BACE455,人β－分泌酶的可变剪接变体的制作方法

专利名称：BACE455,人β－分泌酶的可变剪接变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及遗传学、生物化学、药物化学和医学领域。本发明更尤其公开了参与神经病理学病症的人基因变体的鉴定，和用于所述疾病和相关病症的诊断、预防和治疗以及用于治疗活性药物筛选的方法。本发明涉及催化活性的β-分泌酶(Memapsin2，BACE)变体，和编码其的核酸。本发明可用于鉴定抑制特定BACE异构型的活性的试剂和影响神经病理学病症，包括阿尔茨海默氏病和痴呆的发生、发展或进展的试剂和疗法。
背景技术：
目前广泛认为遗传多样性的产生中可变RNA剪接的重要性为编码超过一种mRNA转录本的单基因的最重要途径中的一种(连同可变启动子和可变聚腺苷酸化的应用)。产生于可变剪接的前mRNA或mRNA异构型在稳定性、翻译能力或编码的蛋白质序列方面可能不同，每方面都可改变所编码蛋白质的功能。
这可在凋亡领域得到最好的例证(Jiang和Wu，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.22064-72(1999))。可变剪接的改变，尤其是标准序列在内含子/外显子交界处的突变可能引起影响基因表达并且产生疾病的异常剪接模式。最近Cooper等(1998)表明至少10％的人遗传疾病与产生RNA剪接缺陷的突变有关；参见例如，Cooper等.，Nucleic AcidsRes.26285-287(1998)。
在诸如癌症、神经变性病症、炎症/哮喘和其他新陈代谢病的广泛病状中观察到共有剪接信号中的散发性突变。RNA剪接缺陷可包括外显子遗漏(exon skipping)、内含子保留和由于隐匿剪接位点的利用或新剪接共有序列的产生的新剪接事件(Lopez，Annu.Rev.Genet.32279-305(1998))。细胞剪接因子活性、水平或氨基酸序列的改变可影响剪接的效率或可变剪接的调控。例如，运动神经元存活基因(SMN)核苷酸序列中单核苷酸的存在调控该基因的剪接，并且引起脊髓性肌萎缩(Lorson等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，966307-6311(1999))。取自患有散发性阿尔茨海默氏病的病人的人脑中，包括a)由ps1基因的外显子9缺失引起的蛋白质早老素-1(PS1)氨基酸序列的改变，b)编码早老素2(ps2基因)基因的外显子5缺失，和c)(在散发性额颞痴呆的病例中)ps2基因外显子5的异常剪接的剪接事件参与神经病理病变(Isoe-Wada.等，Eur J Neurol，6，163-167(1999)；Sato等.J.Biol.Chem.2762108-2114(1991))。
阿尔茨海默氏病(AD)为脑中淀粉样蛋白斑、神经原纤维缠结的大量生成、神经胶质增生和神经元损失的破坏退行性病症(Hardy等.Nat.Neurosci 1355-358(1998)；Selkoe，D.J.InAlzheimer disease，Ed 2(Terry，R.D.，Katzman，R.，Bick，K.，Sisodia，S.S.，eds)，pp 293-310.PhiladelphiaLippincott Williams和Wilkins(1999))。大多数患部为皮层、海马、脑下脚、海马回和扁桃体。AD病人具有增进的记忆损失、智力功能和技能、人格改变和精神分裂症的问题。AD为老年人痴呆的主要原因并且没有用于该神经变性的有效的减轻或预防疗法。
一些遗传和后天因素已被认为是产生AD的机制；其包括遗传易感性、感染物、毒素、金属、头部损伤和血管痴呆。通常认为，负责淀粉样前体蛋白(APP)蛋白酶解加工的胞内途径的调节障碍导致称为A-β1-42肽--A-β肽的一种形式形成的增加，所述A-β1-42肽尤其为致淀粉样的，目前看来其是AD病理生理病变的关键(Selkoe，Neuron32177-180(2001))。
该A-β肽也为脑血管淀粉样沉积物的主要蛋白质组分。淀粉样蛋白是以β-折叠排列的丝状物质。该A-β肽为包含高达43个氨基酸的疏水肽。已表明A-β肽以许多方式对神经元产生毒性，包括通过活性氧(ROS)的诱导、改变的基因转录的诱导，其引起对兴奋毒性敏感性的增强，和其他通常与神经变性病变相关的过程((Ramsden等.，J.Neurochem.79699-712(2001)；Shukla等.，J.Cell.Path.5241-249(2002)；Green和Peers，Neurochem.77953-956(2001)；Kowall等.，Neurobiol.Aging 13537-542(1992)；MacManus等.，J.Biol.Chem.2754713-4718(2000))。APP、早老素1和2(分别为PS1和PS2)中的突变大大改变了APP的加工，导致A-β1-42形成的增加。还在最多活至30岁的患有唐氏综合症的高龄病人中检测到淀粉样蛋白斑。唐氏综合征中观察到的APP表达的上调可能为唐氏综合征病人中AD发展的病因(Rumble等.，N.Engl.J.Med.3201446-52(1989)；Mann，Neurobiol.Aging 10397-399(1989))。淀粉样蛋白斑也存在于自然老化的脑中，虽然数量较少(Vickers等.，Exp.Neurol.1411-11(1996))。
目前已知人APP的不同构型大小范围为695-770个氨基酸，定位于细胞表面，并且具有单个C-末端跨膜结构域。已鉴定许多APPcDNA，包括三个最高丰度的构型，由Kang等.(1987)Nature 325733-736描述的APP695，其被指定为″正常的″APP；由Tanzi等.(1988)Nature331528-530描述的751个氨基酸多肽(APP751)；和由Kitaguchi等.(1988)Nature 331530-532描述的770个氨基酸多肽(APP770)。这些构型由单一前体RNA经可变剪接产生。与APP三个剪接变体的每一个共同的A-β肽源自邻近于并且包含一部分跨膜结构域的APP区域。
三种不同的蛋白酶在体内加工APP(Vassar和Citron，Neuron 27419-422(2000))。α-分泌酶裂解来自质膜的腔(lumenal)表面的APP 12个氨基酸残基；其不参与A-β的产生。通过APP经β-分泌酶(BACE)，一种I型膜结合的天冬氨酰蛋白酶的裂解进行Aβ产生的第一步。BACE裂解产生100-kD的可溶性胞外域构型(sAPP)-突出细胞表面的APP部分-和12-kD包含Aβ多肽N末端的99个氨基酸的膜-关联中间体肽(称为C99)(Vassar等.，Science 286(5440)735-41(1999)。C99肽随后经蛋白酶γ-分泌酶加工而产生大小或末端修饰的多种Aβ多肽(40-42和43个氨基酸残基为体内最常发现的多肽)(综述，参见Selkoe等.，Nature 399(6738Suppl)A23-31(1999)；Tekirian，J.Alzheimers.Dis.3(2)241-248.(2001))。紧邻β分泌酶切割位点的APP序列为EVKM*DAE。
这些残基在标准蛋白酶命名中标记为P4-P3-P2-P1*P1’-P2’-P3’，P1和P1’之间的切割位点经*标记。该区域中的突变，例如KM至NL的突变(称作Swedish突变)，可将APP转化为BACE更优选的底物。因此，APP中氨基酸序列的改变，其导致经BACE增进的APP裂解，增加了阿尔茨海默氏病发展的可能性(Citron等.，Nature 360(6405)672-674(1992))。实验证据显示APP加工是顺序进行的并且APP经β-分泌酶的裂解为γ-分泌酶-介导的APP加工的前提。APP跨膜区经γ-分泌酶的裂解产生40/42-残基的Aβ肽，其在脑中产量和累积的增加是阿尔茨海默氏病发病的关键事件(Selkoe，.Nature 39923-31(1999))。此外，现在已经清楚BACE可在γ-分泌酶后再次切割Aβ肽40-42而产生神经毒性的Aβ34肽，消耗Aβ40-42(Fluhrer等.，J.Biol.Chem.278(8)5531-5538(2003))。
现有的许多AD治疗策略集中于γ-分泌酶的抑制。然而，目前看来这种策略对于治疗或预防AD未必足够，或甚至合理。例如，目前清楚需要BACE而非γ-分泌酶裂解而产生，包括完整的Aβ多肽，并且当在培养的细胞中评估时是神经毒性的C99多肽本身还在AD脑中累积(Tekirian，J.Alzheimers.Dis.3(2)241-248.(2001))。此外，已表明γ-分泌酶抑制剂严重影响免疫系统并且导致C末端APP片段的累积，其自身是有毒的。此外，γ-分泌酶的抑制可能改变各种重要蛋白质的加工(Doerfler，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9312-9317(2001)，Ni等.，Science 2942179-2181(2001)，Marambaud，等.，EMBO J 211948-1956(2002)，Kim，等.，J.Biol.Chem.277499976-499981(2002))。虽然子宫内BACE活性的缺乏可避免致死，早老素1和2基因的双-基因敲除(knock-out)证实确实如此(Herreman，等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611872-11877(1999))。该毒性主要是参与细胞-至-细胞信号传导的Notch信号途径抑制的结果。实际上，Notch受体及其锯齿状同源配体以及Delta为已知的早老素的底物(DeStrooper，等.Nature 398518-522(1999))，并且由于Notch和其配体的裂解引起细胞信号传导中活性蛋白水解片段的释放(LaVoie和Selkoe，J.Biol.Chem.278(36)34427-34437(2003))。
相反，APP多肽β-分泌酶位点的体内加工认为是Aβ多肽产生的限速步骤(Sinha，S.&Lieberburg，Proc Natl Acad Sci USA.96(20)11049-53(1999)；Vassar，Adv.Drug Deliv.Rev.54(12)1589-1602(2002))。BACE似乎不参与其他生理学重要蛋白质的产生(Cai等.，Nat.Neurosci 4233-234(2001)；Luo等.，Nat.Neurosci 4231-232(2001))。因此，BACE似乎可作为最强的治疗靶标用于降低或抑制Aβ的产生。
BACE作为非活性的前酶合成。在分泌途径中的成熟期间，BACE在4N-连接位点的3处糖基化并且与其前肽结构域经蛋白酶的原蛋白质转换酶家族的成员分离。此外，BACE还在其胞质结构域内的半胱氨酸残基处进行棕榈酰化并且在其C末端进行磷酸化。在内质网(ER)中核糖基化后，BACE在靶向至核内体系统之前快速而有效地运输至高尔基体(Fluhrer，R.等；J Biol Chem.278(8)5531-5538(2003))。
迄今为止，已分离了BACE的三种异构型BACE476、BACE457和BACE432。所有这些异构型是通过该基因外显子3区域的选择性利用而框内缺失产生的，并且即使有的话，所有都表现出比BACE501更低的APP加工活性(Bodendorf，等.，J.Biol.Chem.276(15)12019-12023(2001)，Zohar等.，Brain Res.Mol.Brain Res.115(1)63-68(2003)，Tanahashi和Tabira，Neurosci.Lett.307(1)9-12(2001))。
发明概述本发明涉及有关人β-分泌酶(BACE)新异构型鉴定的组合物和方法，其通过患有神经病理学病症的病人的脑组织选择性地表达(例如，人AD脑)，其具有催化活性并且其在药理学方面不同于现有的其他有活性的天然BACE异构型BACE501。这种BACE的新的神经病理学-特异性异构型，称为BACE455，已发现是因外显子4的缺失以及存在于外显子3和外显子5接合处的新核苷酸和对应的氨基酸序列的开发而产生。
在已公开的天然BACE晶体结构的基础上，可以预料本发明的新的异构型BACE455具有和BACE类似的三维结构，该蛋白酶活性部位内的2个天冬氨酸残基仍然彼此相对。然而，BACE455的活性部位更加敞开并且易于接近而因此相比天然的BACE分子可能产生显著提高的Aβ多肽水平。此外，BACE455缺乏负责BACE的失活和天然分子中活性调控的内部蛋白水解位点。因此，相比BACE和其他已知的BACE异构型，BACE455缺乏翻译后调控，具有改变的三维结构，并且很可能产生提高水平的病理性Aβ肽。BACE455在抑制分布图上明显不同于BACE501。这可通过利用得到很好描述的抑制剂展现。因此，当与其他已知的活性BACE异构型相比时，BACE455中外显子4的缺失产生了显著的药理学差异。
假设所观察到的这种异构型的使之与天然BACE区分开的功能和药理学性质可能促进和选择性地驱动哺乳动物，尤其是人受试者的病理性病症。
分离的BACE455及其区别型的片段和对应的核酸可用于与BACE455有关的神经病理学病症的诊断和用于药物，尤其是BACE455抑制剂的筛选，其在神经型失调，尤其是包括神经退行性失调和痴呆的神经病理学病症，更优选目前已知的涉及Aβ生成或累积的病症例如阿尔茨海默氏病和相关病症的治疗中具有治疗活性。
在本发明的另一个实施方案中提供了用于神经病理学病症治疗的方法，包括将BACE455转录、翻译或活性的抑制剂施用于受感染的组织。
″神经病理学病症″指一种或多种病症，包括但不限于，运动神经元病(ALS)、唐氏综合征、帕金森综合症、多发性硬化、弥漫的大脑皮层萎缩症、雷维小体(Lewy-body)痴呆、皮克病(Pickdisease)、中脑皮质边缘(mesolimbocortical)痴呆、丘脑退化、延髓麻痹、亨廷顿舞蹈病(Huntington chorea)、皮层-纹状体-脊髓退化、皮层-基底神经节退化、大脑小脑退化、伴随痉挛下肢轻瘫的家族性痴呆、葡聚糖小体病、香-德综合征(Shy-Drager syndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩、进行性核上麻痹、变形性肌张力障碍、哈斯二氏疾病(Hallervorden-Spatzdisease)、Meige综合症、家族性震颤、痉挛性抽搐(Gilles De LaTourettte)综合症、棘红细胞舞蹈病、Friedreich共济失调、Holmes家族性皮层小脑萎缩、AIDS相关的痴呆、格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、进行性脊髓性肌萎缩、进行性延髓麻痹、黄斑病和视网膜变性，例如非-渗出性老化相关性黄斑变性(ARMD)、渗出性老化相关性黄斑变性、原生性脊髓侧索硬化、遗传性肌肉萎缩、痉挛性截瘫、腓骨肌肉萎缩、肥大间隙的多发性神经病、多神经炎型遗传性运动失调、眼神经病、糖尿病性视网膜病、阿尔茨海默氏病和眼肌麻痹。眼病症的实例包括但不限于，青光眼，包括开角青光眼、高眼压、黄斑病和视网膜变性，例如非-渗出性老化相关性黄斑变性(ARMD)、渗出性老化相关性黄斑变性(ARMD)、脉络膜的新血管形成、糖尿病性视网膜病、中枢性严重脉络膜视网膜病、黄斑囊样水肿、糖尿病斑点浮肿、近视视网膜变性、炎症性疾病，例如急性多点板状色素上皮病变、贝切特氏病、Birdshot视网膜脉络膜病、传染病(梅毒、Lyme、肺结核、弓形体病)、中间葡萄膜炎(ParsPlanitis)、多点脉络膜炎、多个易消失性白点综合症(MEWDS)、眼结节病、后巩膜炎、匐行脉络膜炎、视网膜下纤维化和葡萄膜炎综合症、Vogt-Koyanagi-Harada综合症、点状内脉络膜病、急性后部多点板状色素上皮病变、急性视网膜色素上皮炎、急性斑点视神经网膜病；血管和渗出性疾病，例如糖尿病性视网膜病、中枢性视网膜动脉阻塞性疾病、中枢性视网膜静脉闭塞、散发性血管内凝血病、分枝视网膜静脉闭塞、高血压基底转变、眼缺血性综合症、视网膜动脉小动脉瘤、Coat氏病、近窝区毛细血管扩张、半视网膜静脉闭塞、Papillophlebitis、中枢性视网膜动脉闭塞、分枝视网膜动脉闭塞、颈动脉病(CAD)、冻伤分枝脉管炎、镰状细胞视网膜病及其他血红蛋白病、血管样纹、家族性渗出性Vitreoretinopathy、Eales病、外伤性的、外科手术的和环境性的病症，例如交感性眼炎、眼色素层炎视网膜病、视网膜脱离、创伤、视网膜激光、光动力疗法、光致凝结、手术期间的灌注不足、放射疗法视网膜病、骨髓移植视网膜病；增生性病症，例如增生性玻璃体视网膜病和外视网膜；传染性病症，例如眼组织胞浆菌病、眼弓蛔虫病、眼组织胞浆菌病综合症(POHS)、眼内炎、弓形体病、与H1V感染有关的视网膜疾病、与HIV感染有关的脉络膜病、与HIV感染有关的眼色素层炎病、病毒视网膜炎、急性视网膜坏死、进行性外视网膜坏死、真菌视网膜疾病、眼梅毒、眼结核、弥漫性的单侧近尖的视神经网膜炎、蝇蛆病；遗传病症，例如色素性视网膜炎、与视网膜营养不良有关的全身性病症、先天静止夜盲、圆锥体营养不良、Stargardt病和基底Flavimaculatus、Best病、视网膜色素上皮的模式营养不良、X-关联的视网膜分裂、Sorsby基底营养不良、良性的同轴黄斑病、Bietti晶状体营养不良、弹力纤维性假黄瘤；视网膜损伤，例如斑点孔、巨大视网膜裂孔；视网膜肿瘤，例如与肿瘤有关的视网膜病、RPE的先天肥大、后眼色素层黑色素瘤、脉络膜血管瘤、脉络膜骨瘤、脉络膜转移、视网膜和视网膜色素上皮的组合型错构瘤、成视网膜细胞瘤、眼底的血管增生性肿瘤、视网膜星形细胞瘤和眼内淋巴瘤。
″分离的″指分子存在于和通常未经人的介入而天然存在的环境不同的环境中。因此，例如″分离的BACE455″包括细胞裂解物中所含的天然-产生的BACE455、纯化或部分纯化的BACE455、重组的BACE455以及存在于异源宿主细胞或培养物中的BACE455，例如来自任何生物体(包括，不限于，人、大鼠、猴或其他哺乳动物细胞、细菌或真菌细胞或昆虫细胞)的组织培养细胞。
在本发明的一个实施方案中，描述了参与BACE455蛋白质活性选择性抑制的方法。所述方法可治疗性地用于抑制神经病理学病症的发展，所述病症例如不限于，阿尔茨海默氏病、其他的痴呆、青光眼、帕金森氏症、ALS和中风的结果。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码BACE455的BACE455mRNA或其特有片段、BACE455蛋白质，或BACE455蛋白质的任一特有片段在筛选抑制Aβ肽产生的分子中的应用。
优选本发明的蛋白质或多肽的片段包括至少含有10个连续氨基酸序列的氨基酸，更优选至少含有9个连续氨基酸序列的氨基酸，更加优选至少含有8个连续氨基酸序列的氨基酸，更加优选至少含有7个连续氨基酸序列的氨基酸，更加优选至少含有6个连续氨基酸序列的氨基酸，更加优选至少含有5个连续氨基酸序列的氨基酸。
优选本发明的核酸或多核苷酸的片段包括至少含有30个连续核苷酸序列的核苷酸，更优选至少含有27个连续核苷酸序列的核苷酸，更加优选至少含有24个连续核苷酸序列的核苷酸，更加优选至少含有21个连续核苷酸序列的核苷酸，更加优选至少含有18个连续核苷酸序列的核苷酸，更加优选至少含有15个连续核苷酸序列的核苷酸。
″特有的″当用于描述编码BACE455蛋白质或其片段的核酸时，指所述核酸的核苷酸序列包括非常接近源自BACE455DNA序列外显子5的至少一个密码子的源自外显子3的至少一个密码子，其编码具有由所述核酸或片段编码的相同氨基酸序列的一种蛋白质或其片段，或者与所述核苷酸序列精确互补。在具体的实施方案中，特有的核酸包括含有存在于BACE455外显子3和外显子5接合处的至少5个连续核苷酸的核苷酸序列。
″特有的″当用于描述BACE455蛋白质或其片段时，指包含由编码BACE455蛋白质或其片段的特有核酸编码的氨基酸序列的肽、多肽或蛋白质。
利用市售的软件程序和有机化学和酶学领域熟知的技术，本领域技术人员可利用BACE455蛋白质、其特有的片段和编码这些分子的核酸设计新的BACE455抑制剂。所述抑制剂可用于阿尔茨海默氏病及其他神经病理学病症的诊断和治疗和/或预防。用于制备BACE455抑制剂的方法可使用本领域熟知的技术，例如不限于，组合的和其他化学文库、化学文库的高通量筛选中分离的BACE455蛋白质或其特有片段的使用、利用基于构效关系的药物化学技术的合理药物设计等等。本发明的多肽可用于常规的低容量筛选法以及高-通量筛选(HTS)形式中。所述HTS形式包括例如，96-和384-孔微量滴定板(参见Bennett，等.，J.Mol.Recognition，852-58(1995)；和Johanson，等.，J.Biol.Chem.，270(16)9459-9471(1995))。可用于制备BACE抑制剂的例证性方法已在WO9967221、WO9967220、WO9967219、WO9966934、WO9932453、WO9838177、WO9828268、WO9822494、WO9822493、WO9822441、WO9822433和WO9822430中公开。用于制备化合物组合文库的方法在参考文献例如Turner等.，Biochemestry 4010001-10006(2001)或Gruninger-Leicht等.，J.Biol.Chem.2774687-4693(2002)中公开。
BACE455抑制剂可选自小分子抑制剂、肽、反义寡核苷酸、iRNA和封闭抗体。因此，BACE455的抑制包括抑制BACE455转录、剪接、翻译和/或体内活性的试剂的使用。
本发明优选，而不仅仅涉及相比其他已知的BACE异构型，对BACE455的抑制选择性地表现出2倍，或5倍，或10倍，或30倍，或100倍，或1000倍，或＞1000倍选择能力的BACE455抑制剂。相比缺乏上述选择能力，或优选抑制天然的BACE而不是BACE455的化合物，所述抑制剂具有改善的效用。对抑制BACE455具有2倍、5倍、10倍或更大选择能力的选择性BACE455抑制剂拥有许多益处，包括对抑制病理性疾病发展的更大效力、由于非-病理性Aβ产生的更低抑制带来的降低的副作用，和由于上述化合物提高的选择能力带来的改进的安全性。
BACE455蛋白质、核酸、这些分子的特有片段和BACE455抑制剂可用于神经病理学病症的诊断目的。特异性结合BACE455多肽或核酸，或其特有片段的化合物可帮助鉴定易于发生AD的个体。另外，可使用具有治疗效果的BACE455抑制剂治疗和/或预防阿尔茨海默氏病和与Aβ40或42肽升高的水平和淀粉样蛋白斑肽的累积相关的病症，以及其他神经病理学病症。
在本发明的另一个方面，新的外显子4的缺失和新的外显子3和5的接合可用于诊断和/或评估神经病理学病症的目前的或可能的发展。例如，基于体外核酸和/或抗体测定法的发展，包括人组织或液体的定量测定，可以确定病人是否或倾向于患上涉及BACE455的产生和表达的神经病理学病症。上述测定法可包括不限于，通过例如Northern印迹、基于寡核苷酸接合阵列的核酸检测；例如RT-PCR、定量PCR和连接-PCR及其他方法的核酸扩增方法。这些方法可包括能选择性地或特异地检测包括新剪接点的分析物区域的寡核苷酸探针的使用。BACE455还可利用其特定配体，例如特异性识别包括新剪接点的BACE455区域的抗体而直接检测，作为一个例子，该区域包括BACE455蛋白质190至235的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明包括细菌、昆虫和哺乳动物细胞或细胞系以及转基因的非-人动物，其特异性表达BACE455异构型或其特有片段，而不是天然的BACE501或其他异构型。优选的宿主细胞为哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞的非限制性实例包括小鼠胚胎培养的NIH3T3系(Jainchill等.J.Virol.4549-553(1969))、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚肾细胞系293或成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞系(Biedler等.Cancer Res.383751-3757(1978))。例如，特异表达BACE455异构型的细胞系可通过(a)将BACE455表达载体，例如举例来说，具有克隆入表达盒的BACE455全长cDNA的pCDNA3载体转染入目的细胞类型和(b)利用对应于由该表达载体编码的抗性基因的抗生素或选择试剂选择所转染的细胞而获得。用于产生含有稳定转化体的克隆细胞系的方法例如在Wigler等.(Cell 11223-232(1977))；Kriegler(Gene Transfer and Expression.Stockton Press，New York，New York(1990))或Gramer&Goochee(Biotechnol.Prog.9(4)366-73(1993))中公开。或者，所转染的细胞可用于瞬时转染的测定法中以在无进一步选择时监测BACE455的活性。如本领域所知的，转基因动物可通过利用分子生物学领域熟知方法的重组技术获得，其在上述参考文献如Sambrook等.(Molecular Cloninga LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor N.Y.(1988))和Ausubel(Current Protocols in Molecular Biology(1989))中描述。
上述细胞系代表用于阻止Aβ加工的化合物的初步筛选工具，而非-人转基因动物将可用于研究Aβ依赖的痴呆的发展和用于鉴定体内抑制Aβ依赖的疾病发展的化合物。
附图简述

图1BACE455的核酸(A，SEQ ID NO1)和氨基酸(B，SEQID NO2)序列以及与BACE501氨基酸序列的比对。
图2BACE455(A、C)和BACE501(B、D)在用表达BACE455或BACE501的构建体转染的NIH3T3细胞中的免疫定位。A、B在Triton X100-渗透的细胞上的BACE异构型利用多克隆的抗-hBACE(481-501)(C-三个胞内抗原表位)的胞内染色。C、D在Triton X100未渗透的细胞上BACE异构型利用多克隆的抗-hBACE(46-65)(N-三个胞外的抗原表位)的胞外染色。显微照相表明BACE455呈现与BACE501类似的胞内定位，有效地转运至细胞膜，其在此表现出与BACE501相当的胞外膜免疫反应性。
图3BACE455和BACE501在荧光生成的测定法中利用市售的BACE抑制剂III呈现出不同的抑制特点。显示的结果为3个独立实验中活性±SEM的百分比。
图4BACE455对来自在用空载体(Mock，M)或用表达BACE455(B)的构建体转染的SH-SY5Y细胞中内源性表达的APP异构型的C99片段产生的效果。MW分子量。
图5从在用表达BACE455的构建体转染的SH-SY5Y细胞中内源性表达的APP异构型产生C99肽由布雷菲德菌素A(BFA)和Gleevec抑制。
发明详述在第一个实施方案中，本发明涉及包括BACE455多肽所有或特有片段的多肽。BACE455氨基酸序列在图1中描述。术语″BACE455″或″BACE455多肽″指任何BACE多肽(优选人来源的)，其包括编码野生型BACE肽基因的外显子4的所有或部分缺失。
BACE455多肽特有片段优选的实例为包括氨基酸序列IARIIG(SEQ ID NO3)的那些片段。所述片段另外的实例为包括氨基酸序列EIARIIG(SEQ ID NO4)，通常选自EIARIIGG(SEQ ID NO5)、AEIARIIG(SEQ ID NO6)、AEIARIIGG(SEQ ID NO7)、AEIARIIGGI(SEQ ID NO8)、YAEIARIIG(SEQ ID NO9)、YAEIARIIGG(SEQID NO10)和YAEIARIIGGI(SEQ ID NO11)序列的多肽。最优选的片段为至少6、7、8、9或10个氨基酸长度。
包括特有的BACE455多肽片段的本发明多肽可包括BACE455或其变体的完整氨基酸序列。在这里的术语″变体″指包括BACE455多肽特有片段以及进一步包括相比图1中所述序列，具有一个或几个氨基酸突变、取代和/或插入的经修饰氨基酸序列的任何多肽。通常，所述BACE455变体缺乏全部的外显子4。优选的变体为天然-存在的变体，即源于多态性、剪接等等的BACE多肽，其缺乏外显子4。本发明最优选的多肽为人来源的和/或保留图1中BACE455特性的，尤其为至少BACE455-选择性的免疫特性和/或β分泌酶活性。
所述多肽可选择性地包括另外的残基或官能团，例如不限于，另外的氨基酸残基、化学或生物基团，包括标记、标签、稳定剂、靶部分、纯化标签、分泌肽、功能性反应基团等等。所述另外的残基或官能团可以是化学衍生的，以融合蛋白的氨基酸序列区域添加的，复合的或共价或非共价附着的。其还可包含天然的或非天然的氨基酸。多肽可以是可溶性形式，或附着(或复合或嵌入)至支持物，例如基质、柱、珠、膜、细胞、脂类或脂质体等等。
本发明的某些多肽可如此用于促使体外或体内Aβ肽的产生。其还可用于设计特异性试剂例如肽、抗体(和其衍生物)、拮抗剂、激动剂等等，其特异性地检测、结合或影响上述定义的BACE455多肽的表达或活性。多肽还可作为免疫原用于疫苗组合物中或者产生或检测或定量特异性抗体。
在又一个实施方案中，本发明包括含有编码如上定义的BACE455多肽，包括其特有片段的核苷酸序列的多核苷酸。该多核苷酸优选编码包括哺乳动物memapsin 2(BACE)蛋白片段的多肽，其中所述多肽缺乏全部的外显子4(由全长BACE蛋白的氨基酸190至235编码)。所述多肽的代表性实例包括图1中所述核苷酸序列(SEQ ID NO2)的全部或特有片段。
本发明的具体实施方案还包括含有在严谨条件下选择性地杂交至BACE455RNA特有片段(或其精确的互补物)的核苷酸序列的任何多核苷酸。更优选，所述选择性杂交的多核苷酸编码具有β-分泌酶活性的多肽。严谨条件指，例如，杂交滤膜在2×SSC/1％SDS中约42℃温育约2.5小时，随后滤膜在1×SSC/0.1％SDS中65℃洗涤15分钟4次。所用的方案在上述参考文献如Sambrook等.(Molecular CloningaLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor N.Y.(1988))和Ausubel(Current Protocols in Molecular Biology(1989))中描述。
在特别优选的实施方案中，所编码的BACE多肽包括人BACE蛋白的特有片段。
本发明的核酸、寡核苷酸和多核苷酸可以是DNA或RNA，例如基因组DNA、互补DNA、合成的DNA、mRNA或其类似物，包括例如，经修饰的核苷酸如3′烷氧基核糖核苷酸、甲基膦酸酯之类的，以及肽核酸(PNA)等等。多核苷酸可根据本领域熟知的技术，利用本申请所含的序列信息而产生，例如通过化学合成法、体外转录或通过重组DNA方法。尤其，多核苷酸可通过化学寡核苷酸合成、文库筛选、扩增、连接反应、重组技术和其组合产生。
本发明特定的实施方案属于编码包括具有如SEQ ID NO2所述氨基酸序列的BACE特有片段多肽的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可包括另外的核苷酸序列，例如调控区，即，启动子、增强子、沉默子、终止子等等，其可用于促进或调控BACE455多肽的表达。
本发明的多核苷酸可用于产生本发明的重组多肽。其还可用于设计特异性试剂例如引物、探针或反义分子(包括反义RNA、iRNA、适体、核酶等等)，其特异性地检测、结合或影响编码如上所定义BACE455多肽的多核苷酸的表达。其还可用作治疗分子(例如，作为工程病毒的一部分，例如不限于，基因治疗方案中的工程腺病毒或腺病毒相关病毒载体)或用于产生重组细胞或经遗传修饰的非-人动物，其例如在对化合物文库筛选用于调节BACE455活性的试剂中是有用的。
本发明的另外一方面为载体，例如包含如上定义的BACE455多核苷酸的表达或报告载体。所述载体可选自质粒、重组病毒、噬菌体、游离基因、人工染色体等等。许多上述载体为市售的并且可根据本领域熟知的重组技术产生，例如在如Sambrook等.，Molecular Cloning(2ded.Cold Spring Harbor Press 1989)的手册中所述的方法，其在此处整体引入作为参考。
本发明的另外一方面为用如上定义的多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。该宿主细胞可以是经遗传修饰的并且优选培养过的任何细胞。细胞可以是真核的或原核的，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、真菌、细菌细胞等等。代表性实例包括哺乳动物原代或所建立的细胞(3T3、CHO、Vero、Hela等等)以及酵母细胞(例如，酵母属、克卢费氏酵母属等等)和细菌(例如，大肠杆菌)。可理解的是本发明不限于任何具体的细胞类型，并且根据公知常识可应用于各种细胞。
核酸探针本发明多核苷酸的特定类型为核酸探针，其在严谨杂交条件下选择性杂交至编码BACE455多肽特有片段的核酸或其片段。如本领域所熟知的，″严谨杂交条件″取决于探针的长度和所得的杂交物中鸟嘌呤-胞嘧啶对与胸腺嘧啶(尿嘧啶)-腺嘌呤对的比率。
本发明上下文中，″探针″指具有多核苷酸序列的核酸或寡核苷酸，其能与BACE455RNA(或精确互补的核苷酸序列)的特有片段选择性杂交，并且其适于检测包括所述RNA或互补体的任何样品中BACE455RNA(或具有其精确互补核酸序列的核酸)的存在。探针优选与BACE455RNA的特有片段完全互补。探针通常包括8至1400个核苷酸长度之间，例如10和1000之间，更优选15和800之间，典型地为20和600之间的单链核酸。应当理解的是也可使用较长的探针。本发明优选的探针为8至600个核苷酸长度之间的单链核酸分子，其可特异性地杂交至BACE455RNA的特有片段。
本发明的特定实施方案为选择针对缺乏外显子4的BACE异构型的核酸探针、选择性杂交至所述异构型基因或RNA并基本上不杂交至至少一种包含全长外显子4的其他BACE异构型的核酸探针以及与这些精确互补的核酸探针。
本发明进一步特定的实施方案为选择针对BACE455RNA的核酸探针，即选择性杂交至所述BACE455基因或RNA并基本上不杂交至至少一种其他BACE异构型的核酸探针，以及与这些精确互补的核酸。
选择能力，当用于指示核酸杂交时，表示探针能杂交至靶序列而基本上不杂交至至少一种其他的BACE-编码核酸。
本发明优选的探针包括与BACE455RNA(或其精确互补体)的特有片段互补的序列。上述探针的特定实例包括核酸序列ATTGCCAGGATCATTGGASEQ ID NO12探针的序列可源自本申请提供的BACE455RNA的序列。可以进行核苷酸的取代以及探针的化学修饰。如上所公开的，所述化学修饰可以用于提高杂交物的稳定性(例如，插入基团或经修饰的核苷酸，如2′烷氧基核糖核苷酸)或标志探针。标记物的代表性实例包括不限于，放射性、荧光、发光、酶促标记物等等。探针可杂交至溶液、悬浮液中的，或附着于固相支持物，例如不限于，珠、柱、平板、基底(以产生核酸阵列或芯片)的靶核酸。
在一个实施例中，与BACE455RNA特有片段精确互补的15bpBACE455-选择性寡核苷酸探针用化学发光化合物例如Weeks等.，Clin.Chem.291474-1478(1983)，和Nelson等.，美国专利5,658,737通常所述的吖啶(例如，4-(2-琥珀酰亚氨基氧化羰基乙基)苯基-10-甲基吖啶9-甲酯氟磺酸酯)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯标记，两者此处合并作为参考。连接臂的伯胺反应杂交探针与所选NHS-吖啶酯的偶联如下进行。寡核苷酸杂交探针如上所述合成的连接臂偶联物在Savant SPEED-VAC干燥器中真空-干燥，随后溶于8μl的50％(v/v)DMSO中0.125M的HEPES缓冲液(pH8.0)中。2μl 25mM所需的NHS-吖啶酯另外加入该溶液。混合溶液并且在37℃温育20分钟。
另外3μl DMSO中的25mM NHS-吖啶酯加至该溶液并且温和混合，随后加入2μ10.1M HEPES缓冲液(pH8.0)，混合，并且使试管在37℃温育另外的20分钟。反应用5μl的0.1M DMSO HEPES缓冲液(pH8.0)中0.125M赖氨酸的加入终止，其温和混合入该溶液中。
标记的寡核苷酸通过30μl 3M乙酸钠缓冲液(pH5.0)、245μl水和5μ140mg/ml糖原的加入而从溶液回收。640微升冷却的100％乙醇加至试管，并且试管在干冰上保持5至10分钟。所沉淀的标记探针在冷冻微量离心机中利用标准转头15,000rpm沉降。吸去上清，而沉淀重溶于包含0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的20μ10.1M的乙酸钠(pH5.0)中。
11飞摩尔的标记探针杂交至不同量(0.00、0.01、0.02、0.05、0.20、0.50、2、5、20、50、200、500、2000和5000飞摩尔)的靶BACE455RNA。每组由包含100mM琥珀酸锂(pH5.0)、8.5％(w/v)十二烷基硫酸锂、1.5mM EDTA和1.5mM EGTA的100μl杂交反应液组成并且每一反应混合物在50℃温育50分钟。300微升包含150mM Na2B4O7(pH8.6)和1％(v/v)TRITON.X-100的溶液加至每一反应，并且混合物在50℃温育11分钟。反应混合物随后放入LEADER50光度计(Gen-Probe，Inc.)中，并且在200μl 0.1％(v/v)H2O2和1mM HNO3，接着200μl 1.5N NaOH的注射后在每一混合物中产生化学发光反应。第二次注射后，化学发光在300至650纳米的波长范围读数2秒，并且与阴性和阳性对照标准作比较。超过阴性对照的显著的化学发光表明BACE455-选择性杂交物的存在。
核酸引物本发明其他的选择性多核苷酸为用于扩增包括BACE455RNA或其精确互补体的特有片段区域的核酸引物。所述引物用来扩增BACE455-选择性核酸片段。
本发明特定的引物能选择性地与BACE455RNA或其精确互补体的部分杂交，其位于异构型-特异性核酸序列区域，更优选源于外显子3和外显子5之间新建接合的BACE455RNA，或其精确互补体区域的侧翼。术语″侧翼″指所述部分应该位于适合常规聚合酶活性的靶区域一定距离，例如，离新建接合处不超过300bp，优选不超过200、150100或，更优选离所述接合处上游50bp。所述引物的实例包括或与SEQ IDNO1中核苷酸区域567-704的侧翼序列的部分互补。所述引物的特定实例包括下列序列AGGCATCCTG(SEQ ID NO13)、GGGCTGGCCT(SEQ ID NO14)、ATGCTGAGAT(SEQ ID NO15)、TGCCAG(SEQ ID NO16)、GATCAT(SEQ ID NO17)、TGGAGGTATC(SEQ ID NO18)、GACCACTCGC(SEQ ID NO19)、TGTACACAGG(SEQ ID NO20)或CAGTCTCTGG(SEQ IDNO21)。
本发明其他的特定引物能与包含BACE455RNA或其精确互补体特有片段，更具体源于外显子3和外显子5之间新建接合的BACE455区域的异构型-特异性区域选择性地杂交。上述引物在仅当模板包含该异构型-特异性改变时扩增才发生这点上是有利的。通过利用上述引物，扩增产物的检测指示BACE455RNA的存在。相反，扩增产物的缺乏指示样品中不存在该特异性改变。上述引物的实例包括下列序列的全部或部分CAGGAT(SEQ ID NO22)、CCAGGATC(SEQ ID NO23)、GCCAGGATCA(SEQ ID NO24)或ATTGCCAGGATCATTGGA(SEQ ID NO25)。
本发明的另外方面还包括至少一对核酸引物，其中所述的一对引物包括正向和反向引物，并且其中所述的正向和反向引物允许BACE455RNA或其异构型-特定部分，或精确互补序列的选择性扩增。本发明进一步的实施方案为一对核酸引物，其中所述的对包括正向和反向引物，并且其中所述的正向和反向引物允许缺乏全部或部分外显子4的BACE RNA异构型的全部或异构型-特异性部分的选择性扩增。
本发明代表性的引物为约5至60个核苷酸长度，更优选约8至约35个核苷酸长度，进一步优选约10至25个核苷酸长度的单链核酸分子。其序列可从本申请中公开的BACE455核苷酸序列直接导出或推断出。优选完全互补，以确保高特异性。然而，可以允许一定的错配。
抑制性核酸本发明还涉及可特异性地改变BACE455多肽或包括其片段的多肽(或缺乏功能性外显子4的任何BACE多肽)的表达或活性的核酸分子。所述抑制性核酸包括反义核酸、iRNA、核酶、适体等等。这些抑制性核酸包括与靶异构型基因或RNA的部分互补，并且引起其转录或翻译特异性降低的核酸。绝对的互补，虽是优选的，但并不是必需的。
用于所述分子的产生和使用的技术为本领域技术人员所熟知，并且如下简单描述。寡核苷酸可通过本领域已知的标准方法合成，例如通过利用自动化的DNA合成仪(例如为可从Applied Biosystems，Inc.购买得到的)。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可通过Matsukura等.(Gene.198872343-7)等的方法合成。
反义脱氧核苷酸已广泛用于研究给定基因的作用(作为综述，参见Stein&Cheng，Science 2611004-12(1993)，并且可用在外显子-外显子的接合和靶特定的mRNA异构型上(Sugi等.Dev.Biol.15728-37(1993)；Mahon等.Exp Hematol.231606-11(1995)；Desire等.J.Neurochem.75151-163(2000))。
反义寡核苷酸可以为DNA或RNA或嵌合的混合物或衍生物或其改进型，单链的或双链的。寡核苷酸可在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链，例如(选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和其甲缩醛(formacetal)或类似物)处修饰，以改进分子、杂交的稳定性等等。寡核苷酸可包括其他附加的基团例如肽(例如，用于体内靶向宿主细胞受体)，或促进转运透过细胞膜或血脑屏障的试剂(Letsinger(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.866553-6556)，杂交-引发的裂解试剂(Krol(1988)Bio.Techniques6958-976)或嵌入剂(Zon(1988)Ann.N.Y.Acad.Sci.616161-72(1990))。
反义寡核苷酸可以为α-异头寡核苷酸，其与互补RNA以平行链形成特异性双链杂交物(Gautier等.(1987)Nucl.Acids Res.1566256641)。寡核苷酸为2′-O-甲基核糖核苷酸(Mayeda等.J.Biochem.108399-405(1990))，或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等.(1987)FEBS Lett.215327-330)。
还可将小干扰RNA用于哺乳动物细胞中而实现基因沉默(Elbashir等.Nature 411494-498；Brummelkamp等.Science 296550-553(2003)并且已成功用于可变剪接范围中以研究特异性异构型的功能关联(Celotto&Graveley，RNA 8718-724(2002))。核酶为能催化RNA特异性裂解的酶促RNA分子，也可用于阻止靶基因mRNA的翻译以及，由此靶基因产物的表达(Sarver等.(1990)Science 2471222-1225；Rossi(1994)Current Biology 4469-471)。核酶作用的机理包括核酶分子至互补靶RNA的序列特异性杂交，及随后内切核酸水解的裂解事件。锤头核酶为经修饰的核酶，其在位于和靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区位置裂解mRNA。锤头核酶的组成和产生为本领域所熟知且在Haseloff和Gerlach，1988(Nature)334585-591中更充分地描述。
这些抑制性核酸可在本申请中公开的序列基础上设计。
特异性配体本发明还涉及选择性结合如上公开的BACE455异构型或其特有片段的配体。
可包含不同类型的配体，例如特异性的抗体、合成分子、适体、肽等等。
在一具体的实施方案中，配体为抗体，或其片段或衍生物。因此，本发明的一个具体方面属于特异性结合BACE455-特异性表位，更优选通过外显子4(由SEQ ID NO9的氨基酸190至235编码)的全部或部分缺失产生的抗原表位的抗体。
在本发明范围内，抗体指多克隆抗体、单克隆抗体以及具有基本上相同的抗原特异性的其片段或衍生物。片段包括Fab、Fab′2、CDR区等等。衍生物包括单链抗体、人源化抗体、人抗体、多功能性抗体等等。
针对人BACE455蛋白的抗体可通过本领域通常所知的方法产生。例如，多克隆抗体可通过将蛋白质单独或与合适的蛋白质一起注射入非-人动物而产生。适当时间后，动物放血，回收血清并且用本领域已知的技术纯化(参见Paul，W.E.″Fundamental Immunology″第二版.RavenPress，NY，p176，1989；Harlow等.″AntibodiesA laboratory Manual″，CSH Press，1988；Ward等.(Nature 341(1989)544)。单克隆抗体可例如通过包括免疫B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合的Kohler-Millstein(2)技术(Kohler-Millstein，Galfre，G.，和Milstein，C，Methods Enz.73p.1(1981))制备。例如，上述抗原可注射入上述的小鼠中直至在小鼠血清中检测到多克隆抗体的应答。小鼠可再次加强注射，取出其脾脏并且根据各种方法进行与骨髓瘤的融合。单个存活的杂交瘤细胞首先通过其结合免疫抗原的能力，随后通过其免疫沉淀来自细胞的BACE的能力来检验抗-BACE抗体的分泌。
抗体″选择性针对BACE455多肽″指比其他BACE异构型更大程度地选择性结合BACE455多肽的抗体，即针对BACE455多肽或其包含抗原表位片段产生的抗体。虽然可能存在对其他抗原的非特异性结合，结合至靶BACE455多肽以较高的亲合力发生并且可以与非特异性结合可靠地区别开。优选的抗体为选择性针对包含外显子3和外显子5之间新建接合区的BACE455特异性结构域。选择性针对所述结构域的抗体允许样品中BACE455多肽存在的检测。配体可以可溶性形式，或涂布于表面或支持物上而使用。
合成抑制剂的特定实例包括Gleevec和布雷菲德菌素A。肽抑制剂的特定实例为BACE抑制剂III(SEQ ID NO3)。
检测和诊断本发明允许检测或诊断分析的执行，所述检测或诊断分析尤其可用于检测样品或患者中BACE455或对应核酸的存在、缺乏或量。术语″诊断″应当认为包括检测哺乳动物(优选人)样品中BACE455异构型、对应核酸和其片段、诊断(定性或定量)、药物基因组学、预后等等的方法。
在一个具体方面，本发明涉及检测样品，优选人组织样品中BACE455核酸或多肽或其片段的方法，包括将所述样品与其特异性配体接触并且测定复合物的生成。
本发明的一个特定目的为检测受试者神经退行性疾病或相关病症的存在或易感性的方法，该方法包括检测来自患者的样品中特有的BACE455核酸或多肽，尤其为缺乏全部外显子4的BACE异构型，更优选为分别具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2多核苷酸或氨基酸序列的BACE异构型的存在。
本发明的另一个实施方案为评估患者对神经退行性疾病或相关病症治疗应答的方法，该方法包括检测来自治疗前后不同时期受试者的样品中特有BACE455核酸或多肽的存在。
本发明还涉及测定神经退行性疾病或相关病症治疗效力的方法，该方法包括(i)提供来自所述治疗期间或之后受试者的组织样品，(ii)测定所述样品中BACE455核酸或多肽的存在和/或丰度和(iii)将上述的存在和/或丰度与来自所述受试者治疗之前或早期时取得的对照样品中所述核酸、多肽或片段的量进行比较。
样品中特有BACE455多肽或核酸的存在(或提高)为神经退行性疾病或相关病症的存在、易感性或发展阶段的指示。因此，本发明允许合适的治疗干预的设计，其更有效且更有针对性。此外，前-症状水平时的测定允许预防疗法的应用。
可通过各种技术进行样品中特有BACE455多肽或核酸的存在、缺乏或相对丰度的测定。更优选，该测定包括将样品与BACE455-选择性试剂例如如上述定义的探针、引物或配体接触，并且因此检测样品中最初BACE455多肽或核酸的存在，或测定其量。可在任何合适的装置，例如平板、微量滴定皿、试管、孔、玻璃、柱等等中进行接触。在具体的实施方案中，接触在涂布有试剂的基质，例如核酸阵列或特定的配体阵列上进行。基质可以是固体或半固体的基质例如任何合适的支持物，包括玻璃、塑料、尼龙、纸、金属、聚合物等等。基质可以是不同的形式和大小，例如载玻片、薄膜、珠、柱、凝胶等等。接触可以在适于试剂和样品的核酸或多肽间形成的可检测复合物，例如核酸杂交物或抗体-抗原复合物的任何条件下进行。
在一具体的实施方案中，该方法包括将来自受试者的样品与(涂有其的支持物)如上述定义的BACE455选择性抗体接触，并且测定免疫复合物的存在。可使用用于检测免疫复合物的各种熟知的方法，例如ELISA、放射免疫测定(RIA)等等。
在另一个具体的实施方案中，该方法包括将来自受试者的样品与(涂有其的支持物)如上述定义的BACE455选择性核酸探针在允许杂交发生的合适条件下接触，并且测定杂交物的存在。
在另一个具体的实施方案中，该方法包括将来自受试者的样品与如上述定义的核酸引物在允许核酸扩增发生的条件下接触，并且测定扩增产物(“扩增子”)的存在。可根据本领域本身已知的各种技术进行扩增，例如不限于，通过聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、转录-介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
检测样品中核酸的合适方法包括不限于，下列方法等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、等位基因特异性扩增、Southern印迹(用于DNA)、Northern印迹(用于RNA)、单链构像分析(SSCA)、荧光原位杂交(FISH)、凝胶迁移、发夹变性凝胶电泳、异源双链分析等等。
本发明的诊断方法可在体外、离体或体内优选体外或离体外进行。样品可以是源自受试者的任何生物样品，其视情况包含核酸或多肽。所述样品的实例包括液体、组织、细胞样品、器官、活组织等等。最优选的样品为血液、血浆、唾液、尿、精液等等。还可通过检验胎儿细胞或胎盘细胞进行产前诊断，例如，可根据常规方法收集样品并且直接用于诊断或储存。样品可在执行该方法前处理，以便提供或改进用于检验的核酸或多肽的有效性。处理可包括，例如下列的一种或多种细胞裂解(例如，机械的、物理的、化学的等等)、离心、抽提、柱层析等等。
治疗除裂解基于APP的底物外，重组人BACE还裂解具有序列LVNM/AEGD(Lin等.Proc Natl Acad Sci USA.97(4)1456-1460(2000))的底物，其为人早老素序列的体内加工位点序列。早老素1和早老素2为不稳定的蛋白质，其经加工并且随后通过未知蛋白酶稳定(Capell等.，J.Biol.Chem.273，3205(1998)；Thinakaran等.，Neurobiol.Dis.4，438(1998))。众所周知早老素通过APP在γ-分泌酶位点的切割但仍有BACE活性而控制A-β肽的生成。早老素因此加强了阿尔茨海默氏病的发展。因此，早老素经BACE的加工将增强A-β肽的产生，而由此进一步促进阿尔茨海默氏病的发展。因此，BACE抑制剂将通过在β-分泌酶位点抑制APP的裂解和/(或)通过阻止早老素的加工因此在γ-分泌酶位点间接抑制APP的裂解而降低阿尔茨海默氏病发展的可能性或迟缓其的发展。
本发明的另一个目的为包括BACE455抑制剂，优选BACE455-选择性抑制剂，和药学可接受载体或介质的药物组合物。在一具体的实施方案中，本发明涉及包括(i)BACE455的特异性配体或如上述的BACE455抑制性核酸分子和(ii)药学可接受载体或介质的药物组合物。
本发明还涉及治疗或预防受试者神经退行性疾病或相关病症的方法，该方法包括将有效量的BACE455-选择性抑制剂施于上述受试者。
本发明的另一个实施方案为治疗或预防受试者中Aβ肽产生或累积的方法，该方法包括将有效量的BACE455-选择性抑制剂施于上述受试者。
本发明还涉及BACE455-选择性抑制剂在用于治疗或预防受试者神经退行性疾病或相关病症的药物组合物的制备中的用途。
贯穿该说明书，最优选的受试者为人受试者。
BACE455-选择性抑制剂可以是任何试剂，条件或处理，其降低受试者BACE455多肽或其特有片段的表达或活性；或BACE455核酸或其特有片段的转录或翻译。最优选，BACE455-选择性抑制剂为特异性的，即优先改变BACE455异构型的表达或活性而基本上不直接改变其他BACE剪接异构型的表达。然而，抑制剂可能也更高或更低程度地影响野生型BACE的表达或活性。
BACE455-选择性抑制剂，其呈现出对抑制BACE455活性比对至少一种其他的BACE异构型的2倍，或5倍，或10倍，或30倍，或100倍，和/或＞1000倍的选择能力，相比那些缺乏所述选择能力或那些显著降低野生型BACE活性的化合物，具有改善的效用。抑制BACE455活性和对抑制BACE455相比野生型BACE具有2倍或更高选择能力的抑制剂拥有许多不明显的益处，包括(但不限于)对抑制病理性疾病发展的更高效力、由于对非病理性Aβ的产生更少抑制带来的降低的副作用和由于化合物提高的选择能力带来的改善的安全性。抑制剂可用于病症的预防性或治疗性的目的，病症包括例如阿尔茨海默氏病和与Aβ40或42肽升高的水平以及淀粉样蛋白斑中该肽的累积相关的其他病症。BACE455抑制剂可选自肽、蛋白质、核酸、小药物等等。代表性实例包括上述公开的抑制性核酸和抗体以及小药物。所述药物可利用以下公开的筛选方法表征或确认。其可获自现有的分子文库或其可利用市售的软件程序和有机化学和酶学领域中技术人员熟知的技术而设计。用于制备抑制剂的方法可包括(但不限于)组合化学、分子文库的筛选、合理的药物设计-这些筛选法可利用BACE455多肽或核酸或其片段作为用于合适的治疗候选物选择的测定法的要素。抑制BACE455的方法可包括但不局限于，小分子抑制剂、肽、反义寡核苷酸、iRNA、核酶和封闭抗体的使用，即降低BACE455蛋白的水平、活性或防止脑中天然存在的底物裂解的试剂。
在一具体的实施方案中，BACE455抑制剂为结合BACE455的抗体。抗体可通过本领域本身已知的各种技术产生。尤其，其可通过包括用BACE455多肽或其特有片段免疫非-人动物，和收集来自上述动物的抗体或产生抗体的细胞的方法产生。抗体可以是单克隆的，多克隆的，以及具有基本上相同的抗原特异性(即，能够结合BACE455)的其片段或衍生物。抗体片段包括Fab、Fab′2、CDR等等。抗体衍生物包括单链抗体(ScFv)、人源化抗体、人抗体、重组抗体、双特异性抗体等等。用于单链抗体产生的技术(美国专利4,946,778；Bird，Science 242423-42(1988)；Huston等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883(1988)；和Ward等.，Nature 334544-54(1989))可适于产生单链抗体。单链抗体通过经氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段，产生单链多肽而形成。也可利用大肠杆菌中功能性Fy片段装配的技术(Skerra等.，Science 2421038-1041(1988))。此外，可利用开发用于″嵌合抗体″产生的，通过将来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和来自适当生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起的技术(Morrison等.Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855(1984)；Neuberger等.，Nature 312604-608(1984)；Takeda等.，Nature 314452-454(1985))。嵌合抗体为其中不同部分源自不同动物种类的分子，例如具有源自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些，例如人源化抗体。
人抗体合乎人类病人治疗的需要。人抗体可通过本领域已知的各种方法制备，包括利用源自人免疫球蛋白序列抗体文库的噬菌体展示方法(Brinkman等.，J.Immunol.Methods18241-50(1995)；Ames等.，J.Immunol.Methods 184177-186(1995)；Kettleborough等.，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic等.，Gene 1879-18(1997)；Burton等.，Advances in Immunology 57191-280(1994)；PCT公开WO90/02809；WO91/10737)。产生所述抗体的方法在文献中熟知，如在下文中说明的，不限于文献Harlow等.(AntibodiesA laboratoryManual，CSH Press，1988；Ward等.(Nature 341(1989)544))。最优选的抗体选择性结合BACE455，例如结合相比其他BACE异构型特有的BACE455抗原表位。
在另一具体的实施方案中，BACE455抑制剂为结合BACE455基因或RNA，优选BACE455RNA，并且抑制或降低其转录或翻译的抑制性核酸。所述抑制性核酸可如上述公开的而产生。其优选包括杂交至如上述公开的BACE455RNA分子特有片段的序列。
在另一实施方案中，BACE455抑制剂为选择性抑制剂如BACE抑制剂III(SEQ ID NO3)。
BACE455抑制剂可配制于适合药物用途的任何合适的稀释剂、赋形剂、载体或介质中。在这方面，本发明还包括制备包含BACE455抑制剂的组合物的方法，该方法包括i)选择抑制BACE455的化合物，ii)产生上述化合物，和iii)将上述化合物与其药学可接受盐混合。
本发明抑制BACE的化合物可利用本领域已知的用于所述给药的任何药学可接受剂型经口给药。介质可以是任何溶液、悬浮液、粉剂、凝胶等等，包括等渗溶液、缓冲液和盐溶液，如糖浆或水悬剂等等。该化合物可通过任何合适的路径，包括全身性投递、静脉内的、动脉内的、大脑内的或鞘内注射而给药。如果需要，可进行重复注射。取决于本领域技术人员已知的几个因素，剂量可在很大限制的范围内变化并且在每个具体病例中必须根据个体需要而调节。测定活性化合物用量剂量的因素可以是该具体试剂的药效特征和其模式和给药途径；受体的年龄、健康和重量；症状的性质和程度；共同疗法的类型；治疗频率；和所希望的效果。活性组分的日常剂量可预计为约0.001至约1000毫克每公斤体重，优选的剂量为约0.1至约30mg/kg。日常口服量可在约0.01mg至1000mg，0.1mg至100mg，或10mg至500mg化合物每天的范围内变动。日剂量可作为单剂量或分开的剂量给药，并且此外，当发现其为指示性的时候还可以超出其上限。
本发明的化合物可以如片剂、胶囊(每个可包括持续释放或缓释的制剂)、丸剂、粉剂、粒剂、酏剂、酊剂、悬浮液、糖浆和乳剂的所述口服剂形式给药。同样地，其还可以静脉内(丸剂或输液)、腹膜内、皮下的或肌内方式给药，所有利用的剂型为本领域技术人员所熟知。可利用有效但无毒性的所需化合物的量以预防或治疗与β-淀粉样蛋白的产生或累积相关的神经系统紊乱，例如阿尔茨海默氏病和唐氏综合征。
该化合物可单独给药，但是通常与根据标准药物操作(例如Remington′s Pharmaceutical Sciences中所述的，Mack出版物)的药物载体一起给药。
抑制BACE455的化合物可以产生宿主，例如人或哺乳动物体内活化剂与试剂作用位点接触的任何方式给药。其可通过任何可用于和药物一起，或作为单个治疗剂或以治疗剂的组合，或单独给药或与根据给药途径和标准药物操作所选的药物载体一起给药的常规方法给药。
本发明抑制BACE455的化合物可以鼻内形式经合适的鼻内介质的局部利用，或经透皮路径，利用本领域技术人员熟知的透皮贴片而给药。
含有活性化合物的片剂或胶囊剂形式的口服给药可与口服的、无毒的、药学可接受的惰性载体例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨糖醇等等结合；以液体剂口服给药时，口服的药物组分可与任何口服的、无毒的、药物上可以接受的惰性载体例如乙醇、甘油、水等等结合。进一步说，当希望或必须时，混合物亦可加入合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、以及着色剂。可添加如以上所述的那些甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过抗-氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚(anisol)或维生素E的加入而储存。适宜的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖，例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成胶，例如阿拉伯胶、黄蓍胶、或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等等。崩解剂包括但不限于，淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等等。
抑制BACE455的化合物还可以脂质微粒投递系统的形式给药，例如小的单层囊、大的单层囊、以及多层囊。脂质体可由各种磷脂例如胆甾醇、硬脂酰胺、或卵磷脂形成。或者，本发明的化合物亦可与作为靶向药物载体的可溶性聚合物结合，如聚乙烯基吡咯烷酮、吡喃共聚体、聚羟丙基异丁烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺-苯酚，或被棕榈酰残基取代的聚亚乙基氧-聚赖氨酸制备的聚合物。聚合物还可为可用于实现药物控释的生物可降解聚合物的种类，例如，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚体，聚ω-己内酯、聚氰基酰化物等等或水凝胶的嵌段共聚体。
本发明的化合物可与外加乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等等的粉剂载体配制为胶囊。类似的稀释剂可用于制备压缩片。片剂和胶囊均可以制备成持续释放的产品以在数小时期间持续释放药物。压缩片可以是糖包衣的或是膜包衣的，以掩盖令人不快的味道并使片与环境隔离，或者可以是肠溶包衣的以选择性地在胃肠道崩解。口服液体剂型可以含有着色剂和调味剂以使受试者易于接受。通常，水、合适的油、盐、水相右旋糖(葡萄糖)、以及相关的糖溶液和二元醇如丙二醇或聚乙二醇是非肠道溶液的适宜载体。非肠道给药溶液优选含有活性组分的水溶性盐、适宜的稳定剂，以及如果需要，还含有缓冲物质。抗氧化剂例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸单独或其组合是适宜的稳定剂。还可以使用柠檬酸和其盐以及EDTA钠盐。此外，非肠道溶液可以含有防腐剂例如氯化苄烷铵、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯以及氯丁醇。本发明的治疗组合物和方法可用于抑制病理性疾病如(但不限于)，阿尔茨海默氏病、痴呆、青光眼、帕金森氏症、ALS和中风的发展。在本发明范围内，术语″治疗″指神经系统紊乱的预防性或治愈性的治疗，包括发展的早期或晚期。治疗包括延缓疾病发展，降低Aβ肽的产生或累积，改善病人病症等等。治疗可单独或与其他活性剂结合使用。
药物筛选在另一个实施方案中，本发明还提供用于药物候选物或先导物筛选的新靶标和方法。该方法包括结合分析和/或功能(活性)分析，并且可在体外、细胞系统中、动物中等等进行。
本发明的特定目的为选择、表征、筛选或优化生物学活性化合物的方法，所述方法包括将试验化合物与特有的BACE455核酸、多肽或这些中一种的片段体外接触，并且测定所述试验化合物结合和/或影响BACE455核酸或多肽活性的能力。单独结合提供了化合物调节所述靶活性，并且因此影响引起神经变性病症通路的能力的一些指标，(虽然不结合的变构抑制剂也可用于，并且包括在本发明治疗性方法的范围内)。在目前的一个实施方案中，该方法包括将试验化合物和特有的BACE455多肽或其片段体外接触并且测定所述试验化合物结合所述多肽或片段的能力。该片段优选包括异构型-特异的结构域和/或催化结构域。
结合的测定可通过各种技术，例如通过试验化合物的标记，通过与标记的对照配体的竞争作用，或其他检测结合复合物的直接或间接的方法进行。
本发明的另一实施方案为选择、表征、筛选或优化生物学活性物质的方法，所述方法包括将试验化合物和BACE455多肽体外接触并且测定试验化合物调节所述多肽活性的能力。在一具体的实施方案中，该试验化合物在BACE底物(例如，APP或其合适的片段)存在时和BACE455多肽接触，并且观察BACE455活性的任何改变，例如蛋白水解活性。在一个优选的实施方案中，该方法包括测定试验化合物是否选择性地影响BACE-介导的底物的水解。通常，试验利用表达BACE455多肽的细胞(例如，重组宿主细胞)进行。
本发明的另一实施方案为选择、表征、筛选和/或优化生物学活性物质的方法，所述方法包括将试验化合物和BACE455RNA接触并且测定试验化合物调节所述BACE455RNA翻译的能力。
化合物的选择能力可通过测定其对包含全长外显子4的其他BACE剪接异构型的作用而进行评估。
上述筛选分析可在任何合适的装置，例如平板、试管、皿、细颈瓶等等中进行。通常，该分析在多孔微量滴定皿中进行。利用本发明可同时分析几个试验化合物。此外，试验化合物可以是各种来源的、天然的和组合物。其可以是分离的或与其他物质混合的任何有机或无机物，例如脂类、肽、多肽、核酸、小分子。例如，该化合物可以是化合物组合文库的全部或部分。
本发明另外的方面和优点将在下列实施例中公开，其应当认为是说明性的而不限制本申请的范围。贯穿本说明书和实施例中引用的所有出版物、专利或专利申请的全部内容在此加入作为参考。
实施例实施例1DATAS技术鉴定人BACE中的可变剪接事件用于表达分布研究的DATAS技术(例如，美国专利6,251,590中详述的，因此在此引入作为参考)用来比较确证为AD病人和健康对照的前额皮层中存在的可变剪接的RNA。对照受试者为非精神错乱的，为年龄-匹配的并且脑组织为相似年龄死后的以除去分布研究中老化-相关的和mRNA稳定性-相关的改变。
EXH-NADC5033DATAS片段与NM_012104比对，所述NM_012104包含BACE501蛋白质(异构型变体)的编码序列。由于这2个序列的差异，EXH-NADC5033变体的存在指示了患AD的病人脑中正常RNA剪接事件的调节异常。
通过在BACE序列中外显子3和4水平的各种可变剪接事件，已经描述了不同的异构型(转录本变体-a至-d)(Bodendorf等.，J BiolChem.276(15)12019-12023(2001)，Zohar等.，Brain Res Mol BrainRes.1151)63-68(2003)，Tanahashi和Tabira，Neurosci Lett.307(1)9-12(2001)，由此在此引入作为参考)。
下列引物用于证实和该DATAS片段有关的可变RNA剪接事件的存在用于包含该DATAS片段的核酸片段扩增的PR_NM_012104-F01(BACE501编码序列3760-3780的位置)(SEQ ID NO26)和PR_NM_012104-R01(BACE501编码序列4312-4330的位置)(SEQ IDNO27)以及用于包含经受之前鉴定的可变剪接事件(转录本变体-a至-d)的RNA区域的核酸片段扩增的PR_NM_012104-F02(BACE501编码序列698-716的位置)(SEQ ID NO28)和PR_NM_012104-R02(BACE501编码序列1158-1178的位置)(SEQ ID NO29)(Bodendorf等.，J Biol Chem.276(15)12019-12023(2001)，Zohar等.，Brain Res Mol Brain Res.115(1)63-68(2003)，Tanahashi和Tabira，Neurosci Lett.307(1)9-12(2001))。
分离自确证AD病人前额皮层的人脑总RNA利用Trizol(Invitrogen)分离。1微克RNA在35μl中利用Superscript RT试剂盒(Invitrogen)在42℃反转录1小时，随后与1μl RNAse I(Promega)37℃温育15分钟。用1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，每种引物1μM对反转录本的1/10th进行PCR。条件为94℃3分钟以及94℃30秒，60℃30秒30个循环和72℃45秒。72℃5分钟的最终延伸后，在1.5％琼脂糖凝胶上分析对应全长cDNA的PCR片段，利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆入TOPO TA载体并且将连接产物转化入TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)。在96孔平皿中37℃过夜培养细胞并且挑选克隆并在氨苄存在时2XTY细菌培养基中37℃过夜扩增。
测序前，利用SP6和T7引物(每种1μM，Invitrogen)的PCR对每种培养物的1μl等份进行55℃30个循环。5μl PCR反应物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，而剩余的PCR产物经P100Bio-Gel(Biorad)柱纯化。测序反应利用ABI Prism Big Dye Terminator Cycles SequencingReady Reaction试剂盒3.0版(Aplera)进行并且反应产物经G50Sephadex柱(Amersham)纯化且经3100Genetic Analyser测序仪(Applied Biosystems)分析。
所有PCR产物的批量克隆和测序显示对应BACE501转录本变体a和b加新异构型的2个不同转录本的存在。
推导经DATAS片段部分编码的蛋白质的分析，假定DATAS片段为BACE501和BACE455之间变异的位点。该蛋白质呈现与Sinha等.，Nature 402，537-540(1999)和Vassar等.，Science 286，735-741(1999)所述的天冬蛋白酶2BACE(或ASP2)的高同源性，上述两篇文献都在此处引入作为参考。利用公众可得到的生物信息工具例如BLAT(Kent，Genomeres.12656-664(2002))或利用商业可得到的DoubleTwist Annotated人基因组数据库和DoubleTwist Annotated人和小鼠基因索引(Double Twist，Inc.出品)在各种公共的ETS数据库例如Genbank、DDBJ(日本DNA数据库)和EMBL(欧洲分子生物学实验室)中的搜索未能鉴定新的转录本异构型。新转录本异构型根据文献的命名法(Bodendorf等.J Biol Chem.276(1512019-12023(2001)，Zohar等.，Brain Res Mol Brain Res.115(1)63-68(2003)，Tanahashi和Tabira，Neurosci Lett.307(1)9-12(2001))命名为BACE455。在与BACE501和其他异构型比对的基础上，确定BACE455转录本缺乏外显子4。
实施例2人BACE455，一种新的BACE可变剪接形式的分子克隆全长BACE501cDNA和BACE455的cDNA随后利用富含GC的-PCR-系统(Roche Molecular Biochemicals)(Capell等.，J.Biol.Chem.27540，30849-30854(2000))从来自阿尔茨海默脑的相同的起始材料克隆。利用厂商说明书，反转录的RNA(参见实施例1)用下列引物扩增1.5mM MgCl2存在时以1μM浓度使用的PR_NM_012104-F03(BACE501编码序列442-459的位置)(SEQ ID NO.6)和PR_NM_012104-R03(BACE501编码序列1971-1984的位置)(SEQ IDNO.7)。对应BACE501和BACE455全长cDNA的PCR产物克隆入实施例1中所述的TOPO TA载体中并且利用SP6和T7引物以及引物PR_NM_012104-F01(SEQ ID NO26)，PR_NM_012104-F02(SEQ IDNO28)和PR_NM_012104-R02(SEQ ID NO29)测序。为富集对应BACE455异构型的cDNA中的cDNA群，20μl的第一链反转录反应物在包含DNA聚合酶I，dNTP混合物10mM，RNase H(大肠杆菌，Gibco)和DNA连接酶(大肠杆菌，Gibco)的第二链缓冲液(Gibco)中16℃2小时进行第二链的合成。随后，双链cDNA(dscDNA)经苯酚/氯仿/异戊醇(24∶25∶1，v/v)抽提和沉淀。dscDNA随后用限制性酶Stul或Bcll(New England Biolabs)消化。消化反应利用五分之一纯化的dscDNA反应产物在20μl中37℃进行2小时。Bace455不能由Stul或Bcll切割，其在缺失的DNA片段中切割，而BACE501被消化而不能通过PCR扩增。BACE455利用在1.5mM MgCl2存在时以1μM浓度使用的引物PR_NM_012104-F03(BACE501编码序列442-459的位置)(SEQ ID NO30)和PR_NM_012104-R03(BACE501编码序列1971-1984的位置)(SEQ ID NO31)，和T7引物以及引物PR_NM_012104-F01(SEQ ID NO26)，PR_NM_012104-F02(SEQ IDNO28)和PR_NM_012104-R02(SEQ ID NO29)而PCR扩增(60℃，30个循环)。对应全长cDNA的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上分析，亚克隆入实施例1中所述的TOPO TA载体并且测序。
全长克隆和测序后，确定BACE455的全长核苷酸(SEQ ID NO1)和预测的氨基酸(SEQ ID NO2)序列。结果和比对在图1中显示。
BACE501也克隆自EST IMAGE数据库中的ESTBC036084，克隆MGC33762。含有该EST序列的对应的菌株#MHS1010获自OpenBiosystem(Huntsville，AL)。利用富含GC的-PCR-系统(Roche MolecularBiochemicals)，利用厂商说明书和1μM的引物PR_NM_012104-F03(SEQ ID NO30)和PR_NM_012104-R03(SEQ ID NO31)和1.5mMMgCl2进行PCR。在1.5％琼脂糖凝胶上分析PCR产物并且将对应全长序列的cDNA克隆入实施例1中所述的TOPOTA载体中且利用SP6和T7引物以及引物PR_NM_012104-F01(SEQ ID NO26)，PR_NM_012104-F02(SEQ ID NO28)和PR_NM_012104-R02(SEQID NO29)测序。
由于位于桥接BACE501蛋白质2个胞外突的暴露于溶剂的α-螺旋(氨基酸残基190至235)内2个活性天冬氨酸残基之间的读框内138bp缺失，命名为BACE455的新BACE变体完全缺失BACE501外显子4。在Hong等.，Science.290(5489)150-3(2000)公开的BACE501晶体结构基础上，似乎BACE455的活性部位更张开和易于靠近，而因此可能产生显著提高水平的Aβ肽。
新的较短的蛋白质包含455个氨基酸残基并且具有约50kD的理论分子量。BACE455包含前区，天冬氨酸蛋白酶区域，对于正确的BACE加工(Asn153和Asn172)体系(Fluhrer，R.等.；J Biol Chem.278(8)5531-5538(2003)，Haniu，M.等.J.Biol.Chem.27521099-106(2000))必不可少的靠近C-末端和N-糖基化位点的转膜区，提示新的BACE455变体经过正确的加工并且在分泌途径中成熟。活性酶为BACE455而前酶为前BACE455。
Huse等.(J Biol Chem.278(19)17141-9(2003))的最新数据表明BACEβ-分泌酶活性由BACE1的内部蛋白水解裂解而部分终止。最近发现的加工在BACE的2个胞外突(Leu228和Ala229之间)之间的α-螺旋上发生。已报道在该位点经未知蛋白酶的裂解导致每种37kD大小特有的N-和C末端片段的产生。该2个片段通过二硫键以伪活性的构象表面上维持，导致显著减弱的，而不是消除的酶活性。重要的是，由于该区域由缺失的外显子4编码，BACE455不是蛋白内水解加工的底物。
实施例3转染的哺乳动物细胞中BACE455呈现与BACE501类似的免疫反应性BACE在细胞中具有大于9小时的半衰期(Haniu等.，J.Biol.Chem.27521099-21106(2000))并且在这期间循环至膜数次。因此，利用特异于其N末端部分的抗体，BACE可在完整细胞(即非渗透的)的细胞表面和渗透细胞的细胞内部(高尔基体和核内体区室)免疫定位。相反，BACE变体，例如非活化的并且其按照分泌途径的转运有缺陷的且在内质网水平被阻断的BACE457，在细胞表面未能检测到(Bodendorf等.，J Biol Chem.2762019-23(2001))。
因此，免疫组织化学研究可确定给定的BACE变体例如BACE455是否如APP一样存在于相同的胞内部位，或如BACE501一样存在于胞内和胞外，其为致淀粉样活性的前提。
材料和方法为了产生基于pCDNA3的表达载体，TOPO TA载体中BACE50和BACE455的全长cDNA亚克隆入pcDNA3(Invitrogen)的EcoRl位点以分别产生pcDNA3-BACE501和pcDNA3-BACE455。cDNA(200ng质粒/测序反应)利用Invitrogen的SP6和T7引物和实施例1中所述方案测序用于插入的验证和定向。由于其胞质的大容量和其鼠来源，NIH3T3细胞(ATCC#CRL1658)用于研究BACE免疫反应性。细胞在T150培养瓶中，在具有4.5g/l葡萄糖和补充有10％新生牛血清，1％青霉素/链霉素的Dulbecco改进的伊格尔培养基中37℃以及5％CO2下常规培养。转染前一天细胞以40.000细胞/孔涂布于6-孔平皿。根据厂商的建议，用pcDNA3-BACE501、pcDNA3-BACE455或pcDNA3-GFP(1μg载体/孔)以及Lipofectamine Plus试剂(Life Technologies)进行瞬时转染实验。转染后2天，处理细胞用于免疫定位或功能分析。
转染的细胞在聚D-赖氨酸-涂布的盖玻片上培养。对于免疫染色，细胞在20℃固定于3％的仲甲醛。细胞可用Triton X100(PBS中0.1％)渗透或完好处理(无渗透作用)。用磷酸盐缓冲盐中3％的牛血清白蛋白封闭后，渗透的或完整的细胞与1∶800稀释的针对氨基酸序列46-65或487-501的兔抗-人BACE抗体(Calbiochem)温育。Cy3-或FITC-偶联的二抗(Sigma)以1∶800稀释利用。染色的细胞包埋于FluorSave中(Calbiochem)。
结果从结果可明显看出在细胞表面和亚细胞区室BACE455呈现与BACE501类似的免疫反应性(图2)。此表明由于BACE有效地运至细胞膜，BACE455中外显子4的缺失并不影响其转运。由于BACE的胞内运输与加工和成熟密切相关，很可能BACE455的加工和成熟并未改变并且，从而当与BACE501相比时BACE455的致淀粉样活性没有减弱。
实施例4BACE455对肽底物活性的验证进行2个实验，其证实BACE455对基于APP的包含β裂解位点肽底物的活性。底物的氨基酸序列对应APP并且摹拟在具有遗传性AD的Swedish家族中发现的APP中的突变，其中KM氨基酸残基转变为NL。Swedish突变已知提高APP经β-分泌酶的裂解。第一个实验中，显示转染的人胚肾HEK293中BACE455增强的表达提高了合成荧光底物的裂解。
第二组实验证实在荧光生成分析中BACE455呈现与BACE501类似的活性效力。对此，得到很好表征的人胚肾HEK293细胞系为研究过表达蛋白质功能的实用工具。
材料和方法哺乳动物细胞的转染和克隆的选择人胚肾HEK293细胞(ATCC#CRC-1573)利用Invitrogen的Lipofectamine Plus试剂用表达构建体转染。细胞在10cm培养皿中以70-80％铺曼的密度接种。每个平皿用2μgDNA，8μlPlus试剂和4μlOptiMEM的Lipofectamine转染。温育5小时后，转染培养基用DMEM，10％FBS，NaPyruvate，及抗生素替换并且细胞在正常条件下温育(37℃，5％CO2)72小时。转染后三天，细胞传代入包含400μg/ml G418的培养基中。在选择培养基中生长十五个天后，选择单个克隆接入包含添加G418的生长培养基的96孔平皿的每个孔中。克隆从96孔平皿扩大至24孔平皿随后至6孔平皿。所选的克隆中BACE455或BACE501的表达通过利用如实施例3中的C末端-特异性抗体的Western印迹法和免疫组织化学分析而测定。最终选择的BACE455或BACE501细胞系分别表现出BACE455或BACE501最高的表达水平。
细胞提取物的制备，荧光产生的分析方案收集细胞并且在1,500rpm离心5分钟除去培养基。细胞沉淀用PBS洗涤一次。为了进一步比较BACE455和BACE501的活性，基于包含APP中Swedish突变KM->NL的淬灭的荧光底物(底物V，Calbiochem)开发体外分析。肽序列为MCA-SEVNLDAEFK(DNP)-CONH2(SEQ ID NO32)，包含Swedish APP突变(黑体)，7-氨基-4-甲基香豆素(MCA)为荧光基团和二硝基苯酚(DNP)为猝灭剂。当BACE455和BACE501表达细胞的细胞裂解物与荧光底物V温育时，通过蛋白酶裂解后，荧光基团与淬火基团分离，恢复了供体的全部荧光产率。(Ermolief等.，Biochemistry 3912450-12456(2000)；Ellerby等.J Neurosci.176165-6178(1997)；Capel等.，J Biol Chem.2775637-43(2002))。
模拟转染的HEK293和HEK293-BACE455和-BACE501细胞通过在冰冷的20mM Tris/150mM NaCl，pH7.5加完全的蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics)中破碎而采集。细胞经重复冻融裂解并且在500g离心10分钟后产生核后(postnuclear)组分。沉淀重悬于包含蛋白酶抑制剂混合物的膜提取缓冲液中(20mM MES/1％Triton X100)并且冰上孵育30分钟。分析以200l体积的稀释于包含15μM肽底物V的反应缓冲液(25mM MES/25mM乙酸钠/25mM Tris，pH4.4)中的膜制备物在黑暗的96孔平板(ATGC)中进行。这些组分多次平衡至37℃并且反应通过添加底物而起始。在320nm进行激发并且反应动力学通过测定420nm处的荧光发射而监测。为了测试pH的作用，裂解的细胞重悬于调整pH值为4.4至8之间的25mM MES/25mM乙酸钠/25mMTris中并且随后如上进行温育。
包括纯化的重组人BACE501蛋白质(R&DSystems)的对照，或单独的底物以及本底荧光被除去以记录BACE异构型的活性。
结果蛋白质水解测定法中抽提自膜组分的BACE455产生了荧光信号的时间相关的提高，表明BACE455具有β-分泌酶活性。在2小时后见到最大的蛋白质水解，其后可能由于随着完全裂解的底物的减少而到达平台期。
表2随时间的BACE活性
*p＜0.05，Wilkoxon检验。显示的结果表示用BACE455、BACE501或模拟-转染的细胞进行的至少3个独立实验的荧光信号±SEM实施例5BACE455活性的特异性通过在良好表征的市售BACE501抑制剂，BACE抑制剂III存在下进行β-分泌酶分析而评估BACE455对基于APP肽底物的特异性。更重要的是，利用剂量反应实验，表明BACE455显示明显不同于BACE501的抑制分布。
材料和方法来自Calbiochem的BACE抑制剂III(H-Glu-Val-Asn-Statine-Val-Ala-Glu-Phe-NH2)(SEQ ID NO33)为BACE的底物类似抑制剂。之前显示完全阻断了来自BACE转染细胞的溶解的膜组分中蛋白水解活性(Capel等.，J.Biol.Chem.2775637-43(2002))。抑胃肽A、抑凝乳蛋白酶素、E64c、亮肽素(Sigma)分别为组织蛋白酶D(及其他天冬氨酰蛋白酶)或丝氨酸蛋白酶以及半胱氨酰蛋白酶的抑制剂。
蛋白酶抑制剂以100μM的终浓度加至100μl的反应缓冲液中(25mM MES/25mM乙酸钠/25mM Tris，pH4.4)。当用于指示时，该分析缓冲液具有4.4至8的pH。如实施例4获得膜制备物并且与抑制剂一起在室温下温育10分钟。随后通过添加100μl包含底物的反应缓冲液(15μM终浓度)起始反应并且如实施例4中所述监测。对于图3的剂量-应答实验，在100μM至100nM的不同浓度范围分析抑制剂III。
结果存在经非BACE-特异性抑制剂对BACE455或BACE501过表达的微小抑制活性。此可归结于分析期间共-纯化的其他非BACE膜-结合的蛋白酶。然而，在BACE455或BACE501提取物中，底物裂解活性总的来说对抑胃肽和其它分别为组织蛋白酶D(及其他天冬氨酰蛋白酶)或丝氨酸和半胱氨酰蛋白酶的抑制剂的蛋白酶抑制剂都不是很敏感。这提示对底物裂解的非BACE蛋白水解活性是微小的。
相反，100μM的BACE抑制剂III完全消除了BACE455以及BACE501的活性，证实了对BACE-介导的荧光底物裂解的特异性。
表3不同抑制剂抑制BACE455的百分比
显示的结果为BACE455、BACE501或模拟-转染的细胞提取物加所示抑制剂(每种100μM)中裂解抑制±SEM的百分比。
为了进一步研究BACE455的抑制分布并与BACE501比较，进行剂量-应答实验(参见图3)。当与模拟的转染对照比较时，对于10μM浓度的抑制剂III，BACE455活性为36.04±4.13％(±SEM)而BACE501活性为57.6±3.12％(±SEM)。当与模拟的转染对照比较时，对于1μM浓度的抑制剂III，BACE455活性为57.52±9.08％(±SEM)而BACE501活性为85.15±2.93％(±SEM)。因此显然对于给定的抑制剂浓度，BACE455比BACE501受到更小的抑制，其提示在抑制分布上BACE455明显不同于BACE501以及与BACE501比较时BACE455中外显子4的缺失产生了显著的药理学差异。
实施例6酸性pH为BACE455活性所需BACE为主要定位于高尔基体中以及核内体区室中，并且在这些酸性区室中裂解APP的酸性天冬氨酰蛋白酶。BACE在6.0及以上的pH值时为几乎无活性的(Vassar R.等.Science 286，735-741(1999)；Lin X.等.Proc.Natl Acad.Sci.USA 97，1456-1460(2000))。这里，我们提供了支持新的BACE455变体呈现真实的β-分泌酶活性的另一个论据通过BACE-特异性裂解观察到强pH的需求。
材料和方法如实施例4获得膜制备物，并且在BACE抑制剂III(100μM终浓度)存在或缺乏时，在调节至4.4到8终pH的分析缓冲液(25mMMES/25mM乙酸钠/25mM Tris)中温育。通过添加100μl包含底物的(15μM终浓度)反应缓冲液(4.4至8的pH)起始反应并且如实施例4中所述监测。在这些条件下测定了由抑制剂III抑制BACE的百分比。
结果BACE特异性抑制剂的抑制活性在pH4.4时迅速到最大值。在pH6和8时，观察到非常高的底物裂解活性，不同于在pH4.4时，但其对BACE商品化抑制剂不敏感。此可能是由于在pH6.0或以上起作用的其他蛋白酶的补充而导致，已知BACE在pH6或以上明显无活性。这些数据表明该分析允许仅在文献中已知的，与BACE生物活性相关pH时，BACE455和BACE501分泌酶活性的选择性剂量。此外，结果证实BACE455表现出与BACE501类似的对活性的酸性pH依赖性。
表4抑制剂-敏感的底物V通过表达BACE455和BACE501细胞的水解为pH-依赖的。
显示的结果为用调节至不同pH的反应缓冲液进行的BACE455或BACE501细胞提取物中裂解抑制的平均百分比。
因此，BACE455和BACE501，当同样在HEK293细胞中表达并且利用相同的条件纯化时，也在利用相同分析条件的蛋白质水解分析中裂解Swedishβ-分泌酶肽。
实施例7BACE455和BACE501对内源表达的APP异构型加工的作用APP的蛋白水解加工分为致淀粉样的和抗致淀粉样的途径。在致淀粉样途径中，APP通过BACE的裂解在Aβ结构域的N-末端发生并且产生分泌的sAPPβ以及99个氨基酸(C99)11,145道尔顿分子量的APP的C末端片段。C99进一步在其跨膜结构域内由γ-分泌酶裂解，导致Aβ肽的分泌和APP胞内结构域AICD的产生。在抗致淀粉样途径中，APP通过α-分泌酶在Aβ肽内的裂解产生神经营养性的和神经保护的sAPPα。
加工来自APP的Aβ肽的人细胞系提供了在细胞分析中筛选β-分泌酶的活化剂和抑制剂的工具。虽然APP的表达以及内源APP的加工和Aβ肽的释放是低的，SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞系(ATCC，CRL-2266)为检测APP加工和C99和Aβ肽产生的有效体系。
材料和方法哺乳动物细胞转染和克隆的选择用于转染的SH-SY5Y细胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco改进的伊格尔培养基(DMEM)中生长至80％铺满。利用LipofectAmine Plus(Gibco-BRL)和4pcDNA3DNA每10*10<6>细胞进行转染。转染后三天，细胞传代入包含400μg/ml浓度G418的培养基中。在选择培养基中生长二十天后，选择单个克隆并且接入包含添加G418的生长培养基的96孔平皿的每个孔中。克隆从96孔平皿扩大至24孔平皿随后至6孔平皿。已失去原始神经元-样形态的克隆不扩增。所选的克隆中BACE455或BACE501的表达通过利用C末端-特异性抗体的Western印迹法和免疫组织化学分析而进行测定。最终的细胞系表现出最高的BACE455或BACE501表达水平并且已在400μg/ml G418中每隔三日传代入新鲜培养基中进行培养。
细胞提取物的制备，Western印迹方案接种3天后收集细胞。细胞用PBS洗涤两次并且在1ml添加蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics)的CellLytic溶液(Sigma)中裂解15分钟。裂解物转入1.5ml微量离心管并且在1,500rpm离心5分钟。上清作为细胞提取物在-80℃储存。来自用BACE455或对照载体(模拟的)转染的细胞提取物的等份(20μg)通过12％Bis-Tris NOVEX凝胶(Invitrogen)电泳。分离多肽至PVDF膜的电转移后，APP和C99蛋白水解片段用1/500在PBS-Tween200.1％中的C末端-特异性兔抗-APP抗体(Serotec，UK)检测，并且抗体-抗原复合物利用碱性磷酸酶偶联的山羊抗-兔抗体(1/5000)观察。初级抗体识别的序列对应于C99片段的氨基酸85-99。细胞中，初级抗体还检测到迁移至约45kD的非特异性条带。
结果用抗生素G418选择后，BACE455对来自内源表达的APP异构型的C99片段产生的作用在转化体有表达BACE455的构建体或用空载体(模拟的)转染的SH-SY5Y细胞中转化体(图4)进行评估。相比用空载体DNA转化的细胞，用BACE455构建体转化的细胞中C99的产生强烈增高。此与内源APP在残基Asp-1处以类似于BACE501中所述的方式提高的蛋白质水解相对应。此外，如文献中对BACE501的报道，BACE455的过表达对APP水平没有影响。
实施例8布雷菲德菌素和Gleevec对内源APP异构型的BACE455-依赖的加工的抑制作用干涉BACE活性以及APP加工的一种途径为真菌代谢物布雷菲德菌素A(BFA)的利用，其促进顺式、中间和反式高尔基体(而不是TGN)与ER的融合(Lippincott-Schwartz等.Cell 67601-616(1991))，或破坏高尔基体内运输的莫能菌素的利用(Dinter等.Histochem.CellBiol.109571-590(1998))。两种药物不仅影响APP加工，而且影响BACE前肽在高尔基体内通过抑制通过ER和高尔基体的胞内运输的除去。因此，BFA存在时，BACE的过表达导致C99产生的降低(Fischer等.J.Neurochem.801079(2002))。
Gleevec(imatinib甲磺酸盐)为选择性的酪氨酸激酶抑制剂，其由于阻断β-分泌酶-介导的APP的裂解而可抑制Aβ的释放(Netzer等.Proc Natl Acad Sci USA 10012444-12449(2003))。Gleevec为调控细胞骨架、轴突发育和树突发生的Bcr-Abl抑制剂(Jones等.J.Neurosci 248510-8521(2004))。因此，Gleevec已检验为经BACE，通过影响细胞细胞骨架和胞内运输，由此阻止APP和BACE加工而最终调控C99产生的药理学试剂。
材料和方法BACE455SH-SY5Y细胞如实施例7中处理。接种后3天收集细胞并且如上述处理用于Western印迹实验。对于BFA和Gleevec处理，分别在最后的8小时期间以10μg/ml以及在最后的24小时期间以10μM处理细胞。
结果为了检验BFA是否以类似于已报道的BACE501的方式在BACE455细胞中干扰C99的产生，用BFA或Gleevec处理BACE455细胞并且细胞裂解物经受利用C末端-特异的兔抗-APP抗体的Western印迹(图5)。不出所料，在不仅影响APP加工，而且影响BACE加工的BFA存在时，BACE的过表达导致C99产生的降低。此表明BACE455呈现与BACE501类似的通过ER-高尔基体的加工。
BACE455细胞的Gleevec处理也强烈降低了C99肽的产生。虽然不清楚作用机理，其可能涉及对BACE定位的作用或以可能通过胞内运输和加工的改变而阻止APP与BACE455相互作用的方式对APP的作用。
实施例9BACE455和BACE501对来自内源表达的APP异构型的Aβ肽产生的作用加工来自APP的Aβ肽的人细胞系提供了在细胞分析中筛选β-分泌酶的活化剂和抑制剂的工具。多个亚细胞部位负责不同Aβ肽的产生。反式-高尔基体网主要产生Aβ1-40(Xu等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.943748-3752(12997)，Hartmann等.，Nat.Med.31016-1020(1997))，而内质网/中间体区室产生Aβ1-42(Lee等.，J.Biol.Chem.，Vol.2784458-4466(2003)，Greenfield等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96，742-747(1999))。Aβ肽的产生和释放入培养物上清中可通过酶联免疫吸附分析(ELISA)监测。虽然APP的表达以及内源APP的加工和Aβ肽的释放是低的，SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞系(ATCC，CRL-2266)为检测Aβ加工的有效体系。对此，可利用指示细胞提取物、血清、培养基中Aβ体外定量的异构型-特异的ELISA。ELISA试剂盒的实例为来自BioSource International的异构型-特异的Aβ1-40ELISA。
通常，常规条件中培养的SH-SY5Y细胞分泌约40pg/ml的Aβ1-40，其正好处于分析的检测限制和线性范围中(Takahashi等.，J.Biol.Chem.27818664-70(2003))。相反，Aβ1-42的产生弱于Aβ1-40并且因此在不过表达APP时检测不到。
AβELISA分析(对Aβ1-40的双抗体夹心ELISA)接种后72小时收集的细胞培养上清在标准的双抗异构型-特异的Aβ1-40ELISA(BioSource International)中进行如下分析。捕获兔抗体特异于Aβ呈递的抗原表位并且已涂布至96孔微量滴定板。检测抗体特异于Aβ1-40并且偶联的二抗为偶联至辣根过氧化物酶的抗-兔IgG。合成的人Aβ1-40标准肽在提供用于产生标准曲线的样品稀释剂(diluant)中连续稀释。稀释后肽的浓度为100μl/孔体积中1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6和0.0pg/ml。
为了进行条件培养基中的定量，含有1μM金属内蛋白酶抑制剂膦酰二肽的5ml DMEM通过一个3.5*106SH-SY5Y细胞(接种密度)的10cm平皿条件化培养17小时并且在低速离心5分钟以除去细胞碎片(Haugabook等.，J.Neurosci.Methods.108171-179(2001))。人Aβ1-40标准样品，以及100μl/孔样品，例如所转染细胞的条件培养基在洗涤平皿后加入。平皿在4℃过夜孵育。第二天，洗涤平皿4次后，加入100μl/孔的兔检测抗体并且在轨道平皿振荡器上20℃温育2小时。4次洗涤后，使用100μl/孔的抗-兔IgG-辣根过氧化酶抗体(1∶100稀释)并且在室温下振荡温育2小时。最近5次洗涤后作为生色团底物加入100μl/孔的四甲基联苯胺并且在室温下暗处进行20分钟的显色。加入100μl/孔终止溶液并且2小时内在450nm读取每孔的吸光度，每种生色团的100μl溶液和终止溶液作为空白。所有标准样品和样品进行3次。从标准曲线推断具有落入标准曲线内吸光值的样品(通过与在相同的平皿上分析的A-β40和A-β42标准肽而获得的值相比较)并且以pg/ml培养基表示。
结果在用表达BACE455或BACE501的构建体或用空载体(模拟的)转染的SH-SY5Y细胞中在转化体用抗生素G418选择后评估BACE455或BACE501对来自内源表达的APP产生Aβ肽的作用。相比用空载体DNA转化的细胞，用BACE455或BACE501构建体转化的细胞中Aβ1-40的产生提高了两倍。收集自用空载体转染的细胞的条件培养基中Aβ1-40的水平为43.21+1.46pg/ml，正好处于分析线性范围内的值。表示为对照(用空载体DNA转染的细胞)百分比，从用BACE455或BACE501转染的细胞释放的Aβ1-40分别为199.95+18％和193.15+2.73(两者均p＜0.001)。此表明如BACE501那样，BACE455促进来自内源表达APP的Aβ的加工和释放。在不仅影响APP加工而且影响BACE加工的BFA，以及Aβ1-40源自其的C99片段产生存在时，条件培养基中Aβ1-40的水平与模拟转染的细胞中的类似。BACE455细胞的Gleevec处理也强烈降低Aβ1-40的释放。Gleevec已显示阻断β-分泌酶-介导的APP的裂解(Netzer等.Proc Natl Acad SciUSA 10012444-12449(2003))，其为产生Aβ1-40所必需。因此，结果表明Gleevec的作用不仅涉及β-分泌酶-介导的APP裂解的降低，而且以阻止APP与BACE455相互作用的方式产生对BACE或APP的胞内运输和加工即对其的定位的影响。
总起来说，这些数据证实BACE455在β分泌酶部位直接作用而裂解APP，并且在细胞内该异构型和BACE501之间的裂解速率并不显著不同。然而，BACE455的活性依赖胞内运输和加工并且可由布雷菲德菌素A和Gleevec抑制。BACE455因此为患有阿尔茨海默氏病的病人脑中表达的有活性的APP-裂解蛋白酶。因此，本申请人认为BACE455导致负责阿尔茨海默氏病发展的致淀粉样Aβ肽的累积。
表5转染BACE455或BACE501质粒DNA对Aβ释放的效果
*p＜0.05，Wilkoxon检验。表中的值为Aβ释放±SEM的百分比，对照设为100％表1引物序列的列表
Refseq(NCBI参照序列)上的位置指BACE501核酸序列上(NM_012104)引物的位置。RefSeq为基因鉴定和表征、突变分析、表达研究、多态性发现和比较分析的参照。参照序列(RefSeq)的集合提供了主要研究的生物体的序列，包括基因组DNA、转录本(RNA)和蛋白质产物的全面、综合、非冗余的组。
序列表<110>埃克森希特医疗股份有限公司(EXONHIT THERAPEUTICS SA)<120>BACE455，人β-分泌酶的可变剪接变体(Compositions a，d methods to inhibit the production of Abeta peptide)<130>SCT061608-66<150>US 60/517,401<151>2003-11-06<160>32<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1368<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(1)..(1368)<223>
<400>1atg gcc caa gcc ctg ccc tgg ctc ctg ctg tgg atg ggc gcg gga gtg48Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val1 5 10 15ctg cct gcc cac ggc acc cag cac ggc atc cgg ctg ccc ctg cgc agc96Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser20 25 30ggc ctg ggg ggc gcc ccc ctg ggg ctg cgg ctg ccc cgg gag acc gac 144Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp35 40 45gaa gag ccc gag gag ccc ggc cgg agg ggc agc ttt gtg gag atg gtg 192Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val50 55 60gac aac ctg agg ggc aag tcg ggg cag ggc tac tac gtg gag atg acc 240Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr65 70 75 80gtg ggc agc ccc ccg cag acg ctc aac atc ctg gtg gat aca ggc agc 288Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser85 90 95
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1 5 10 15Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser20 25 30Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp35 40 45Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val50 55 60Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr65 70 75 80Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser85 90 95Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr100 105 110Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val115 120 125Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp130 135 140Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile145 150 155 160Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp165 170 175Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Ile Ile Gly180 185 190Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile195 200 205
Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn210 215 220Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser225 230 235 240Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe245 250 255Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe260 265 270Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly275 280 285Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly290 295 300Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr305 310 315 320Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys325 330 335Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile340 345 350Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly355 360 365Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala370 375 380Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn385 390 395 400Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met405 410 415
Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys420 425 430Gln Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala435 440 445Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys450 455<210>3<211>6<212>PRT<213>artificial sequence<220>
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Glu Ile Ala Arg Ile Ile Gly Gly1 5<210>6<211>8<212>PRT<213>artificial sequence<220>
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<223>fluorogenic APP-based peptide MCA<220>
<221>MOD_RES<222>(10)..(10)<223>AMIDATION<400>32Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Lys1 5 10
权利要求
1.一种包括BACE455全部或特有片段的分离的多肽。
2.权利要求的多肽，包括氨基酸序列SEQ ID NO2的全部或特有片段。
3.权利要求2的多肽，其包括选自SEQ ID Nos 3-11的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求1、2或3的多肽的分离的多核苷酸。
5.权利要求4的多核苷酸，包括SEQ ID NO1的序列。
6.包括权利要求4或5的多核苷酸的载体。
7.核酸探针，选自a)选择性杂交至编码BACE455多肽或其特有片段的第二核酸的第一核酸，和b)与所述的第一核酸精确互补的第三核酸。
8.可用于扩增编码BACE455多肽的核酸分子的至少一个特有片段的核酸引物。
9.抑制性核酸分子，其中所述分子在生理条件下杂交至编码BACE455多肽的核酸分子并且选择性抑制其转录或翻译。
10.包括权利要求4的多核苷酸或权利要求6的载体的宿主细胞。
11.一种多核苷酸，选自a)包括在严谨条件下杂交至SEQ ID NO1所示核酸序列的第一核苷酸序列的核酸，和b)包括与所述的第一核苷酸序列精确互补的第二核苷酸序列的核酸。
12.能选择性结合BACE455多肽或其特有片段的配体。
13.权利要求12的配体，其包括选自抗体、抗体片段或抗体衍生物的多肽。
14.权利要求13的多肽，其结合BACE455多肽的特有片段。
15.一种BACE455抑制剂，其中所述抑制剂抑制BACE455多肽或核酸的表达或活性。
16.一种药物组合物，包括BACE455抑制剂和药学可接受载体或介质。
17.一种治疗或预防受试者神经退行性疾病或相关病症的方法，该方法包括给所述受试者施用有效量的BACE455抑制剂。
18.一种治疗或预防受试者Aβ肽产生或累积的方法，该方法包括给所述受试者施用有效量的BACE455抑制剂。
19.一种选择、表征、筛选或优化生物学活性化合物的方法，所述方法包括将试验化合物与BACE455核酸、多肽或所述核酸或多肽的特有片段接触，并且测定所述试验化合物是否结合所述BACE455核酸或多肽或调控所述BACE455核酸或多肽的活性。
20.一种检测受试者神经退行性疾病或相关病症存在或易感性的方法，该方法包括检测来自受试者的样品中BACE455核酸或多肽的存在。
21.一种评估受试者对神经退行性疾病或相关病症治疗应答的方法，该方法包括检测来自受试者的样品中BACE455核酸或多肽的存在。
22.一种测定受试者的神经退行性疾病或相关病症治疗效力的方法，该方法包括(i)测定取自所述治疗期间或之后所述受试者的样品中BACE455核酸或多肽的存在和/或丰度，和(ii)将所述存在和/或丰度与来自治疗之前或早期的所述受试者的参照样品相比较。
23.一种用于制备结合BACE455多肽的抗体的方法，该方法包括用BACE455多肽或其特有片段免疫非-人动物，并且收集来自所述动物的抗体或产生抗体的细胞。
24.一种制备含有BACE455抑制剂的组合物的方法，该方法包括iv)选择抑制BACE455的化合物，v)产生所述化合物，和vi)将所述化合物与其药学可接受的盐混合。
全文摘要
本发明涉及遗传学、生物化学、药物化学和医学领域。本发明更尤其公开了参与神经病理学病症的人基因变体的鉴定，和用于所述疾病和相关病症的诊断、预防和治疗以及用于治疗活性药物筛选的方法。本发明涉及催化活性的β－分泌酶(Memapsin2，BACE)变体，和编码其的核酸。本发明可用于鉴定抑制特定BACE异构型的活性的试剂和影响神经病理学病症，包括阿尔茨海默氏病和痴呆的发生、发展或进展的试剂和疗法。
文档编号C07K14/47GK1875100SQ200480032656
公开日2006年12月6日 申请日期2004年11月5日 优先权日2003年11月6日
发明者劳伦特·德西雷 申请人:埃克森希特医疗股份有限公司