胆甾醇臭氧化产物的检测的制作方法

专利名称：胆甾醇臭氧化产物的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及胆甾醇臭氧化产物由动脉粥样硬化病变(lesion)产生这一发现。本发明提供诊断、检测和监测患有胆甾醇相关血管病症如动脉粥样硬化和/或心血管疾病的患者的方法。
背景技术：
大众不断得到建议说，应谨慎的监测血清胆甾醇水平，大众还经常受到提醒说，饮食不节制和缺乏运动会导致胆甾醇在动脉斑块中积累，增加动脉粥样硬化和冠心病的危险。然而，虽然高血清胆甾醇水平是这种危险的指标，但它并不证明成问题的动脉粥样硬化斑块累积实际存在。
已知血清胆甾醇主要与低密度脂蛋白(LDL-胆甾醇)、高密度脂蛋白(HDL-胆甾醇)和极低密度脂蛋白中的三甘油酯(VLDL-胆甾醇)有关。许多长期临床试验的统计证据表明，高比例HDL-胆甾醇与低比例LDL-胆甾醇与较低的相对危险有关。HDL-胆甾醇是有益的，条件是其水平不过低，即低于30mg/dL。VLDL-胆甾醇仍未涉及任何风险测定，但高三甘油酯本身可能是严重问题。另一方面，高比例LDL-胆甾醇和低比例HDL-胆甾醇是更高的动脉粥样硬化和冠心病危险的指标。
即使动脉粥样硬化和高LDL-胆甾醇水平之间存在紧密的相关性，某些研究已表明，血清LDL-和HDL-胆甾醇水平的测量进行得很差，经常提供不可靠的结果。参见Superko，H.R.等，High-DensityLipoprotein Cholesterol Measurements--A Help or Hinderance inPractical Clinical Medicine，JAMA 2562714-2717(1986)；Warnick，G.R.等，HDL CholesterolResults of Interlaboratory Proficiency Test，Clin.Chem.26169-170(1980)；和Grundy，S.M.等，The Place of HDL inCholesterol Management.A Perspective from the National CholesterolEducation Program，Arch.Inter.Med.149505-510(1989)。Grundy等的文章报告，HDL-胆甾醇测量值的实验室间变异系数高达38％。美国病理学家学会(College of American Pathologists)1987年关于两千多个实验室对相同HDL-胆甾醇样品所作测量的报告显示，33％以上的测量值与参考值的差异超过5％。在使用相同方法的组别中，实验室间变异系数确实改进到16.5％，但这种程度的变异仍表明大多数测试结果太不准确，在临床环境中难以有任何预测价值。因此，在危险评估中不再使用总胆甾醇∶HDL-胆甾醇之比。
在典型的脂质分布型(profile)研究中，总胆甾醇和三甘油酯水平直接从血清样品测量。然后用试剂处理样品，以沉淀出LDL-胆甾醇和VLDL-胆甾醇。HDL-胆甾醇在样品作这种处理后剩下的上清液中测量。认为VLDL-胆甾醇占三甘油酯的固定分数(例如0.2)。然后通过从总胆甾醇减去HDL和VLDL胆甾醇的值，间接计算出LDL-胆甾醇。这三个独立测量中出现的误差传递使得LDL-胆甾醇测量是总准确度和精密度最低的一个，尽管它对于心血管危险的评估是最重要的。由于这种不准确性，难以有意义地监测和确定在LDL-胆甾醇减低疗法中随时间推移是否取得临了床进展。
因此，血清LDL-胆甾醇测量往往是不准确的。这种不准确性加上LDL-胆甾醇水平不能实际证明存在成问题的动脉粥样硬化病变这个事实，说明需要相对简单、可靠和可再现的方法来确定患者中是否存在成问题的富胆甾醇动脉粥样硬化病变。
发明概述根据本发明，胆甾醇臭氧解产物存在于动脉粥样硬化斑块中。此外，对采自患者的组织和体液中胆甾醇臭氧化产物的检测和定量，是患者中是否实际存在动脉粥样硬化病变的准确指标。本发明因此提供简单准确的方法来检测患者中是否存在动脉粥样硬化病变。本发明的方法涉及检测胆甾醇臭氧化产物是否存在于采自患者的试样。本发明还设想，定量生物样品中存在的胆甾醇臭氧化产物的量，作为诊断和监测哺乳动物中动脉粥样硬化斑块形成程度的手段。
本发明的一个方面是产生于动脉粥样硬化斑块的分离的胆甾醇臭氧化产物。这种胆甾醇臭氧化产物可例如具有以下任一式4a-15a、3c或7c



本发明的另一方面是胆甾醇臭氧化产物的可检测衍生物，所述衍生物包括亚硫酸氢盐加合物、亚胺、肟、腙、丹磺酰腙、缩氨基脲或Tollins试验产物，其中所述胆甾醇臭氧化产物在动脉粥样硬化斑块中产生。
本发明的另一方面涉及具有式4b或式4c的胆甾醇臭氧化产物的腙衍生物 本发明的另一方面涉及具有式5b的胆甾醇臭氧化产物的腙衍生物 本发明的另一方面涉及具有任一式6b-15b或10c的胆甾醇臭氧化产物的腙衍生物



本发明的另一方面涉及具有式4d的胆甾醇臭氧化产物的丹磺酰腙衍生物
本发明的另一方面涉及具有式5c的胆甾醇臭氧化产物的丹磺酰腙衍生物 本发明的另一方面是具有式13a、13b、14a、14b、15a、15c或3c的半抗原。
本发明的另一方面是可结合胆甾醇臭氧化产物的分离抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可结合的胆甾醇臭氧化产物可以是具有任一式4a-15a、3c、4c、7c的化合物。在某些实施方案中，分离抗体可结合胆甾醇臭氧化产物的腙衍生物，例如具有任一式4b-15b、4c或10c的化合物。本发明的抗体可例如针对具有式13a、13b、14a、14b、15a、15c或3c的半抗原而产生。
本发明的另一方面是分离抗体，其中所述分离抗体源自杂交瘤KA1-11C5:6或KA1-7A6:6(ATCC检索号PTA-5427或PTA-5428)。
本发明的另一方面是分离抗体，其中所述分离抗体源自杂交瘤KA2-8F6:4或KA2-1E9:4(ATCC检索号PTA-5429和PTA-5430)。
本发明的另一方面是通过检测获自患者的试样中是否存在胆甾醇臭氧化产物来检测患者中的动脉粥样硬化的方法。臭氧化产物可由动脉粥样硬化斑块产生。试样可例如是血清、血浆、血液、动脉粥样硬化斑块物质、尿液或血管组织。检测动脉粥样硬化的方法也可涉及定量试样中存在的胆甾醇臭氧化产物的量。
在一个实施方案中，检测动脉粥样硬化的方法可包括以下步骤使试样与亚硫酸氢盐、氨、席夫碱、芳族或脂族肼、丹磺酰肼、Gerard试剂、Tollins试验试剂反应，并检测由这种反应形成的胆甾醇臭氧化产物的衍生物。
在另一个实施方案中，检测动脉粥样硬化的方法可包括使试样与肼化合物反应以产生甾醇臭氧化产物的腙衍生物。例如，肼化合物可以是2，4-二硝基苯肼。
在另一个实施方案中，检测动脉粥样硬化的方法可包括使试样与丹磺酰肼反应以产生甾醇臭氧化产物的丹磺酰腙衍生物。例如，所形成的丹磺酰腙衍生物可具有式4d或5c。
在另一个实施方案中，检测动脉粥样硬化的方法可包括使试样与能结合胆甾醇臭氧化产物的抗体相接触。在这个方法中可使用任何本文描述的抗体。
本发明的另一个方面涉及通过检测获自患者的试样中是否存在胆甾醇臭氧化产物，来检测胆甾醇臭氧化产物是否由患者中的动脉粥样硬化斑块释放的方法，其中所述臭氧化产物是具有式5a的化合物。检测胆甾醇臭氧化产物是否由动脉粥样硬化斑块释放的方法也可涉及定量试样中存在的胆甾醇臭氧化产物的量。
本发明的另一个方面涉及检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括将2，4-二硝基苯肼加入到获自患者的试样中，检测试样中是否存在胆甾醇臭氧化产物的腙衍生物。检测出的腙衍生物可以为具有任一式4b、4c、5b、6b、7b、8b、9b、10b、10c、11b、12b、13b、14b或15b的化合物。
本发明的另一个方面涉及通过使巨噬细胞与试样接触并确定巨噬细胞对脂质的摄取是否增加，来检测试样中是否存在胆甾醇臭氧化产物的方法。
本发明的另一个方面涉及检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括使巨噬细胞与获自患者的试样接触，并确定巨噬细胞对脂质的摄取是否增加。
本发明的另一个方面涉及检测试样中的胆甾醇臭氧解产物的方法，所述方法包括使低密度脂蛋白与试样相接触，并观察低密度脂蛋白的二级结构是否改变。
本发明的另一个方面涉及检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括使低密度脂蛋白与获自患者的试样相接触，并观察低密度脂蛋白的二级结构是否改变。
本发明的另一个方面涉及检测试样中的胆甾醇臭氧解产物的方法，所述方法包括使脱辅基蛋白质B100与试样相接触，并观察脱辅基蛋白质B100的二级结构是否改变。
本发明的另一个方面涉及检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括使脱辅基蛋白质B100与获自患者的试样相接触，并观察脱辅基蛋白质B100的二级结构是否改变。
低密度脂蛋白或脱辅基蛋白质B100的二级结构可例如通过圆二色性来观察。
附图简述

图1A-1D显示靛蓝胭脂红1可被4-β-佛波醇12-十四烷酸13-乙酸酯(PMA)处理的人动脉粥样硬化病变氧化形成靛红磺酸2。
图1A图示靛蓝胭脂红1被臭氧转化成靛红磺酸2的过程中发生的化学变化。
图1B图示PMA-活化动脉粥样硬化病变对靛蓝胭脂红1的漂白。各玻璃小瓶含等量的动脉粥样硬化斑块(约50mg湿重)的分散液，在靛蓝胭脂红1(200，μM)和牛过氧化氢酶(50μg)的磷酸缓冲盐水溶液(PBS，10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.4)中。将PMA(10μL，40μg/mL)的DMSO溶液加入右边小瓶中30分钟后照相。左边小瓶加入相同体积的无PMA的DMSO。反应混合物的总体积是1mL。
图1C显示，反相HPLC分析得出，在图1B所示+PMA小瓶的上清液中出现新的HPLC峰。该新峰对应于靛红磺酸2，保留时间(RT)大约9.71分钟。
图1D显示上清液的负离子电喷射质谱图，该上清液来自离心以上图1B所述的与靛蓝胭脂红1反应的PMA-活化人动脉粥样硬化斑块物质。当用靛蓝胭脂红1指示剂在H218O中进行悬浮斑块物质的PMA活化时，如分离的裂解产物靛红磺酸2的质谱中[M-H]-230质量片段峰的外观和相对强度所示，大约40％的靛蓝胭脂红1的内酰胺羰基氧掺入18O。在正常的水(H216O)存在下由靛蓝胭脂红1生成的靛红磺酸2具有[M-H]-228质量片段峰。
图2A图示涉及胆甾醇3臭氧解产生5，6-断甾醇(secosterol)4a，再通过羟醛缩合转化成5a的反应步骤。用2，4-二硝基苯肼(2mM于0.08％HCl中)衍生化分别提供腙衍生物4b和5b。衍生化过程中从4a生成的5b的量约为20％。5a和5b的构象排布按K.Wang，E.Bermudez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)来确定。
图2B显示作为图3中约18分钟洗脱的[M-H]-579峰的标准品来研究的氧甾醇6a-9a和2，4-二硝基苯肼盐酸盐衍生物6b-7b的结构。7a-7b的构象排布基于使用真实的合成7b物质的1H-1H ROESY实验。
图3A-E图示使用液相色谱质谱(LCMS)对斑块物质和腙4b、5b和6b的化学合成真实样品的分析。条件Adsorbosphere-HS RP-C18柱，75％乙腈，20％水，5％甲醇，0.5mL/分钟流速，360nm检测，斑块抽提物用盐酸2，4-二硝基苯肼(DNPH HCl)衍生化后进行线内负离子电喷射质谱(MS)(Hitachi M8000色谱仪)。
图3A图示不经PMA活化，但如本文所述用2，4-二硝基苯肼衍生化后的斑块物质的LCMS分析。在用PMA(40μg/mL)活化前的动脉粥样硬化病变中检测出化合物4b(RT～14.1分钟)、5b(RT～20.5分钟)和6b(RT～18分钟)。
图3B图示如上所述用PMA(40μg/mL)活化、抽提和用2，4-二硝基苯肼衍生化后的斑块材料的LCMS分析。在用PMA(40μg/mL)活化后的动脉粥样硬化病变中检测出较大量的化合物4b(RT～14.1分钟)和较少量的化合物6b(RT～18分钟)。
图3C图示真实4b的HPLC分析；插图显示质谱分析。
图3D图示真实6b的HPLC分析；插图显示质谱分析。
图3E图示真实5b的HPLC分析；插图显示质谱分析。
图4A-D图示抽提和衍生化的动脉粥样硬化物质的HPLC-MS分析，其中使用100μl注射体积，以便检测痕量腙。图4A显示使用上文详述条件的时间-强度LC迹线。RT26.7为7b(与真实物质比较)。RT～24.7的峰是[M-H]-461的未知腙。图4B提供[M-H]-597的单离子监测。图4C提供[M-H]-579的单离子监测。图4D显示[M-H]-461的单离子监测。
图5A-C图示患者A-N的动脉粥样硬化抽提物中的胆甾醇臭氧化产物浓度。
图5A显示来自用PMA活化前后的患者动脉粥样硬化病变的4a在抽提和衍生化后，腙4b的测量浓度的条形图。该条形图显示用Macintosh上的GraphPad Prism(3.0版本)进行Student t测验法(双侧)(p＜0.05，n＝14)分析确定的活化前后检测量的数值。
图5B显示来自用PMA活化前后的患者动脉粥样硬化病变的5a在抽提和衍生化后，5b的测量浓度的条形图(n＝14)。
图5C是显示来自患者的血浆样品的5a在抽提和衍生化后，5b的测量浓度的条形图。组A(n＝8)患者在24小时内进行颈动脉内膜切除术程序(样品收集后3天进行血浆分析)。组B(n＝15)患者从上普通医学诊所的患者当中随机挑选(样品收集后7天进行血浆分析)。注意，在初步研究中，5a的血浆水平每天下降约5％。在此测试的条件下，4b和5b的检出限是1-10nM。因此，在没有明显的4b或5b的情况下，4b或5b的水平低于10nM。
图6A图示3、4a和5a对B-细胞(WI-L2)细胞系的细胞毒性。各数据点是至少两次重复测量的平均值。4a(■)和5a(▲)的IC50±标准误差通过用Macintosh计算机上的GraphPad Prism(3.0版本)进行非线性回归分析(Hill图形分析)来计算。在此浓度范围内没有观察到3()的细胞毒性。
图6B图示3、4a和5a对T-细胞(Jurkat)细胞系的细胞毒性。各数据点是至少两次重复测量的平均值。4a(■)和5a(▲)的IC50±标准误差通过用Macintosh计算机上的GraphPad Prism(3.0版本)进行非线性回归分析(Hill图形分析)来计算。在此浓度范围内没有观察到3()的细胞毒性。
图7A-B显示胆甾醇臭氧解产物4a和5a增加巨噬细胞的脂质负荷(lipid-loading)，产生泡沫细胞。
图7A显示与J774.1巨噬细胞一起温育的LDL对这些巨噬细胞的脂质负荷的影响极少。巨噬细胞首先在含10％胎牛血清的RPMI-1640中生长24小时，然后在含LDL(100μg/mL)的相同培养基中温育72小时。细胞用4％甲醛固定，用苏木精和油红O染色，使脂质颗粒染成较深的红色。放大倍数×100。
图7B显示与臭氧解产物4a一起温育的LDL诱导巨噬细胞的脂质负荷，产生泡沫细胞。J774.1巨噬细胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640中生长24小时。然后细胞在含LDL(100μg/mL)和臭氧解产物4a(20μm)的相同培养基中温育72小时。细胞用4％甲醛固定，用苏木精和油红O染色，使脂质颗粒染成较深的红色。放大倍数×100。注意，臭氧解产物4a对巨噬细胞的作用不能与臭氧解产物5a的作用相区别。
图8A-C显示，圆二色性检测发现，通过暴露于臭氧解产物4a或5a，LDL中的蛋白质的二级结构被改变。报告的结果得自各样品的至少两次重复实验。
图8A显示，正常LDL的蛋白质内含物有较大比例的α螺旋结构(～40±2％)和较少量的β结构(～13±3％)、β转角(～20±3％)和无规卷曲(27±2％)。图8A显示37℃下PBS(pH 7.4)中的LDL(100μg/ml)的时间依赖性圆二色性谱。
图8B显示37℃下LDL与臭氧解产物4a一起在PBS(pH 7.4)中温育导致apoB-100的二级结构丧失。图8A显示37℃下PBS(pH 7.4)中的LDL(100μg/ml)和4a(10μm)的时间依赖性圆二色性谱。
图8C显示37℃下LDL与臭氧解产物5a一起在PBS(pH 7.4)中温育导致apoB-100的二级结构丧失。图8A显示37℃下PBS(pH 7.4)中的LDL(100μg/ml)和5a(10μm)的时间依赖性圆二色性谱。
图9图示胆甾醇臭氧化产物4a和5a的丹磺酰肼(分别为4d和5c)的结构及这些肼衍生物的HPLC洗脱图形。如图所示，胆甾醇臭氧化产物4a和5a产生具有不同HPLC保留时间的丹磺酰腙共轭物。
图10图示可通过气相-质谱(GCMS)分析，在人颈动脉标本中检测出胆甾醇臭氧化产物。所示色谱图是动脉粥样硬化斑块抽提物的特点。在22.49分钟洗脱的峰是对应于胆甾醇臭氧化产物4a和5a的峰。插入的质谱示在22.49分钟洗脱的物质其m/z为354。
图11提供ID-GCMS对两种动脉粥样硬化斑块(P1和P2)的定量分析。检出的胆甾醇臭氧化产物4a和5a的量为约80-100pmol/mg组织，与LC-MS分析检出的近似。各条代表双份抽提物，表示为平均值±平均标准误差。
发明详述本发明提供检测胆甾醇臭氧化产物的方法。本发明还提供检测胆甾醇臭氧化产物的试剂盒和试剂。这些方法、试剂盒和试剂用于检测与胆甾醇累积有关的血管病症。例如，这些方法、试剂盒和试剂用于诊断和监测炎性动脉疾病如动脉粥样硬化的预后。
胆甾醇臭氧化根据本发明，胆甾醇在发生动脉粥样硬化的动脉中被活性氧物质如臭氧氧化。许多胆甾醇臭氧化产物由这个过程产生，可在采自动脉粥样硬化患者的组织或液体样品中检出。胆甾醇臭氧化产物的检测是诊断炎性动脉疾病如动脉粥样硬化的依据。
胆甾醇具有以下结构(3) 虽然血液中胆甾醇的高水平与形成动脉粥样硬化斑块的可能性相关，但这种胆甾醇高水平并不明确表示患者动脉系统中存在脉粥样硬化斑块。为确定患者是否实际患有动脉粥样硬化病变，目前使用昂贵的测试法，如快速CAT扫描、带成像程序的染料注射，或者侵入性内窥镜检查或导管插入术方法。
但是，根据本发明，可通过检测胆甾醇臭氧化产物，来检测实际的动脉粥样硬化斑块的存在。当胆甾醇沉积在动脉中时，可形成动脉粥样硬化斑块。虽然不想局限于具体机制，但似乎巨噬细胞、嗜中性白细胞和其他免疫细胞投入动脉粥样硬化病变中，并释放出活性氧物质如臭氧。所产生的活性氧物质与病变中的胆甾醇反应，将胆甾醇氧化成多种可在患者中检出的产物。因此，两个事件依次发生，使胆甾醇臭氧化产物出现在采自患者的样品中。首先，胆甾醇必须在动脉粥样硬化斑块中大量累积。其次，动脉粥样硬化必须发展到其中产生活性氧物质的阶段。正是这两个事件的并列出现导致胆甾醇臭氧化产物的形成。由于胆甾醇累积和臭氧产生在其他情形下基本不出现，因此胆甾醇臭氧化产物的检测是患者中是否存在炎性动脉病症如动脉粥样硬化的准确指标。此外，根据本发明，采自动脉粥样硬化患者的生物样品(例如血清)中存在的胆甾醇臭氧化产物的量是患者所患动脉粥样硬化的严重性指标。
根据本发明，已鉴定出多种胆甾醇臭氧化产物。例如，当胆甾醇3被氧化时，所形成的主要产物是断酮醛4a及其羟醛加合物5a。
此外，还观察到结构类似于化合物6a-15a和7c的胆甾醇臭氧化产物。


根据本发明，断酮醛4a、其羟醛加合物5a及相关化合物6a-15a和7c可存在于动脉粥样硬化患者的动脉粥样硬化斑块和血流中。此外，断酮醛4a、其羟醛加合物5a及相关化合物6a-15a和7c与患者中动脉粥样硬化斑块形成的程度和严重性相关。例如，在八名动脉粥样硬化病况充分发展到有理由进行动脉内膜切除术的患者当中，有六名检出含量在70-1690nM范围内的羟醛5a(图5C)。但是，在十五份来自普通医学诊所患者中随机挑选的患者的血浆样品当中，只有一份可检出5a。
本发明因此设想通过检测这些胆甾醇臭氧化产物，来确定患者是否患有动脉粥样硬化病变，并确定循环胆甾醇结合到动脉粥样硬化斑块中的程度。
臭氧和胆甾醇产物的检测可通过本领域技术人员可获得的任何方法，检测或鉴定胆甾醇臭氧化产物。例如，可通过高压液相色谱(HPLC)、液相色谱质谱(LCMS)、气相色谱(GC)、气相色谱质谱(GCMS)、高压液相色谱质谱(HPLC-MS)、带蒸发光散射检测(ELSD)的HPLC、带气相色谱质谱的离子检测(ID-GCMS)、可见光谱、紫外光谱或红外光谱、薄层层析、电泳、液相色谱、核磁共振、湿法化学测定、免疫测定(例如ELISA)、免疫组织化学、荧光光谱、可见光谱或紫外光谱，或者通过本领域技术人员可获得的任何其他方法，来检测或鉴定这些产物。
此外，还可通过观察胆甾醇臭氧化产物对低密度脂蛋白(LDL)、脱辅基蛋白质B100(apoB-100，LDL的蛋白质组分)或巨噬细胞的作用，来检测这些产物的存在。如本文所述，胆甾醇臭氧解产物4a和5a可促进从巨噬细胞形成泡沫细胞。此外，胆甾醇臭氧解产物4a和5a修饰LDL和apoB-100的二级结构。因此，可通过确定试样是否可促进泡沫细胞形成或改变LDL或脱辅基蛋白质B100的二级结构，来检测试样中胆甾醇臭氧解产物的存在。这些测试在下文作更详细的描述。
在某些实施方案中，使试样与有助于检测和鉴定胆甾醇臭氧化产物的试剂反应。例如，可使试样与任何荧光、磷光或有色试剂接触，所述试剂可与胆甾醇臭氧化产物反应，并且反应产物可用荧光、可见光或紫外光检测器检测。在其他实施方案中，没有采用这种试剂，胆甾醇臭氧化产物通过其物理性质或化学性质来鉴定。这种方法在下文作更详细的描述。
动脉粥样硬化斑块物质中的臭氧量也表示已形成的动脉粥样硬化斑块的量。因此，本发明设想通过检测和/或定量动脉粥样硬化斑块物质中的臭氧，来估算动脉粥样硬化斑块的大小。可通过使用能检测臭氧的任何试剂，检测动脉粥样硬化斑块物质中的臭氧。例如靛蓝胭脂红1是有色试剂，其蓝色在其与臭氧反应时消失。如下所示，在这个过程中形成靛红磺酸2。
因此，可用臭氧检测方法来评估动脉粥样硬化斑块累积的程度。
但是，虽然可在动脉粥样硬化物质中检出臭氧，不过在具有大量动脉粥样硬化斑块物质的患者的血流中可检出胆甾醇臭氧化产物。因此，为避免分离动脉粥样硬化斑块物质，本领域技术人员可选择分离血液样品，然后检测是否存在胆甾醇臭氧化产物。这避免昂贵的侵入性方法如动脉内膜切除术，为估算患者中存在多少动脉粥样硬化斑块物质提供可靠的方法。
为诊断动脉粥样硬化，可检测任何胆甾醇臭氧化产物，例如断酮醛4a、其羟醛加合物5a和/或相关化合物6a-15a和7c。但是，至今为止所进行的研究表明，羟醛加合物5a是可在血清中检出的主要产物之一。
在某些实施方案中，可化学修饰在生物样品中获得的胆甾醇臭氧化产物，以促进检测。可用于这种化学修饰的试剂包括亚硫酸氢盐、氨、席夫碱(使用脂族或芳族胺如苯胺)、芳族或脂族肼、丹磺酰肼、Gerard试剂(氨基脲)、Tollins试验试剂(甲醛和氢氧化钙)等。这些试剂当与本发明的胆甾醇臭氧化产物反应时，提供可容易地被本领域技术人员检测的区别性产物，如亚硫酸氢盐加合物(容易以钠盐结晶)、亚胺、肟、腙、缩氨基脲、Tollins试验产物等。
例如，可容易地形成断酮醛4a、其羟醛加合物5a或相关化合物4c、6a-15a和7c的腙衍生物，它们是确定患者是否患有动脉粥样硬化病变的有用标志。这些腙衍生物包括具有类似于化合物4b-15b和可能4c或10c的结构的化合物。





已用HPLC质谱检出浓度低达约1nM至10nM的这些腙衍生物。用气相质谱分析，可检出低至10fg/μL的胆甾醇臭氧化产物。
胆甾醇臭氧化产物可例如通过与肼化合物如2，4-二硝基苯肼反应，转化成腙衍生物。在某些实施方案中，反应在有机溶剂如乙腈或醇(例如甲醇或乙醇)中进行。通常采用酸性环境和非含氧、非活性气氛。
例如，血浆可从患者中获得，并置于EDTA中。此样品可用二氯甲烷洗涤数次，以抽提胆甾醇臭氧化产物。可真空蒸发二氯甲烷级分，含胆甾醇臭氧化产物的残余物可溶于醇(例如甲醇)中。然后可加入2，4-二硝基苯肼和1N HCl的乙醇溶液。所述溶液可吹入氮气较短时间(例如5分钟)，以除去游离氧。可搅拌溶液，搅拌时间足以使胆甾醇臭氧化产物转化成其腙衍生物(例如2小时)。在这个方法中检出的主要产物据信是羟醛加合物5a的腙衍生物。此外，初步研究已揭示，可从血浆抽提的5a的量每天下降约5％。因此，新鲜血浆样品将给出更准确的样品中羟醛加合物5a实际含量的测量值。
本发明的试剂和方法可用来检测任何发展阶段的动脉粥样硬化。根据被AHA采纳并用于本发明的新分类法，在动脉粥样硬化的发展过程中，可区分八种病变类型。
I型病变由内膜中的小脂质沉积物(胞内和巨噬泡沫细胞中)形成，造成最初和最小的动脉血管壁变化。这种变化不会增厚动脉血管壁。
II型病变以脂肪纹为特征，所述脂肪纹为黄色条纹或斑点，其增加内膜的厚度不到1毫米。它们由比I型病变观察到的更多脂质积累所组成。脂质含量为病变干重的大约20-25％。大多数脂质在胞内，主要在巨噬泡沫细胞和平滑肌细胞中。胞外空间可含有脂滴，但它们比细胞内的要小，还含有小的囊状颗粒。在化学上，脂质由胆甾醇酯(胆甾醇油酸酯和胆甾醇亚油酸酯)、胆甾醇和磷脂组成。
III型病变也称为前动脉粥样化病变。在III型病变中，血管内膜只比II型病变所观察到的稍厚。III型病变不会阻塞动脉血液流动。胞外脂质和囊状颗粒与见于II型病变的完全相同，但存在的量增加(大约25-35％干重)，并开始积累在小体(small pool)中。
IV型病变与动脉粥样化有关。其为新月形，会增加动脉的厚度。所述病变可不使动脉管腔变得十分窄，但血浆胆甾醇水平非常高的人例外(对许多人来说，所述病变不可能通过血管造影术看见)。IV型病变由在内膜层过量积累(大约60％干重)的胞外脂质(有时称为脂核(lipidcore))组成。脂核可包含微小的矿物质堆(clamp)。这些病变易于破裂和易于形成腔壁血栓。
V型病变与纤维动脉粥样化有关。它们具有一层或多层主要由I型胶原组成的纤维组织。V型病变具有厚度增加的壁，随着动脉粥样硬化的发展，管腔不断缩小。这些病变具有的特征使其可以进一步细分。在Va型病变中，新组织是带脂核的病变的一部分。在Vb型病变中，脂核和病变的其他部分钙化(导致VII型病变)。在Vc型病变中，脂核不存在，脂质通常最少(导致VIII型病变)。通常，发生破裂的病变是Va型病变。它们相对较软，具有高浓度的胆甾醇酯而不是游离的胆甾醇一水合物晶体。V型病变会破裂，形成腔壁血栓。
VI型病变是具有病变表面破溃如裂纹、侵蚀或溃疡(VIa型)、血肿或出血(VIb型)和血栓形成沉积物(VIc型)的复杂病变，其覆盖在IV型病变和V型病变之上。VI型病变的病变厚度增加，管腔往往完全被阻塞。这些病变可转化为V型病变，不过它们更大和更加引起阻塞。
VII型病变是以更晚期病变的大片矿物化为特征的钙化病变。矿物化采取磷酸钙和磷灰石的形式，取代死细胞或胞外脂质的积累残余物。
VIII型病变是主要由多层胶原组成的纤维变性病变，含极少的脂质。VIII型病变可能是血栓的脂质消退或脂质病变大量转化成胶原的结果。这些病变可阻塞中等大小动脉的管腔。
如本文所述，胆甾醇臭氧解产物4a和5a可促进从巨噬细胞形成泡沫细胞，并可修饰低密度脂蛋白(LDL)和脱辅基蛋白质B100(LDL的蛋白质组分)的二级结构。在未活化鼠巨噬细胞存在下将LDL与4a或5a一起温育。这些巨噬细胞暴露于4a或5a后开始脂质负荷，泡沫细胞开始在反应容器中出现(参见图7)。此外，圆二色性检测发现(图8B、C)，人LDL(100μg/ml)与4a和5a(10μM)一起温育导致apoB-100结构的时间依赖性变化。如图8A所示，正常LDL的蛋白内含物有较大比例的α螺旋结构(～40±2％)和较少量的β结构(～13±3％)、β转角(～20±3％)和无规卷曲(27±2％)。但是，当LDL与4a和5a一起温育时，二级结构有相当大的损失。二级结构的损失主要是α螺旋结构的损失(4a～23±5％；5a～20±2％)。相应地，观察到更高百分比的无规卷曲(4a～39±2％；5a～32±4％)。因此，4a和5a胆甾醇臭氧解产物可直接导致某些与成问题的动脉粥样硬化有关的生理变化。
本发明因此提供诊断成问题的胆甾醇臭氧解产物是否存在于试样中的方法。在某些实施方案中，这种方法涉及确定试样是否可引起巨噬细胞摄取脂质方面的变化。如果试样与巨噬细胞一起温育后观察到脂质摄取增加，则试样含有胆甾醇臭氧解产物，获得试样的患者可能患有成问题的动脉粥样硬化。在另一个实施方案中，本发明提供通过检测试样是否可修饰LDL或脱辅基蛋白质B100的二级结构，来检测试样中的胆甾醇臭氧解产物的方法。可使用本领域技术人员可获得的方法，例如圆二色性或测热法，来监测或观察LDL或脱辅基蛋白质B100的二级结构。
生物样品中胆甾醇臭氧化产物的定量测量可用来诊断获得生物样品的动物中存在哪个动脉粥样硬化阶段和/或什么类型的病变。测试来自已知具有确切病变类型或确切动脉粥样硬化阶段的患者群体的生物样品，可将这些样品中胆甾醇臭氧化产物的量列成表格。这种表格为统计分析和使动脉粥样硬化阶段(或病变类型)与患者样品中胆甾醇臭氧化产物的量建立关联提供可能。可计算出各患者群体的胆甾醇臭氧化产物量的平均值和范围，从而对新患者样品中甾醇臭氧化产物量的了解可预测新患者中存在的动脉粥样硬化阶段。类似地，也可定量生物样品可造成巨噬细胞脂质负荷或造成低密度脂蛋白和/或脱辅基蛋白质B100的二级结构改变的程度，并可将其与动脉粥样硬化患者中存在的动脉粥样硬化阶段和/或病变类型建立关联。
可通过任何可获得的方法进行患者样品中胆甾醇臭氧化产物的量的定量测量。例如，可通过确定得自高压液相色谱(HPLC)、液相色谱质谱(LCMS)、可见光谱、紫外光谱、红外光谱、气相色谱、液相色谱或其他本领域技术人员可获得方法的读出峰下面积，来进行定量测量。在其他实施方案中，可用薄层层析斑点或电泳条带的大小或光密度来定量样品中胆甾醇臭氧化产物的量。湿法化学反应测定混合物、颜色反应或免疫测定(例如ELISA)的光密度也可用来定量样品中胆甾醇臭氧化产物的量。当暴露于试样时显示脂质负荷的巨噬细胞的百分率或数量也可用作试样中胆甾醇臭氧化产物的量的定量测量。类似地，当暴露于试样时LDL或脱辅基蛋白质B100二级结构的变化程度或百分率可用作试样中胆甾醇臭氧化产物的量的定量测量。
在另一个实施方案中，这种产物可通过免疫测定来检测。本发明提供能结合任何式3、4a-15a、4b-15b、3c、4c、7c或10c化合物的抗体和结合实体(binding entity)。本发明进一步涉及结构上与胆甾醇臭氧化产物及这种臭氧化产物的腙衍生物相关的半抗原。例如，本发明提供具有式3c、13a、13b、14a、14b、15a或15b的半抗原，其可用来产生可与胆甾醇臭氧化产物和腙产物反应的抗体

抗体和结合实体本发明提供针对胆甾醇臭氧化产物、半抗原和相关胆甾醇样分子的抗体制剂和结合实体，其可用于检测和鉴定胆甾醇臭氧化产物。例如，本发明的抗体或结合实体能够结合任一式3、4a-15a、4b-15b、3c、4c、7c或10c化合物。本文所用的术语结合实体包括抗体和其他能够结合胆甾醇臭氧化产物的多肽。
在一个实施方案中，抗体或结合实体可选择性地结合任一式3、4a-15a、4b-15b、3c、4c、7c或10c化合物。在另一个实施方案中，抗体或结合实体可结合不只一种式3、4a-15a、4b-15b、3c、4c、7c或10c化合物。抗体制剂的具体实例针对式13a、14a、13b、14b或15a化合物而产生。具体地说，杂交瘤KA1-11C5和KA1-7A6提供针对式15a化合物而产生的抗体制剂。杂交瘤KA2-8F6和KA2-1E9提供针对式14a化合物而产生的抗体制剂。
按照布达佩斯条约的条款，于2003年8月29日将针对式15a化合物而产生的杂交瘤KA1-11C5和KA1-7A6保藏于美国典型培养物保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，Va.，20110-2209 USA(ATCC))，ATCC保藏号为PTA-5427和PTA-5428。按照布达佩斯条约的条款，同样于2003年8月29日将针对式14a化合物而产生的杂交瘤KA2-8F6和KA2-1E9保藏于ATCC，ATCC保藏号为PTA-5429和PTA-5430。
本发明还提供通过现有的方法制备的可结合胆甾醇臭氧化产物的抗体。这种抗体的结合结构域，例如这些抗体的CDR区可转移到或与任何方便的结合实体骨架一起利用。
抗体分子属于称作免疫球蛋白的血浆蛋白家族，其基本构件——免疫球蛋白折叠或结构域在免疫系统和其他生物识别系统的许多分子中以多种形式被使用。标准的抗体是四聚体结构，由两条完全相同的免疫球蛋白重链和两条完全相同的轻链组成，分子量约为150,000道尔顿。
抗体的重链和轻链由不同的结构域组成。每条轻链具有一个可变区结构域(VL)和一个恒定区结构域(CL)，而每条重链具有一个可变区结构域(VH)和三个或四个恒定区结构域(CH)。参见例如Alzari，P.N.，Lascombe，M.-B.&Poljak，R.J.(1988)Three-dimensional structure ofantibodies.Annu.Rev.Immunol.6，555-580。由约110个氨基酸残基组成的各结构域折叠成特征性β夹层结构即免疫球蛋白折叠，所述β夹层结构由两个互相挤在一起的β折叠形成。VH和VL结构域各有三个互补决定区(CDR1-3)，其为环或转角，在结构域的一端连接β链。轻链和重链两者的可变区通常均对抗原特异性作出贡献，尽管各单独的链对特异性的贡献并不总是均等。抗体分子通过使用六个随机化环(CDR)，已进化成可结合大量的分子。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可归为不同的类别。至少有五(5)种主要的免疫球蛋白类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别中的几种可进一步细分成亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。对应于免疫球蛋白的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别的重链恒定区分别称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。根据其恒定区的氨基酸序列，抗体的轻链可归为两种截然不同的类型中的一种，所述两种类型称为kappa(κ)和lambda(λ)。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。
就抗体的可变区而言，术语“可变”指一种抗体与另一种抗体之间可变区结构域的某些部分在序列上有极大差异这个事实。可变区结构域是用来结合的，它决定各具体抗体对其具体抗原的特异性。但是，可变性并不在抗体可变区结构域当中均匀分布。相反，可变性集中在轻链可变区结构域和重链可变区结构域中的三个称为互补决定区(CDR，也称为高变区)的区段。
较高度保守的可变区结构域部分称为框架(FR)区。天然重链和轻链的可变区结构域各自包含四个主要采取β折叠构型的FR区，所述FR区由三个CDR连接，形成连接β折叠结构的环，在某些情况下构成β折叠结构的一部分。各链中的CDR通过FR区紧连在一起，与其他链的CDR一起对抗体的抗原结合位点的形成作出贡献。恒定区结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
因此，设想用于本发明的抗体可以是任何各种形式，包括完整免疫球蛋白，抗体片段如Fv、Fab和类似片段，包括可变区结构域互补决定区(CDR)的单链抗体，以及相似的形式，所有这些形式均落入本文所用的概括性术语“抗体”之内。本发明设想使用多克隆抗体或单克隆抗体的任何特异性，并不限于识别和与具体的胆甾醇臭氧化产物或其衍生物发生免疫反应的抗体。
此外，可将抗体的结合区或CDR置于任何合适结合实体多肽的骨架中。在优选的实施方案中，就本文所述的方法而言，使用对任何式3-15化合物及其半抗原和衍生物(包括腙衍生物)具有免疫特异性的抗体、结合实体或其片段。
术语“抗体片段”指全长抗体的部分，通常是抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段和Fv片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个完全相同的称作Fab片段的抗原结合片段(各片段具有单一抗原结合位点)及残余的Fc片段。Fab片段因此具有完整轻链和一条重链的一部分。用胃蛋白酶处理产生具有两个能够与抗原交联的抗原结合片段的F(ab′)2片段及称作pFc′片段的残余片段。胃蛋白酶消化的抗体被还原后，获得Fab′片段，其由完整轻链和重链的一部分组成。每个抗体分子可获得两个Fab′片段。Fab′片段与Fab片段不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加少数残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。
Fv是包含完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区由牢固非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。各可变区结构域的三个CDR正是以这种构型相互作用，来确立VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。但是，即使单个可变区结构域(或只包含三个对抗原有特异性的CDR的半个Fv)也有识别和结合抗原的能力，尽管比完整结合位点的亲和力要低。本文所用的涉及抗体的“功能片段”指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。
另外的片段可包括双抗体、线型抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。单链抗体是包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，通过合适的多肽连接体连接成基因工程融合单链分子。这种单链抗体也称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。通常，Fv多肽另外还包含VH结构域和VL结构域之间的、使sFv能够形成需要的抗原结合结构的多肽连接体。有关sFv的综述参见Pluckthun的ThePharmacology of Monoclonal Antibody，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，N.Y.，第269-315页(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段在同一多肽链上包含轻链可变区结构域(VL)连接的重链可变区结构域(VH)(VH-VL)。通过使用短得不能使同一链上的两个结构域发生配对的连接体，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，造成两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 906444-6448(1993)中有更充分的描述。
因此，本发明设想的抗体片段不是全长抗体。但是，相对于全长抗体，这种抗体片段可具有类似或改进的免疫学性质。这种抗体片段可小至约4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、9个氨基酸、约12个氨基酸、约15个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸或更多。
一般来说，相对于特异性结合胆甾醇臭氧化产物的抗体，本发明的抗体片段只要具有类似或改进的免疫学性质，可具有任何最高大小限制。例如，较小的结合实体和轻链抗体片段可具有不到约200个氨基酸、不到约175个氨基酸、不到约150个氨基酸或不到约120个氨基酸，如果所述抗体片段与轻链抗体亚单位相关。此外，较大的结合实体和重链抗体片段可具有不到约425个氨基酸、不到约400个氨基酸、不到约375个氨基酸、不到约350个氨基酸、不到约325个氨基酸或不到约300个氨基酸，如果所述抗体片段与重链抗体亚单位相关。
针对本发明的胆甾醇臭氧化产物的抗体可通过任何现有的方法来制备。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员可获得的。参见例如Green等，Production of Polyclonal Antisera，见ImmunochemicalProtocols(Manson编辑)，第1-5页(Humana Press)；Coligan等，Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats Mice and Hamsters，见Current Protocols in Immunology，2.4.1节(1992)，所述参考文献通过引用结合到本文中。
单克隆抗体也可应用于本发明。本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本均质性抗体群体获得的抗体。换句话说，除了在较少量的某些抗体中有偶然的天然突变之外，构成群体的单个抗体都是完全相同的。单克隆抗体是高度特异性的，可针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势还在于它们通过杂交瘤培养来合成，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示抗体从基本均质性抗体群体获得的特性，不能被解释为要求抗体通过任何具体方法来生产。
本文的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体，所述“嵌合”抗体中一部分重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列一致或同源，所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体的相应序列一致或同源。也可使用这种抗体的片段，只要它们显示所需的生物活性。参见美国专利第4,816,567号；Morrison等，Proc.Natl.Acad Sci.81，6851-55(1984)。
单克隆抗体的制备同样是常规的。参见例如Kohler & Milstein，Nature，256495(1975)；Coligan等，2.5.1-2.6.7节；和Harlow等，见AntibodiesA Laboratory Manual，第726页(Cold Spring Harbor Pub.(1988))，这些参考文献通过引用结合到本文中。可通过各种已确立的技术，从杂交瘤培养物分离和纯化单克隆抗体。这种分离技术包括蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。参见例如Coligan等，2.7.1-2.7.12节和2.9.1-2.9.3节；Barnes等，Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，见Methods in Molecular Biology，第10卷，第79-104页(Humana Press(1992)。
体外和体内操作抗体的方法是本领域技术人员可获得的。例如，按照本发明进行使用的单克隆抗体可通过上述杂交瘤方法来制备，或可通过如美国专利第4,816,567号中描述的重组方法来制备。也可使用在Clackson等，Nature 352624-628(1991)和Marks等，J.Mol Biol.222581-597(1991)中描述的技术，从噬菌体抗体文库分离用于本发明的单克隆抗体。
制备抗体片段的方法也是本领域公知的(参见例如Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，(1988)，其通过引用结合到本文中)。可通过抗体的蛋白酶解或通过在合适的宿主中表达编码抗体片段的核酸，来制备本发明的抗体片段。可通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体的常规方法，获得抗体片段。例如，可通过用胃蛋白酶对抗体进行酶解切割，提供称作F(ab′)2的5S片段，来生产抗体片段。可使用硫醇还原剂和任选使用由裂解二硫键获得的巯基的封闭基团，进一步切割此片段，产生3.5S Fab′单价片段。或者，用胃蛋白酶进行酶解切割直接产生两个单价Fab′片段和一个Fc片段。这些方法在例如美国专利第4,036,945号和4,331,647号及其中包含的参考文献中有描述。这些专利通过引用整体结合到本文中。
也可使用其他抗体切割方法，如分离重链以形成单价轻-重链片段，片段的进一步切割，或者其他酶学、化学或遗传学技术，只要片段结合被完整抗体识别的抗原。例如，Fv片段包含VH链和VL链的缔合。这种缔合可以是非共价的，或者可变链可通过分子间二硫键连接或通过化学试剂如戊二醛交联。优选Fv片段包含通过肽连接体连接的VH链和VL链。通过构建由寡核苷酸连接的包含编码VH结构域和VL结构域的DNA序列的结构基因，来制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)。将结构基因插入表达载体中，后者随后引入到宿主细胞如大肠杆菌。重组宿主细胞合成单一多肽链，其中的连接体肽桥接两个V结构域。生产sFv的方法由例如Whitlow等，Methodsa Companion to Methods inEnzymology，第2卷，第97页(1991)；Bird等，Science 242423-426(1988)；Ladner等，美国专利第4,946,778号；和Pack等，Bio/Technology111271-77(1993)描述。
另一种形式的抗体片段是编码(coding for)单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)经常参与抗原识别和结合。可通过克隆或构建编码目的抗体CDR的基因，获得CDR肽。这种基因例如通过使用聚合酶链式反应从抗体生产细胞的RNA合成可变区来制备。参见例如Larrick等，Methodsa Companion to Methods inEnzvmology，第2卷，第106页(1991)。
本发明设想人形式和人源化形式的非人(例如鼠)抗体。这种人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力和容量的CDR残基置换。
在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含既不见于受者抗体也不见于引入的CDR或框架序列的残基。造成这些修饰是进一步改进和最优化抗体性能。一般来说，人源化抗体基本包含至少一种、通常两种可变区结构域的全部，其中全部或基本全部的CDR区与非人免疫球蛋白的对应，且全部或基本全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的。人源化抗体最好还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是一部分人免疫球蛋白恒定区。更多的细节参见Jones等，Nature 321，522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332，323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2，593-596(1992)；Holmes等，J.Immunol.，1582192-2201(1997)和Vaswani等，Annals Allergy，Asthma & Immunol.，81105-115(1998)。
虽然可获得标准化的方法来产生抗体，但抗体的大小、抗体的多链结构和抗体中存在的六个结合环的复杂性构成了改进和生产大量抗体的障碍。因此，本发明进一步设想使用结合实体，其包含可识别和结合胆甾醇臭氧化产物的多肽。
许多蛋白质可充当蛋白质支架，胆甾醇臭氧化产物的结合结构域可连接在其上，从而形成合适的结合实体。结合结构域与本发明的胆甾醇臭氧化产物结合或相互作用，而蛋白质支架仅仅支持和稳定结合结构域，以便它们能够进行结合。有各种蛋白质支架可以使用。例如，可使用噬菌体衣壳蛋白。参见Clackson & Wells，Trends Biotechnol.12173-184(1994)中的综述。噬菌体衣壳蛋白已被用作展示随机肽序列的支架，包括牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(Roberts等，PNAS 892429-2433(1992))、人生长激素(Lowman等，Biochemistry 3010832-10838(1991)，Venturini等，Protein Peptide Letters 170-75(1994))和链球菌的IgG结合结构域(O′Neil等，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb，L编辑)第517-524页，Academic Press，San Diego(1994))。这些支架已展示可被修饰以包括胆甾醇臭氧化产物的结合结构域的单一随机化环或区。
研究者也已使用小的74个氨基酸的α淀粉酶抑制剂——淀粉酶抑肽(Tendamistat)作为丝状噬菌体M13上的呈递支架。McConnell，S.J.，&Hoess，R.H.，J.Mol.Biol.250460-470(1995)。淀粉酶抑肽是来自轮枝链霉菌(Streptomyces tendae)的β折叠蛋白质。它具有的多种特征使其成为引人注意的多肽结合支架，包括小尺寸、稳定性和可获得高分辨率NMR和X射线结构数据。淀粉酶抑肽的总体拓扑结构与免疫球蛋白的结构域相似，两个β折叠通过一系列的环连接。与免疫球蛋白结构域形成对比的是，淀粉酶抑肽的β折叠通过两个而不是一个二硫键结合在一起，这是这种蛋白质稳定性相当大的原因。淀粉酶抑肽的环可起到类似于见于免疫球蛋白的CDR环的功能，且可容易通过体外诱变而被随机化。淀粉酶抑肽源自轮枝链霉菌，在人类中可有抗原性。因此，采用淀粉酶抑肽的结合实体优选在体外应用。
纤连蛋白III型结构域也已被用作可连接结合实体的蛋白质支架。纤连蛋白III型是免疫球蛋白超家族的大亚家族(Fn3家族或s-型Ig家族)的一部分。将这种纤连蛋白III型结构域用作结合实体(如CDR肽)的蛋白质支架的序列、载体和克隆方法在例如美国专利申请公开20020019517中提供。另参见Bork，P.& Doolittle，R.F.(1992)Proposedacquisition of an animal protein domain by bacteria.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，8990-8994；Jones，E.Y.(1993)The immunoglobulin superfamilyCurr.Opinion Struct.Biol.3，846-852；Bork，P.，Hom，L.& Sander，C.(1994)The immunoglobulin fold.Structural classification，sequencepatterns and common core.J.Mol.Biol.242，309-320；Campbell，I.D.&Spitzfaden，C.(1994)Building proteins with fibronectin type III modulesStructure 2，233-337；Harpez，Y.& Chothia，C.(1994)。
在免疫系统中，从大文库选择和扩增特异性抗体(亲和力成熟)。可通过结合实体的组合文库的诱变和产生，来模拟免疫细胞使用的组合技术。因此，变异的结合实体、抗体片段和抗体也可通过展示类型的技术来产生。这种展示类型的技术包括例如噬菌体展示、反转录病毒展示、核糖体展示和其他技术。可使用本领域可获得的技术来产生结合实体的文库和筛选这些文库，选出的结合实体可进行另外的成熟过程，如亲和力成熟。Wright和Harris，出处同上，Hanes和PlucthauPNAS USA 944937-4942(1997)(核糖体展示)，Parmley和Smith Gene73305-318(1988)(噬菌体展示)，Scott TIBS 17241-245(1992)，Cwirla等，PNAS USA 876378-6382(1990)，Russel等，Nucl.Acids Research211081-1085(1993)，Hoganboom等，Immunol.Reviews 13043-68(1992)，Chiswell和McCafferty TIBTECH 1080-84(1992)，和美国专利第5,733,743号。
本发明因此还提供使抗体、CDR或结合结构域突变，以最优化它们的亲和力、选择性、结合强度和/或其他需要性质的方法。突变结合结构域指选定的结合结构域(例如CDR)的氨基酸序列变异体。一般来说，突变结合结构域中的一个或多个氨基酸残基与参考结合结构域中存在的不同。这种突变抗体与参考氨基酸序列的序列一致性或相似性必然是不到100％。一般来说，突变结合结构域与参考结合结构域的氨基酸序列有至少75％的氨基酸序列一致性或相似性。优选突变结合结构域与参考结合结构域的氨基酸序列有至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％的氨基酸序列一致性或相似性。
例如，使用噬菌体展示的亲和力成熟可用作产生突变结合结构域的一种方法。使用噬菌体展示的亲和力成熟指在Lowman等，Biochemistry 30(45)10832-10838(1991)中描述的过程，另参见Hawkins等，J.Mol Biol.254889-896(1992)。虽然不严格局限于以下描述，但该过程可简要描述为涉及几个结合结构域或抗体超变区在多个不同位点的突变，目的是在每个位点产生所有可能的氨基酸置换。这样产生的结合结构域突变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示为融合蛋白。通常对M13的基因III产物造成融合。表达不同突变体的噬菌体可循环几轮，以选择目的特性，例如结合亲和力或选择性。分离目的突变体并测序。这种方法更详细地描述于美国专利第5,750,373号、美国专利第6,290,957号和Cunningham，B.C.等，EMBO J.13(11)，2508-2515(1994)中。
因此，在一个实施方案中，本发明提供操纵结合实体或抗体多肽或编码它们的核酸，以产生具有改进的识别胆甾醇臭氧化产物的结合性质的结合实体、抗体和抗体片段的方法。
这种使现有的结合实体或抗体的部分突变的方法涉及将胆甾醇臭氧化产物结合结构域的编码多肽的编码核酸融合到噬菌体外被蛋白的编码核酸以产生编码融合蛋白的重组核酸，使编码融合蛋白的重组核酸突变以产生编码突变融合蛋白的突变核酸，在噬菌体的表面上表达突变融合蛋白，及选择结合胆甾醇臭氧化产物的噬菌体。
因此，本发明提供可识别和结合胆甾醇臭氧化产物、半抗原或胆甾醇衍生物的抗体、抗体片段和结合实体多肽。本发明进一步提供操纵这些抗体、抗体片段和结合实体多肽，以最优化它们的结合性质或其他需要性质(例如稳定性、大小、容易使用)的方法。
可修饰这种抗体、抗体片段和结合实体多肽，以包括可用于检测抗体存在的标记或报告分子。本文所用的标记或报告分子是可与抗体直接或间接相连并直接或间接导致可测量、可检测信号的任何分子。许多这种可掺入或偶联到抗体或结合实体的标记是本领域技术人员可获得的。适合与本发明的抗体或结合实体一起使用的标记的实例包括放射性同位素、荧光分子、磷光分子、酶、第二抗体和配体。
合适的荧光标记的实例包括荧光素(FITC)、5，6-羧甲基荧光素、德克萨斯红、硝基苯-2--1，3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、罗丹明、4′-6-联脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。在某些实施方案中，荧光标记是荧光素(5-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或罗丹明(5，6-四甲基罗丹明)。用于某些实施方案的组合多色(combinatorial multicolor)的荧光标记包括FITC和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。这些荧光剂的最大吸收和最大发射分别是FITC(490nm；520nm)、Cy3(554nm；568nm)、Cy3.5(581nm；588nm)、Cy5(652nm；672nm)、Cy5.5(682nm；703nm)和Cy7(755nm；778nm)，这样使得它们可以同时进行检测。这种荧光标记可从多种商业来源获得，包括Molecular Probes，Eugene，OR和Research Organics，Cleveland，Ohio。
掺入到抗体或结合实体中的检测标记如生物素随后可用本领域可获得的灵敏方法来检测。例如，生物素可如下检测使用结合生物素的链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物(Tropix.，Inc.)，随后可通过合适底物(例如化学发光底物CSPD3-(4-甲氧基螺-[1，2，-二氧杂环丁烷-3-2′-(5′-氯)三环[3.3.1.1.sup.3，7]癸烷]-4-基)苯基磷酸二钠；Tropix，Inc.)的化学发光进行检测。
在本发明中也可使用结合两个或更多个的这些报告分子或检测标记的分子。任何已知的检测标记都可以与公开的抗体、抗体片段、结合实体和方法一起使用。由检测标记产生的信号的检测和测量方法也是本领域技术人员可获得的。例如，放射性同位素可通过闪烁计数或直接显色(visualization)来检测；荧光分子可用荧光分光光度计来检测；磷光分子可用扫描仪或分光光度计来检测，或直接用照相机显现；酶可通过酶催化反应的产物的显色来检测。这种方法可直接用于公开的甾醇臭氧化产物检测方法中。
胆甾醇臭氧化产物的测定本领域技术人员可获得的任何测定法可用于检测胆甾醇臭氧化产物，包括用以检测指示胆甾醇臭氧化的胆甾醇半抗原或胆甾醇衍生物的测定法。例如，所述测试法可采用质谱、气相色谱或液相色谱、核磁共振、红外光谱、紫外光谱、可见光谱或高压液相色谱。在某些实施方案中，可使用免疫测定来检测任何式3、4a-15a、3c、4c、7c、10c或4b-15b化合物。
测定法可用以检测从多种来源获得的试样中的胆甾醇臭氧化产物，所述试样包括例如来自哺乳动物的血清、血浆、血液、淋巴液、组织(例如斑块样品)、唾液、尿液、大便和其他生物样品。在某些实施方案中，试样是组织样品。但是，在其他实施方案中，试样是体液如尿液、血液或血清。对这种来自哺乳动物对象的样品的测定使得可以对血管疾病进行非侵入性诊断。例如，可从哺乳动物对象采集液体，并将胆甾醇臭氧化产物作为样品液体中释放的因子或细胞上的细胞膜束缚因子进行测定。
在某些实施方案中，采用免疫测定。这种免疫测定可涉及本领域技术人员可获得的任何测定方法。免疫测定的实例包括放射免疫测定、竞争性结合测定、夹心测定和免疫沉淀测定。可将本发明的结合实体结合或连接到本文所述的可检测标记。取决于应用情况，所用标记的选择会有所不同，可由本领域技术人员来进行选择。
在本发明的实施中，可检测标记可以是酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶、顺磁性离子、顺磁性离子的螯合物、生物素、荧光团、生色团、重金属、重金属的螯合物、X光不能穿透的化合物或元素、放射性同位素或者放射性同位素的螯合物。
可用作可检测标记的放射性同位素包括如下同位素碘-123、碘-125、碘-128、碘-131，或者铬-51、钴-57、镓-67、铟-111、铟-113m、汞-197、硒-75、铊-201、锝-99m、铅-203、锶-85、锶-87、镓-68、钐-153、铕-157、镱-169、锌-62或铼-188的螯合金属离子。
用作可检测标记的顺磁性离子包括如下离子铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)或镱(III)。
放射免疫测定通常将放射性用于结合实体(例如抗体)和胆甾醇臭氧化产物之间的复合物的测量。在这种方法中，结合实体是放射性标记的。使结合实体与未标记的胆甾醇臭氧化产物反应。然后例如通过沉淀后离心，从未结合材料分离放射性标记的复合物。一旦放射性标记的结合实体和胆甾醇臭氧化产物之间的复合物与未结合材料分离，可通过直接测量辐射或通过观察放射性标记对荧光分子如二苯基唑(DPO)的作用，来定量复合物的量。后一方法要求较少的放射性，且更加灵敏。这种称作闪烁法的方法测量被放射性标记如3H或32P激发的染料溶液的荧光发射。通过测量从荧光颗粒释放的荧光的强度，确定结合的程度。这种称作闪烁亲近测定法(SPA)的方法的优点是能够测量原位形成的结合实体复合物，无需洗去未结合的放射性结合实体。
竞争性结合测定依赖于标记标准品与试样分析物竞争结合有限量的结合实体的能力。标记标准品可以是胆甾醇臭氧化产物或免疫反应性半抗原或其衍生物。试样的量与结合到结合实体的标准品的量成反比。为有利于测定发生结合的标准品的量，通常在竞争之前或之后造成所采用的结合实体不溶。这样做是为了使结合到结合实体的标准品和分析物可方便地与保持未结合的标准品和分析物分离。
夹心测定涉及使用两种结合实体，每种结合实体各自能够结合待检测产物的不同免疫原性部分或表位。在夹心测定中，试样分析物被固定化于固体载体上的第一结合实体结合，然后第二结合实体结合所述分析物，从而形成不可溶的三部分复合体(David & Greene，美国专利第4,376,110号)。第二结合实体本身可用可检测部分标记(直接夹心测定)，或者可用结合第二结合实体并被可检测部分标记的第三结合实体来检测(间接夹心测定)。例如，一种类型的夹心测定是ELISA测定，在这种情况下可检测部分是酶。
通常，夹心测定包括“正向”测定，其中结合到固相的结合实体首先与受试样品接触，以通过在固定化结合实体和胆甾醇臭氧化产物之间形成二元固相复合体，从样品抽提胆甾醇臭氧化产物。在一段合适的温育时间后，洗涤固体载体，除去未结合的液体样品，包括未反应的胆甾醇臭氧化产物(如有)。然后使固体载体与含未知量的标记结合实体(起到标记或报告分子的作用)的溶液相接触。进行第二次温育，以使标记结合实体与固定化结合实体和胆甾醇臭氧化产物之间的复合物反应之后，再次洗涤固体载体，除去未反应的标记结合实体。这种类型的正向夹心测定可以是简单的“是/否”测定，以确定试样中是否存在胆甾醇臭氧化产物。
可以使用的其他类型夹心测定包括所谓的“同时”测定和“反向”测定。同时测定涉及单个温育步骤，其中标记的和未标记的结合实体两者同时暴露于受试样品。未标记的结合实体固定化于固体载体上，而标记的结合实体游离在含试样的溶液中。温育结束之后，洗涤固体载体，以除去未反应的样品和未络合的标记结合实体。然后象常规的“正向”夹心测定那样，确定与固体载体结合的标记结合实体的存在。
在“反向”测定中，采用逐步添加法，首先将标记结合实体的溶液添加到试样中，接着进行温育，然后再添加结合到固体载体上的未标记结合实体。第二次温育后，按常规方式洗涤固相，除去受试样品残余物和未反应的标记结合实体的溶液。然后如“同时”测定和“正向”测定那样，测定与固体载体结合的标记结合实体。
除了它们的诊断效用之外，本发明的结合实体还可用于通过检查组织、细胞或血清样品中胆甾醇臭氧化产物不同时间的水平，来监测对象中血管疾病的发展。胆甾醇臭氧化产物水平随时间的变化可表明对象中血管疾病或心脏疾病的进一步发展。
血管疾病通过本发明诊断的血管疾病是哺乳动物血管疾病。词语哺乳动物指任何哺乳动物。哺乳动物的某些实例包括宠物动物如狗和猫；畜牧动物如猪、牛、绵羊和山羊；实验室动物如小鼠和大鼠；灵长类动物如猴、猿和黑猩猩；及人类。在某些实施方案中，优选通过本发明的方法来诊断人类。
本发明涉及检测或诊断涉及胆甾醇沉积和胆甾醇臭氧化的血管病症或循环病症的方法。这种病症可由解剖学部位或系统中的脉管系统的损失、伤害或破坏引起。术语“血管病症”或“血管疾病”指其中血液流动受损或可受损的血管组织状态。
许多病理学状况可导致由胆甾醇沉积引起的血管疾病。可用本发明的组合物和方法检测或诊断的血管病症的实例包括动脉粥样硬化(或动脉硬化)、惊厥前期、外周血管疾病、心脏病和中风。因此，本发明涉及治疗例如如下疾病的方法中风、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征(包括非稳定心绞痛、血栓形成和心肌梗塞)、斑块破裂、冠状动脉或外周动脉中原发性和继发性(支架内)再狭窄、移植引起的硬化、四肢疾病(peripheral limb disease)、间歇性跛行和糖尿病并发症(包括局部缺血性心脏病、外周动脉疾病、充血性心力衰竭、视网膜病、神经病和肾病)或血栓形成。
试剂盒本发明还包括用于检测试样中的胆甾醇臭氧化产物的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包括包含特异性结合胆甾醇臭氧化产物的结合实体或抗体的容器。所述结合实体或抗体可具有直接连接或间接结合的检测标记或报告分子。结合实体或抗体也可以液体形式提供，或者它可以连接到固相，例如用于任何便利的免疫测定方法的需要。
本发明的试剂盒也可包括另一容器，所述容器包含胆甾醇臭氧化产物，其可例如在胆甾醇臭氧化产物的测定中用作对照或标准品。
本发明的试剂盒还可包括另一个容器，所述容器包含可与胆甾醇反应以产生可容易地通过本发明任何结合实体或抗体来检测的试剂。
本发明的试剂盒也可包括第三个容器，所述容器包含检测标记或报告分子，用于检测结合实体、抗体或结合实体/抗体与胆甾醇臭氧化产物之间的复合物。
这些试剂盒也可包括装有用于收集试样(如血液、血浆、血清、尿液、唾液和大便)的工具的容器。这种工具包括用以收集和稳定血液的采血针、试管和吸水纸或布；用以收集和稳定唾液的拭子；用以收集和稳定尿液或大便样品的杯子。可任选处理收集材料如试管、纸、布、拭子、杯子等，以避免样品的变性或不可逆吸附。这些收集材料也可用防腐剂、稳定剂或抗微生物剂处理或包含它们，以帮助保持标本的完整性。
本发明进一步通过以下非限制性实施例进行说明。
实施例1材料和方法本实施例提供用于本文所述的某些实验的材料和方法。
动脉粥样硬化的动脉标本的手术分离和处理。通过颈动脉的动脉内膜切除术获得组织样品。所述样品含有动脉粥样硬化斑块和一些粘附的血管内膜和中膜。斑块分析的方案由Scripps Clinic Human SubjectsCommittee批准，外科手术前要得到患者的同意。通过颈动脉的动脉内膜切除术手术切除的新鲜组织在30分钟内进行分析。注意，斑块样品既不进行储存也不进行防腐处理。所有的分析操作都在手术切除后2小时内完成。标本中没有加入固定液。
动脉粥样硬化的人动脉标本对靛蓝胭脂红1的氧化。如上所述分离的动脉内膜切除术标本(n＝15)分成湿重近似相等(±5％)的两部分。将各标本置于含靛蓝胭脂红1(200μM，Aldrich)和牛过氧化氢酶(100μg)的磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4，1.8mL)中。加入靛蓝胭脂红1充当臭氧的化学阱(chemical trap)。Takeuchi等，Anal.Chim.Acta 230，183(1990)；Takeuchi等，Anal.Chem.61，619(1989)。加入十四烷酸佛波醇酯(PMA，40μg于0.2mL DMSO中)或DMSO(0.2mL)作为蛋白激酶C的激活物。用组织均质机均质各样品10分钟，然后离心(10,000rpm 10分钟)。倾析上清液，通过过滤器(0.2μm)，用定量HPLC分析滤液中靛红磺酸2的存在。
如图1B所示，靛蓝胭脂红1的可见吸光度被漂白，反应产生可用定量HPLC检测(表1)并被鉴定为靛红磺酸2(另参见图1A)的新化学物质。
定量靛红磺酸2的HPLC测定。在带L-7200自动进样器、L-7100泵和L-7400紫外检测器(254nm)的Hitachi D-7000仪上进行HPLC分析。所述L-7100用Dell GX150个人计算机上的Hitachi-HSM软件来控制。LC条件为Spherisorb RP-C18柱和乙腈∶水(0.1％TFA)(80∶20)流动相1.2mL/分钟。靛红磺酸2的保留时间RT为约9.4分钟。通过使用Macintosh上的GraphPad v3.0软件，将峰面积与峰面积对真实样品浓度的标准曲线相比较，进行定量(表1)。
表1由活化的动脉粥样硬化动脉物质形成的靛红磺酸2(ISA)。
平均值±平均标准误差＝72.62±21.69在H218O中动脉粥样硬化的人动脉标本对靛蓝胭脂红1的氧化。此实验按以上靛蓝胭脂红测定所述进行，但有以下例外。第一，将各斑块样品(n＝2)加入到于95％以上H218O中的磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.4)中。第二，滤液在PD10柱上脱盐，在Finnegan电喷射质谱仪上通过负离子电喷射质谱分析。原始的离子丰度数据摘录成Graphpad Prism(3.0版本)格式，以供显示。
这些实验表明，在斑块材料和H218O(＞95％18O)存在下，18O同位素掺入到靛红磺酸2的内酰胺羰基中。因为只有臭氧能够氧化裂解靛蓝胭脂红1的双键，促进来自H218O的同位素掺入到靛红磺酸2的内酰胺羰基中，臭氧很可能是氧化靛蓝胭脂红1的活性氧物质。因此，在动脉粥样硬化病变中产生臭氧。另参见P.Wentworth Jr.等，Science298，2195(2002)；B.M.Babior，C.Takeuchi，J.Ruedi，A.Guitierrez，P.Wentworth Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3920(2003)；P.Wentworth Jr等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，1490(2003)。
来自动脉粥样化动脉标本的醛的抽提和衍生化方法。如上所述分离的动脉内膜切除术标本分成湿重近似相等(±5％)的两部分。将各标本置于含牛过氧化氢酶(100μg)和十四烷酸佛波醇酯(40μg于0.2mLDMSO中)或DMSO(0.2mL)的磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4，1.8mL)中。用组织均质机均质各样品10分钟。动脉内膜切除术样品均质后，如上分离，然后用二氯甲烷(DCM，3×5mL)洗涤。真空蒸发合并的有机部分。残余物溶于乙醇(0.9mL)中，并加入2，4-二硝基苯肼(100μL，2mM，和1N HCl)的乙醇溶液。向溶液中吹入氮气5分钟，然后搅拌溶液2小时。将所得悬浮液滤过0.22μm过滤器，滤液通过HPLC测定进行分析(见下文)。当胆甾醇3(1-20μM)在这些条件下处理时，没有形成4a或5a。将添加PMA前后在动脉粥样化动脉抽提物中检出的4b的量进行Student双侧t测验分析，以确定PMA添加对动脉抽提物中4a水平的显著性(p＜0.05认为显著)，并用Macintosh上的Graphpad v3.0软件测定所述量。
4a在这些条件下衍生化的过程中，在4a的浓度范围(5-100μM)内，约有20％的4a转化成5b。这些数据表明，测定量的5a(超过相同斑块样品中存在的4a的20％)是由3臭氧解后醛醇化而产生的。在所采用的衍生化条件下4a转化成6b的程度在4a的浓度范围(5-100μM)内始终＜2％。这些观察结果表明，斑抽提物中存在的6a量超过酮醛4a量的2％，在衍生化之前就存在，是通过水的β消除从臭氧解产物4a产生的。
除了三种主要的腙产物4b-6b之外，在几个斑块抽提物中还检出痕量(＜5pmol/mg)的7a腙衍生物(称作7b)(RT～26分钟，[M-H]-579，SOM图2&4)。化合物7a是5a的A环脱水产物。衍生化的斑块抽提物中7b的量接近所采用的HPLC测定的检出限，因此没有在所有的斑块样品中进行此化合物的完全分析研究。化合物7a和7b的构型排布基于合成物质7b的1H-1H ROESY实验。
利用化合物6b、7a、7b、8a和9a的合成制品来鉴定图4中具有RT～26分钟的峰[M-H]-579的化合物。
腙的HPLC-MS分析。在带L-7200自动进样器(正常注射体积10μl)、L-7100泵、L-7400紫外检测器(360nm)或L-7455二极管阵列检测器(200-400nm)和线内M-8000离子阱质谱仪(以负离子方式)的HitachiD-7000仪上进行HPLC-MS分析。所述L-7100和M-8000用Dell GX150个人计算机上的Hitachi-HSM软件来控制。使用Vydec C18反相柱进行HPLC。采用0.5mL/分钟等度流动相(75％乙腈，20％甲醇和5％水)。用Hitachi D7000色谱工作站软件测定峰高和峰面积，通过与真实物质的标准曲线比较转化为浓度。在这些条件下，腙4b-6b的检出限在1-10nM之间。使用这种HPLC系统，没有获得顺式和反式腙异构体的拆分。
抽提出并衍生化的动脉粥样硬化物质的代表性HPLC-MS在图4中显示。几种关键腙化合物的真实样品的保留时间和质量比例在表2中显示。
表2真实腙的LCMS分析
a真实醛8a的腙通过上述衍生化方法制备，醛8a不单独合成和纯化。b市售酮9a的腙通过上述衍生化方法制备，不单独合成和纯化。c真实醛10a的腙通过上述衍生化方法制备，不单独合成和纯化。d8b和9b之间的辨别基于它们的紫外光谱来作出[通过Hitachi L-7455二极管阵列检测器(200-400nm)测量]。α，β-不饱和腙8b的λmax为435nm，而腙9b的λmax为416nm。
血浆样品中醛4a和5a的分析。从按计划在24小时内进行颈动脉的动脉内膜切除术的患者(n＝8)获得血浆样品。样品收集后3天分析所有这种血浆样品中4a和5a的存在。从普通医学诊所的随机患者(n＝15)获得对照血浆样品，并在收集后7天进行分析。在典型的方法中，用二氯甲烷(DCM，3×1mL)洗涤EDTA(1ml)中的血浆。真空蒸发合并的有机部分。残余物溶于甲醇(0.9mL)中，并加入2，4-二硝基苯肼(100μL，0.01M，Lancaster)和1N HCl的乙醇溶液。向溶液中吹入氮气5分钟，然后搅拌溶液2小时。将所得悬浮液滤过0.22μm过滤器，滤液通过HPLC测定进行分析(见上文)。初步研究揭示，可从血浆抽提的5a的量每天下降约5％。
真实样品4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a、7b、8a和8b的制备一般方法。除非另有指定，所有反应均在存在干燥剂、溶剂和火焰干燥的玻璃器具的惰性气氛中进行。所有原料均购自Aldrich、Sigma、Fisher或Lancaster，并按获得时原样使用。酮9a获自Aldrich。所有快速柱色谱均使用硅胶60(230-400目)来进行。制备型薄层层析(TLC)使用Merck(0.25、0.5或1mm)涂铺硅胶Kieselgel 60 F254板来进行。1H NMR谱在Bruker AMX-600(600MHz)、AMX-500(500MHz)、AMX-400(400MHz)或AC-250(250MHz)波谱计上记录。13C NMR谱在Bruker AMX-500(125.7MHz)或AMX-400(100.6MHz)波谱计上记录。化学位移以相对于内标的百万分之一(ppm)以δ标度来报告。高分辨率质谱在VG ZAB-VSE仪器上记录。
3β-羟基-5-氧代-5，6-断胆甾烷-6-醛(4a)。此化合物按K.Wang，E.Bermudez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)中的一般描述进行合成。在干冰温度下，使胆甾醇3(1g，2.6mmol)的氯仿-甲醇(9∶1)(100ml)溶液臭氧化10分钟。蒸发反应混合物，在室温下用Zn粉(650mg，10mmol，于水-乙酸(1∶9，50ml)中)搅拌3小时。用二氯甲烷(100ml)稀释被还原的混合物，并用水(3×50ml)洗涤。合并的有机级分用硫酸钠干燥，真空蒸发至干。残余物用硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(25∶75)]纯化，得到标题化合物4a，为白色固体(820mg，76％)
1H NMR(CDCl3)δ9.533(s，1H，CHO)，4.388(m，1H，H-3)，3.000(dd，J＝14.0，4.0Hz，1H，H-4e)，0.927(s，3H，CH3-19)，0.827(d，J＝6.8Hz，3H，CH3-21)，0.782(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.778(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.603(s，3H，CH3-18)；13C NMR(CDCl3)δ217.90(C-5)，202.76(C-6)，70.81(C-3)，55.96(C-17)，54.26(C-14)，52.52(C-10)，46.70(C-4)，44.17(C-7)，42.43(C-13)，42.17(C-9)，39.75(C-12)，39.33(C-24)，35.85(C-22)，35.61(C-20)，34.58(C-8)，33.99(C-1)，27.87(C-25)，27.73(C-16)，27.52(C-2)，25.22(C-15)，23.62(C-23)，22.91(C-11)，22.70(C-27)，22.44(C-26)，18.44(C-21)，17.46(C-19)，11.42(C-18).
C27H46O3Na(M+Na)+HRMALDITOFMS计算值441.3339，实测值441.3355。
3β-羟基-5-氧代-5，6-断胆甾烷-6-醛的2，4-二硝基苯腙(4b)。此化合物按K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)中的一般描述进行合成。将2，4-二硝基苯肼(52mg，0.26mmol)和对甲苯磺酸(1mg，0.0052mmol)加入到酮醛4a(100mg，0.24mmol)的乙腈(10ml)溶液。在室温下搅拌反应混合物4小时，真空蒸发至干。残余物溶于乙酸乙酯(10ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机部分用硫酸钠干燥，真空蒸发至干。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化，得到标题化合物4b，为黄色固体(100mg，70％)，是顺式和反式异构体(1∶4)的混合物。从己烷-二氯甲烷结晶得到反式4b，为黄色针状物(30mg，21％)
1H NMR(CDCl3)δ10.994(s，1H，NH)，9.107(d，J＝2.8Hz，1H，H-3′)，8.316(dd，J＝9.6，2.8Hz，1H，H-5′)，7.923(d，J＝9.6Hz，1H，H-6′)，7.419(dd，J＝6.0，3.6Hz，1H，H-6)，4.417(m，1H，H-3)，2.971(dd，J＝13.6，4.0Hz，1H，H-4e)，1.076(s，3H，CH3-19)，0.915(d，J＝6.4Hz，3H，CH3-21)，0.853(d，J＝6.4Hz，3H，CH3)，0.849(d，J＝6.4Hz，3H，CH3)，0.710(s，3H，CH3-18)；13C NMR(CDCl3)δ216.05(C-5)，150.84(C-6)，144.96(C-1′)，137.87(C-4′)，130.23(C-5′)，128.90(C-2′)，123.50(C-3′)，116.52(C-6′)，71.42(C-3)，56.07(C-17)，54.54(C-14)，52.69(C-10)，47.34(C-4)，42.61(C-13)，42.61(C-9)，39.82(C-12)，39.42(C-24)，36.99(C-8)，35.96(C-22)，35.67(C-20)，34.13(C-1)，32.65(C-7)，27.98(C-16)，27.93(C-25)，27.90(C-2)，25.31(C-15)，23.70(C-23)，23.12(C-11)，22.78(C-27)，22.52(C-26)，18.56(C-21)，17.77(C-19)，11.67(C-18)；C33H50N4O6Na(M+Na)HRMALDITOFMS计算值621.3622，实测值621.3622λmax360nm，ε2.57±0.31×104M-1cm-1。
3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛(5a)。此化合物按T.Miyamoto，K.Kodama，Y.Aramaki，R.Higuchi，R.W.M.Van Soest，Tetrahedron Letter 42，6349(2001)中的一般描述进行合成。向酮醛4a(800mg，1.9mmol)的乙腈-水(20∶1，100ml)溶液加入L-脯氨酸(220mg，1.9mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时，真空蒸发至干。残余物溶于乙酸乙酯(50ml)并用水(3×50ml)洗涤。合并的有机级分用硫酸钠干燥，真空蒸发。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化，得到标题化合物5a，为白色固体(580mg，73％)1H NMR(CDCl3)δ9.689(d，J＝2.8Hz，1H，CHO)，4.115(m，1H，H-3)，3.565(s，1H，3β-OH)，2.495(broad s，1H，5β-OH)，2.234(dd，J＝9.2，3.2Hz，1H，H-6)，0.920(s，3H，CH3-19)，0.904(d，J＝6.4Hz，3H，CH3-21)，0.854(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.850(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.705(s，3H，CH3-18)；13C NMR(CDCl3)δ204.74(C-7)，84.26(C-5)，67.33(C-3)，63.89(C-9)，56.10(C-14)，55.67(C-17)，50.42(C-6)，45.47(C-10)，44.72(C-13)，44.22(C-4)，40.02(C-8)，39.67(C-12)，39.44(C-24)，36.15(C-22)，35.58(C-20)，28.30(C-16)，27.98(C-2)，27.91(C-25)，26.69(C-1)，24.55(C-15)，23.78(C-23)，22.78(C-27)，22.52(C-26)，21.54(C-11)，18.71(C-21)，18.43(C-19)，12.48(C-18).
C27H46O3Na(M+Na)+HRMALDITOFMS计算值441.3339，实测值441.3351。
3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛的2，4-二硝基苯腙(5b)。此化合物按K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)中的一般描述进行合成。将2，4-二硝基苯肼(52mg，0.26mmol)和盐酸(12M，2滴)加入到醛5a(100mg，0.24mmol)的乙腈(10ml)溶液。在室温下搅拌反应混合物4小时，真空蒸发至干。残余物溶于乙酸乙酯(10ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机部分用硫酸钠干燥，真空蒸发至干。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化，得到标题化合物5b黄色固体(90mg，62％)，为反式5b苯腙1H NMR(CDCl3)11.049(s，1H，NH)，9.108(d，J＝2.4Hz，1H，H-3′)，8.280(dd，J＝9.6，2.6Hz，1H，H-5′)，7.901(d，J＝9.6Hz，1H，H-6′)，7.561(d，J＝7.2Hz，1H，H-7)，4.214(m，1H，H-3)，3.349(s，1H，3β-OH)，2.337(dd，J＝9.2，6.8Hz，1H，H-6)，0.967(s，3H，CH3-19)，0.917(d，J＝6.8Hz，3H，CH3-21)，0.850(d，J＝6.4Hz，3H，CH3)，0.846(d，J＝6.4Hz，3H，CH3)，0.713(s，3H，CH3-18)；13C NMR(CDCl3)δ155.18(C-7)，145.12(C-1′)，137.51(C-4′)，129.91(C-5′)，128.64(C-2′)，123.57(C-3′)，116.36(C-6′)，83.35(C-5)，67.56(C-3)，56.34(C-17)，56.34(C-9)，55.56(C-14)，51.47(C-6)，45.50(C-10)，44.76(C-13)，43.62(C-4)，42.59(C-8)，39.66(C-12)，39.43(C-24)，36.16(C-22)，35.58(C-20)，28.50(C-16)，28.07(C-2)，27.98(C-25)，27.70(C-1)，24.67(C-15)，23.78(C-23)，22.78(C-27)，22.52(C-26)，21.63(C-11)，18.75(C-21)，18.67(C-19)，12.48(C-18)；C33H50N4O6Na(M+Na)+HRMALDITOFMS计算值621.3622，实测值621.3625。HPLC-MS检测RT20.8分钟；[M-H]-597；λmax361nm，ε2.47±0.68×104M-1cm-1。
5-氧代-5，6-断胆甾-3-烯-6-醛(6a)。此化合物按P.Yates，S.Stiveer，Can.J.Chem.66，1209(1988)中的一般描述进行合成。将甲磺酰氯(400μl，2.87mmol)滴加到冰浴温度下搅拌的酮醛4a(300mg，0.72mmol)和三乙胺(65μl，0.84mmol)的CH2Cl2溶液(15ml)中。所得溶液在0℃氩气下搅拌30分钟，然后加入三乙胺(400μl，2.87mmol)，将溶液升温至室温。2小时后，将反应混合物真空蒸发至干。残余物溶于二氯甲烷(15ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机级分用无水硫酸钠干燥，真空蒸发。粗残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶9)]纯化。蒸发所得级分，得到醛6a(153mg，53％)，为无色油。
1H NMR(CDCl3)显示δ9.574(s，1H，CHO)，6.769(m，1H，H-3)，5.822(d，J＝10Hz，1H，H-4)，2.512(dd，J＝16.8，3.6Hz，1H，H-7)，1.070(s，3H，CH3-19)，0.882(d，J＝6.8Hz，3H，CH3-21)，0.845(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.841(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.674(s，3H，CH3-18)；13C NMR(CDCl3)δ208.22(C-5)，202.42(C-6)，147.46(C-3)，128.44(C-4)，56.08(C-17)，54.96(C-14)，47.80(C-10)，45.05(C-7)，42.33(C-13)，42.04(C-9)，39.73(C-12)，39.43(C-24)，35.93(C-22)，35.71(C-20)，35.42(C-1)，33.77(C-8)，27.97(C-25)，27.67(C-16)，25.22(C-15)，24.67(C-2)，23.71(C-23)，23.27(C-11)，22.77(C-27)，22.51(C-26)，18.54(C-21)，17.71(C-19)，11.48(C-18).
C27H45O2(M+H)+HRMALDITOFMS计算值401.3414，实测值401.3404。
5-氧代-5，6-断胆甾-3-烯-6-醛的2，4-二硝基苯腙(6b)。将2，4-二硝基苯肼(45mg，0.23mmol)加入到酮醛6a(80mg，0.2mmol)和对甲苯磺酸(1mg，0.0052mmol)的乙腈(10ml)溶液。在室温下搅拌反应混合物2小时，真空蒸发至干。残余物溶于二氯甲烷(10ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机级分用硫酸钠干燥，真空蒸发至干。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(15∶85)]纯化，得到标题化合物6b，为黄色固体(70mg，60％)
反式-6b1H NMR(CDCl3)显示δ10.958(s，1H，NH)，9.104(d，J＝2.4Hz，1H，H-3′)，8.288(dd，J＝9.8，2.8Hz，1H，H-5′)，7.896(d，J＝9.6Hz，1H，H-6′)，7.337(dd，J＝5.6，5.6Hz，1H，H-6)，6.771(m，1H，H-3)，5.822(d，J＝10Hz，1-H，H-4)，2.600(ddd，J＝16.4，4.8，4.8Hz，1H，H-7)，1.139(s，3H，CH3-19)，0.897(d，J＝6.4Hz，3H，CH3-21)，0.840(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.837(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.703(s，3H，CH3-18)；13C NMR(CDCl3)δ207.78(C-5)，151.17(C-6)，147.69(C-3)，145.00(C-1′)，137.61(C-4′)，129.97(C-5′)，128.52(C-2′)，128.38(C-4)，123.48(C-3′)，116.46(C-6′)，56.05(C-17)，54.68(C-14)，47.87(C-10)，42.30(C-13)，41.69(C-9)，39.72(C-12)，39.37(C-24)，36.35(C-8)，35.91(C-22)，35.66(C-20)，35.34(C-1)，32.84(C-7)，27.93(C-25)，27.73(C-16)，24.93(C-15)，24.68(C-2)，23.69(C-23)，23.24(C-11)，22.74(C-27)，22.48(C-26)，18.52(C-21)，17.81(C-19)，11.58(C-18)；C33H48N4O5Na(M+Na)+HRMALDITOFMS计算值603.3517，实测值603.3523。HPLC-MS检测RT18.3分钟；[M-H]-579；λmax360nm，ε2.29±0.23×104M-1cm-1。
5β-羟基-B-降胆甾-3-烯-6β-甲醛(7a)。此化合物按P.Yates，S.Stiveer，Can.J.Chem.66，1209(1988)中的一般描述进行合成。在室温氩气氛下，将甲醇中的甲醇钠(0.5M，0.16mmol)滴加到酮醛4a(50mg，0.125mmol)的无水甲醇溶液(10ml)中。30分钟后，真空除去甲醇，残余物溶于二氯甲烷(20ml)并用水(3×20ml)洗涤。合并的有机级分用硫酸钠干燥，真空蒸发。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶9)]纯化，得到标题化合物醛7a，为无色油(16mg，32％)1H NMR(CDCl3)δ9.703(d，J＝3.2，1H，CHO)，5.716(m，2H，H-3 andH-4)，2.398(dd，J＝9.6，3.6Hz，1H，H-6)，0.953(s，3H，CH3-19)，0.904(d，J＝6.4Hz，3H，CH3-21)，0.854(d，J＝6.4Hz，3H，CH3)，0.849(d，J＝6.4Hz，3H，CH3)，0.706(s，3H，CH3-18)；13C NMR(CDCl3)δ204.41(C-7)，134.21(C-3)，126.66(C-4)，81.44(C-5)，64.49(C-9)，55.86(C-14)，55.55(C-17)，48.44(C-6)，45.12(C-10)，44.47(C-13)，39.92(C-8)，39.45(C-12)，39.40(C-24)，36.16(C-22)，35.57(C-20)，29.06(C-1)，28.31(C-16)，27.98(C-25)，24.73(C-15)，23.76(C-23)，22.78(C-27)，22.53(C-26)，21.69(C-2)，21.24(C-11)，18.74(C-21)，18.44(C-19)，12.37(C-18)；
C27H44O2Na(M+Na)+HRMALDITOFMS计算值423.3233，实测值423.3240。
5β-羟基-B-降胆甾-3-烯-6β-甲醛的2，4-二硝基苯腙(7b)将2，4-二硝基苯肼(8mg，0.041mmol)和对甲苯磺酸(1mg，5.2μmol)加入到醛7a(15mg，0.037mmol)的乙腈溶液(5ml)中。在室温下搅拌反应混合物2小时，真空蒸发，并用二氯甲烷(10ml)稀释。有机层用水水(3×20ml)洗涤，用硫酸钠干燥，并蒸发至干。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶9)]纯化，得到腙7b，为黄色固体(9mg，41％)1H NMR(CDCl3)trans-7b 11.060(s，1H，NH)，9.119(d，J＝2.8Hz，1H，H-3′)，8.291(dd，J＝9.2，2.0Hz，1H，H-5′)，7.930(d，J＝9.6Hz，1H，H-6′)，7.546(d，J＝7.2Hz，1H，H-7)，5.761(ddd，J＝10.2，4.4，2.0Hz，1H，H-3)，5.705(d，J＝9.6Hz，1H，H-4)，2.485(dd，J＝10.4，7.6Hz，1H，H-6)，0.977(s，3H，CH3-19)，0.917(d，J＝6.4Hz，3H，CH3-21)，0.848(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.844(d，J＝6.4Hz，3H，CH3)，0.707(s，3H，CH3-18)；1H-1H ROESY NMR显著相关性(H4-H6)，(H6-H7)，(H7-H8)，(H7-H19)，缺乏相关性(H3-H19)，(H4-H7)，(H4-H19)，(H6-H19)；13C NMR(CDCl3)δ154.62(C-7)，145.09(C-1′)，137.59(C-4′)，133.89(C-3)，129.94(C-5′)，128.68(C-2′)，127.12(C-4)，123.57(C-3′)，116.42(C-6′)，80.91(C-5)，56.83(C-9)，56.07(C-14)，55.39(C-17)，49.58(C-6)，45.00(C-10)，44.58(C-13)，42.50(C-8)，39.44(C-12)，39.44(C-24)，36.17(C-22)，35.54(C-20)，30.46(C-1)，28.53(C-16)，27.98(C-25)，24.91(C-15)，23.74(C-23)，22.77(C-27)，22.52(C-26)，21.79(C-2)，21.31(C-11)，18.76(C-21)，18.76(C-19)，12.34(C-18).
HPLC-MS检测RT 18.3分钟；[M-H]-579；λmax364nm，ε2.32±0.17×104M-1cm-1。
3β-羟基-B-降胆甾-5-烯-6-甲醛(8a)将醛5a(50mg，0.12mmol)和磷酸(85％，5ml)的乙腈-二氯甲烷溶液(1∶1，4ml)加热回流30分钟。真空蒸发反应混合物，用二氯甲烷(50ml)稀释，并用水(3×20ml)洗涤。有机层用硫酸钠干燥，真空蒸发。残余物通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化，得到标题醛，为12mg(25％)的α，β不饱和醛8a
1H NMR(CDCl3)of 8a显示δ9.958(s，1H，CHO)，3.711(tt，J＝10.8，4.5Hz，1H，H-3)，3.475(dd，J＝14.1，4.8，1H，H-4)，2.563(dd，J＝11.0，11.0Hz，1H，H-8)，0.953(s，3H，CH3-19)，0.941(d，J＝6.9Hz，3H，CH3-21)，0.881(d，J＝6.6Hz，3H，CH3)，0.876(d，J＝6.6Hz，3H，CH3)，0.746(s，3H，CH3-18)；13C NMR(CDCl3)δ189.44(C-7)，168.74(C-5)，139.21(C-6)，70.88(C-3)，60.16(C-9)，55.40(C-17)，54.48(C-14)，46.35(C-10)，46.19(C-8)，45.27(C-13)，39.86(C-12)，39.55(C-24)，36.26(C-4)，36.22(C-22)，35.64(C-20)，33.93(C-1)，31.32(C-2)，28.62(C-16)，28.09(C-25)，26.65(C-15)，24.00(C-23)，22.90(C-27)，22.64(C-26)，20.80(C-11)，19.02(C-21)，15.73(C-19)，12.59(C-18)；C27H44O2Na(M+Na)+HRMS计算值423.3233，实测值423.3239。
从此反应获得副产物B-降胆甾-3，5-二烯-6-甲醛12a，为白色固体(27mg，60％)1H NMR(CDCl3)δ10.017(s，1H，CHO)，6.919(d，J＝10.2Hz，1H，H-4)，6.225(m，1H，H-3)，2.675(d d，J＝10.8，10.8Hz，1H，H-8)，0.950(d，J＝6.9Hz，3H，CH3-21)，0.914(s，3H，CH3-19)，0.882(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.877(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.769(s，3H，CH3-18)；13C NMR(CDCl3)δ189.41(C-7)，163.33(C-5)，138.18(C-6)，135.75(C-3)，120.68(C-4)，59.54(C-9)，55.41(C-17)，54.30(C-14)，45.47(C-8)，45.08(C-10)，44.72(C-13)，39.79(C-12)，39.55(C-24)，36.27(C-22)，35.65(C-20)，34.18(C-1)，28.62(C-16)，28.09(C-25)，26.72(C-15)，24.00(C-23)，23.96(C-2)，22.90(C-27)，22.64(C-26)，20.72(C-11)，19.03(C-21)，14.87(C-19)，12.62(C-18)；C27H43O(M+H)+HRMALDITOFMS计算值383.3308，实测值383.3309。
酮醛4a与氨基酸的羟醛缩合。在典型的方法中，将酮醛4a(2mg，4.8μmol)溶于NMR管中的DMSO-d6(800μl)和D2O(80μl)。向此溶液加入1当量的任一a)L-脯氨酸、b)甘氨酸、c)盐酸L-赖氨酸或d)二盐酸L-赖氨酸乙酯。样品在各时间点进行1H NMR分析。通过监测许多共振的变化，例行观察反应。
1H NMR(DMSO-d6)1H NMR 5a显示δ9.527(d，J＝3.2Hz，1H，CHO)，3.876(m，1H，H-3)，0.860(d，J＝6.4Hz，3H，CH3-21)，0.772(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.767(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.771(s，3H，CH3-19)，0.642(s，3H，CH3-18).1H NMR 4a显示δ9.518(s，1H，CHO)，4.223(m，1H，H-3)，2.994(dd，J＝12.8，4.0Hz，1H，H-4e)，0.858(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.842(s，3H，CH3-19)，0.811(d，J＝6.8Hz，3H，CH3)，0.807(d，J＝6.4Hz，3H，CH3-21)，0.615(s，3H，CH3-18).
在这些条件下，在DMSO-d6(800μl)和D2O(80μl)中没有发生4a的羟醛缩合。
断酮醛4a与动脉粥样硬化的动脉部分和血液部分的羟醛缩合。在典型的方法中，将酮醛4a(5mg，0.0012mmol)溶于DMSO-d6(800μl)和D2O(80μl)中。向此溶液加入任一a)动脉粥样硬化的动脉(2.1mg)，其已在组织均质机中均质于PBS(1ml)中并冻干，b)冻干的人血液(1ml)，c)冻干的人血浆(1ml)或d)冻干的PBS(1ml)。在各时间点抽取样品进行1H NMR分析(见上文)。在这些条件下，在冻干的PBS存在时没有发生4a的羟醛缩合。
用4a和5a进行生物研究已描述了某些由体内胆甾醇氧化产生的氧甾醇。E.Lund，I.Bjrkhem，Acc.Chem.Res.28，241(1995)。此外，已从海绵Stellettahiwasaensis分离出只在胆甾烷(cholestan)侧链上存在结构差异的5a类似物，作为对细胞毒性天然产物的全面筛选的一部分。T.Miyamoto，K.Kodama，Y.Aramaki，R.Higuchi，R.W.M.Van Soest，Tetrahedron Lett.42，6349(2001)；B.Liu，Z.Weishan，Tetrahedron Lett.43，4187(2002)。但是，在人类中，如在甾醇4a和5a中类甾醇核被破坏的衍生物以前并没有报告。
细胞毒性测定。WI-L2人B-淋巴细胞系、HAAE-1人腹腔主动脉内皮细胞系、MH-S鼠肺泡巨噬细胞系和J774A.1鼠组织巨噬细胞系从ATCC获得。人主动脉内皮细胞(HAEC)和人血管平滑肌细胞(VSMS)从Cambrex Bio Science获得。Jurkat E6-1T-淋巴细胞由J.Kaye博士(TheScripps Research Institute)惠赠。细胞在含10％胎牛血清的ATCC推荐培养基中培养。细胞在37℃、5或7％CO2的控制气氛下温育。对于乳酸脱氢酶(LDH)释放测定，通过添加0.05％胰蛋白酶/EDTA或通过刮取来收获贴壁细胞。将获得的细胞接种在96孔微量滴定板上(25,000个细胞/孔)，让其复原24-48小时。轻轻洗涤细胞，培养基用含5％胎牛血清的新鲜培养基置换。用3、4a或5a(0-100μM)处理两份重复的或者更多的细胞样品18小时。然后通过测量培养物中从细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)，来确定细胞毒性。简单的说，用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega，USA)，测量96孔板中培养的细胞在酮醛4a、羟醛5a或胆甾醇3处理结束时细胞上清液中的LDH活性。100％细胞毒性定义为如台盼蓝排斥试验所示死细胞释放的LDH最大量，或者细胞用0.9％Triton X-100裂解时检出的LDH最高量。通过用Macintosh上的Graphpad(版本3.0)软件，将浓度对细胞毒性(％)的原始双份重复数据进行非线性回归分析(Hill plot)，确定IC50值。
Lipid-loading测定(泡沫细胞形成)。在37℃、5或7％CO2的控制气氛下，将J774.1巨噬细胞在8孔腔式载玻片上温育于含10％胎牛血清的ATCC推荐培养基中。然后将细胞在含抗氧化剂2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚甲苯(100μM)、二亚乙基三胺五乙酸(100μM)以及LDL(100μg/mL)或者LDL(100μg/mL)与4a(20μg/mL)或者LDL(100μg/mL)与5a(20μg/mL)的相同培养基中温育72小时。结束时，用PBS(pH 7.4)洗涤细胞两次。然后用溶于PBS的6％(v/v)低聚甲醛固定细胞30分钟，用丙二醇漂洗2分钟，用5mg/ml油红O使脂质染色8分钟。用Harris苏木精复染细胞45秒钟，用6％低聚甲醛除去背景染色，然后在PBS中洗涤一次和在自来水中洗涤一次。用甘油将盖玻片放置在载玻片上，然后对玻片标本进行光学显微检查。记下每张载玻片的单个视野中所计数的总共至少100个细胞中富脂细胞的数目，将其表示为总细胞的百分数。以100x的放大倍数拍照。
圆二色性。在37℃下，在Aviv旋光分光计上恒温控制(±0.1℃)的0.1cm石英样品池中记录溶于PBS(pH 7.4，含1％异丙醇)的LDL(100μg/mL)、LDL(100μg/mL)与4a(10μM)和LDL(100μg/mL)与5a(10μM)的圆二色性(CD)谱。在肽的范围内(200-260nm)记录圆二色性谱。为提高信噪比，每次测量均取多个谱(三个)的平均值。用Dell个人计算机上的CDPro软件包(由科罗拉多州立大学的NarasimhaSreerama开发)，进行每次测量的摩尔椭圆度谱的去叠合。
实施例2动脉粥样硬化斑块产生臭氧和胆甾醇臭氧解产物使用上述方法，本实施例显示，通过颈动脉内膜切除术从15名人类患者(n＝15)获得的动脉粥样硬化组织可产生臭氧，臭氧可通过与靛蓝胭脂红1反应检出。
动脉粥样硬化斑块产生的臭氧对靛蓝胭脂红的漂白本发明发明人先前发现，当在靛蓝胭脂红1(臭氧的化学阱)溶液中用蛋白激酶C激活物4-β-佛波醇12-十四烷酸13-乙酸酯(PMA)处理抗体包被的白细胞时，靛蓝胭脂红1的可见吸光度被漂白，靛蓝胭脂红1被转化成靛红磺酸2。参见例如P.Wentworth Jr等，Science 298，2195(2002)；B.M.Babior，C.Takeuchi，J.Ruedi，A.Guitierrez，P.Wentworth Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3920(2003)；P.Wentworth Jr等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，1490(2003)。靛红磺酸2的结构在图1A中提供。当这些实验在H218O(＞95％18O)中进行时，观察到氧同位素掺入到靛红磺酸2的内酰胺羰基中(见上文)。这个方法将臭氧和1O2*与也可氧化靛蓝胭脂红1的其他氧化剂区别开来，因为在据认为与炎症有关的氧化剂当中，只有臭氧氧化裂解靛蓝胭脂红1的双键，同时同位素(来自H218O中)掺入到靛红磺酸2的内酰胺羰基中(参见上文和图1A)。
如实施例1所述，通过颈动脉内膜切除术从15名据认为有成问题的动脉粥样硬化的人类患者获得斑块物质。将各斑分成两相等部分(约50mg湿重，悬浮于1mL PBS中)。将每部分斑物质加入到靛蓝胭脂红1(200μM)和牛过氧化物酶(50μg/mL)的磷酸缓冲盐水(PBS，pH 7.4，10mM磷酸盐缓冲液，150mM NaCl)溶液(1mL)中。通过将DMSO(10μL)或十四烷酸佛波醇酯(PMA，10μL，20μg/mL)的DMSO溶液加入到悬浮斑块物质的一个等分试样或另一个等分试样中，开始进行分析。
加入PMA时，在15个斑样品中观察到有14个出现1的可见吸光度的漂白(图1B)。经反相HPLC分析(图1A和C)确定，此漂白伴随靛红磺酸2的形成。取决于受试的分离斑或块，所形成的靛红磺酸2的量在1.0-262.1nmol/mg之间变动。由不同分离物产生的靛红磺酸2的平均量是72.62±21.69nmol/mg。
当在含H218O的PBS(＞95％18O)(n＝2)中与靛蓝胭脂红1(200μM)进行悬浮斑块物质的PMA活化时，如分离的裂解产物靛红磺酸2的质谱(图1D)中[M-H]-228和230质量片段峰的相对强度所示，大约有40％的靛蓝胭脂红1内酰胺羰基氧掺入18O。
这些用靛蓝胭脂红1进行的研究表明，臭氧由活化的动脉粥样硬化斑块物质产生。
胆甾醇的臭氧解产物动脉粥样硬化斑块中存在的一种主要脂质是胆甾醇3。D.M.Small，Arteriosclerosis 8，103(1988)。在化学模型研究中，研究者已显示，在一组氧化剂如3O2、1O2*、·O2-、O22-、羟基自由基、O3和·O2+及臭氧O3当中，只有臭氧使胆甾醇3的Δ5，6双键裂解，产生5，6-断甾醇4a(图2A)。此观察结果与其他化学报告相一致，所述化学报告也指出，5，6-断甾醇4a是胆甾醇3臭氧解的主要产物。Gumulka等，J.Am.Chem.Soc.105，1972(1983)；Jaworski等，J.Org.Chem 53，545(1988)；Paryzek等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.l，1222(1990)；Comforth等，Biochem.J.54，590(1953)。
因此，进一步的实验贯注在检测和鉴定5，6-断甾醇4a或胆甾醇的其他臭氧解产物是否存在于动脉粥样硬化斑块中。因此，调查了14名患者(n＝14)的人动脉粥样硬化斑块在PMA活化前后5，6-断甾醇4a的存在。
将Pryor与同事一起开发的改进分析方法用于这些研究中。参见K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)。该改进方法涉及用有机溶剂(二氯甲烷，3×5mL)萃取均质斑块物质(约50mg湿重)的PBS(1mL，pH 7)悬浮液，然后在室温下用盐酸2，4-二硝基苯肼(DNPH HCl)的乙醇溶液(2mM于乙醇中，pH 6.5)处理有机部分2小时。通过HPLC(直接注射，360nm紫外检测)和线上负离子电喷射质谱法分析此反应混合物，寻找4b即臭氧解产物4a的2，4-二硝基苯腙衍生物的存在(图3)。于14个未活化斑块抽提物的11个中(6.8-61.3pmol/mg斑块)及所有的活化斑块抽提物中(1.4-200.6pmol/mg)检出腙4b。此外，由4b的平均量判断，用PMA活化时斑块物质中4a的量显著增加。具体地方说，当没有使用PMA时，4b的平均量是18.7±5.7pmol/mg。与此对照，当加入PMA时，4b的平均量是42.5±13.6pmol/mg(n＝14，p＜0.05)(图3A-B)。
在斑块抽提物的HPLC分析过程中，除4b之外，还观察到另外两个主要腙峰。第一个峰具有RT～20.5分钟，[M-H]-＝597，第二个峰具有RT～18.0分钟，[M-H]-＝579(图3A，B)。腙4b容易与这些峰相区别，因为它的保留时间约为13.8分钟(RT～13.8分钟，[M-H]-597)(图3A，B)。经与真实样品比较，RT～20.8分钟的峰确定为羟醛缩合产物5a的腙衍生物5b(图2和3E)。在化学模式研究中，Pryor以前已提到过4a的肼衍生化的主要副产物是羟醛缩合产物5a的腙衍生物5b，其相对含量是酸浓度和反应时间的函数。K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)。
在所采用的衍生化条件下，在受试的4a浓度范围内(5-100μM)，4a转化成5b的程度约为20％。但是，往往观察到20％以上的转化率。超过斑块样品中存在的4a的20％的5a测定量很可能由3的臭氧解及随后的羟醛缩合而产生。
许多含有氨基或羧基的生化成分可催化羟醛缩合。这种组分存在于斑和血液中，可促进4a向5a的转化。进一步的实验表明，以下氨基酸和物质促进4a向5a的转化L-Pro(2小时，完全转化)、Gly(24小时，完全转化)、L-Lys HCl(24小时，完全转化)、L-Lys(OEt)·2HCl(100小时，62％转化)以及来自动脉粥样化动脉的抽提物(22小时，完全转化)、全血(15小时，完全转化)、血浆(15小时，完全转化)和血清(15小时，完全转化)。相对于背景反应的速度，所有这些物质均加速4a向5a的转化。
如上所述，在PMA活化时斑块中酮醛4a的量增加。但是，PMA对5a形成的作用较不明晰。在某些情况下，在PMA活化后5a的水平提高(图5B，患者F和H)，而在其他情况下，在PMA活化后5a的水平下降(图5B，患者C、G和N)。
合成和分析了许多其2，4-二硝基苯腙衍生物在质谱中(图2B)具有[M-H]-579峰的含羰基类甾醇衍生物6a-9a，以帮助鉴定18分钟处的[M-H]-579峰(图3A，B)。经与真实样品的HPLC共注射、负离子电喷射质谱和紫外光谱比较，～18分钟处的峰确定为6b，即6a的腙衍生物和4a的A环脱水产物(图3D)。研究了所选的衍生化标准条件下4a向6b的转化程度。发现在受试的4a浓度范围内(5-100μM)此转化程度始终在2％以下。这些数据表明，斑块抽提物中存在的超过抽提物中酮醛4a量2％的6a量，在衍生化之前即存在，由臭氧解产物4a通过水的β消除而产生。
除了4b-6b这三种主要的腙产物外，还检出另一种产物7b，并确定为7a的腙衍生物和5a的A环脱水产物。此产物(7b)在几个斑抽提物中以痕量(＜5pmol/mg)存在，保留时间约为26分钟([M-H]-579，图4)。但是，斑块抽提物中7b的量接近所采用的HPLC测定的检出限，尚未对此化合物在所有斑样品中的存在或不存在进行过全面研究。
活化斑块物质氧化裂解靛蓝胭脂红1的双键(为臭氧的化学特征)，以及胆甾醇的Δ5，6双键通过臭氧所独有的途径(根据已知化学原理)裂解的实验证据给出了有说服力的证据，动脉粥样硬化斑块可产生臭氧。此外，由于这些独特的胆甾醇臭氧化产物在斑活化前也存在，很可能在动脉粥样硬化斑块的发展过程中也产生臭氧。
现已确认，外源给予的臭氧在体内通过白介素(IL)-1α、IL-8、干扰素(IFN)-γ、血小板聚集因子(PAF)、生长相关的癌基因(Gro)-α、核因子(NF)-κB和肿瘤坏死因子(TNF)-α的活化而具有促炎作用。除了这些通常公知的臭氧在炎症中的作用之外，还存在动脉粥样硬化斑块所独有的情况，这种情况可加大内源产生的臭氧当在此部位产生时对疾病的引发和永存的病理学作用。胆甾醇的臭氧解可能是斑块所独有的，因为仅在这个部位出现需要的高浓度臭氧和胆甾醇，而可捕捉任何产生的臭氧的其他活性物质不存在。
只要动脉粥样硬化的动脉含有抗体和活化巨噬细胞和髓过氧化物酶形式的1O2*产生系统，很可能动脉粥样硬化病变可通过抗体催化的水氧化途径产生O3。的确，3的Δ5，6双键裂解产生4a的观察结果是炎症中臭氧通过抗体催化而产生的进一步证据。已知许多氧甾醇在体内通过胆甾醇的氧化产生，且只在胆甾烷侧链上存在结构差异的5a类似物已从海绵Stelletta hiwasaensis分离出，作为对细胞毒性天然产物的全面筛选的一部分。T.Miyamoto，K.Kodama，Y.Aramaki，R.Higuchi，R.W.M.Van Soest，Tetrahedron Letter 42，6349(2001)；B.Liu，Z.Weishan，Tetrahedron Lett.43，4187(2002)。但是就我们所知，在人类中以前并没有报告如在甾醇4a-6a中类甾醇核被破坏的衍生物。因此，重要的是发起对其他这种类甾醇及其衍生物的搜寻，并研究它们的生物功能。
实施例3胆甾醇臭氧解产物存在于动脉粥样硬化患者的血流中本发明发明人在前面已证实，臭氧在抗体催化的水氧化途径中产生，而臭氧作为有效的氧化剂可在炎症中发挥作用。P.Wentworth Jr等，Science 298，2195(2002)；B.M.Babior，C.Takeuchi，J.Ruedi，A.Guitierrez，P.Wentworth Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，3920(2003)；P.Wentworth Jr等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，1490(2003)。
炎症被认为是动脉粥样硬化发病机制中的因素。R.Ross，NewEngl.J.Med.340，115(1999)；G.K.Hansson，P.Libby，U.Schnbeck，Z.-Q.Yan，Circ.Res.91，281(2002)。但是，在本发明之前，不能获得可将炎性动脉疾病与其他炎性过程相区分的特异性非侵入性方法。动脉粥样硬化斑块的独特成分及动脉粥样硬化斑块释放到血流中的产物可提供这种方法。具体地说，动脉粥样硬化病变含有高浓度的胆甾醇。如本文所示，臭氧由动脉粥样硬化病变产生，且胆甾醇臭氧解产物如4a和/或其羟醛缩合产物5a也是由动脉粥样硬化病变产生。因此，进行了进一步的实验，以查明这种胆甾醇臭氧解产物是否可以作为炎性动脉疾病如动脉粥样硬化的标记。
分析了来自两组患者的血浆样品，以寻找4a或5a的存在。组A由动脉粥样硬化病况充分发展到有理由进行动脉内膜切除术的患者(n＝8)组成。组B患者是随机挑选的普通医学诊所的患者。在组A的8名患者中有6名检出羟醛5a，含量在70-1690nM的范围(此测定的检出限是～1-10nM)(图5A-C)。组B的15个血浆样品中只有一个可检出5a。在任何患者的血液样品中都没有检出酮醛4a(此测定的检出限是～1-10nM)。这些数据表明，要么是4a通过血液中所含催化剂转化成5a，要么是血浆中的成分对4a和5a具有差别性亲和力。
过去，由于胆甾醇自氧化问题，“氧甾醇”的血清分析困难重重。H.Hietter，P.Bischoff，J.P.Beck，G.Ourisson，B.Luu，Cancer Biochem.Biophys.9，75(1986)。但是，如本文所述，在所有通过胆甾醇3的生物相关性氧化作用产生的胆甾醇氧化产物当中，类甾醇4a和5a是臭氧所独有的产物。这些研究表明，血浆中缩醛产物5a(以其DNP腙衍生物5b而检出)的存在可作为动脉粥样硬化中晚期动脉炎症的标记。因此，臭氧的抗体催化产生可将胆甾醇积累、炎症、氧化和细胞损伤这些在其他方面表面看来无关的因素联系为导致动脉粥样硬化的病理级联。
一些研究表明，胆甾醇氧化产物拥有生物活性，如细胞毒性、致动脉粥样化性和免疫原性。H.Hietter，P.Bischoff，J.P.Beck，G.Ourisson，B.Luu，Cancer Biochem.Biophys.9，75(1986)；J.L.Lorenso，M.Allorio，F.Bernini，A.Corsini，R.Fumagalli，FEBS Lett.218，77(1987)；A.Sevanian，A.R.Peterson，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，4198(1984)。假定胆甾醇氧化产物4a和5a从未被认为在人体中出现，如下所述进一步研究这些化合物对动脉粥样化形成的关键方面的作用。
实施例4胆甾醇臭氧解产物的细胞毒性有些胆甾醇氧化产物拥有生物活性，如细胞毒性、致动脉粥样化性和免疫原性。在本实施例中，分析了4a和5a对多种细胞系的细胞毒性作用。
在本研究中采用了以下细胞系Levy等，Cancer 22，517(1968)中描述的人B淋巴细胞(WI-L2)；Weiss等，J.Immunol.133，123(1984)中描述的T淋巴细胞细胞系(Jurkat E6.1)；Folkman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，5217(1979)中描述的血管平滑肌细胞系(VSMC)和腹腔主动脉内皮细胞(HAEC)细胞系；Ralph等，J.Exp.Med.143，1528(1976)中描述的鼠组织巨噬细胞(J774A.1)；和Mbawuike等，J.Leukoc.Biol.46，119(1989)中描述的肺泡巨噬细胞细胞系(MH-S)。
化学合成的4a和5a对多种已知存在于动脉粥样硬化斑块的细胞类型——白细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞具有细胞毒性。结果在图6中和表3中显示。
表3
4a和5a对所有受试细胞系的IC50值非常相似。此外，化合物4a和5a对受试细胞系的细胞毒性曲线非常相似。鉴于4a和5a之间显著的结构差异，这些结果是不寻常的。但是，4a和5a在由细胞成分如氨基酸促进的过程中的确相互平衡(见上)，4a和5a在细胞毒性测定的时间期限内可相互处于平衡状态。因此，化合物4a和5a在体内可具有相似的细胞毒性。
本发明发明人使用类似的方法证实，化合物6a、7a、7c、10a、11a和12a对白细胞细胞系有细胞毒性，断酮醛4a及其羟醛加合物5a对神经元细胞系有细胞毒性。7c化合物具有以下结构。
臭氧和胆甾醇的接近可导致产生细胞毒性类甾醇4a-12a和7c，它们在原位产生情况下，完全可以通过促进内皮细胞或平滑肌细胞损伤，或者通过引发动脉粥样化中的炎性细胞凋亡，在病变的发展中起到作用(见上)。前述动脉粥样硬化斑块晶相中胆甾醇的臭氧解可促成斑块不稳定，斑块不稳定被认为是动脉梗塞前的最后步骤。
实施例5胆甾醇臭氧解产物促进泡沫细胞形成和改变LDL与脱辅基蛋白质B100的结构提高低密度脂蛋白致动脉粥样化性的低密度脂蛋白(LDL)修饰被认为是心血管疾病发展中的关键事件。D.Steinberg，J.Biol.Chem.272，20963(1997)。例如，通过CD36和其他巨噬细胞清除受体提高巨噬细胞摄取LDL的LDL或脱辅基蛋白质B100(apoB-100，LDL的蛋白质组分)氧化修饰，被认为是动脉粥样硬化发作中的决定性病理原因事件。本实施例描述的实验显示，胆甾醇臭氧解产物4a和5a可促进泡沫细胞从巨噬细胞的形成，并可修饰LDL和apoB-100的结构。
如实施例1所述，在未活化的鼠巨噬细胞(J774.1)存在下，将LDL(100μg/mL)与4a或5a一起温育。这些巨噬细胞暴露于4a或5a之后，开始脂质负荷，泡沫细胞开始在反应容器中出现(图7)。
此外，圆二色性(图8B，C)检测显示，人LDL(100μg/mL)与4a和5a(10μM)一起温育导致apoB-100的结构发生时间依赖性变化。无4a和5a时总LDL的圆二色性分析揭示，在实验的持续时间内(48小时)，LDL的二级结构通常保持稳定(图8A)。如图8A所示，正常LDL的蛋白内含物有较大比例的α螺旋结构(～40±2％)和较少量的β结构(～13±3％)、β转角(～20±3％)和无规卷曲(27±2％)。但是，当LDL与4a和5a一起温育时，虽然其谱图形状仍与天然LDL保持某些相似(图8B和C)，但其二级结构有相当大的损失，主要是α螺旋结构的损失(4a～23±5％；5a～20±2％)，相应地无规卷曲的百分比提高(4a～39±2％；5a 32±4％)。因此，4a和5a胆甾醇臭氧解产物似乎破坏LDL的结构完整性。
为修饰LDL结构，在4a和5a胆甾醇臭氧解产物的醛部分与apoB-100赖氨酸残基的ε-氨基侧基之间可发生共价反应，形成席夫碱或烯胺中间体，其与以前在丙二醛和4-羟基壬烯醛与apoB-100之间的反应所观察到的化合物类似。Steinbrecher等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，3883(1984)；Steinbrecher等，Arteriosclerosis 1，135(1987)；Fong等，J.Lipid.Res.28，1466(1987)。这种席夫碱或烯胺中间体可具有明显半寿期，可使衍生化的LDL变成能被巨噬细胞清除受体识别的形式。因此，4a和5a胆甾醇臭氧解产物与apoB-100-LDL之间的共价反应可产生衍生化的apoB-100-LDL复合物，其可被巨噬细胞清除受体识别并以较高的速度摄取，从而产生图7中所观察到的泡沫细胞。
唯一已知的含醛成分的胆甾醇氧化形式是4a和5a臭氧解产物。因此，这种胆甾醇衍生物与LDL/apoB-100之间的反应可提供此时以前一直未知的胆甾醇、泡沫细胞形成和动脉斑块形成之间的关系。因此，患者血流中高水平的4a和5a臭氧解产物的检测可提供这些患者患动脉粥样硬化的程度的直接量度。
实施例6产生针对胆甾醇臭氧化产物的抗体本实施例描述为针对式13a、14a或15a半抗原而产生的可与胆甾醇臭氧化产物和腙产物反应的抗体。式13a、14a和15a半抗原的结构如下所示 化合物13a是4-[4-甲酰-5-(4-羟基-1-甲基-2-氧代-环己基)-7a-甲基-八氢-1H-茚-1-基]戊酸。
方法制备化合物13a、14a和15a的KLH缀合物。用这些KLH缀合物以标准方法免疫小鼠。从小鼠移取脾脏并分散，获得作为抗体产生细胞的脾细胞。
将脾细胞和源自小鼠骨髓瘤的SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL-1581)共悬浮于预热至37℃的无血清RPMI-1640培养基(pH 7.2)，细胞密度分别为3×104个细胞/ml和1×104个细胞/ml。离心悬浮液，收集沉淀。在1分钟内向此沉淀滴加1ml含50w/v％聚乙二醇的无血清RPMI-1640培养基(pH 7.2)，然后在37℃下温育所得混合物1分钟。进一步向混合物中滴加无血清RPMI-1640培养基(pH 7.2)，至最终体积为50ml，离心收集沉淀。将沉淀悬浮于HAT培养基，分成200μl的等分试样，每个等分试样加入到96孔微量滴定板的一个孔。将微量滴定板在37℃下温育一个星期，结果形成约1,200种类型的杂交瘤。通过免疫测定与胆甾醇臭氧化产物的结合，分析得自杂交瘤的上清液。
按照布达佩斯条约的条款，于2003年8月29日将针对式15a化合物而产生的杂交瘤KA1-11C5和KA1-7A6保藏美国典型菌种保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，Va.，20110-2209 USA(ATCC))，ATCC保藏号为PTA-5427和PTA-5428。按照布达佩斯条约的条款，同样于2003年8月29日将针对式14a化合物而产生的杂交瘤KA2-8F6和KA2-1E9保藏于ATCC，ATCC保藏号为PTA-5429和PTA-5430。
产生单克隆抗体制品KA1-7A6:6和KA1-11C5:6(为针对半抗原15a的KLH缀合物而产生)及KA2-8F6和KA2-1E9(为针对半抗原14a的KLH缀合物而产生)的库(pool)。通过ELISA测定KA1-7A6:6和KA1-11C5:6单克隆抗体(由15a产生)对臭氧化产物5a和胆甾醇半抗原3c的结合滴度。还进行ELISA测定，以确定KA2-8F6:4和KA2-1E9:4抗体(由臭氧化产物5a产生)对13b、14b和胆甾醇半抗原3c的结合滴度。
以下提供胆甾醇半抗原3c的结构。
如下进行ELISA测定。分别将13a、14a、3c、13b、14b或15a的BSA缀合物加入到高结合(hi-bind)96孔微量滴定板(FischerBiotech.)，让其在4℃下静置过夜。用PBS将板彻底洗涤，然后加入乳溶液(1％w/v于PBS中，100μL。让板在室温下静置2小时，然后用PBS洗涤。用PBS系列稀释含不同抗体制品的培养物，将50μL的各稀释液分别加入到各排的第一个孔中。混合和稀释后，让板在4℃下静置过夜。用PBS将板洗涤后，加入山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物(0.01μg，5μL)。将板在37℃下温育2小时。将板洗涤后，加入底物溶液(50μL)3，3′，5，5′-四甲基联苯胺
。使板在暗处显色30分钟。加入硫酸(1.0M，50μL)猝灭反应，在450nm处测量光密度。
报告的滴度是对应于最大光密度的50％的血清稀释度。数据用Graphpad Prism(3.0版本)分析，并报告为至少两次重复测量的平均值。
结果ELISA试验的结果在表4和表5中显示。
表4抗15a抗体KA1-7A6:6和KA1 11C5:6对15a、臭氧化产物5a和胆甾醇半抗原3c的结合滴度
*通过ELISA测量对15a、5a和3c的BSA缀合物的滴度。绝对值是当结合时对应于最大吸光度50％的抗体组织培养上清溶液的稀释倍数。
如表4所示，如上所述测量的表观结合亲和力几乎完全相同。
表5KA2-8F6:4和KA2-1E9:4抗体(由5a产生)对15b、14b和胆甾醇半抗原3c的结合滴度
*通过ELISA测量对15b、14b和胆甾醇半抗原3c的BSA缀合物的滴度。绝对值是当结合13b、15b和胆甾醇半抗原3c的BSA缀合物时，对应于最大吸光度50％的抗体组织培养上清溶液的稀释倍数。
这些结果表明，可针对胆甾醇臭氧化产物产生高亲和力抗体制品。
实施例7另外的胆甾醇臭氧化产物检测方法本实施例说明胆甾醇臭氧化产物可通过多种方法检测，包括通过将这些臭氧化产物上的游离醛基缀合到荧光部分和通过使用与这些臭氧化产物反应的抗体。
材料和方法一般方法除非另有指定，所有反应均用干燥试剂、溶剂和火焰干燥的玻璃器具进行。除非另有指定，原料购自Aldrich Chemical Company，并按获得时原样使用使用。胆甾醇-[26，26，26，27，27，27-D6]购自MEDICALISOTOPES INC。快速柱色谱均使用硅胶60(230-400目)来进行。胆甾醇臭氧化产物4a和5a及臭氧化产物4a和5a的2，4-二硝基苯腙(分别为4b和5b)按前述实施例的描述进行合成。薄层层析(TLC)使用Merck(0.25mm)涂铺硅胶Kieselgel 60 F254板来进行，用对茴香醛染色来显色。1H NMR谱在Bruker AMX-600(600MHz)波谱计上记录。13CNMR谱在Bruker AMX-600(150MHz)波谱计上记录。化学位移以相对于外标的百万分之一(ppm)以δ标度来报告。
3β-羟基-5-氧代-5，6-断胆甾烷-6-醛的丹磺酰腙(4d)的合成将丹磺酰肼(50mg，0.17mmol)和对甲苯磺酸(1mg，0.0052mmol)加入到胆甾醇臭氧化产物4a(65mg，0.16mmol)的乙腈溶液(8ml)中。在室温氩气氛下搅拌反应混合物2小时，真空蒸发至干。残余物溶于二氯甲烷(10ml)并用水(2×10ml)洗涤。有机部分用硫酸镁干燥，真空浓缩。粗黄色油通过硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶1；7∶3)]纯化，得到标题化合物4d(70mg，68％)，为几何异构体的混合物(顺式∶反式8∶92)1H NMR(CDCl3)δ9.341(s，1H)，8.567(d，J＝8.4Hz，1H)，8.358(dd，J＝7.2，1.2Hz，1H)，8.290(d，J＝8.4Hz，1H)，7.550(dd，J＝8.4，7.6Hz，1H)，7.539(dd，J＝8.4，7.6Hz，1H)，7.167(d，J＝7.6Hz，1H)，7.000(t，J＝4.0Hz，0.92H trans)，6.642(dd，J＝6.8，2.8Hz，0.08H cis)，4.273(bs，1H)，3.045(dd，J＝13.6，3.4Hz，1H)，2.869(s，6H)，2.233(d，J＝13.6Hz，1H)，2.097(dt，J＝18，4.4Hz，1H)，1.162(s，3H)，0.904(d，J＝6.4Hz，3H)，0.899(d，J＝6.8Hz，3H)，0.892(d，J＝6.4Hz，3H)，0.513(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ209.66，151.77，149.49，133.52，131.20，130.99，129.64(2C)*，128.52，123.25，118.83，115.25，71.07，56.20，52.68，52.56，47.10，45.40，42.32，40.81，39.82，39.48，36.51，36.05，35.79，34.39，31.05，28.02，27.74，27.30，24.27，24.13，22.99，22.84，22.56，18.53，17.45，11.31；C39H59N3O4SNa(M+Na)HRMALDIFTMS计算值688.4118，实测值688.4152；Rf0.43[乙酸乙酯-己烷(7∶3)]。*2C表示此信号被认为对应于来自丹磺酰部分的两个碳信号(C0按gHSQC)。
3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛的丹磺酰腙(5c)的合成向胆甾醇臭氧化产物5a(30mg，0.072mmol)的四氢呋喃(5ml)溶液加入丹磺酰肼(25mg，0.08mmol)和盐酸(浓，0.05ml)。通过加水(0.2ml)将立即形成的白色沉淀溶解。均匀的反应混合物在室温氩气氛下搅拌3小时后，蒸发至干。将红色残余物溶于乙酸乙酯(10ml)并用水(2×10ml)洗涤。有机部分用硫酸镁干燥，真空浓缩。粗黄色油首先通过硅胶色谱[乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4-1∶1)]纯化，然后通过制备HPLC(C18 Zorbax21.22mm和25cm，100％乙腈)纯化，得到标题化合物化合物5c(14.5mg，30％)，为几何异构体的混合物(顺式∶反式17∶83)1H NMR(CDCl3)δ8.557(d，J＝8.8Hz，1H)，8.372(dd，J＝7.2，1.2Hz，1H)，8.300(d，J＝8.8Hz，1H)，8.084(s，1H)，7.575(dd，J＝8.8，7.6Hz，1H)，7.554(dd，J＝8.8，7.6Hz，1H)，7.197(d，J＝7.6Hz，1H)，7.057(d，J＝7.2Hz，0.84H trans)，6.517(d，J＝5.2Hz，0.16H cis)，4.229(m，0.17H cis)，4.004(m，0.83H trans)，2.905(s，6H)，2.379(bm，4H)，1.913(dd，J＝9.6，7.2Hz，2H)，0.886(d，J＝6.8Hz，3H)，0.879(d，J＝6.4Hz，3H)，0.841(d，J＝6.8Hz，3H)，0.691(s，3H)，0.393(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ154.081，133.425，131.367，130.912，129.695，128.611，123.350，115.121，83.268，70.469，67.079，55.773，55.677，55.280，51.652，45.429，45.038，44.372，43.129，42.443，39.488，36.143，35.585，28.580，28.458，27.984，27.766，23.850，22.825，22.549，21.389，18.659，18.063，12.192；C39H59N3O4SNa(M+Na)HRMALDIFTMS计算值688.4118，实测值688.4118；Rf0.41[乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶1)]。
3β-羟基-5-氧代-5，6-断[26，26，26，27，27，27-D6]-胆甾烷-6-醛(D6-4a)的合成在-78℃下，将臭氧在氧气中的气相混合物吹入D6-胆甾醇(50mg，0.13mmol)的5mL氯仿-甲醇(9∶1)溶液1分钟，此时溶液变成浅蓝色。蒸发反应混合物，在室温下与Zn粉(40mg，0.61mmol)在2.5mL乙酸-水(9∶1)中搅拌3小时。用二氯甲烷(10mL)稀释此不均匀混合物，并用水(3×5mL)和盐水(5mL)洗涤。有机部分用硫酸镁干燥并蒸发。残余物用硅胶色谱(用己烷-乙酸乙酯5∶1、3∶1和2∶1洗脱)纯化，得到标题化合物，为白色固体(44mg，0.104mmol)，得率81％。
1H NMR 600MHz(δ，ppm，CDCl3)9.61(s，1H)，4.47(s，1H)，3.09(dd，1H，J＝13.6Hz，4.0Hz)，2.25-2.40(m，3H)，2.15-2.19(m，1H)，1.01(s，3H)，0.88(d，3H，J＝6.1Hz)，0.67(s，3H).13CNMR 150MHz(δ，ppm，CDCl3)217.5，202.8，71.0，56.1，54.2，52.6，46.8，44.1，42.5，42.1，39.8，39.3，35.9，35.7，34.7，34.0，27.8，27.7，27.5，25.3，23.7，23.0，18.5，17.5，11.5.
3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾醇-[26，26，26，27，27，27-D6]-6β-甲醛(D6-5a)的合成向D6-4a(26mg，0.061mmol)的乙腈-水(20∶1，5mL)溶液加入L-脯氨酸(11mg)。在室温下搅拌反应混合物2.5小时，真空蒸发。残余物溶于乙酸乙酯(10mL)，用水(2×5mL)和盐水洗涤。有机部分用硫酸镁干燥，蒸发，留下分析纯的白色固体(26mg，0.061mmol，得率100％)，供进行NMR。
1HNMR 600MHz(δ，ppm，CDCl3)9.69(s，1H)，4.11(s，1H)，2.23(dd，1H，J＝9.2Hz，3.0Hz)，0.91(s，3H)，0.90(d，3H，J＝6.6Hz)，0.70(s，3H)；13C NMR150MHz(δ，ppm，CDCl3)204.7，84.2，67.3，63.9，56.1，55.7，50.4，45.5，44.7，44.2，40.0，39.7，39.3，36.1，35.6，28.3，27.9，27.5，26.7，24.5，23.8，21.5，18.7，18.4，12.5.
4-(5-(4-羟基-1-甲基-2-氧代环己基)-7α-甲基-4-(2-氧代乙基)-八氢-1H-茚-1-基)戊酸15a的合成。按对D6-5a所述进行3β-羟基胆甾-5-烯-24-酸3c的臭氧解。
1HNMR 400MHz(δ，ppm，CDCl3)9.60(s，1H)；4.47(s，1H)，3.40(dd，J＝13.6Hz，4Hz，1H)；1.00(s，1H)，0.91(d，J＝6.4Hz，3H)，0.67(s，3H).13C NMR 100MHz(δ，ppm，CDCl3)218.7，202.9，179.8，70.9，55.5，54.1，52.5，46.4，44.0，42.4，42.1，39.6，35.1，34.5，34.0，30.8，30.4，27.5，27.3，25.1，22.8，17.9，17.4，11.4.
胆甾醇臭氧化产物的抽提用改进的Bligh和Dyer方法从血液样品和组织样品抽提总脂质。参见Bligh EG，D.W.Can J Biochem Physiol 1959，37，911-17。将收集于Vacutainer管并保藏于4℃的含柠檬酸或EDTA作为抗凝剂的人血浆(200μL)加入到加盖玻璃管中的磷酸二氢钾(KH2PO4，0.5M，300μL)中。加入甲醇(500μL)，短暂漩涡搅拌样品。加入氯仿(1mL)，漩涡搅拌样品2分钟。以3000rpm离心5分钟，移取有机层。重复氯仿加入、漩涡搅拌和离心这个过程。合并有机层，真空蒸发。从根据常规指征进行颈动脉动脉内膜切除术的患者获得动脉内膜切除术标本。TheScripps Green Hospital Institutional Review Board批准了人类对象方案。标本在分析前冷冻并在-70℃下保藏。为进行分析，让组织样品升温至室温，然后用组织均质机(Tekmar)均质于含水缓冲液(KH2PO4，0.5M，1-2mL)中。将均质液加入到甲醇∶氯仿(1∶3，6mL)溶液中，以3000rpm离心5分钟。收集有机部分。将氯仿(6mL)加入到剩余的含水可混部分，离心样品(3000rpm，5分钟)。然后真空蒸发合并的有机部分。
抽提的胆甾醇臭氧化产物的丹磺酰肼衍生化和HPLC分析将蒸发后的血液抽提物或组织抽提物(见上)重新悬浮于含丹磺酰肼(200μM)和H2SO4(100μM)的异丙醇(200μL)中，于37℃温育48小时。分析方法包括，以等度洗脱流动相乙腈∶水(90∶10，0.5mL/分钟)，使用荧光检测(激发波长360nm，发射波长450nm)，在与Vydec C-18RP柱相连的Hitachi D-7000 HPLC系统上进行HPLC分析。臭氧化产物5a的丹磺酰衍生物(5c)的保留时间(RT)为约8.1分钟。5a的肼衍生物(5b)的保留时间为约10.7分钟。通过使用Macintosh个人计算机和Prism(版本4.0)软件，参考真实标准品，通过计算峰面积按常规确定浓度。
气相色谱-质谱将蒸发后的标本重建于二氯甲烷中至1mL体积，并通过将含1％三甲基氯硅烷的100uL吡啶和100uL N，O-双(三甲基甲硅烷基)-三氟乙酰胺加入到浓缩的斑块抽提物中，进行甲硅烷化。将样品中37℃下温育2小时，然后旋转蒸发至干。各样品在分析前重新悬浮于100uL二氯甲烷中。通过不分流进样(Agilent 7673自动进样器)将2.5ul样品注射到HP-5ms柱上，膜厚30m×0.25mm ID×0.25um，流速1.2ml/分钟，注射器温度290℃，温度程序从50℃开始，保持5分钟，然后以20℃/分钟升温，直到300℃，保持12分钟。用Agilent model 5973 inert进行质量分析，扫描范围50-700m/z，然后通过选择离子检测(SIM)扫描m/z 354和360。MS四极温度为150℃，MS源温度为280℃。
半抗原5a偶联到载体蛋白KLH和BSA将盐酸1-乙基-3，3′-二甲基氨基丙基-碳二亚胺(EDC，1.5mg，0.008mmol)和磺基N-羟基琥珀酰亚胺(1.8mg，0.008mmol)溶于0.01mL H2O中，并加入到半抗原(2.5mg，0.006mmol)的0.1mL DMF溶液中。漩涡搅拌混合物，在室温下保持24小时，然后在4℃下加入到BSA(5mg，于PBS缓冲液(0.9ml，0.05mM，pH＝7.5)中)中。将此最终混合物在4℃下保持24小时后，在-20℃下保藏。涉及合成化合物5a的KLH或BSA缀合物的反应如下图示。

反应a如上所述涉及用O3/O2臭氧解化合物3c。反应b涉及用EDC和HOBt(于DMF中)处理化合物15a过夜，然后与BSA或KLH一起在磷酸缓冲盐水(PBS)，pH 7.4中温育。
单克隆抗体生产按标准方法进行。如下进行8周龄129GIX+小鼠的免疫每只小鼠用10ug KLH-15a缀合物(于50uL PBS中)，所述PBS与等体积的RIBI佐剂混合，每隔3天腹膜内注射一次，共5次免疫。通过ELISA测定血清滴度。30天后，在尾侧静脉中静脉内注射(IV)最后的50ug KLH-15a缀合物(于100uL PBS中)。3天后，处死动物，取出脾脏，以供融合。将来自免疫动物的脾细胞与X63-Ag8.653骨髓瘤细胞以5∶1在RPMI培养基中混合，离心，在37℃下重新悬浮于1mLPEG 1500中。所述PEG在3分钟内用9mL RPMI稀释，在37℃下温育10分钟，然后离心，重新悬浮于培养基中后，平板接种于15×96孔板中。进行ELISA，筛选结合胆甾醇臭氧化产物4a或5a但不结合胆甾醇的抗体。选出的杂交瘤亚克隆2代，以保证单克隆性。
从ApoE敲除小鼠的主动脉上升段制备组织切片使标本在液氮中急冻。获取10微米切片，放在载玻片上。通过将标本依次浸没在1∶1乙醇∶二乙醚20分钟，100％乙醇10分钟和95％乙醇10分钟进行固定。在PBS中洗涤后，施与对胆甾醇臭氧化产物有特异性的抗体的1∶200稀释液，并与组织一起温育1小时。用FITC标记的山羊抗小鼠IgG(Calbiochem)的40∶1稀释液进行二次标记。用optronics microfire数字照相机获得影像，用Adobe Photoshop处理。
结果胆甾醇臭氧化产物丹磺酰腙的荧光检测。
如前面的实施例所述，可用K.Wang，E.Bermúdez，W.A.Pryor，Steroids 58，225(1993)的化学研究中开发的分析方法的改进方法，体内检测胆甾醇臭氧化产物。这个改进方法涉及将均质斑块物质(～50mg湿重)的PBS(1mL)pH 7.4悬浮液抽提到有机溶剂(二氯甲烷，3×5mL)中，在室温下用盐酸2，4-二硝基苯肼(DNPH HCl)(2mM，pH 6.5)的乙醇溶液处理有机可溶级分2小时。通过反相HPLC(直接注射，360nm处紫外检测)和线上负离子电喷射质谱分析所得反应混合物，分析4b即4a的2，4-二硝基苯腙(2，4-DNP)衍生物和5b即5a的2，4-DNP衍生物的存在。这种技术既快速又高度灵敏。但是，这种测定法当应用于生物样品时有许多限制。这些限制包括在360nm处有紫外吸收的其他生物化合物的干扰，缀合反应过程中4b转化成5b，以及在低浓度胆甾醇臭氧化产物下缀合反应效率下降。
因此，测试了新的方法，以确证是否可以提高测试灵敏度。该方法涉及将胆甾醇臭氧化产物缀合到具有荧光生色团的肼，然后进行荧光检测和HPLC分析。所选的荧光生色团是丹磺酰基团。这个测定法涉及在上述的酸性条件下用丹磺酰肼使抽提的胆甾醇臭氧化产物衍生化。丹磺酰肼与胆甾醇臭氧化产物4a反应的产物是如下图示的4d。

丹磺酰肼与胆甾醇臭氧化产物5a反应的产物是如下图示的5c。
在多种溶剂中评估了丹磺酰肼衍生化的反应效率，所述溶剂如己烷、甲醇、氯仿、四氢呋喃、乙腈和异丙醇(IPA)。由此分析确认，就反应效率和胆甾醇臭氧化产物4a自发发生羟醛缩合生成5a的速率最低而言，IPA是最佳溶剂。用化学合成的真实丹磺酰腙标准品4d和5c(图9)，通过HPLC来定量反应效率。37℃下，胆甾醇臭氧化产物4a与丹磺酰肼(200μM)和硫酸(100μM)于IPA中衍生化48小时，形成保留时间(RT)为约11.2分钟的4a腙衍生物4d，其效率是86.0±8.0％。重要的是，在衍生化过程中，只有1.3％的5c由4a或4d的羟醛缩合所形成。在0.01-100μM的5a浓度范围内，5a转化成其丹磺酰腙衍生物5c(RT～19.4分钟)的效率是83±11％。丹磺酰腙4d和5c的灵敏度水平为～10nM。
为确定4a和5a胆甾醇臭氧化产物从血浆样品抽提并被衍生化的效率，使人血浆样品掺加5a，然后抽提，用2，4-DNP或丹磺酰肼缀合。两种方法检出的缀合腙的含量没有显著差异；有37.5±1.9％衍生为丹磺酰腙5c，有31±8.9％以2，4-DNP腙5b回收。
同位素稀释-气相色谱与线上质谱联用(ID-GCMS)目前，大多数测定富胆甾醇组织如血液(血浆)和动脉粥样硬化动脉中的氧甾醇的分析方法，是基于带火焰离子化检测(FID)或选择离子检测(SIM)的GC。SIM法优于FID法的优点在于检测的特异性。在生物基质中分析氧甾醇要求有这种特异性。SIM策略的关键性方面在于内标的使用。最常用的是5α-胆甾烷。参见Jialil，I.；Freeman，D.A.；Grundy，S.M.Aterioscler.Thromb.1991，11，482-488；Hodis，H.N.；Crawford，D.W.；Sevanian，A.Atherosclerosis 1991，89，117-126。但是，优选的方法是使用氘标记内标的GC-MS，因为它既灵敏又有特异性，可针对不同分析物的不同回收率进行校正。Dzeletovic，S.；Brueuer，O.；Lund，E.；Diszfalusy，U.Analytical Biochem.1995，225，73-80。氘化内标的作用有两重。首先，它们通过使同位素丰度与浓度建立关联，使得可以进行定量。其次，在抽提程序前加入已知量的氘化分子使得可以评估胆甾醇臭氧化产物的抽提效率。Leoni，V.；Masterman，T.；Patel，P.；Meaney，S.；Diczfalusy，U.；Bjrkhelm，I.J.Lipid.Res.2003，44，793-799。
如下所示从[26，26，26，27，27，27-D]-胆甾醇(氘代3c)制备六氘代胆甾醇臭氧化产物D6-4a和D6-5a。
在合成的第一步(a)中，在78℃下将臭氧吹入D6-3c的氯仿-甲醇(9∶1)溶液中，产生D6-4a。在第二步(b)中，将D6-4a溶于DMSO中，在室温下与脯氨酸反应2.5小时，产生D6-5a。
D6-4a和D6-5a用作内标，在内部Agilent GC/MS上测试GC/MS方法的灵敏度。在典型的方法中，通过在37℃氩气氛下用吡啶和BSTFA处理2小时，使真实胆甾醇、4a、5a、D6-胆甾醇、D6-4a和D6-5a的样品转化成它们的三甲基甲硅烷醚。真空除去挥发物后，将残余物溶于二氯甲烷中，然后转移到自动进样器小瓶中。
然后在连接到5973 Inert MSD的Agilant Technologies 6890GC(带分流/不分流进样系统和7683自动注射器组件)上进行GC-MS。在完全离子扫描模式下操作质谱仪。观察到的保留时间(RT)和M+离子如下臭氧化产物4a和5a(RT＝29.6分钟，M+354)；D6-4a和D6-5a(RT＝29.6分钟，M+360)；胆甾醇(RT＝27.2分钟，M+329)，D6-胆甾醇(RT＝27.2分钟，M+335)。GC-MS中胆甾醇臭氧化产物4a和5a的推导片段如下所示。
如上所示，胆甾醇臭氧化产物4a和5a都产生M+约354的片段。氘化(D6)4a和5a胆甾醇臭氧化产物产生M+约360的片段。
因此，在GC-MS测定中没有观察到胆甾醇臭氧化产物4a和5a之间的差别，可能因为在甲硅烷化步骤中胆甾醇臭氧化产物4a转化成5a。因此，M+354(或360)的量是真实4a和5a胆甾醇臭氧化产物的浓度的量度。354离子峰的面积与浓度成线性关系，对于胆甾醇臭氧化产物，至今为止测出的较低水平的灵敏度是10fg/μL(相当于前面实施例中描述的LC/MS测定的检出限提高约2-对数)。
通过从临床切除的颈动脉斑块物质抽提胆甾醇臭氧化产物，进一步验证GCMS测定。从进行颈动脉动脉内膜切除术的患者获得用于常规分析的颈动脉动脉内膜切除术组织(n＝2)，用组织均质机均质10分钟(在氩气下)，然后抽提到CHCl3/MeOH中。如上所述将抽提物甲硅烷化，然后进行GC-MS分析(图10和11)。离子丰度对时间的GC-MS迹线表明，存在许多仍有待明确的氧甾醇。但是，可清楚分辨合并的臭氧解产物4a和5a(RT＝22.49分钟)。
这些数据明确证实了进行整体抽提和GC-MS测定以分析生物样品中4a和5a胆甾醇臭氧化产物的可行性，并验证了前面实施例中所述的关于动脉粥样硬化斑块物质分析的结果。
胆甾醇臭氧化产物4a和5a的免疫组织化学定位如上所述，用化合物15a的KLH缀合物(为胆甾醇臭氧化产物4a类似物)免疫小鼠。单克隆抗体通过杂交瘤方法产生。11C5和7A7这两种单克隆抗体对胆甾醇臭氧化产物5a有良好的结合亲和力(＜1μM)，对胆甾醇有极好的特异性(亲和力低1000倍)。
针对4a类似物半抗原的抗5a抗体的产生毫不奇怪，因为如上显示，胆甾醇臭氧化产物4a加入到血液中导致其立即转化成5a。
来自ApoE缺陷型小鼠的主动脉冷冻固定切片用抗体11C5和FITC标记的抗IgG第二抗体进行免疫组织化学染色，当其与用非特异性鼠抗体染色的连续切片相比时，证实胆甾醇臭氧化产物5a定位于血管内膜下层中的动脉粥样硬化区域。抗体与可溶性胆甾醇的吸附并不消除血管内膜下层的荧光。
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本文参考或提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的技术水平，这种参考专利或出版物的每一项通过引用结合到本文中，其程度如同它通过单独引用整体结合到本文中或者整体在本文中提出。本发明申请人保留将来自任何这种引用专利或出版物的任何和所有材料和信息完全结合到本说明书中的权利。
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其他实施方案落入以下权利要求书中。此外，在本发明特征或方面以马库什组方式描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员子集的方式来描述。
权利要求
1.一种分离的胆甾醇臭氧化产物，所述胆甾醇臭氧化产物在动脉粥样硬化斑块中产生。
2.权利要求1的臭氧化产物，所述臭氧化产物具有式4a
3.权利要求1的臭氧化产物，所述臭氧化产物具有式5a
4.权利要求1的臭氧化产物，所述臭氧化产物具有任一式6a-15a或7c
5.一种可检测的胆甾醇臭氧化产物衍生物，所述衍生物包括亚硫酸氢盐加合物、亚胺、肟、腙、丹磺酰腙、缩氨基脲或Tollins试验产物，其中所述胆甾醇臭氧化产物在动脉粥样硬化斑块中产生。
6.一种胆甾醇臭氧化产物腙衍生物，其中所述胆甾醇臭氧化产物在动脉粥样硬化斑块中产生。
7.权利要求6的腙衍生物，所述腙衍生物具有式4b或式4c
8.权利要求6的腙衍生物，所述腙衍生物具有式5b
9.权利要求6的腙衍生物，所述腙衍生物具有任一式6b-15b或10c
10.权利要求6的丹磺酰腙衍生物，所述丹磺酰腙衍生物具有式4d
11.权利要求6的丹磺酰腙衍生物，所述丹磺酰腙衍生物具有式5c
12.一种半抗原，所述半抗原具有式13a或13b 其中所述半抗原可用来产生可与胆甾醇的臭氧化产物或腙产物反应的抗体。
13.一种半抗原，所述半抗原具有式14a或14b 其中所述半抗原可用来产生可与胆甾醇的臭氧化产物或腙产物反应的抗体。
14.一种半抗原，所述半抗原具有式3c 其中所述半抗原可用来产生可与胆甾醇的臭氧化产物或腙产物反应的抗体。
15.一种半抗原，所述半抗原具有式15a 其中所述半抗原可用来产生可与胆甾醇的臭氧化产物或腙产物反应的抗体。
16.一种分离的抗体，所述抗体可结合胆甾醇臭氧化产物。
17.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体可结合胆甾醇臭氧化产物。
18.权利要求16或17的抗体，其中所述胆甾醇臭氧化产物具有式4a
19.权利要求16或17的抗体，其中所述胆甾醇臭氧化产物具有式5a
20.权利要求16或17的抗体，其中所述胆甾醇臭氧化产物具有任一式6a-14a或7c
21.权利要求16或17的抗体，其中所述抗体针对具有式15a的半抗原而产生
22.一种分离的抗体，所述抗体可结合胆甾醇臭氧化产物的腙衍生物。
23.权利要求22的分离的抗体，其中所述腙衍生物具有式4b或式4c
24.权利要求22的分离的抗体，其中所述腙衍生物具有式5b
25.权利要求22的分离的抗体，其中所述腙衍生物具有任一式6b-15b或10c
26.权利要求22的分离的抗体，其中所述分离的抗体针对具有式13a或14a的半抗原而产生
27.权利要求22的分离的抗体，其中所述分离的抗体针对具有式15a的半抗原而产生
28.一种分离的抗体，其中所述分离的抗体源自ATCC检索号为PTA-5427或PTA-5428的杂交瘤KA1-11C5:6或KA1-7A6:6。
29.一种分离的抗体，其中所述分离的抗体源自ATCC检索号为PTA-5429和PTA-5430的杂交瘤KA2-8F6:4或KA2-1E9:4。
30.一种检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括检测获自患者的试样中是否存在胆甾醇臭氧化产物。
31.权利要求30的方法，其中所述臭氧化产物由动脉粥样硬化斑块产生。
32.权利要求30的方法，其中所述试样是血清、血浆、血液、动脉粥样硬化斑块物质、尿液或血管组织。
33.权利要求30的方法，其中所述臭氧化产物是具有式4a的化合物
34.权利要求30的方法，其中所述臭氧化产物是具有式5a的化合物
35.权利要求30的方法，其中所述臭氧化产物是具有任一式6a-15a或7c的化合物
36.权利要求30的方法，其中所述方法进一步包括使试样与亚硫酸氢盐、氨、席夫碱、芳族或脂族肼、丹磺酰肼、Gerard试剂、Tollins试验试剂反应，并检测由这种反应形成的胆甾醇臭氧化产物的衍生物。
37.权利要求30的方法，其中所述方法进一步包括使试样与肼化合物反应，以产生胆甾醇臭氧化产物的腙衍生物。
38.权利要求37的方法，其中所述肼化合物是2，4-二硝基苯肼。
39.权利要求37的方法，其中所述腙衍生物具有式4b或式4c
40.权利要求37的方法，其中所述腙衍生物具有式5b
41.权利要求37的方法，其中所述腙衍生物具有任一式6b-15b或10c
42.权利要求30的方法，其中所述方法进一步包括使试样与丹磺酰肼反应，以产生胆甾醇臭氧化产物的丹磺酰腙衍生物。
43.权利要求42的方法，其中所述丹磺酰腙衍生物具有式4d或5c
44.权利要求30的方法，其中所述方法进一步包括使试样与可结合胆甾醇臭氧化产物的抗体接触。
45.权利要求44的方法，其中所述抗体针对具有式13a或14a的半抗原而产生
46.权利要求44的方法，其中所述抗体针对具有式15a的半抗原而产生
47.权利要求44的方法，其中所述抗体源自ATCC检索号为PTA-5427或PTA-5428的杂交瘤KA1-11C5:6或KA1-7A6:6。
48.权利要求44的方法，其中所述抗体源自ATCC检索号为PTA-5429和PTA-5430的杂交瘤KA2-8F6:4或KA2-1E9:4。
49.权利要求44的方法，其中所述抗体可结合具有式4a的化合物
50.权利要求44的方法，其中所述抗体可结合具有式5a的化合物
51.权利要求44的方法，其中所述抗体可结合具有任一式6a-15a或7c的化合物
52.一种检测胆甾醇臭氧化产物是否由患者中的动脉粥样硬化斑块释放的方法，所述方法包括检测获自患者的试样中是否存在胆甾醇臭氧化产物，其中所述臭氧化产物是式5a的化合物
53.一种检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括将2，4-二硝基苯肼加入到获自患者的试样中，检测试样中是否存在胆甾醇臭氧化产物的腙衍生物。
54.权利要求53的方法，其中所述腙衍生物具有式4b、4c、5b、6b、7b、8b、9b、10b、10c、11b、12b、13b、14b或15b
55.一种检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括将丹磺酰肼加入到获自患者的试样中，检测试样中是否存在胆甾醇臭氧化产物的丹磺酰腙衍生物。
56.权利要求55的方法，其中所述丹磺酰腙衍生物是具有式4d或5c的化合物
57.一种检测试样中是否存在胆甾醇臭氧解产物的方法，所述方法包括使巨噬细胞与试样接触，并确定巨噬细胞对脂质的摄取是否增加。
58.一种检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括使巨噬细胞与获自患者的试样接触，并确定巨噬细胞对脂质的摄取是否增加。
59.一种检测试样中的胆甾醇臭氧解产物的方法，所述方法包括使低密度脂蛋白与试样接触，并观察低密度脂蛋白的二级结构是否变化。
60.一种检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括使低密度脂蛋白与获自患者的试样接触，并观察低密度脂蛋白的二级结构是否变化。
61.一种检测试样中的胆甾醇臭氧解产物的方法，所述方法包括使脱辅基蛋白质B100与试样接触，并观察脱辅基蛋白质B100的二级结构是否变化。
62.一种检测患者中的动脉粥样硬化的方法，所述方法包括使脱辅基蛋白质B100与获自患者的试样接触，并观察脱辅基蛋白质B100的二级结构是否变化。
63.权利要求57-62中任一项的方法，其中所述低密度脂蛋白或脱辅基蛋白质B100的二级结构通过圆二色性观察。
全文摘要
本发明涉及由动脉粥样硬化斑块物质产生的胆甾醇臭氧化产物的检测，还涉及与胆甾醇积累和氧化有关的血管病症的检测方法。
文档编号C07C49/00GK1878787SQ200480032482
公开日2006年12月13日 申请日期2004年9月3日 优先权日2003年9月5日
发明者P·温特沃思, R·A·莱纳 申请人:斯克里普斯研究学院