120℃加热30分钟，然后向该反应混合物中加入1-(5-羧基戊基)-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(100mg)和吡啶(5ml)，反应混合物在120℃进一步加热30分钟，冷却后将暗绿色反应混合物倾入到过量的乙酸乙酯(250ml)中，过滤得到的固体，用乙酸乙酯洗并干燥，产物通过HPLC纯化(Vydac protein & peptide C18(250mm×25mm)；流速；10ml/min；梯度5-15％B在30分钟内；洗脱液A＝0.1％三乙胺在水中，洗脱液B＝0.1％三乙胺在甲醇中；检测在650nm进行，然后改变到梯度2-25％B在30分钟内；洗脱液A＝0.1％TFA在水中，洗脱液B＝0.1％TFA在乙腈中)。收集含有所需产物的级分，减压蒸发溶剂获得产物，为暗绿色固体(7mg)。
LC-MS(ES+)实测值927，MH+＝C41H54N2O14S4理论值927。
UV/Vis；λmax754nm(PBS缓冲液)。
4. 2-{(1E，3E，5E，7E)-7-[5-羧基甲基)-3-甲基-1，3-二(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]庚-1，3，5-三烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(化合物4) 4.1[2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-基]乙酸 4-(羧基甲基)苯肼盐酸盐(5g，0.025摩尔)和5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸(5g，0.024摩尔)一起在乙酸中在140℃加热5小时，然后冷却到室温。过滤反应混合物除去任何粒子，然后减压除去乙酸，得到暗褐色残余物，将残余物溶于水并再次过滤，除去暗褐色杂质。将产物溶于水中，通过HPLC纯化(Prep AKTA；Phenomenex C18柱(250mm×50mm)；流速100ml/min；梯度0-100％B在30分钟内；洗脱液A＝0.1％TFA在水中，洗脱液B＝0.1％TFA在乙腈中；检测在220nm进行)。收集含所需产物的级分，减压蒸发溶剂，然后冷冻干燥残余物，得到产物，为铁锈褐色固体(4.14g)。
LC-MS(ES+)实测值340，MH+＝C16H22NO5S理论值340。
1H NMR(D2O)δ0.90(m，2H)，1.68(m，5H)，2.23(m，2H)，2.75(m，4H)，3.88(s，2H)，7.49，7.64(dd，2H)，7.64(s，1H)。
4.2 5-(羧基甲基)-2，3-二甲基-1，3-二(4-磺基丁基)-3H-吲哚 2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-基]乙酸(0.89g，2.63毫摩尔)和乙酸钠三水合物(0.46g)溶于甲醇(30ml)并在室温下搅拌10分钟，减压蒸发溶剂，将残余物溶于甲醇(30ml)，并再次减压蒸发溶剂，得到浅褐色残余物，向其中加入四亚甲基砜(5ml)和1，4-丁磺酸内酯(0.67ml，6.56摩尔)，反应混合物在氮气下在150℃加热6小时；烧瓶四周分离出暗紫色残余物。冷却到室温，倾走上清液，残余物与乙酸乙酯研磨，得到紫色固体。过滤产物，用乙酸乙酯洗(该物质极易吸湿)。产物溶于含有2％TFA的水中，然后放置12小时，产物通过HPLC纯化(Vydacprotein & peptide C18柱(250mm×25mm)；流速；10ml/min；梯度0-25％B在30分钟内；洗脱液A＝0.1％三乙胺在水中，洗脱液B＝0.1％三乙胺在甲醇中；检测在220nm进行)。收集含有所需产物的级分，减压蒸发溶剂获得产物，为浅紫色残余物(0.64g)。
LC-MS(ES+)实测值476，M+＝C20H30NO8S2理论值476。
1H NMR(D2O)δ0.85(m，2H)，1.31(t，24H)，1.58(s，3H)，1.76(m，2H)，1.95(q，2H)，2.12(m，2H)，2.26(m，2H)，2.73(t，2H)，2.96，(t，2H)，3.20(q，18H)，3.78(s，2H)，4.55(t，2H)，7.75，7.78(dd，2H)，7.63(s，1H)。
4.3 2-{(1E，3E，5E，7E)-7-[5-(羧基甲基)-3-甲基-1，3-二(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]庚-1，3，5-三烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐5-(羧基甲基)-2，3-二甲基-1，3-二(4-磺基丁基)-3H-吲哚(640mg)和N-[5-(苯基氨基)-2，4-戊-二烯亚基)苯胺一盐酸盐(125mg)一起在乙酸(5ml)、乙酸酐(5ml)和三乙胺(0.5ml)的混合物中在120℃加热40分钟，然后向该反应混合物中加入1-乙基-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(825mg(30％纯度)和吡啶(5ml)，反应混合物在120℃再加热40分钟。冷却后将暗绿色反应混合物倾入到过量的乙酸乙酯(500ml)中，过滤得到的固体，用乙酸乙酯洗并干燥，产物(950mg)根据需要使用HPLC纯化(Vydac protein & peptide C18(250mm×25mm)；流速；10ml/min；梯度15-30％B在30分钟内；洗脱液A＝0.1％TFA在水中，洗脱液B＝0.1％TFA在乙腈中)。收集含有所需产物的级分，减压蒸发溶剂获得产物，为暗绿色固体(11.7mg，得自150mg粗品)。
LC-MS(ES+)实测值927，MH+＝C41H54N2O14S4理论值927。
UV/Vis；λmax756nm(PBS缓冲液)5. 1-苄基-2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(化合物5)
5.1 1-苄基-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐2，3-二甲基-3-(4-磺酸根合丁基)-3H-吲哚-5-磺酸二钠(5g，13.9毫摩尔)和乙酸钠(3.11g)与甲醇(100ml)搅拌1小时，旋转蒸发除去溶剂，并另外加入部分的甲醇(100m1)，旋转蒸发除去甲醇，得到橙色粘稠固体，向其中加入sulfolan(25ml)和溴苄(9.51g，55.6毫摩尔，4当量)。混合物在氮气下在110℃搅拌过夜，将冷却的红色溶液倾入到搅拌的乙酸乙酯(1升)中，过滤沉淀物，沉淀物用大量的乙酸乙酯和乙醚洗，然后真空干燥。将样品溶于水并通过反相TLC分析，使用混有0.1％TFA的乙腈混有0.1％TFA的水(30∶70)。分离得到产物(Rf0.6)和起始产物(Rf0.95)，产物点放置时变成红色，表明已经发生季铵化。收率8g。
5.2 1-苄基-2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐1-苄基-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(2g)、1-(5-羧基戊基)-2，3-二甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(2g)和丙二醛二苯基亚胺(2g)溶于乙酸∶吡啶∶乙酸酐(4.5∶4.5∶1)中(100ml)，混合物在90℃加热2小时，混合物立即变成蓝/绿色，将小份样品在水中稀释，用于UV分析。UV/Vis光吸收光谱在650nm的峰表明形成了Cy5，反应混合物在+2℃储存过夜。旋转蒸发混合物，得到油状物。真空泵抽数小时以确保干燥，粘稠的固体用乙腈(4×500ml)洗，得到干燥粉末，其经过过滤并再用乙腈洗，真空干燥固体，得到3.05g。
将染料溶于水(7.5ml)，过滤并通过HPLC纯化(Dynamax C1842mm×25cm)，使用用20-30％乙腈(0.1％TFA)改性的水(0.1％TFA)在60分钟梯度洗脱，流速为20ml/min，合并含有所需产物的级分，并旋转蒸发到小体积，转移到小烧瓶中，并o/n冻干，UV/Vis在650nm进行，得到132mg。然后将经过部分纯化的物质溶于水中(7.5ml)，过滤并通过HPLC在60分钟内纯化(Dynamax C1842mm×25cm)，使用用20-30％乙腈(0.1％TFA)改性的水(0.1％TFA)洗脱，流速20ml/min。最终得到103mg。
探针分析表明消光系数156175M-1cm-1，λmax652nm，荧光发射max670nm(除652nm外)和荧光纯度99.6％。
5.3化合物5NHS酯的制备1-苄基-2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐(5mg)溶于含有HSPyU(10mg)的DMSO(2.2ml)和DIPEA(80μl)中，混合物滚动2小时，将400μl小份分散在含有1ml无水乙酸乙酯的Sarstedt试管中，将试管离心15分钟，并倾析掉乙酸乙酯。HPLC分析从任何痕量起始物质中分离出产物，酸的保留时间为22.5分钟，酯的保留时间为31.38分钟，NHS酯的纯度为96.01％。
6.使用Cy5染料的标记研究，化合物2与Cy5TM(化合物6)的比较
6.1羧基染料到NHS酯的转化在单独的Sarstedt试管中，将化合物2和6(各自为2.5mg)和O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N′，N′-四甲基脲(uronium)四氟硼酸盐(TSTU，10mg)与无水DMF(100μl)混合。然后向两个得到的溶液中都加入N，N-二异丙基乙胺(10μl)。将试管盖上盖子，涡旋并静置1小时。然后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释，涡旋，然后离心，以收集NHS酯。倾析掉上清液；将小球用新鲜的乙酸乙酯洗并在真空下干燥。反应由质谱(MALDI-TOF)证实。
化合物2C45H59N3O19S5，计算值M+＝1105；实测值M+＝1104。
化合物6(Cy5)C37H43N3O10S2，计算值M+＝753；实测值M+＝752。
6.2用Cy5染料(化合物2和6)的NHS衍生物标记绵羊γ-球蛋白将绵羊IgG以1mg/ml溶解于碳酸钠缓冲液(0.1M，pH 9.2)中；将染料NHS酯以～10mg/ml溶解于无水DMSO中(250μl)。为了得到一系列的染料/蛋白质比，进行一系列标记实验。每个反应使用500μl的抗体溶液，与在0.1-32.0μl范围内的不同量的染料NHS酯溶液组合。标记反应在环境温度下在暗处进行45分钟。通过使用Sephadex作为固定相和使用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为洗脱液的尺寸排阻色谱法纯化，从偶联物中除去游离的染料。对于使用化合物2的反应，将经纯化的抗体级分另外进行透析，以保证彻底除去未结合的染料。
6.3偶联物的UV/Vis光谱表征首先测量纯偶联物溶液的光吸收光谱在其中染料吸光度超出仪器的线性范围(～1.5AU)的情况中，使用PBS配制更稀的样品并对读数作适当地换算。记录在染料吸收峰(～650nm)和抗体吸收峰(～280nm)处的吸光度值。
使用下面的标准公式计算染料/蛋白质比D/P=Amax.ϵAB(A280-x.Amax).ϵD]]>
Amax＝在染料峰波长(～650nm)的吸光度，εD＝在染料峰波长的染料消光系数(～250,000dm3mol-1cm-1)，A280＝在280nm(抗体吸收峰)的吸光度，x＝染料在280nm的消光系数，相对于染料峰消光系数(通过对结果进行数学分析和通过纯染料的光谱分析测定，＝0.05)，εAB＝抗体在280nm的消光系数(通过实验测定为170,000dm3mol-1cm-1)。
将两种染料的结果进行处理并表示为(染料/蛋白质比)对(施加的染料-NHS的量)的图。该图表示在图1(1A和1B)中。可以看出，两种染料的标记效率具有可比性。
将偶联物溶液用PBS稀释(将200μl偶联物稀释到20ml)并在Perkin Elmer LS-55仪器上测定荧光读数。在染料峰吸收波长激发并在680nm记录发射。处理初始的荧光读数，用于考虑从吸光度数据测定的各样品中抗体的实际浓度。将两组偶联物的读数如此标度为抗体的恒定浓度；然后将相对荧光对染料/蛋白质比绘图图2。
结果表明，在较高的染料负荷下，化合物2与蛋白质IgG的偶联物比标准Cy5(化合物6-lgG偶联物)更亮。这种性能差异的原因归于在当染料彼此紧密接近进行结合时，染料通过聚集而缔合的趋势的明显下降。这种聚集的减少可由两个因素进行解释。第一，每种染料标记上增加的负电荷引起电荷-电荷排斥增加，其对抗平面芳香系统由于π-π堆叠相互作用所致的正常吸引。第二，新染料的更大空间体积起到阻止染料分子接近，进一步防止堆叠的相互作用。
可以通过偶联物的光吸收光谱观察染料聚集的减少。已知花青染料在溶液中聚集引起主吸收峰上高能肩峰的吸光度增加。这种效果在Cy5TM偶联物的吸收光谱中清楚地可见，并且其随着染料/蛋白质比的增加而变得更加显著参见图3A。相比之下，同意义的化合物2偶联物的吸收光谱没有表现出这种效果；偶联物的染料吸收谱带基本上与染料/蛋白质比无关，并且光谱为特别不可叠加的(superimposable)参见图3B。
7.使用Cy7染料的标记研究；化合物3和4与Cy7(化合物7)的比较将本发明的七甲炔花青染料实例的性能与市售的Cy7衍生物(化合物7)相比较。
7.1羧基染料到NHS酯的转化使用实施例6.1的方法将化合物3和4转化为它们的NHS酯衍生物。
化合物3C45H58N3O16S4，计算值M+＝1024；实测值M+＝1024。
化合物4C45H58N3O16S4，计算值M+＝1024；实测值M+＝1024。
7.2用七甲炔花青染料化合物3、4和7的NHS衍生物标记绵羊γ-球蛋白将绵羊IgG以1mg/ml溶解于碳酸钠缓冲液(0.1M，pH 9.2)中；将染料NHS酯以～10mg/ml溶解于无水DMSO中(250μl)。为了得到一系列的染料/蛋白质比，进行一系列标记实验。每个反应使用500μl的抗体溶液，其与在0.5-16μl范围内的不同量的染料NHS酯溶液组合。标记反应在环境温度下在暗处进行45分钟。通过使用Sephadex作为固定相和使用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为洗脱液的尺寸排阻色谱法纯化从偶联物除去游离的染料。
7.3通过UV/Vis光谱表征偶联物首先测量纯偶联物溶液的光吸收光谱在其中染料吸光度超过仪器的线性范围(～1.5AU)的情况中，使用PBS配制更稀的样品并对读数作适当地换算。记录在染料吸收峰(～750nm)和抗体吸收峰(～280nm)的吸光度值。
使用实施例6中给出的标准公式计算染料/蛋白质比，εD取为250,000dm3mol-1cm-1，并且x取为0.04。
如图4中所示，PBS中偶联物的UV/Vis吸光度表现出由肩峰蓝移幅度表示的Cy7-IgG结构内Cy7(化合物7)在较高的染料/蛋白质比下的高度聚集图4A。化合物3和4的IgG偶联物显示没有表现出这种聚集性质图4B。
7.4通过荧光表征偶联物进一步用PBS缓冲液稀释UV/Vis溶液，以测量由不同的七甲炔花青染料标记的偶联物的相对荧光。如实施例6.3中所述测量相对荧光，然后对染料/蛋白质比绘图图5。结果表明，在较高的染料负荷下，化合物3和4的IgG偶联物比标准Cy76-IgG偶联物更亮。
8.用化合物2标记氨基烯丙基2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸酯8.1将氨基烯丙基-dUTP溶解于碳酸盐缓冲液(10ml，pH 9.2)中。向其中加入在乙腈中的N-三氟乙酰基氨基己酰基N-羟基琥珀酰亚胺(2当量)。将其在室温下搅拌4.5小时。分析性HPLC显示反应完成。然后加入氢氧化铵(0.88S.G.，10ml)并将混合物搅拌过夜，以得到氨基己酰基-氨基烯丙基-dUTP。将产物通过反相HPLC纯化。
8.2在经烘干的25ml圆底烧瓶中将在DMSO(500μl)和二异丙基乙胺(40μl)中的氨基己酰基-氨基烯丙基-dUTP(1mg)在氮气下搅拌15分钟。将化合物2NHS酯(1mg)溶解于DMSO(300μl)中并将其一次性加入到该混合物中。将所用小瓶用DMSO(200μl)漂洗，该DMSO也加入到混合物中。加入DMAP(～1mg)并将混合物在氮气下在暗处搅拌18小时。使用分析性HPLC(Phenomenex Jupiter C1810μ 25×0.46cm)分析样品(在500μl缓冲液中的25μl)，在30分钟内用由5到30％乙腈梯度改性的磷酸盐缓冲液0.05M pH 5.6，以1ml/分钟的恒定流速洗脱。使用在254nm和650nm的吸光度进行样品检测。色谱表现出酯和胺的消耗产生RT为15.5分钟的新产物。将产物用水(1ml)稀释并通过离子交换色谱法(HiTrap Q HP 5ml)纯化，在60分钟内用由20-75％的1M三乙铵碳酸盐缓冲液改性的0.1M三乙铵碳酸氢盐缓冲液洗脱。流速为1ml/分钟，检测在650nm和254nm进行。将相当于主峰的级分合并并加热旋转蒸发，溶解于水中并冷冻干燥。
9.使用化合物2和5标记cDNA9.1 cDNA探针标记如下所述通过后标记技术使用化合物2和5标记cDNA，其中将染料的活性NHS酯衍生物与cDNA偶联以产生微阵列探针。
根据CyScribe Post Labelling Kit(GE Healthcare)中所述的标准规程，在氨基烯丙基-脱氧UTP、脱氧核苷酸、逆转录酶和反应缓冲液的存在下在42℃下在20μl反应中使用寡-dT和随机引物，将纯化的人骨骼肌信使RNA(1μg)转化为cDNA。通过将cDNA结合在玻璃珠基质从而从合成的cDNA除去未结合的核苷酸和缓冲液。将氨基烯丙基-cDNA在水中洗脱。
经洗脱的cDNA干燥并再悬浮在等分小份的0.1M碳酸氢钠缓冲液pH 8.5(40μl)中，并将单独的等分小份与化合物2和5的活性NHS酯混合。将等量的cDNA和100-500μg的化合物2和5的活性NHS酯一起使用。结合反应在暗处进行1小时30分钟，随后使用玻璃珠基质从未反应的酯中纯化经标记的cDNA。为了进行比较，还将等分小份的cDNA用化合物6(Cy5NHS酯)标记。将cDNA标记探针纯化并如下所述测定收率。
i)被标记的cDNA的收率计算收率cDNA＝DNA Abs260nm×37μg/ml×总探针量(ml)ii)染料结合 Absmax＝在染料峰波长(650nm)的吸光度ε＝染料在染料峰波长的消光系数(250,000mol-1cm-1)iii)核苷酸/染料比 上述计算假定平均探针大小为1000个碱基，并且cDNA中dNMP的平均分子量为324.5。标记反应的结果如表5中所示。
表5
虽然化合物6的标记效率比化合物2和5中的任一种都高，但是这通过向标记混合物中加入更大量的后者的活性染料而被克服。化合物5给出比化合物2更高的结合效率，可能是由于化合物5的改善的水稳定性。另外，在本发明的染料结构中多个磺酸盐基团的存在，看来似乎减少探针聚集，如在与650nm染料荧光最大值临近的605nm吸光度肩峰减少所示的(参见图6和7)。这与在接近650nm最大值的605nm处表现出较大的肩峰的化合物6标记的cDNA探针(图8)大不相同。
10.染料的光稳定性在闪烁管中将化合物2、5和6稀释到～0.5AU，总体积为10ml。将小瓶置于20℃的控温室中的光箱上。在120小时的时间范围内测量UV吸光度。结果如图9中所示，其表明包含与发色团结构连接的多个磺酸盐基团的花青染料的光稳定性与包含较少这种基团的染料相比得到增强。
将完全一样的样品也储存在相同条件下但是在暗处。在这些样品中观察到UV吸光度没有变化。
权利要求
1.由下式(I)表示的化合物 其中基团R3和R4连接于Z1环结构，基团R5和R6连接于Z2环结构，并且n＝1、2或3；Z1和Z2独立地表示使一个环或两稠和环芳香系统完整所需的碳原子；基团R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少一个为基团-E-F，其中E为单键或具有含1-20个连接原子的链的间隔基团，连接原子选自碳、氮和氧原子，F为靶结合基团；基团R11、R12、R13和R14中的一个或多个独立地选自基团-(CH2)k-W，其中W为磺酸或膦酸，k为1到10的整数；当基团R1和R2中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R1和R2独立地选自C1-C6烷基、未取代的或被磺酸取代的苄基、和基团-(CH2)k-W，其中W和k定义如上；当基团R3、R4、R5和R6中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R3、R4、R5和R6独立地选自氢和磺酸；当基团R11、R12、R13和R14中的任一个不是所述基团-(CH2)k-W时，则所述剩余的基团R11、R12、R13和R14独立地为C1-C6烷基；剩余的基团R7为氢，或者两个R7与以下基团 一起形成具有5或6个原子的烃环系统。
2.权利要求1的化合物，其中R11、R12、R13和R14中的至少两个独立地为-(CH2)k-W，其中W和k定义如上。
3.权利要求1的化合物，其中基团R11和R12之一、和基团R13和R14之一为基团-(CH2)k-W，其中W和k定义如上；并且剩余的基团R11或R12、和R13或R14为C1-C6烷基。
4.权利要求1到3中任一项的化合物，其中W为磺酸。
5.权利要求1到3中任一项的化合物，其中-(CH2)k-W选自-(CH2)3-SO3H和-(CH2)4-SO3H。
6.权利要求1到5中任一项的化合物，其中Z1和Z2选自苯基和萘基部分。
7.权利要求1到6中任一项的化合物，其中所述靶结合基团F包括用于与靶材料上的官能团反应的活性基团、或用于与靶材料上的活性基团反应的官能团。
8.权利要求7的化合物，其中所述活性基团选自羧基、琥珀酰亚胺基酯、磺基-琥珀酰亚胺基酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺、酰卤、酰肼、乙烯基砜、二氯三嗪和亚磷酰胺。
9.权利要求7的化合物，其中所述官能团选自羟基、氨基、巯基、咪唑、包括醛和酮的羰基、和硫代磷酸酯基。
10.权利要求1到6中任一项的化合物，其中所述靶结合基团F包括亲和标记物。
11.权利要求1到10中任一项的化合物，其中所述间隔基团E选自-(CHR′)p-Q-(CHR′)r-其中Q选自-CHR′-、-NR′-、-O-、-CR′＝CR′-、-C(O)-NR′-和-(CO)-O-；R′为氢或C1-C4烷基，p为0-5，并且r为1-5。
12.权利要求11的化合物，其中Q选自-CHR′-、-C(O)-NH-和 其中R′定义如上。
13.权利要求1到6中任一项的化合物，其中所述基团-E-F包括羧基戊基。
14.权利要求1到13中任一项的化合物，其选自i)2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐；ii)2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-1，3-双(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐；iii)2-{(1E，3E，5E，7E)-7-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]庚-1，3，5-三烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐；iv)2-{(1E，3E，5E，7E)-7-[5-(羧基甲基)-3-甲基-1，3-双(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]庚-1，3，5-三烯基}-1-乙基-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐；和v)1-苄基-2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3-甲基-5-磺基-3-(4-磺基丁基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-3-(4-磺基丁基)-3H-吲哚-5-磺酸盐。
15.制备权利要求1到14中任一项的化合物的方法，该方法包括a)将由下式(A)表示的第一中间体化合物 其中Z1、R1、R3、R4、R11和R12定义如上；b)可与第一中间体化合物相同或不同并由式(B)表示的第二中间体化合物 其中Z2、R2、R5、R6、R13和R14定义如上，和c)适合形成第一和第二化合物之间的连接的第三化合物(C)反应；条件是基团R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为基团-E-F，其中E和F定义如上；并且条件是基团R11、R12、R13和R14中的一个或多个独立地选自基团-(CH2)k-W，其中W选自磺酸和膦酸基团，并且k为1到10的整数。
16.由下式表示的化合物 其中基团R3和R4连接于Z1环结构，其中Z1定义如上；基团R1、R3和R4中的至少一个为基团-E-F，其中E和F定义如上；基团R11和R12中的至少一个为基团-(CH2)k-W，其中W选自磺酸或膦酸基团，并且k为1到10的整数。
17.权利要求16的化合物，其中-(CH2)k-W选自-(CH2)3-SO3H和-(CH2)4-SO3H。
18.标记靶组分的方法，该方法包括i)将所述组分与式(I)化合物接触 其中基团R3和R4连接于Z1环结构，基团R5和R6连接于Z2环结构，并且n＝1、2或3；Z1和Z2独立地表示使一个环或两稠和环芳香系统完整所需的碳原子；基团R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中的至少一个为基团-E-F，其中E为单键或具有含1-20个连接原子的链的间隔基团，连接原子选自碳、氮和氧原子，F为靶结合基团；基团R11、R12、R13和R14中的一个或多个独立地选自基团-(CH2)k-W，其中W为磺酸或膦酸，k为1到10的整数；当基团R1和R2中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R1和R2独立地选自C1-C6烷基、未取代的或被磺酸取代的苄基、和基团-(CH2)k-W，其中W和k定义如上；当基团R3、R4、R5和R6中的任一个不是所述基团-E-F时，则所述剩余的基团R3、R4、R5和R6独立地选自氢和磺酸；当基团R11、R12、R13和R14中的任一个不是所述基团-(CH2)k-W时，则所述剩余的基团R11、R12、R13和R14独立地为C1-C6烷基；剩余的基团R7为氢，或者两个R7与以下基团 一起形成具有5或6个原子的烃环系统；和ii)将所述荧光染料与所述组分在适合结合于所述组分并从而标记所述组分的条件下培养。
19.权利要求18的方法，其中所述组分选自抗体；脂质；蛋白质；肽；碳水化合物；包含、或被衍生化以包含氨基、巯基、羰基、羟基、和羧基和硫代磷酸酯基中一个或多个的核苷酸；和包含、或被衍生化以包含氨基、巯基、羰基、羟基、羧基和硫代磷酸酯基中一个或多个的含氧多核酸和脱氧多核酸；微生物材料；药物；激素；细胞；细胞膜；和毒素。
全文摘要
本发明公开了可用于标记和检测生物材料和其它材料的花青染料。染料由式(I)表示，其中基团R
文档编号C07D209/10GK1875073SQ200480032219
公开日2006年12月6日 申请日期2004年10月29日 优先权日2003年10月31日
发明者R·M·维斯特, N·博斯沃尔思, R·B·穆朱姆达 申请人:阿默森生物科学英国有限公司, 卡内基梅隆大学