从木橘中分离欧前胡素的方法

专利名称：从木橘中分离欧前胡素的方法
技术领域：
本发明涉及从木橘(Aegle marmelos Correa)中分离欧前胡素(imperatorin)的方法，所述欧前胡素是有效的诱导型一氧化氮合酶抑制剂和抗炎候选物。本发明还涉及欧前胡素的分离方法，所述欧前胡素是来自新鲜/干木橘果实的成熟/未成熟中果皮的抗首过有效的低分子量呋喃香豆素(furanocoumarin)。本方法的副产品是富含免疫学上重要的植物甾醇的部分，其可用作免疫系统中的靶向特异位点的治疗。欧前胡素属于线性呋喃香豆素族化合物。欧前胡素(9-[3-甲基-2-丁烯基)-氧]-7H-呋喃并[3，2-g][1]苯并吡喃-7-酮)是苯并-a-吡喃骈香豆素(pyranocoumarin)的呋喃衍生物并且在植物中处于游离态。
背景技术：
木橘是中等大小、细长、有香味的树，高6.0至7.5米，围长90至120厘米，原产于印度次大陆。这种植物的野生生长遍及印度的落叶林以及野生于印度中部和南部的次喜玛拉雅(sub-Himalayan)森林中。其也移植于斯里兰卡、巴基斯坦、孟加拉、缅甸、泰国和大部分东南亚国家。其在北印度语、阿萨姆语和孟加拉语中也被称为Bael(印度枸桔)和Bel，在古吉拉特语中被称为Marwari和Bili，在坦米尔语中被称为Koovalam和Vilvam，在泰卢固语语中被称为Bilvamu和Maredu，在乌尔都语被称为Bel以及在英语中被称为Stone Apple。Aegle属于柑橘亚科Aurantioideae，Clauseneae族和Balsamocitrinae亚族和科(rutaceae)的单型属中的一种。
木橘果实直径5.0至7.5厘米，球状、长椭圆梨状，表皮灰色或黄色，果肉甜美，颜色呈深黄色、橙色至棕色。其种子数目众多并且置于粘稠透明的粘液包围的小室中。未成熟的或半成熟的果实被视为收敛剂、消化药和健胃药。所述果实被誉为滑泻和痢疾的有价值的印度草药并作为心脏和大脑的补药。未成熟果实的临床试验显示了其对新城鸡瘟病毒的抗病毒活性、低血糖活性和抗寄生虫的重要效果。使用水稀释并且添加一定量的糖和罗晃子，所述果肉将成为美味的清凉饮料。印度枸桔果实是最富有营养的可食用果实之一，其富含类胡萝卜素、核黄素以及果胶，可用于制备许多产品，例如糖果、果汁饮料、太妃糖、厚片、果肉粉末和果茶等(The Wealth of India，vol.5，1990-94和Compendium of Indian Medicinal Plants，vol.1-5，(1962-1998))。
呋喃香豆素(除了最熟知的呋喃香豆素外，也称作呋喃并香豆素(furocoumarin)，有时指的是补骨脂素)是一类广泛存在的酚类化合物，尤其在柑橘属果实中含量丰富。这些化合物在高等植物中是普遍存在的。它们存在于大约15个植物科中，其中伞形科(Umbelliferae)成员是最著名的呋喃香豆素生产者，其次是芸香科(Rutaceae)、桑科(Moraceae)和豆科(Leguminasae)。这些植物的若干种是人类食物的一部分，例如柠檬、芫荽、芹菜、防风草、荷兰芹以及胡萝卜。呋喃香豆素具有除了其有名的光敏化效应以外，还具有诸如止痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗凝血等若干令人关注的生物活性。由白芷(Angelica dahurica)(伞形科)根分离出的欧前胡素被发现可以诱发人体早幼粒细胞白血病HL-60细胞的凋亡。DNA断裂分析、基于形态学的评价以及流式细胞计数分析证明，微摩尔浓度的欧前胡素可以触发HL-60细胞的凋亡(Hyun-Ock等人，Imperatorin，a furanocoumarin from Angelica dahurica(Umbelliferae)，induces cytochrome c-dependent apoptosis in human promyelocyticleukaemia，HL-60 cells(欧前胡素，来自白芷(伞形科)的呋喃香豆素，在人体早幼粒细胞白血病HL-60细胞中诱导细胞色素c依赖的凋亡)；Pharmacology & Toxicology，vol.91，no.1，pp40-48，2002)。使用氮蓝四唑(NBT)法，欧前胡素对HL-60细胞显示出强大活性(Kawa等人，Effectof coumarins on HL-60 cell differentiation(香豆素类对HL-60细胞分化的影响)；Anticancer research，vol.20，No.4，pp 2505-2512，2000)。由中药I.防风(Saposhnikovia divaricata(Turcz)Schischk)分离的欧前胡素是可能的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂，其对亚硝酸盐产生的抑制的IC50值为17.3μg/ml，它可以用作癌症的化学预防剂(Yang等人，Inducible mitric oxide synthase inhibitor of the Chinese herb I.Saposhnikovia divaricata(Turcz)Schischk(中药I.防风(Turcz)Schischk的诱导型一氧化氮合酶抑制剂；Cancer Letters，vol.145，pp 2505-2512，1999)。
欧前胡素是由芫花萜和Radix Angelica dahurica制造的芫花萜止痛胶囊的主要成分(0.66至0.72mg/胶囊)，其被收录于由中华人民共和国卫生部出版的药物标准第八卷(1993)(Wenxiang等人，Determinationof imperatorin in Yuanhu analgesic capsule by RP-HPLC(使用RP-HPLC测定芫花萜止痛胶囊中的欧前胡素)；Chemical Journal on Internet，vol.3，No.11，pp56-59，2001)。因此，开发将来具有潜在治疗和商业用途的有效和经济可行的iNO抑制剂的天然来源是有价值的。
欧前胡素广泛分布于植物界，并可以从植物的不同部分(尤其是果实、种子和根)分离出欧前胡素。从王草(Imperatoria osthruthium L.)的根、当归(Angelica archangelia L.)的种子和欧防风(Pastinaca sativa L.)的果实中分离出欧前胡素(The Merck index，XII edition，p4960)。还可以从莳萝(Anethum graveolens)、当归(Angelica archangelia)、茴芹(Anthriscus cerefolium)、旱芹(Apium graveolens)、葛缕子(Carum carvi)、芫荽(Coriandrum sativum)、孜然(Cuminum cminum)、胡萝卜(Daucuscarota)、茴香(Foeniculum vulgare)、独活(Heracleum sphondylium)、欧当归(Levisticum officinale)、欧防风(Pastinaca sativa)、香芹(Petroselinum crispum)和大茴香(Pimpinella anisum)中分离出欧前胡素(Ceska等人，Photoactive furocoumarin in fruits of some umbellifers(某些伞形科果实中的光敏性呋喃香豆素)；Phytochemistry，vol.26，No.1，165-169，1986)。虽然所述植物生长于东南亚国家中，但是据报道，仅仅印度的木橘中存在欧前胡素(Asima Chatterjee等人，Isolation ofallo-imperatorin and β-sitosterol from the fruits of Aegle marmelos Correa(从木橘的果实中分离别欧前胡素和β-谷甾醇)；J.Ind.Chem.Soc.，vol.34，No.3，pp 228-230，1957)。还报道了不同科的将近40种其它植物种类含有欧前胡素。
虽然植物木橘在印度广泛用于医药目的以及用于制造冷饮，但是与木橘相关的专利并不多。现有的少量专利涉及用于污染控制的使用木橘的草药催化组合物以及用于汽车的节油和抗糖尿病组合物(IPRBulletin，Vol.7，No.3-4，March-April，2001)。
在印度，Asima Chatterjee(Asima Chatterjee等人，Isolation ofallo-imperatorin and β-sitosterol from the fruits of Aegle marmelos Correa(从木橘的果实中分离别欧前胡素和β-谷甾醇)；J.Ind.Chem.Soc，vol.34，No.3，pp 228-230，1957)于1957年报道了从Aegle marmelos分离欧前胡素，其中果实果肉的浓缩乙醇提取物的苯溶剂结晶得到0.003％的别欧前胡素，使用Broekmann氧化铝色谱柱(12cm×1cm)，石油醚和苯(1∶4)梯度混合物对母液进行色谱分离得到0.006％欧前胡素和0.00125％β-谷甾醇混合物。该方法的主要缺点是使用具有高度致癌性和禁用的苯作为溶剂对甲醇提取物进行分配以分离欧前胡素。除了非常低的产率以外，其不仅是耗时的方法，而且还是昂贵的方法。
由木兰(Magnolia pterocarpa Roxb)分离出的欧前胡素的含量为0.003％(Talapatra等人，Polyphenolic constituents(木兰的多酚类成分)，J.Ind.Chem.Soc，vol.60，1983)。
木橘生长于印度、泰国、斯里兰卡和其它东南亚国家。一棵树一季可以产最多800颗果实，但是平均产量为150-200颗，或者好的品种可以达到400颗。印度枸桔果实除了储存时真菌引起变质以外，无病虫害。在印度、中国、缅甸和斯里兰卡，它被用于若干药物的本土系统中。当地人利用植物的若干部分。在东印度群岛，在1500年代葡萄牙人以及在随后的时期英国殖民者依赖印度枸桔果实。印度枸桔果实可以被切成两半，或者将柔软类型打开，并且使用棕榈糖调味的果肉可以用于早餐，这在印度尼西亚是普遍的习惯。在印度制备的一种浓稠的冰冻果子露被认为具有缓泻、滋补和助消化的功效。给痔疮患者开带有茴香和姜的未熟透果实的煎剂的处方。包裹种子的粘液可用作在水中极度膨胀的粘合剂、添加剂、多用悬浮剂、表面活性剂以及乳化剂。其还被用作图片的清漆并且为水彩画增加光泽。种子油具有杀虫性能并且可以被用作滴耳剂。当果实熟透时，可从果皮中制备黄色染料。对于医药用途，未成熟的早期果实通常被水平地切成薄片，在太阳下晒干并在当地市场出售。它们从印度出口至马来亚和欧洲。
未熟透果实的厚果皮是收敛剂并在印度被用作治疗痢疾、腹泻等。因为果实是收敛剂，所以它被用作草药发油的成分。欧前胡素报道具有许多令人关注的生物活性，例如抗炎、强力保肝、抗诱变、放松效应、强抗血小板凝聚活性(体外)以及潜在的癌症化学预防剂。
在中国，欧前胡素是由芫花萜和当归组成的芫花萜止痛胶囊的主要活性成分(0.66至0.72mg/胶囊)，其被收录于由中华人民共和国卫生部出版的药物标准第八卷(1993)。在中国，印度枸桔果实也被用作凉茶。
在美国，欧前胡素是草药“Organic Ashitaba”的活性成分之一。
在德国，欧前胡素氢过氧化物衍生物被报道为通过羟基进行氧化性DNA修饰作用的新的嵌入“Photo-Fenton”试剂。
在印度，国家药物植物委员会(NMPB)已经出版了32种药用本草于2001-2002年和2004-2005年期间的年度需求数字(吨)以及年度增长率。以国家水平优先发展这32种药用植物。已经整理了这些草药的栽培信息并且出版了题为“Cultivation Practices of Some ImportantMedical Plants(一些重要药用植物的栽培实践)”的小册子。在该名单中，Aegle marmelos树在2001-2002年的年需要量为5,381.2MT以及在2004-2005年的年需要量为7084.5MT，年增长率为9.6％。
已经观察到，若干其它化合物经常与呋喃香豆素同时出现，这使其分离困难。通常，呋喃香豆素的分离起初依靠利用通常使用的极性增加的溶剂(石油醚、苯、醚、甲醇和乙醇等)对干植物的进行连续提取。已经观察到，使用非极性溶剂对植物材料进行提取时使呋喃香豆素回收率降低。然而，用于呋喃香豆素提取的极性溶剂(甲醇和乙醇)使具有颜色和脂肪物质的总提取物总量增加。脂肪物质和有色物质的分离是困难的任务。本发明中，我们选择卤代溶剂提取，得到带有少量有色和脂肪物质的更大量的欧前胡素。回收的纯溶剂的再次利用也更加容易。
现在不存在直接由木橘的新鲜/干中果皮分离欧前胡素的节省成本的方法。没有报道过先前试图使用减压柱液相色谱法直接处理木橘新鲜/干果实以分离欧前胡素。同样地，没有报道过高含量欧前胡素的植物用于商业开发或任何大规模分离纯欧前胡素的方法。
发明目的本发明的主要目的是提供新的、节省成本的、廉价的、有效率的和商业上可行的由成熟的/未成熟的新鲜的/干的木橘中果皮中分离欧前胡素的方法。
本发明另一目的是提供作为副产品获得富含免疫学上重要的植物甾醇的部分的方法。
本发明另一目的是开发木橘作为高含量欧前胡素的商业来源。
本发明另一目的是为欧前胡素的选择性提取选择节省成本的溶剂。
本发明另一目的是为分离用于治疗用途的纯欧前胡素开发经济上可行的方法。
发明概述因此，本发明提供由木橘分离和提取欧前胡素的新的以及节省成本的方法，其克服了迄今已知的从其它来源获得欧前胡素的方法的缺点。本发明尤其提供了从天然来源获得更廉价和更高产率的诱导型一氧化氮合酶抑制剂和抗炎候选物欧前胡素的方法。
本发明提供由木橘的成熟/未成熟果实中分离欧前胡素的方法，所述方法包括a)使用卤代溶剂提取新鲜的/干粉末的果实果肉直接地得到油水混合物或使用一元醇提取新鲜的/干粉末的果实果肉得到醇提取物；b)真空中浓缩所述提取的醇提取物至其原体积的10至30％；c)使用卤代溶剂分配所述浓缩的醇提取物以将欧前胡素转移至非极性溶剂中；d)使用无水硫酸钠干燥步骤(a)中直接得到的或通过步骤(c)的分配得到的所述提取油水混合物并蒸发所述溶剂以得到浓缩物；e)在溶剂中结晶所述浓缩物并过滤所生成的晶体；
f)浓缩滤液并将它们在硅胶上经减压柱液相色谱处理；g)在溶剂中洗脱欧前胡素以提供富含植物甾醇的部分和纯欧前胡素；h)结晶含有纯欧前胡素化合物的所述部分。
在本发明的一个实施方案中，在室温下，使用卤代溶剂直接地提取或使用一元醇提取所述新鲜/干粉末的果实果肉24至48小时，果肉∶溶剂比为1∶3至1∶6。
在本发明的另一实施方案中，使用卤代溶剂或一元醇，在Soxhlett装置中提取新鲜的/干粉末的果实果肉6至12小时，果肉∶溶剂比为1∶4。
在本发明的另一实施方案中，成熟/未成熟的新鲜果实果肉或干粉末果实果肉来自木橘。
在本发明的另一实施方案中，通过RP-HPLC筛选使用不同的溶剂，以新鲜方法和干式方法处理的木橘的所述成熟和未成熟果实。
在本发明的另一实施方案中，用于直接提取或分配的所述卤代溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳和二氯乙烷。
在本发明的另一实施方案中，提取用的所述一元醇是甲醇或乙醇。
在本发明的另一实施方案中，使用非极性氯代溶剂直接地选择性提取呋喃香豆素或使用氯代溶剂(四氯化碳、二氯甲烷和二氯乙烷)从醇相中转移呋喃香豆素。
在本发明的另一实施方案中，以1∶4至1∶6的比例将结晶后留在母液中的欧前胡素在硅胶(230-400目)上经减压柱液相色谱处理，以完全分离纯欧前胡素。
在本发明的另一实施方案中，欧前胡素由醇提取物向非极性溶剂的分配降低了粗提取物65-75％的体积(bulkiness)。
在本发明的另一实施方案中，欧前胡素从选自石油醚、丙酮和二氯甲烷及其混合物的溶剂中结晶。
在本发明的另一实施方案中，使用EDC/DCM(果肉∶溶剂1∶3)通过两天低温渗浸(cold percolation)的直接方法，由新鲜成熟果实中分离欧前胡素的产率为0.74％至1.43％(基于干重)。
在本发明的另一实施方案中，使用EDC/DCM(果肉∶溶剂1∶3)通过两天渗浸的直接方法，从干成熟果实中分离欧前胡素的产率为1.24至1.66％(基于干重)。
在本发明的另一实施方案中，使用EDC/DCM(果肉∶溶剂1∶6)通过两天低温渗浸，由新鲜成熟果实中分离欧前胡素的产率为2.19％至2.15％(基于干重)。
在本发明的另一实施方案中，通过甲醇提取物的DCM/EDC分配的方法，由新鲜成熟果实中分离欧前胡素的产率为1.92％/2.29％(基于干重)。
在本发明的另一实施方案中，通过甲醇提取物的DCM分配的干式方法，由未成熟果实中分离欧前胡素的产率为0.52％。
在本发明的另一实施方案中，使用二氯乙烷在Soxhlett装置提取6至12小时，由成熟果实(mature fruit)、未成熟果实(immature fruit)和熟透果实(ripe fruit)中分离欧前胡素的产率分别为3.12％、0.89％和1.71％。
发明的详细说明本发明提供由成熟的/未成熟的木橘果实中分离用作有效的诱导型一氧化氮合酶抑制剂和抗炎药物候选物的化合物欧前胡素的方法。本发明所述方法陈述如下(a)室温下使用卤代溶剂提取新鲜的/干粉末的果肉直接地或使用一元醇提取新鲜的/干粉末的果肉(果肉∶溶剂1∶3至1∶6)24至48小时，或使用卤代溶剂或一元醇在Soxhlett装置中提取新鲜的/干粉末的果实果肉6至12小时(果肉∶溶剂1∶4)，(b)真空中浓缩所述提取的醇溶剂至其原体积的10至30％，(c)使用卤代溶剂分配所述浓缩的醇提取物以将欧前胡素转移至非极性溶剂中，(d)使用无水硫酸钠干燥直接得到的或通过分配得到的所述提取的油水混合物并蒸发所述溶剂，(e)在石油醚-二氯甲烷混合物中结晶浓缩物并过滤所生成的晶体，
(f)浓缩滤液并在硅胶上经减压柱液相色谱处理，(g)以石油醚-乙酸乙酯混合物洗脱欧前胡素以提供富含植物甾醇的部分和纯欧前胡素；(h)结晶含有纯欧前胡素化合物的所述部分。
选用木橘的成熟/未成熟新鲜果实果肉或干粉末果实果肉分别进行新鲜方法或干式方法以分离欧前胡素。通过RP-HPLC筛选使用不同溶剂的新鲜方法和干式方法中的所有木橘的成熟和未成熟果实所分离的欧前胡素。与其它报道的植物相比，木橘的欧前胡素产率非常高。
用于直接提取或分配的卤代溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳和二氯乙烷。提取用的一元醇是甲醇或乙醇。用卤代溶剂分离欧前胡素导致产生含有较少量颜色和脂肪物质的欧前胡素。
使用非极性氯代溶剂直接地选择性提取呋喃香豆素或使用氯代溶剂(四氯化碳、二氯甲烷和二氯乙烷)从醇相中转移呋喃香豆素。欧前胡素中的大部分颜色和脂肪物质留在极性相中，因此，在非极性相中使富集欧前胡素的结晶(60-70％)。以1∶4至1∶6的比例将结晶后留在母液中的欧前胡素在硅胶(230-400目)上经减压柱液相色谱处理，以完全分离纯欧前胡素。
欧前胡素从醇提取物向非极性溶剂的分配降低了粗提取物65-75％的体积，接下来在处理时就需要更少量的硅胶和溶剂。欧前胡素从选自石油醚、丙酮和二氯甲烷及其混合物的溶剂中结晶。使用EDC/DCM(果肉∶溶剂1∶3)通过两天低温渗浸的直接方法，由新鲜成熟果实中分离欧前胡素的产率为0.74％至1.43％(基于干重)。
使用EDC/DCM(果肉∶溶剂1∶3)通过两天渗浸的直接方法，由干的成熟果实中分离欧前胡素的产率为1.24至1.66％(基于干重)。使用EDC/DCM(果肉∶溶剂1∶6)通过两天低温渗浸，由新鲜成熟果实中分离欧前胡素的产率为2.19％至2.15％(基于干重)。使用甲醇提取物的DCM/EDC分配方法，由新鲜成熟果实中分离欧前胡素的产率为1.92％/2.29％(基于干重)。使用甲醇提取物的DCM分配的干式方法，由未成熟果实中分离欧前胡素的产率为0.52％。使用二氯乙烷在Soxhlett装置提取6至12小时，由成熟果实、未成熟果实和熟透果实中分离欧前胡素的产率分别为3.12％、0.89％和1.71％。
本发明提供从木橘分离欧前胡素的新的以及节省成本的方法，其克服了迄今已知的从其它来源分离欧前胡素的方法的缺点。本发明尤其提供自天然来源获得更廉价和更高产率的诱导型一氧化氮合酶抑制剂和抗炎药物候选物欧前胡素的方法。
下列实施例对本发明方法进行了说明，但不应解释为限制。
实施例1选择果实进行提取进行了未成熟、成熟和半成熟阶段的木橘新鲜果实果肉的欧前胡素含量的对比研究。在Soxhlett装置中，使用二氯乙烷提取水分含量为2.5至4％的50g干样品6至12小时。过滤并使用无水硫酸钠干燥提取的油水混合物，并在真空中蒸发所述溶剂至干燥。将提取物(1mg)溶解于5ml HPLC级的甲醇中。在下列操作条件下使用带有UV检测器的LC8A Shimadzu HPLC检测每一样品中的欧前胡素含量流动相甲醇∶水(50∶50)；流速1ml/min，在300nm处检测，色谱柱-C18R-ODS-S-A5μm。使用标准欧前胡素的校准曲线进行定量分析，不同成熟阶段果实的分析结果如下纯度为54％至62％的未成熟的(0.89％)，成熟的(3.12％)以及熟透的(1.71％)。
实施例2选择用于提取的溶剂使用300ml不同的溶剂(四氯化碳、二氯甲烷、二氯乙烷和二氯乙烷∶甲醇(9∶1))在室温下低温渗浸24小时，提取含有71.5％水分的木橘新鲜粉碎样品(100mg)。过滤并使用无水硫酸钠干燥每一提取物，并在真空中浓缩。将每一提取物(1mg)溶解于5ml HPLC级的甲醇中并使用实施例1中描述的HPLC方法检测欧前胡素的含量。通过RP-HPLC，筛选使用不同的溶剂进行新鲜方法和干式方法处理的所有木橘的成熟、未成熟和熟透果实的欧前胡素含量。不同处理中得到欧前胡素的含量如下新鲜方法室温下低温渗浸含水分71.5％的成熟果实(果肉∶溶剂1∶3)24小时后，基于干重，直接EDC(0.75％)、DCM(0.82％)、EDC∶MeOH(9∶1)(0.66％)和CCl4(0.38％)。进一步延长渗浸一天，使欧前胡素含量增加，即基于干重EDC增加(1.43％)、DCM增加(1.24％)以及EDC∶MeOH(9∶1)增加(1.22)。两天连续渗浸后，含水分68％的新鲜成熟果实果肉(果肉∶溶剂1∶6)的EDC和DCM渗浸得到欧前胡素的含量为2.19％和2.15％。
干式方法在成熟果实的干式方法处理中，欧前胡素的含量如下，根据65％至70％纯度的干重渗浸一天后，EDC(1.31％)、DCM(1.24％)；渗浸两天后进一步增加为(1.66％)、(1.56％)。基于40％至50％纯度的干重，EDC/DCM分配的新鲜成熟果实果肉甲醇提取物含有(1.92％)/(2.29％)。
实施例3从成熟果实果肉提取并分离欧前胡素使用机械剥离木橘成熟果实的果肉并在室温下使用二氯甲烷[170.9g新鲜果肉，含有54.68％的干物质]或二氯乙烷[399.4g新鲜果肉，含有127.8％的干物质]直接渗浸含水分(68％)的粉碎果肉(果肉∶溶剂1∶6)24至48小时。使用无水硫酸钠干燥全部提取的油水混合物并在真空中浓缩。将浓缩物[DCM2.85g/EDC3.93g]溶于正己烷-二氯甲烷混合物(15至20ml)中，并在冰箱中(0-4℃)保持4-5小时以便结晶。过滤并干燥晶体化合物以得到纯欧前胡素。结晶过程重复三次以得到(60至70％)纯欧前胡素化合物(由DCM得到1g/由EDC得到2.0254g)。以(1∶5)比率在硅胶上通过减压柱液相色谱分离滤液中剩余的欧前胡素，并使用正己烷中含20％至40％EtOAc洗脱欧前胡素。收集并蒸发含欧前胡素的部分并使其结晶，得到纯欧前胡素(由DCM得到0.176g/由EDC得到0.7729g)。因此，使用二氯甲烷/二氯乙烷低温渗浸，由170.9g含2.15％欧前胡素的新鲜成熟果实果肉分离出(85％)的纯欧前胡素，而由399.4g含2.19％欧前胡素的新鲜成熟粉碎果肉分离出(90％)纯欧前胡素。作为本方法副产品得到了富含免疫学上重要的植物甾醇部分(0.04至0.16％)。通过文献中报道的m.p.、IR、UV、1H、13C NMR和质谱数据鉴别欧前胡素。
实施例4由木橘未成熟果实果肉中提取并分离欧前胡素使用机械剥离木橘未成熟果实的果肉，切成薄片并在荫凉处干燥。在Soxhlett装置中，使用甲醇提取含水分(3.5％)的干粉末果肉(111g)6至12小时。在真空中，将全部提取物浓缩至其原体积的10至30％。使用二氯甲烷(5次，100ml)分配所述浓缩甲醇提取物。使用无水硫酸钠干燥所述二氯甲烷提取物(3.66g)并在真空下蒸发。如实施例3描述的那样，从该残余物中分离欧前胡素。因此，使用甲醇提取物的DCM分配干式方法，从欧前胡素含量0.52％的111g荫凉处干燥的果实果肉中分离出(82％)纯欧前胡素(0.5668g)。得到作为有用副产物的植物甾醇混合物(0.10％)。
发明优点1.本发明首次报道了从木橘分离欧前胡素的商业上可行的方法。
2.鉴别果实用于以提高的产率和降低的处理成本分离欧前胡素。
3.与使用诸如甲醇或乙醇的其它溶剂并分配到卤代溶剂相比，使用二氯乙烷直接提取新鲜/干果实果肉更加经济，高纯度的欧前胡素产率更高。
4.从醇提取物相至卤代非极性相的欧前胡素的选择性转移使纯欧前胡素的纯化和分离容易进行。
5.直接由粗提取物结晶欧前胡素使欧前胡素产率在减压柱液相色谱前达到60-70％。
6.所述方法允许溶剂和硅胶的重复使用。
7.所述方法使得富含植物甾醇的部分作为有用副产品。
8.本发明是由成熟/未成熟木橘果实分离欧前胡素的节省成本的和高产率的方法。
9.与使用诸如甲醇或乙醇的其它溶剂并分配至卤代溶剂相比，使用二氯乙烷直接提取新鲜/干果实果肉更加经济，高纯度的欧前胡素产率更高。
10.从醇提取物向卤代非极性相的欧前胡素的选择性转移使纯欧前胡素的纯化和分离容易进行。
11.粗提取物的纯化使欧前胡素在减压柱液相色谱前达到60-75％的结晶。
12.所述方法允许溶剂和硅胶的重复使用。
13.所述方法允许富含植物甾醇的部分作为有用副产品。
这些优点具有重要的经济价值并且易于在大的商业规模上生产欧前胡素。
权利要求
1.从成熟/未成熟的木橘果实中分离欧前胡素的方法，所述方法包括(a)使用卤代溶剂提取新鲜的/干粉末的果实果肉直接地得到油水混合物或使用一元醇提取新鲜的/干粉末的果实果肉得到醇提取物；(b)真空下浓缩所述提取的醇提取物至其原始体积的10至30％；(c)使用卤代溶剂分配所述浓缩的醇提取物，以将欧前胡素转移至非极性溶剂中；(d)使用无水硫酸钠干燥步骤(a)中直接得到的或通过步骤(c)的分配得到的提取的油水混合物并蒸发所述溶剂以得到浓缩物；(e)溶剂中结晶所述浓缩物并过滤所生成的晶体；(f)浓缩滤液并在硅胶上经减压柱液相色谱处理；(g)在溶剂中洗脱欧前胡素以提供富含植物甾醇的部分和纯欧前胡素；(h)结晶含有纯欧前胡素化合物的所述部分。
2.如权利要求1所述的方法，其中在室温下，使用卤代溶剂直接地提取或使用一元醇提取所述新鲜/干粉末的果实果肉24至48小时，果肉∶溶剂比为1∶3至1∶6。
3.如权利要求1所述的方法，其中使用卤代溶剂或一元醇在Soxhlett装置中提取新鲜的/干粉末的果实果肉6至12小时，果肉∶溶剂比为1∶4。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟/未成熟新鲜果实果肉或干粉末果实果肉来自木橘。
5.如权利要求1所述的方法，其中使用不同的溶剂的新鲜方法和干式方法处理的所述木橘的成熟和未成熟果实的筛选是通过RP-HPLC进行的。
6.如权利要求1所述的方法，其中用于直接提取或分配的所述卤代溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳和二氯乙烷。
7.如权利要求1所述的方法，其中提取所用的所述一元醇是甲醇或乙醇。
8.如权利要求1所述的方法，其中使用非极性氯代溶剂直接地选择性提取呋喃香豆素，使用选自四氯化碳、二氯甲烷和二氯乙烷的氯代溶剂从醇相中转移呋喃香豆素。
9.如权利要求1所述的方法，其中以1∶4至1∶6的比例将结晶后留在母液中的所述欧前胡素在硅胶(230-400目)上经减压柱液相色谱处理，以完全分离纯欧前胡素。
10.如权利要求1所述的方法，其中欧前胡素由醇提取物向非极性溶剂的所述分配降低了所述粗提取物65-75％的体积。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述欧前胡素从选自石油醚、丙酮和二氯甲烷及其混合物的溶剂中结晶。
12.如权利要求1所述的方法，其中使用EDC/DCM(果肉∶溶剂1∶3)通过两天低温渗浸的直接方法，从新鲜成熟果实中分离欧前胡素的产率为0.74％至1.43％(基于干重)。
13.如权利要求1所述的方法，其中使用EDC/DCM(果肉∶溶剂1∶3)通过两天渗浸的直接方法，从干成熟果实中分离欧前胡素的产率为1.24至1.66％(基于干重)。
14.如权利要求1所述的方法，其中使用EDC/DCM(果肉∶溶剂1∶6)通过两天低温渗浸，由新鲜成熟果实中分离欧前胡素的产率为2.19％至2.15％(基于干重)。
15.如权利要求1所述的方法，其中通过甲醇提取物的DCM/EDC分配方法，从新鲜成熟果实中分离欧前胡素的产率为1.92％/2.29％(基于干重)。
16.如权利要求1所述的方法，其中通过甲醇提取物的DCM分配的干式方法，从未成熟果实中分离欧前胡素的产率为0.52％的范围。
17.如权利要求1所述的方法，其中通过使用二氯乙烷在Soxhlett装置中提取6至12小时，由成熟果实、未成熟果实和熟透果实中分离欧前胡素的产率分别为3.12％、0.89％和1.71％。
全文摘要
本发明涉及从木橘中分离欧前胡素的方法，所述欧前胡素是有效的诱导型一氧化氮合酶抑制剂和抗炎候选物。
文档编号C07D493/14GK1926142SQ200480042640
公开日2007年3月7日 申请日期2004年10月19日 优先权日2004年3月31日
发明者曼加拉·高里·庞南帕利, 马埃瓦里·穆拉利达拉恩·吉贾, 马达姆·瓦迪拉詹·韦努高帕兰·韦卢帕伦布, 阿鲁穆汉·沙米 申请人:科学与工业研究委员会