结合淋巴细胞的天然IgM抗体的制作方法

专利名称：结合淋巴细胞的天然IgM抗体的制作方法
技术领域：
本发明整体上涉及天然的IgM抗淋巴细胞抗体，更具体的，本发明通过使用这些抗体抑制疾病发展的方法。
背景技术：
正常的人类和动物具有天然的IgM自身抗体(被称作IgM NAA)，其在出生时出现，并在不存在与目标抗原的精密免疫反应时被产生。现有技术已经清楚地证明IgM NAA是最多反应性的，其中单克隆IgM NAA能够识别多种近似的自身抗原，其具有独特但是有区别的抗原决定簇特异性组。这种多反应性的特征的最好例证是类风湿因子，其是一种识别并结合到不同自身和非自身IgG的Fc区但不会结合到其他糖蛋白或者自身核蛋白的IgM NAA。IgM NAA的抗原结合位点通常是由种系基因所编码的，其不会进行或者进行最少的突变，该特征相应于这些抗体的多反应性。相反，编码相应引起疾病(例如甲状腺炎)的外源抗原或自身抗体所产生的抗体的抗原结合位点的基因是高度突变的，该遗传特征为这些抗体高度特异地提供了高结合亲和力。因此，来自于他们遗传组成的IgM NAA的多反应性和低结合亲和力使这些抗体与在精密免疫反应所产生的传统抗体或者产生疾病的自身抗体区别开。现有技术教导NAA主要是IgM同种型，但是其他同种型的NAA也已经被描述(参见Nakamura M，J of Immunol.1988，vol 141，p 4165-72，该对比文件的材料在这里被作为参考引入)。现有技术已经使用抗体，典型的是在免疫反应后产生的，并具有高度的结合亲和力和高特异性，以保护免于感染，或者抑制免疫介导的紊乱。本发明在所使用的抗体是天然存在的方面是新颖性的。
正常人类和动物在他们的血液中具有低水平的循环的天然IgM抗体，其结合到他们自身的白细胞，诸如例如B淋巴细胞和T淋巴细胞，而不会在37℃下引起细胞裂解。因此，这类IgM抗体被称作“IgM抗淋巴细胞自身抗体”。这些IgM抗淋巴细胞抗体结合到巨噬细胞、嗜中性粒细胞和内皮细胞，并且除了自身白细胞外还结合到异体细胞。动物抗淋巴细胞NAA(小鼠、大鼠、羊、马、兔)和人IgM抗淋巴细胞NAA都结合相同的人类细胞。因此，在本申请中，IgM抗淋巴细胞自身抗体(无论人还是动物)都被称作IgM抗淋巴细胞或者抗白细胞抗体或者自身抗体，即自身抗体或抗体可以被互换使用。关于结合到IgM自身抗体的白细胞或淋巴细胞抗原或受体了解得非常少。
这类抗淋巴细胞抗体的水平在炎症状态的过程中会提高，其包括自身免疫疾病和炎症疾病诸如例如系统性红斑狼疮(SLE)、结节病、HIV-1、疟疾、Epstein-Barr病毒(″EBV″)和巨细胞病毒(″CMV″)。因此，带有无症状HIV-1的个体具有高水平的IgM抗白细胞自身抗体。
然而，发明人的研究显示趋化因子受体是细胞膜受体之一，其结合这些IgM自身抗体，并通过该机制，这类IgM自身抗体抑制HIV-1感染细胞。发明人的研究还显示结合淋巴细胞的IgM自身抗体是异源的，并且只有这些抗体中的某些具有抑制HIV-1感染细胞的能力。抑制HIV-1感染细胞的IgM抗体水平是非常低的，或者在AIDS患者中是缺少的。因此，尽管带有无症状HIV-1感染的个体具有提高的抑制HIV-1感染性的IgM自身抗体水平，然而，当该疾病发展为AIDS时这些水平会显著降低。关于IgM NAA和IgM抗淋巴细胞抗体的更多信息在Lacroix-Desmazes S.等人J of Immunol Methods 216117-137，1998Cervenak J，Acta Microbiologica等人Immunologica Hungraria1999，vol 46，p 53-62中被进行综述，这两篇参考文献的材料这里被引入作为参考。
发明人的研究还显示IgM结合T细胞上的CD3和CD4受体以及另外下调T细胞上的CD2。这样，如在发明人的研究中所显示的具有与CD3、CD4结合特异性并下调CD2、CD80和CD86的IgM NAA抑制T细胞激活和增殖，并且还抑制HIV-1结合到CD4受体。该技术教导T细胞激活对于起始和维持炎症过程，上调膜受体进而增强病毒进入和复制，包括HIV-1进入和复制是重要的(参见Jenkins MK，Annual Review of Immunol，2001，vol 19，p 23-45.HuberBT.Microbiological Reviews，1996vol 60 p 473-82关于EBV，CMV狂犬病病毒；Sutkowski N，Immunity，2001，vol 15，p 579-89关于EBV；Frenkel N，J of Virol，1990，vol 64 p 4598-602关于疱疹病毒6；和Stein BS，Advances in Exp Med andBiol，1991，vol 300 p 71-86关于HIV-1)。在这5份参考文献中的所有材料都被引入此处作为参考。这样，通过抑制T细胞激活，IgM NAA对不同疾病状态以及在不同的组织位点的炎症过程具有抑制作用，并对病毒进入和复制有抑制作用。该技术还教导HIV-1结合到CD4受体以增强病毒进入，因此，如在发明人的研究中所显示的，另外，IgM NAA对HIV-1感染性的抑制是由于IgMNAA结合到CD4，这样抑制HIV-1结合到CD4。
现在本发明人简要地提供趋化因子和趋化因子受体的总结。关于该主题的细节被Olson和Ley，Amer.J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiology283R7-R28，2002；Gerard和Rollins，Nature Immunol 2108-115，2001；以及Onuffer和Horuk，Trends in Pharmacological Sciences 23459-467，2002所描述，在这3份参考文献中的所有材料都被引入此处作为参考。
人类中的已知趋化因子系统包括大约50种不同的趋化因子和大约20种G蛋白偶联的趋化因子受体。该趋化因子系统具有多种特征(i)大部分趋化因子是被分泌的，但某些例如CXXXC趋化因子(fractalkine)被表达在细胞表面。(ii)趋化因子被下分为CC、CXC或者CX3C组，其基于在头两个半胱氨酸之间的氨基酸数目。(iii)某些趋化因子仅结合一种受体，例如CXCR4与SDF-1α，CXCR5与BCA-1，而其他的受体则能够结合多种趋化因例如CXCR3结合IP-10、Mig和I-TAC。类似的，单一趋化因子能够结合多种受体例如RANTES会以高亲和力结合CCR1、CCR3和CCR5。这已经引导本领域中的某些暗示趋化因子系统的过剩是普遍的。然而存在某些例外，例如CXCR4受体表达的缺少与异常的胚胎形成以及器官形成相关。另外，在相同的细胞上表达的不同趋化因子受体能够诱导特异的信号，这样指示受体被偶联到不同的细胞内通路。(iv)对于正常稳态转运重要的某些趋化因子(以及他们各自的受体)(例如BCA-1，其参与淋巴细胞迁移到淋巴结)是组成型表达的，而炎症趋化因子(以及他们的受体)是在白细胞和其他细胞例如内皮细胞上被诱导的，其仅在特异的条件下，典型的是通过炎症趋化因子例如由巨噬细胞或激活的T淋巴细胞产生的IL-1或TNF-α。(v.)趋化因子受体被表达在许多不同细胞上，其包括白细胞、内皮细胞、平滑肌细胞以及上皮细胞和神经细胞，并且这也细胞也能够分泌趋化因子。
趋化因子在白细胞转运中发挥了主导作用，所述转运发生于某些多种多样的炎症过程如多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、同种异体移植物和异种移植物排异和急、慢性细菌和病毒感染、哮喘、大肠炎、牛皮癣、动脉硬化症、高血压、缺血再灌注和与瘤形成相关的炎症。另外，趋化因子在其他非炎症过程中发挥了重要作用例如器官形成、造血以及与小胶质细胞的、和血管形成的神经细胞通讯。在这些紊乱中的某些中，趋化因子所发挥的重要作用被如下观察所阐明(a)CXCR4的特异性缺失与异常器官形成相关，和(b)在CCR5中具有纯合子缺陷的个体受到保护免于同种异体移植物排异和哮喘。在炎症过程中趋化因子系统的参与包括白细胞转运以及白细胞激活和免疫细胞分化。例如，趋化因子诱导嗜中性粒细胞提高整合素的表达、嗜中性粒细胞的脱粒以及超氧化物的形成。类似的，趋化因子系统参与淋巴细胞亚群的组织特异性寻靶到淋巴器官，在该处淋巴细胞被激活，并开始分化(参见Olso和Ley的参考文献)。
特别重要的是发现趋化因子受体即主要是CXCR4和CCR5作为HIV-1病毒进入细胞的共受体。X4HIV-1病毒使用CXCR4受体，而R5HIV-1病毒使用CCR5受体。现在已经相当清楚的是，通过趋化因子受体的病毒进入在影响HIV-1感染后的病毒复制和疾病发展是最重要的。例如，在CCRS受体有遗传缺陷的个体已经与在HIV-1感染之后的延长的潜伏期相关，即HIV-1较慢地发展为AIDS。
研究人员和制药公司已经在研究阻断或者使特异性趋化因子受体失活的策略，以抑制诱导疾病过程的炎症反应，并抑制HIV-1进入细胞。这些种的某些包括肽和IgG单克隆抗体的应用，其结合到特异性的趋化因子受体。然而这些策略还未表现出有效。
最后，发明人将提供对T细胞在炎症过程中作用的总结。现有技术已经显示T细胞在多种不同的炎症过程中发挥了显著的作用，其包括过敏、自身免疫紊乱、移植器官的排异、动脉硬化症以及对感染的抗性。例如在缺失T细胞的动物中同种异体移植物不被排异，这说明T细胞激活和细胞因子的产生对于诱导或者促进与排异相关的炎症过程是必要的。该技术还教导CD3和CD4是重要的受体(或者开关)，其参与T细胞的激活(参见Werlen G，CurrentOpinion in Immunol Vol 14 p 299-305，2002，在这方面的现有技术)。因此，发明人认为通过结合到CD3和CD4，IgMNAA会抑制T细胞激活，并提供抑制T细胞激活发挥显著作用的不同炎症过程的另一种机制。T细胞在某些炎症过程中的作用的例子在Perkins DL，Current Opinion in Nephrology andHypertension Vol 7，p 297-303，1998；Hansson GK等人Circulation Research Vol91 p 281-291，2002中被综述，这两篇参考文献中的材料在这里被引入作为参考。
研究人员和制药公司已经在研究抑制T细胞激活以抑制炎症过程的策略，其包括自身免疫紊乱、过敏和同种异体移植物排异。这些中的某些包括使用使T细胞失活或者杀死T细胞的抗体。这些抗体是使用人类T淋巴细胞对动物进行免疫而产生的。其他的策略包括使用(i)免疫抑制性药物例如环孢霉素或雷怕霉素(Rapamycin)和(ii)抑制激活的T细胞所产生细胞因子的药物。这些策略是昂贵的，并且具有严重的副作用，并且对于生活特别是在移植后不得不被长期和多次使用。能够增强IgM NAA产生的疫苗能够证明是更便宜，更有效和可以用于大量个体人群。

发明内容
正常的人类和动物具有天然IgM自身抗体(被称作IgM NAA)，其在出生时出现，并且这些在血清中的抗体的所有组成成分在生命的最初几年会提高。这些抗体在没有被靶抗原的精密免疫的情况下被产生。IgM NAA与使用外源抗原进行免疫后所产生的抗体或者造成疾病的自身抗体在由种系基因所编码的NAA的抗原结合位点方面是截然不同的，其经历了很少的突变或者没有突变。结果，IgM NAA缺少特异性，并且具有低结合亲和力。IgM NAA是大部分多反应性的，因为单一的IgM单克隆抗体能够够识别多种非常相近似的自身抗原，其具有独特但不同的抗原决定簇特异性组。尽管IgM抗淋巴细胞NAA之前已经被描述，但没有现有技术鉴定IgM所靶向的糖蛋白淋巴细胞受体，也没有现有技术显示IgM抗淋巴细胞NAA能够改变细胞功能或者抑制细胞对病毒的易感染性。
在本发明中，申请人已经发现某些从正常人血清得到的IgM抗淋巴细胞NAA结合到趋化因子受体，并特异性地抑制趋化因子结合到他们的受体，增强或抑制趋化作用，并抑制HIV-1感染细胞。抑制HIV-1感染细胞的IgM自身抗体在AIDS患者中被耗尽，而在无症状的感染HIV-1的个体或者在正常个体中没有被耗尽。因此，本发明人认为IgM NAA抑制HIV-1的感染性，其通过利用结合到CD4以及趋化因子受体“阻断”HIV-1进入，并且通过利用结合到趋化因子受体和其他受体如CD3和CD4(如下)抑制淋巴细胞激活。
而且，IgM抗淋巴细胞NAA是结合在淋巴细胞上的趋化因子受体和其他非趋化因子受体的某些不同抗体的异源组。这类非趋化因子受体包括糖蛋白和糖脂蛋白受体。这些IgM抗淋巴细胞NAA具有低结合亲和力，并且在体温下(即37℃)在存在补体的情况下不会裂解正常细胞。在本发明中，申请人已经发现这些多反应性IgM抗淋巴细胞NAA结合到相同或者非常相似的淋巴细胞受体(例如趋化因子受体或者非趋化因子受体)，其出现在其他白细胞(即嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和巨噬细胞)、内皮细胞和恶性细胞(淋巴的与非淋巴的)。在本发明中，申请人还证明IgM抗淋巴细胞NAA结合到非趋化因子受体，其被鉴定为CD3和CD4，并且还显示天然具有抗CD3、抗CD4和抗趋化因子受体活性的IgM抑制淋巴细胞的激活和增殖。申请人还证明IgM抗淋巴细胞NAA下调T细胞上的CD2，在抗原递呈细胞上的CD80和CD86，这样通过该额外的机制抑制T细胞。
本发明人还观察到具有IgM对他们供体淋巴细胞高水平反应的人类肾脏移植受体很少具有排异的问题。在本发明中，申请人认为对排异的保护是通过IgM对自体同源白细胞以及供体内皮细胞的抑制作用介导。高水平的受体IgM结合到供体淋巴细胞，也与相似水平的IgM结合到受体白细胞和供体内皮细胞相关。这样，受体IgM将通过抑制白细胞迁移，以及通过抑制自体同源淋巴细胞的激活保护免受排异，例如通过结合到CD3和CD4趋化因子受体以及下调CD2、CD80和CD86。
最后，发明人还观察到在存在正常IgM抗淋巴细胞NAA的情况下，37℃下提高的恶性细胞(而不是正常细胞)的细胞死亡和裂解。发明人认为这些抗体也通过结合到趋化因子受体和其他未知的受体而保护免于恶化。
因此，本发明的一个目标是提供一种通过使用IgM抗淋巴细胞NAA抑制疾病过程的方法，其中所述疾病过程包括和/或由趋化因子受体和非趋化因子受体介导。
通过下面的目前优选的实施方式的详细描述，在结合附图以及后面的权利要求，进行考虑时，本发明的上述和其他目标、优点和特征将变得更清楚。
发明人的背景本发明人具有现有技术以显示(a)天然IgM结合到趋化因子受体并抑制HIV-1的感染性(2003年8月26日发布的USPTO专利号6,610,834B1)以及(b)天然IgM结合到CD3和趋化因子受体，并通过该机制抑制T细胞激活和抑制HIV-1的感染性(参见2002年11月7日提交的US专利申请10/292,002)。
此处的公开提供了新的技术以显示IgM结合CD4，并下调CD2、CD80和CD86。在此处的公开中，发明人引入了发明人的在先技术，因为通过结合到CD4，IgM显著地增强天然IgM抗淋巴细胞抗体对HIV-1感染性的抑制作用，其通过阻断HIV-1结合到CD4。第二，通过结合到CD4并下调CD2、CD80和CD86，IgM增强IgM对T细胞激活和增强的抑制作用(参见Schulze-KoopsH等人，Curr Directions in Autoimmunity，vol 2.p 24-49，2000和Pullar，CE，ScandJ Immunology，vol 57，p 33-341，2003)。
因此，本发明人认为在新技术中，增强天然IgM抗淋巴细胞抗体对现有技术中相同疾病的效果。而且，天然IgM抗体在新技术中需要在现有技术中所描述的IgM抗体以对相同的疾病过程有作用。因此，对新技术的主张与现有技术相结合。
发明的公开为了达到前面所述和其他的目标，根据这里所具体实施和充分描述的本发明的目的，本发明涉及结合IgM受体的抗体的表达、刺激和给药以处理病毒感染以及其所诱导的疾病状态。
现有技术已经显示在正常未被感染的个体和新生儿的血液中的IgM自身抗体结合到淋巴细胞上的细胞外受体。有现有技术也显示在正常体中以低水平出现的淋巴细胞的IgM自身抗体在各种感染状态(包括HIV)、自身免疫紊乱和炎症紊乱中提高。这些IgM抗体是异源的，并结合到多种不同的未被鉴定的膜受体。然而，有现有技术显示IgM自身抗体结合到淋巴细胞膜上的鞘糖脂和磷脂膜抗原。这些IgM自身抗体在37℃下不会破坏正常细胞，因为在该温度下，他们具有低结合亲和力，并且不能够激活补体。
根据本发明，在正常血清中出现的IgM抗淋巴细胞自身抗体结合趋化因子受体，例如CXCR4、CCR5、CCR3和CCR2b，以及其他非趋化因子淋巴细胞表面受体，例如CD3和CD4抗原。发明人还显示存在IgM抗淋巴细胞受体自身抗体亚组，其抑制HIV-1感染细胞，并且该IgM亚组在AIDS患者中被耗尽。
在不希望受到特定理论的约束的情况下，发明人认为在HIV-1感染后，这些抗体的提高减慢了感染朝发展AIDS的进程，在新生儿中的高水平IgM保护新生儿免于从他们被感染的母亲获得HIV-1病毒血症。未经治疗的感染HIV-1的母亲的新生儿中只有20～25％被发现带有HIV-1病毒。抑制HIV-1的细胞感染性的可能机制包括(但不限于)抑制HIV-1结合到CD4受体(ii)“阻断”HIV-1病毒通过趋化因子受体进入，其通过趋化因子的位阻或二聚化以及(iii)通过结合到CD3和CD4受体，或者下调其他激活受体例如CD2、CD80、CD86和趋化因子受体，使淋巴细胞失活。IgM抗白细胞抗体能够造成趋化因子受体以及TCR/CD3受体的二聚化，其通过结合和交联这些受体以及通过结合到与这些受体结合的脂筏。脂筏含有鞘糖脂以及磷脂，现有技术已经显示其是IgM抗淋巴细胞自身抗体的靶抗原。IgM抗淋巴细胞NAA结合到糖脂和磷脂已经在Griggi等人，Scand.J of Immunol，4077-82，1994以及Stimmler等人，Archives of Internal Medicine 1491833-1835，1989中被描述，并且这里引入该材料作为参考。
趋化因子、趋化因子受体和淋巴细胞受体(例如CD3、CD4和其他的共刺激分子)都参与包括白细胞和内皮细胞的炎症过程中。炎症过程的例子包括(但不限于)自身免疫紊乱(例如SLE、类风湿性关节炎)、哮喘、动脉粥样化形成、在血液透析的晚期肾病(ESRD)患者、结节病、各种病毒、细菌和寄生虫感染、同种异体移植物和异种移植物排异、各种形式的脉管炎、多发性硬化、间质性肺和肾部炎症和血管球性肾炎。在不希望被任何具体理论束缚的情况下，发明人认为IgM抗淋巴细胞NAA通过结合到趋化因子受体和其他淋巴细胞受体能够抑制上面所述的炎症过程。抑制的可能机理包括在结合IgM后抑制趋化因子受体的功能，并且更重要的是在结合到趋化因子受体和非趋化因子受体例如CD3和CD4受体之后，淋巴细胞和/或巨噬细胞的失活。
IgM抗淋巴细胞NAA也结合到内皮细胞以及恶性细胞系。在本发明中，我们显示IgM NAA是多反应性的，并因此结合到在这些细胞上出现的相同或者相近似或者不同的趋化因子和非趋化因子受体。发明人相信某些单克隆IgM抗趋化因子受体抗体是多反应性的，并且结合到多个不同的趋化因子受体，因为淋巴细胞吸收IgM会去除结合到恶性细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、巨噬细胞和内皮细胞的IgM，尽管这些细胞具有不同的趋化因子受体并缺少在淋巴细胞上存在的趋化因子受体。
认为IgM通过结合到内皮细胞和恶性细胞上的趋化因子和非趋化因子受体，抑制这些细胞的功能。例如，存在现有技术显示恶性细胞上的趋化因子受体有助于这些细胞的迁移(参见MuellerA等人，Nature Vol 410 p 50-56，2001和Gerard C，Nature Immunol Vol 2 p108-115，2001)。因此，发明人认为IgM通过结合到恶性细胞和/或内皮细胞上的趋化因子受体能够通过位阻或者二聚化抑制恶性细胞的生长和扩散。而且，存在现有技术显示淋巴结内的和渗透入肿瘤质(tumor mass)的淋巴细胞分泌趋化因子和其他的细胞因子，所有这些有利于肿瘤细胞的生长和迁移。因此，发明人认为IgM通过结合到趋化因子受体以及其他白细胞和恶性细胞上的“激活”受体将通过该额外机制也会抑制肿瘤生长和迁移。最后，发明人显示恶性淋巴瘤细胞(而不是正常细胞)如果与IgM进行孵育，在37℃下会具有增强的细胞死亡。因此，IgM通过增强恶性细胞的细胞死亡会提供另一个抗癌作用的机制。
内皮细胞和白细胞在多种炎症过程(例如同种异体移植物排异、动脉粥样化形成、脉管炎和脑部的炎症状态)中也是重要的。因此，认为IgM抗淋巴细胞NAA通过结合到在白细胞和内皮细胞上的趋化因子受体能够提供在抑制这类炎症过程中的保护作用。而且，IgM抗淋巴细胞NAA也能够抑制炎症过程，其通过抑制激活淋巴细胞和巨噬细胞的受体(例如CD3和CD4)。
发明人相信所收集的IgM制剂含有抗体的异源组，其结合到白细胞、内皮细胞和恶性细胞上的趋化因子或者非趋化因子受体，并且IgM结合到这些受体中的多种能够增加或者具有在IgM介导的病毒感染性、炎症状态和恶性细胞生长和扩散的抑制中的协同作用。
实验研究方法/程序细胞系Sup T-1是一种淋巴瘤T细胞系，其组成型表达CXCR4和CCR5趋化因子受体。Jurkat细胞是一种淋巴瘤T细胞系，其组成型表达CXCR4，而不是CCR5受体。这些细胞系是从NIH的AIDS Reagent Program获得的。
HOS骨肉瘤细胞系被共转染CD4以及CXCR4或CCR5基因以产生HOS-CD4、HOS-CD4-CXCR4和HOS-CD4-CCR5细胞。GHOST CCR5和GHOST CXCR4分别是被共转染HIV-2 LTR驱动的hGFP构建和CCR5或CXCR4基因的HOS-CD4细胞。该细胞系和转染子是从NIH的AIDS ReagentProgram获得的。
成胶质细胞瘤细胞系U373-MAGI被共转染CD4和CXCR4或CCR5以分别产生U373-MAGI-CXCR4和U373-MAGI-CCR5。这些细胞系和转染子也是从NIH的AIDS Reagent Program获得的。
所有这些被转染的细胞系都稳定表达CCR5或CXCR4，其中U373-MAGI细胞具有这些受体的最高表达。
人类外周血淋巴细胞(″PBL″)被IL-2激活，以增强CCR5的表达。PBL(在含有10％胎牛血清的1ml RPMI培养基中的2×106个细胞被通过使用IL-2(40单位/ml)和植物血球凝集素(″PHA-P″，5mcg/ml)Ficol/hypaque分散的PBL进行起始的预处理而激活，接着经细胞在37℃下大约5％的CO2中培养24～48小时后清洗PBL。接着，在趋化因子结合试验中被使用之前，将这类PHA预处理的细胞保持生长另外6～7天，其补充20％的胎牛血清和IL-2(40单位/ml)。
HIV-1病毒用于感染GHOST CCR5或者丝裂原激活的PBL的R5HIV-1病毒(8397、8442和8658)是从约翰霍普金斯大学的Homayoon Garadegan博士处获得的。用于感染GHOST CXCR4或者丝裂原激活的PBL的X4病毒IIIB和RF是从NIH的AIDS Reagent Program获得的。
IgM制剂和血清使用从热(56℃)灭活的正常个体或者患者的血清纯化的IgM进行研究。使用Sephacryl S-300HR尺寸排阻柱层析从血清制备IgM。使用低渗透析或者通过氯化铵沉淀，IgM不会从血清沉淀，因为这些过程降低了生物活性。任何造成污染的IgG都被从IgM制剂中去除，其通过将纯化的IgM再次通过Sephacryl/S-300HR柱，并通过暴露到琼脂糖蛋白G和连接到羊抗人IgG的琼脂糖(Sigma)。我们基本上采用尺寸柱层析以去除会影响我们数据的低分子量的物质(例如趋化因子，抗病毒药物)和IgG抗HIV-1抗体。血清蛋白质电泳和免疫电泳揭示通过尺寸排阻层析获得的这些IgM制剂，含有IgG(＜1％)、白蛋白(＜3％)和其他蛋白质(＜1％)。我们不希望亲和纯化这些抗体，因为这些程序例如将IgM结合到结合甘露聚糖的蛋白质，或者IgM结合到偶联羊抗人IgM的琼脂糖，产生了10-15％的起始IgM，并且具有耗尽某些IgM亚组的可能。而是，在某些实验中，我们使用IgG、IgA、白蛋白和α-2-巨球蛋白来确定是否我们的观察能够被这些微量的污染解释。当使用ELISA和Western印迹技术进行分析时，在这些IgM制剂中没有出现可以检测到的RANTES和SDF-1α。
我们从未被感染的健康个体、无症状的HIV-1感染的患者以及在HAART治疗和在在血液透析的晚期肾病(ESRD)患者得到血清。某些HIV-1患者已经遭受了AIDS引起的疾病，其他的某些尽管进行了HAART治疗仍具有高病毒负荷(＞100,000个拷贝)。为了获得充分的量，收集了来自9个HIV-1患者的的IgM。还收集了来自7个ESRD患者的IgM。附图中所表示的数据来自个体，或者来自所收集的IgM，并在该图中进行指示。
通过Sephacryl S-300HR柱层析对转染EBV的人B细胞克隆的培养物上清进行分离，其根据尺寸分离蛋白质。人类B细胞克隆来自从SLE患者的血中所分离的B淋巴细胞。B细胞克隆是通过使用EBV病毒感染B细胞而开发的，这使B细胞不会死亡，并且能够分泌特异性的抗体即IgM。更具体的，非T细胞是在除去T细胞后，使用羊红血球花结技术从PBL分离的。在含有大约10％胎牛血清的大约0.1ml RPMI 1640细胞培养基中的大约2×103非T细胞被加入到96孔板的每个孔中。接着向每个孔加入大约50兰布达(lambda)的含EBV的B95-8细胞系上清。在孵育之前，0.05ml中大约104个异源经过辐射(3,000rad)的PBL被加入作为滋养细胞。将这些板在37℃下，在大约5％的CO2中进行孵育。大约每4～5天对该培养基进行替换。大约3～4周后，B细胞系在孔中成“簇”出现。在该过程中滋养细胞死亡。当出现“簇”时，这些成簇的细胞被转移到24孔板即来自一个孔的细胞被转入一个更大的孔。当培养基变为淡黄色时，对培养基进行更换，通常大约3～5天。在大约2周后，检测上清的IgM抗体。含有具有期望的抗体特异性的细胞系的孔被进一步通过限制稀释在96孔板中进行亚克隆。将大约105个滋养细胞加入到含有这些细胞系的每个孔中。对上清进行重新检查以利用期望的抗体特异性进行分离克隆。对上清进行冷却，但不是冷冻，因为IgM会沉淀出来。可以用于抑制HIV-1感染性的分泌IgM抗体的克隆被冷冻保藏。来自这些克隆的上清通常含有大约0.5～大约0.7μg/ml的抗体。特别感兴趣的克隆能够与K6H6/B5浆细胞瘤细胞系(或者不分泌抗体的其他相似的细胞系)融合以开发杂交瘤。对这些克隆进行筛选以鉴定和获得与在被转染的细胞上出现的CD3、CD4、CCR5和CXCR4趋化因子受体反应的克隆。与HOS-CD4对照相比，通过流式细胞仪，这些克隆具有提高的IgM与HOS-CD4转染子(即HOS-CD4-CXCR4和HOS-CD4-CXC5)结合。以这种方式，两个克隆CK12和CK15被进行鉴定，它们分泌具有与HOS-CD4CCR5或CXCR4转染子提高结合的IgM。
由血清和培养上清中获得的IgM中的所有污染的IgG都被除去，通过将所制备的IgM暴露给G蛋白-琼脂糖凝胶(Sigma公司提供)和羊抗人IgG(特异识别Fc)-琼脂糖(Sigma公司提供)。
IgM还可以通过Sephacryl S-300HR柱层析的方式从患有瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)的病人的血清中获得。将血清进行蛋白电泳可以看到单独的IgM(单克隆的)的峰。这后而制备的IgM制剂后文称为“瓦尔登斯特伦IgM”并且单克隆的IgM可以结合到淋巴细胞和其他白细胞上的未知膜受体。
Jurkat细胞吸附IgM2.5毫升浓度为0.2mg/ml的IgM RPM1溶液用280×106Jurkat细胞在37℃，5％CO2条件下吸附45分钟。之所以选用Jurkat细胞，因为作为T细胞系该种细胞表达多数T细胞受体包括CD3和趋化因子受体。45分钟后，离心分离IgM以除去细胞并用ELISA技术检测被吸附的IgM。25％到30％的IgM在吸附中而丢失。用流式细胞仪检测，被吸附的IgM对Jurkat细胞，淋巴细胞，嗜中性粒细胞或培养的内皮细胞有＜5％的残余结合活性。
单体IgM的制备单体IgM来源于五聚体形式，在200nM Tris，150mM NaCl和1mM EDTA，pH 8.0的缓冲液中，用5mM DTT室温下还原2小时。之后用12mM的碘乙酰胺在冰上碱化处理1小时。IgM的单体通过与PBS平衡的层析柱(Superdex-200)与剩余的五聚体形式分离。单体IgM的纯度可通过在还原和非还原状态下的SDS-PAGE Western印迹鉴定。流式细胞仪检测，可以发现和五聚体形式相比，单体的IgM对淋巴细胞的结合力下降了不到20％。
趋化因子四种趋化因子制剂被用于随后的研究。RANTES、SDF-1α和生物素标记的SDF-1α和RANTES购于加利福尼亚Becton Dickinson of La Jolla公司。放射性标记的RANTES(记为″I125RANTES″或者″I125″)购于马萨诸塞州的波士顿NEN生命科学公司。RANTES结合CCR5，而SDF-1α结合CXCR4。
抗体克隆2D7、CTC-5、45502、45523和45549是鼠的IgG单克隆抗体，特异性识别完整细胞上表达的CCR5。此外，Western印迹中的克隆CTC-5还可以结合线性化的CCR5分子。克隆12G5(IgG 2a)44708、(IgG 2a)44717(IgG 2b)和44716(IgG 2b)是鼠的IgG单克隆，其结合完整细胞上的CXCR4受体并且可以抑制细胞对SDF-1α所表现的趋化性。所有这些抗体都来自R&D系统或美国国立卫生研究院AIDS试剂计划(NIHAIDS Reagent program)。克隆4G10由Chris Broder博士提供，是鼠的IgG单克隆抗体可以结合CXCR4的N端结构。Leu 3a(Becton-Dickenson)是鼠的IgG单克隆抗体特异性识别CD4。
IgM在完整细胞水平抑制RANTES结合CCR5通过下面的方法可以检测IgM是否抑制RANTES结合完整细胞上的CCR5受体，例如，U373-MAGI-CCR5E和IL-2激活的人淋巴细胞。首先，约1×105细胞用含10％的胎牛血清的RPMI培养基、或用约150nM亲和纯化的精确IgM、或用约400nM纯化的人IgG或约5nM、约1.25nM或约0.45nM的CK15 IgM在室温下培养大约45分钟，该培养要在每种混合物都被加入1微克RANTES之前进行。然后，细胞重新在4℃下培养约90分钟并在4℃下清洗.然后加入羊的抗RANTES抗体(购于R&D of Minneapolis，明尼苏达州)，在洗之前，在4℃下培养细胞约45分钟，随后用FITC兔抗羊抗体染色。用流式细胞仪检测与细胞上的CCR5结合的FITC标记的RANTES的数量。
IgM在完整细胞水平抑制SDF-1α结合CXCR4通过下面的方法可以检测IgM是否抑制SDF-1α结合完整Sup T-1细胞上的趋化因子受体(如CXCR4)。首先，约1×105Sup T-1细胞用含10％的胎牛血清的RPMI培养基、或用均是约150nM的正常IgM和HIV IgM、或用均是约5nM的Waldenstrom IgM和CK15IgM，室温培养45分钟，该培养要在每种混合物被加入25ng生物素标记的SDF-1α之前进行。然后，细胞重新在4℃培养约90分钟。随后再培养，向细胞加入FITC抗生物素，并冲洗细胞。用流式细胞仪检测与CXCR4结合的FITC标记的SDF-1α的数量。
免疫沉淀技术和Western印迹检测IgM结合可溶性细胞膜受体在4℃下用10ml 100mM(NH4)25O4，20mM Tris HCl(pH 7.5)含10％甘油，1％Cymal-5(Anatrace公司，Maumee，俄亥俄州)和1片小的完整(Roche)培养细胞系(80×106)30分钟，以在最小程度的变性状态下溶解膜受体。IgM/受体复合物可以通过100μL细胞裂解液(相当于含50×106细胞的量)和100μg IgM相互作用而得到。IgM/细胞裂解液的混合物然后和50μL含共价结合了羊IgG抗人IgM的洗过的琼脂糖珠状颗粒(Sigma)相互作用。用含1％的牛血清白蛋白的缓冲液洗结合了IgM/受体复合物的琼脂糖珠三次(700转每分钟)然后再用缓冲液洗2次。洗过的带IgM/受体复合物的珠和含有4％的2-ME的Laemmli缓冲液共同在37℃孵育30分钟，在最低的还原状态下解离并线性化受体。较高温度的孵育会导致羊IgG(与琼脂糖珠共价结合)的解离和变性。对上清在SDS-PAGE中电泳，转膜到硝化纤纬上并且，然后用特异识别讨论中的受体的IgG一抗来探测。HRP偶联的二抗(即使是特异性识别鼠或兔IgG的Fc片段)通常都会结合含有羊IgG(从珠上脱落的)重链和轻链以及IgG的轻链的其他蛋白条带。因此，二抗可以自然的与之前使用的羊IgG和人IgM预吸附。而Western印迹的阴性对照是用与IgM(但没有细胞裂解液)相互作用的珠的上清来进行，或用和裂解液(但没有IgM)相互作用的珠来进行，用以来检测非特异条带的存在。而阳性对照的设置是不含珠或IgM的细胞膜裂解液与Laemmli缓冲液在相同条件下作用并通过SDS-PAGE电泳检测。
Western印迹中的抗体下述的抗体是Western印迹中所使用的一抗抗IL2-R(α或β链)、抗CD3、抗CD4、抗HLA-A、抗HLA-DR或抗CXCR4的兔多克隆抗体；抗CCR5(克隆CTC，N端)和抗CXCR4(克隆4G10，N端)的鼠单克隆IgG抗体。抗体购于R&D Systems公司，MN公司，或Santa Cruz Biotechnology公司(加利福尼亚)或Biochain Institute公司(加利福尼亚)。如下是使用的HRP偶联的二抗(特异识别Fc片断)羊抗兔IgG、鼠IgG、或人IgM的多克隆抗体。所有二抗均来自于Jackson Immunological Labs公司。
趋化性分析趋化性分析是在正常IgM、HIV IgM、AIDS IgM和Waldenstrom IgM且浓度约为20nM、40nM、100nM和200nM IgM的条件下，在24孔的带5微米聚碳酸脂过滤器的Costar transwell组织培养板上操作。每次实验中，IgM被加在transwell孔的上层，上层含有约2×104Jurkat细胞，在0.1ml含有2％人白蛋白的RPM1培养基中。大约30分钟后，加入50ng SDF-1α到transwell孔的底层，其中含有约0.6ml和上层孔相同的培养液。约4小时后，用流式细胞仪统计从上层迁移到下层孔的细胞。趋化性指数是用在没有SDF-1α存在条件下的迁移细胞的总数除以SDF-1α加入后迁移细胞的总数而得到。
MLR分析简要的说，0.2×106PBL与相同数目但来源于其他个体的细胞在0.2ml含10％胎牛血清的RPM1培养基中共同培养(一式三份)，已知该个体拥有不同的HLA-Class 1和DR抗原。培养4到5天之后，在96孔板每个孔的培养细胞中加入[H]3标记的胸腺嘧啶，12到18小时后在过滤基质上收细胞。由于细胞增殖而摄入的胸腺嘧啶的量可用液态闪烁计数器检测。在第0天到第1天之间的不同培养阶段加入不同剂量的IgM。温度依赖的IgM抗白细胞抗体对细胞自溶的影响温度依赖的IgM抗白细胞抗体对细胞自溶的影响测定方法采用补体依赖微量淋巴细胞毒性试验。在加入作为补体源的新鲜兔血清前，不同梯度稀释的IgM抗体与2×105PBL或IL-2激活的PBL(7天)反应1小时。约2小时后，洗细胞两次，然后加入台盼兰并计数被染成蓝色的死细胞。实验在15℃和37℃进行操作。
IgM抑制HIV-1侵染细胞a)HIV-1感染GHOST细胞已观测到HIV-1R5病毒通过CCR5受体进入细胞，而HIV-1 X4病毒则利用CXCR4受体。因此，实验设计用于检测是否IgM可以抑制上面所观测到的HIV-1病毒进入细胞。研究过程中，用HIV-1侵染GHOST CCR5和GHOST CXCR4转染细胞系。GHOST细胞来源于HOS细胞，HOS细胞被转入CCR5或CXCR4基因并且都共转了HIV-2 LTR控制的人绿色荧光蛋白(hGFP)构建。hGFP构建可以使受到HIV-1病毒感染的细胞发绿色荧光，所以受感染细胞的数目可以通过流式细胞仪计数。这两个细胞系相当适用这些研究，因为不到48小时就可以检测到单周期的病毒的复制。
在12孔板中，每种约2×104个GHOST CCR5和CXCR4被分别培养在含10％的胎牛血清的1ml RPM1培养基中约12小时。在将R5HIV-1加入GHOST CCR5和将X4HIV-1病毒加入GHOST CXCR4之前，然后正常HIV或ESRD IgM被加入每个GHOST CCR5和CXCR4中约30分钟。之后病毒和抗体在一起共同孵育48小时。没有加入polybrene促进病毒进入细胞。
孵育结束后，收集细胞并用福尔马林固定。通过流式细胞仪计数被感染的发射绿色荧光的细胞。加之，当病毒或IgM抗体在和GHOST细胞共同培养4小时后洗去培养基，检测可以获得类似的数据。
b)HIV感染激活的人PBL人PBL首先用植物凝集素(Phytohemmaglutium，PHA-P)和IL-2预处理提高T淋巴细胞和单核细胞上受体的表达(如CCRS和CD4)并激活这些细胞。这些措施可以促进HIV-1的侵染和复制。因此，用Ficol/Hypaque分离的PBL(含10％胎牛血清的每毫升培养基中有2×106个细胞)用PHA-P(5mg/ml)和IL-2(40units/ml)预处理，在5％CO2条件下培养24到48小时。在加入IL-2、IgM和HIV-1病毒前冲洗细胞。细胞不用再冲洗但要保持生长12到14天。其中，在第7天，移去(并保留)一半的培养上清并在每孔添加1×106新鲜的激活PBL(至少激活48小时)同样补充一半量的IgM和IL-2。12到14天后，收集培养上清并加入p-24核心抗原，用ELISA技术检测定量。
c)HIV-1感染人PBL/SCID老鼠我们采用(并改进)了Mosier开发的技术，参考1991年Torbett发表在Immunol Reviews 124139-164，1991上的文章，该文章在这里被作为参考文献引入。7到8周大的雌性CB 17 SCID老鼠购买于印第安纳波利斯的HarlanSprague Dawley公司，其血清中的IgM浓度小于1微克/毫升。将1ml含新分离的25-35×106PBL细胞的含10％FCS和抗生素的RPMI(RPMI培养基)，经腹膜内注射给该老鼠。2小时后重新经腹膜内注入1ml含105TCID50HIV-1病毒的RPMI培养基。随后立即注射或48小时后注射浓度为1mg/ml的IgM1ml到老鼠的腹膜内。该IgM来源于相同PBL赠体。之后每隔5天都注射相同剂量的IgM，直到动力学检测显示经腹膜内注射后第二天的血清IgM峰值达到40-50μg/ml，且之后第五天IgM峰值达到8-10μg/ml。人PBL细胞注射3周后处死老鼠。通过用FITC标记的鼠抗人CD3或CD4(BD Pharmigen)，用流式细胞仪计数脾脏中表达CD3和CD4阳性的T淋巴细胞的百分数。其次，鼠的脾细胞和被IL2激活两天的自体PBL共同培养，以测定脾细胞中HIV的含量。在此过程中，1ml含2×106的脾白细胞的RPMI培养基和1ml含有2×106PHA+IL-2激活(2天)的人PBL细胞的含人IL2的RPMI培养基(30units/ml)共同培养。每周都更换2×106IL2激活两天的自体PBL。二到三周后，用ELISA试剂盒定量检测共培养的上清中的p24抗原。应用上述技术(如，单一剂量的病毒并且3周后处死老鼠)，不能检测到一周之后并发的病毒血症。对于SCID老鼠的研究以获得动物应用与关怀委员会(Institutions AnimalCare and Use Committee)的允许。
结果介绍结果部分的数据将按如下顺序讨论
a)研究表明IgM可以结合淋巴细胞、其他白细胞和恶性细胞并且在37℃不引起细胞裂解。
b)研究表明纯化的血清IgM在体内和体外都可抑制HIV-1的感染。
c)研究表明IgM可抑制T细胞的增殖和趋化反应。
d)研究确定了IgM抑制T细胞增殖的部分机制，包括(i)免疫沉淀研究显示IgM可以结合CD3和CD4；(ii)IgM可下调CD4、CD2、CD80和CD86受体；(iii)IgM可以抑制主要的T细胞激活信号。
e)研究确定了IgM抑制趋化反应的部分机制，包括(i)免疫沉淀显示IgM可以结合CCR5和CXCR4；(ii)IgM抑制MIP-1α和RANTES与CCR5的结合但对SDF-1α和CXCR4的结合影响甚微；(iii)IgM下调CCR5但不调控CXCR4；(iv)IgM阻碍被CXCR4的内化作用诱导的SDF-1α。
f)上述数据详细说明了IgM介导的HIV-1的抑制机理。
g)研究表明IgM抗淋巴细胞自身抗体可以抑制肾移植受者的免疫排斥反应。
h)研究表明IgM抗淋巴细胞自身抗体在37℃引起淋巴瘤细胞死亡。
数据陈述a)研究表明IgM抗淋巴细胞、其他白细胞和恶性细胞并且在37℃不引起细胞裂解。
(i)IgM结合淋巴细胞、其他白细胞和恶性细胞研究过程中，采用流式细胞仪定量测定和IgM结合的不同细胞。参照图1A和1B，正常IgM和HIV IgM中含有可以结合Sup T-1细胞(图1A)和GHOST CD4-CXCR4细胞(图1B)的IgM抗体。参照图1D和1E，正常和AIDS IgM中含有可以结合从外周血分离的T淋巴细胞(图1D)和中性粒细胞(图1E)的抗体。每张图的阴性对照表明培养的各种细胞中不包含IgM。
(ii)IgM抗淋巴细胞抗体在37℃下的非裂解性在15℃补体存在的条件下进行分析，观察到约40％到60％的正常淋巴细胞会发生裂解。IL-2-激活淋巴细胞细胞中受体表达升高，也表现出更高的裂解水平。当IgM浓度到达1.0微克或更高，就会引起细胞裂解。CK15在浓度约0.05微克或更高时便会裂解细胞。然而，在37℃的实验条件下，仅有小于约5％的正常或IL-2-激活淋巴细胞发生裂解。这些现象和许多报道相一致，清楚的说明了IgM抗淋巴细胞自身抗体并不在37℃而是在较低的温度下才会导致细胞裂解。(参见Lobo PI等人在Lancet Vol 2，p 879-83，1980发表的文章)。
b)研究表明纯化的血清IgM抑制HIV-1的感染人PBL细胞。
(i)体外实验表明人IgM可以抑制HIV-1感染PHA+IL-2激活的人PBL细胞。
研究使用的IgM来源于正常人、HIV-1感染的个体和等待肾移植的ESRD病人的血清。我们没有HIV-1感染长期无进展的没有进行HAART治疗的样本。所有采用的的HIV-1感染者均在接受HAART治疗。我们采用ESRD病人的IgM作比较以确认IgM-ALA除了在ESRD中或在HIV感染之后能引起部分炎症反应外，是否还存在基于我们假设所预测的HIV-1感染抑制活性。研究中，我们也使用了从大鼠、小鼠和兔子血清中纯化的IgM。在初期的实验中，用不同种的HIV-1病毒株(X4和X5)感染用促细胞分裂素激活48小时的PBL细胞，并加入用不同浓度的IgM。所有选用的IgM浓度都在生理范围之内。当所有IgM制剂的浓度等于或大于15μg/ml时，表现出最大的抑制活性。虽然某些特定的病毒，在所有IgM制剂浓度低于4μg/ml时就接近最大抑制效果。由于数量有限，通常将来源于4～5个个体的IgM收集在一起，但在特定的实验中，使用指明了来源于单独个体的IgM并没有表现出和整个结果有不同之处。表I和表II显示了使用两个主要的R5病毒株(8397和8568)和X4病毒株IIIB的5个不同实验的结果。有趣的是，正常HIV和ESRD IgM和solCD4抑制了8658(R5)和IIIB(X4)病毒株超过98％的病毒复制。然而，只有ESRD IgM和sol CD4能够抑制8397(R5)病毒株到98％以上。起初对于正常和HIV-1IgM缺乏对8397(R5)的抑制的结果感到迷惑，但是随后的免疫沉淀实验(见图7和11)表明ESRD IgM对CD4和CCR5的结合活性要比正常和HIV-1IgM高数倍。
表I由正常人、HIV-1感染的个体和ESRD病人的血清纯化的IgM在体外对HIV-1病毒感染的影响

表I数据源代表5个不同的实验。每个p24的值都是三个孔的平均值，其中与平均值的偏差小于15％。实验中采用的IgM集合了3到4个人的样本，并且在先于病毒30分钟加入。ND表示未进行实验。
表II全部体外实验结果总结，评估了正常IgM，ESRD IgM，和HIV-1IgM对不同HIV病毒株的抑制百分比。
平均抑制百分数

(N)表示不同的实验序号，每个实验都重复了三次。在没有IgM的病毒培养条件下P-24水平从29,000到200,000pg/ml不等。
表III收集的正常和HIV-1IgM抑制具有抵抗力的R58397病毒。

实验细节和表I的注释相同。所有值都是三个平行实验的平均值，且三个培养中的每个的值与平均值的偏差均小于15％有两种潜在的可能性以解释来源不同的IgM对R5病毒8397(见表I和表II)的抑制效果不同。与正常和HIV-1IgM相比，ESRD IgM都拥有较高的结合活性，或者正常和HIV-1IgM缺少存在于ESRD IgM上的具有一定识别特性的IgM。综合Western印迹实验的结果(见图7和11的基本数据)，可以明显的看出大部分HIV-1IgM都缺少IgM抗-CCR5，但具有高水平的IgM抗-CD4。而正常IgM具有低水平的结合CD4的IgM，但具有足够高的结合CCR5的IgM。反之，ESRD IgM具有对于CD4和CCR5结合均高水平的IgM。因此，我们可以假设对R5病毒8397的抑制需要IgM抗体同时结合并封闭CD4和CCR5位点。为了验证我们的假设，我们混合了有很高水平的IgM抗CCR5但低水平的IgM抗CD4的源于正常人的IgM和有高水平的IgM抗CD4但缺乏IgM抗CCR5的HIV IgM。我们发现如此操作使抗体可以同时封闭CD4和CCR5。具体数据见表III。这些数据支持了我们的猜想，即对于某些HIV-1病毒，需要IgM抗体同时封闭CD4和CCR5受体才能抑制病毒进入和感染细胞。因此，通过收集正常的和HIV IgM，对8397 R5病毒的感染，我们可以获得与ESRD IgM同等的抑制效果。
可溶性CD4可以有效抑制8397(R5)，表明8397(R5)对CD4有较高的亲和性或亲和力。其次，表I的数据显示500ng/ml剂量且每48小时重新补充的RANTES只能很小地抑制R5病毒。然而，仅仅热灭活的血清，等同与PBL，却能够抑制87％的8658(R5)病毒株。另一方面，这些血清类似于正常的IgM，只能微弱的抑制8397(R5)病毒。混合IgG对IIIB没有任何抑制效果。从大鼠、小鼠和兔子的血清中纯化的IgM对所有三种HIV-1病毒株都有高于95％的抑制效果。
我们随后检测了IgM抑制效果的动力学特性。如图2中描述，纯化的正常IgM甚至在加入病毒培养了96小时之后仍可以抑制HIV-1、IIIB(X4)和8658(数据未出示)。这些发现促使我们怀疑是否非-IgM-ALA抗体也有抗病毒活性。
为了排除这种可能性，IgM开始便被吸附在表达CD3、CD4、CXCR4和CCR5的Jurkat T细胞系上。表IV显示，在与T细胞系吸附之后，IgM丧失了对HIV-1感染的抑制活性，因此对HIV-1感染起到抑制效果位于可与白细胞结合的IgM(如IgM-ALA)。这个结果进一步暗示了IgM-ALA可以抑制HIV-1通过阻止病毒进入细胞而实现的。因此，我们用GHOST细胞系统来确认是否IgM可以抑制病毒进入细胞。GHOST CCR5和CXCR4转染细胞系用HIV-2 LTR这样稳定地转染调控hGFP构建。由于HIV-1病毒基因组整和进入细胞DNA后，被感染的细胞会发出绿色荧光。因此，特别在48小时一代复制后收集细胞，可以测定病毒进入细胞的效率。图3的数据清楚的表示了在IgM存在的条件下，病毒进入细胞的能力下降了95％或更多。
表IV实验检测了正常的IgM集合对HIV-1的抑制活性是否依赖于结合T细胞的IgM(如IgM-ALA)-Jurkat T细胞系吸附IgM的效果


(ii)对人PBL-SCID老鼠模型的研究显示正常的IgM可以抑制体内HIV-1的感染我们用一个详细说明的体内模型来确认在体外从PHA+IL-2激活PBL细胞观测得到的结果。在这个模型中，PBL细胞被病毒感染之前并没有被促细胞分裂素预先激活，因此IgM-ALA可以通过抑制T细胞的活性而控制病毒复制。实验方法和血清中IgM水平的定量分析的细节问题在“程序方法”章节中有具体描述。研究中并没有使用HIV和ESRD IgM，因为血液的样本很难获得并且数量不够支持整个实验。关于收集的正常人的IgM和两个不同病毒株的数据参见表V。这些数据提供了两方面的观察资料。首先，由于CD4细胞的耗尽，30％的被感染的老鼠自动的转为不再被感染的个体，Mosier也报道过同样的现象。因此3周后只有60～70％的老鼠仍被感染。然而，正常的IgM可以将被感染老鼠的数目降至27％。这种对8658(R5)病毒感染所表现的差异已经具有统计显著性(p＜0.08)。几乎很少老鼠被IIIB感染但IgM仍然将被感染的老鼠的数目由75％降至14％。结合8658和IIIB两方面的数据，IgM降低了被感染老鼠的数目具有明显的统计显著性(p＜0.05)(费歇准确检定，FishersExact Test)。在人IgM存在的条件下，被HIV-1感染的人-PBL-SCID老鼠数目减少并不是因为人PBL的IgM或HIV-1的耗尽，由于在IgM+HIV+PBL处理的和未处理的对照SCID老鼠中，通过三色流式细胞仪分析，并没有检测到两种老鼠的脾脏内的人T细胞种群(CD45+，CD3+，CD4+)有明显改变(数据未出示)。
表V在人-PBL-SCID老鼠中，体内的IgM对HIV-1感染的影响

*这种感染的差异具有统计显著性(p＜0.08，费歇准确方程)。
IgM-ALA水平在各种炎症反应中升高和IgM-ALA可以抑制HIV-1感染，这两方面的结果所用促使我们考虑是否IgM-ALA介导的抑制效应是通过和HIV-1病毒进入细胞所必须的受体结合而该受体也参与多种炎症反应。因为IgM可以结合T细胞受体和趋化因子受体所以这个假设有很大的可能性。为了验证这些可能性，我们首先检测了从血清中纯化的IgM是否可以(i)抑制同种异型抗原(MLR)和抗CD3诱导的T细胞的增殖；(ii)抑制响应趋化因子的趋化反应。在研究过程中，我们将正常的IgM和HIV-1、ESRD IgM比较。用Waldenstrom IgM作为实验阴性对照。
综上所述，这些数据清楚的表明了源于正常人、ESRD患者和HIV-1感染者的IgM在体内和体外都可以有效抑制HIV-1感染激活的人PBL，并且通过Jurkat T细胞吸附IgM可以消除抑制效应，这两方面表明抑制HIV-1感染是由通过结合到Jurkat细胞细胞膜的IgM介导的。除此，应用GHOST细胞的实验表明IgM的抑制效果是作用在病毒进入细胞的环节上。我们的结论仍然不能解释可能存在于纯化的IgM制剂中的与Tat和gp120有相互作用活性的IgM，之前的研究发现，可以抗Tat和抗gp120的IgM并没有HIV-1中和活性，也不能抑制病毒侵入细胞。同样，我们仍然不能解释为何IgM可以中和HIV-1病毒，正如其他文献所公开的新鲜的人血清并不能裂解或失活HIV-1病毒(见Rodman TC等人，J of Exp Med，Vol 175 p1247-1353，1992；Berberian等人Science Vol 261 p1588-1591，1993；Llorente M.Scand J of Immunol，Vol 50p270-279，1999；Hoshino H，Nature Vol 310 p324-325，1984；and Bonapur B，Virology Vol 152p 268-271，1986是关于这些的现有技术)。我们无法通过ELISA和Western印迹技术检测这些IgM制剂中的RANTES或SDF-1α。
c)研究表明IgM可抑制T细胞的增殖和趋化反应(i)IgM抑制MLR诱导的细胞增殖混合淋巴细胞反应(MLR assay)(参见方法)被用于初步检测IgM对同种异型抗原响应的T细胞增殖的效影响。从图4可以看出，在生理剂量的IgM(如15μg/ml)浓度下，不是收集的正常的和HIV IgM而是收集的ESRD IgM可以有效的抑制T细胞的增殖。ESRD IgM加入24小时后，失去对T细胞增殖的抑制效应。收集的IgG或白蛋白在MLR分析中不表现任何抑制效应。当浓度达到40到60μg/ml时，正常的IgM表现出抑制MLR活性(数据未出示)。
为了确定ESRD IgM的抑制效应是由于IgM与T细胞的结合所致，我们用Jurkat T细胞系吸附处理ESRD IgM(参见方法)以除去所有抗T细胞活性。然后，MLR分析显示用Jurkat细胞吸附过的IgM不能抑制T细胞的增殖。这表明观察到的ESRD IgM抑制T细胞增殖是因为IgM可以结合T细胞。
(ii)IgM抑制抗CD3诱导的T细胞增殖我们想确定IgM是否可以影响抗CD3诱导的PBL的增殖。在研究过程中，正常的PBL细胞(1×105个细胞0.2ml中)被置于0.01μg OKT3(鼠的IgG2a抗CD3单克隆抗体)中，并且在用H3标记的胸腺嘧啶检测细胞增殖程度前要先培养4天。收集的正常IgM，HIV IgM，或ESRD IgM(15μg)在培养初期便被加入细胞中。图5显示了三个实验之一的实验数据。HIV和ESRDIgM明显的抑制了抗CD3介导的T细胞的增殖。同样，ESRD IgM加入24小时后，失去对T细胞增殖的抑制效应。这些数据和MLR诱导T细胞增殖中得到的数据类似(见图4)。
(iii)IgM抑制RANTES(但非SDF-1α)诱导的趋化反应研究过程中，我们主要关注两种趋化因子受体CCR5和CXCR4。图6显示了，在IgM(10μg/ml)存在和不存在的条件下，激活5天的PBL细胞在MLR培养中对RANTES和SDF-1α引起的趋化反应(2小时分析)的三次实验中一次的数据。标准误差表示三次平行实验的偏差。这些数据清楚的表示了在5天的培养过程中，ESRD IgM可以抑制被培养的PBL细胞对RANTES的趋化反应，但对对SDF-1α的趋化反应没有抑制效果。正常IgM和HIV IgM不能抑制RANTES诱导的趋化反应(数据未示出)，反而可以促进SDF-1α诱导的趋化反应。
d)研究确定IgM-ALA抑制T细胞增殖的机制特别通过ESRD IgM对同种异型抗原或抗CD3引起的T细胞增殖的抑制效应促使我们确认是否对于IgM结合TcR/CD3和/或一些共激活分子，由IgM介导的抑制效应是次要的。实验结果支持了这样的猜想，表明抗体结合CD4受体后可以抑制同种异型抗原或抗CD3引起的T细胞增殖。除此IgM抗体结合CD3(不同于IgG抗CD3)而抑制T细胞激活和增殖很可能与它的五聚体结构有关。我们也想知道IgM结合受体是否可以下调受体水平。研究中我们使用从单独的正常人的血清中纯化的IgM和独立个体来源的HIV和ESRD IgM进行比较。这些纯化的IgM制剂用于免疫沉淀受体构建高表达的细胞系的全细胞裂解液中的CD3、CD4、CD2、CD8、HLA-A、HLA-DR、，IL-2R。Jurkat细胞系用于CD3、CD4、CD2和HLA-A的免疫沉淀反应；Daudi B细胞系用于HLA-DR的免疫沉淀反应；而HUT-78T细胞系用于CD8和IL-2R的免疫沉淀反应。
(i)免疫沉淀结果表明IgM可以结合CD3和CD4全细胞裂解液中的受体可以和纯化的独立个体的正常、HIV或ESRDIgM发生沉淀反应，之后在37℃，用2ME(细节参见方法)存还原状态下进行SDS-PAGE凝胶电泳30分钟。被IgM免疫沉淀的受体被转移到硝酸纤维素膜上后，用鼠单克隆抗体或兔的IgG多克隆抗体作为一抗检测这些受体。我们设置了很多对照以排除珠和受体的非特异结合(即没有IgM)。图7显示了三次独立实验的结果代表数据，实验使用同等量的正常、HIV IgM和ESRDIgM和同样量的全细胞裂解液。结果清楚的说明了正常、HIV和ESRD IgM都可以与CD3和CD4受体发生免疫沉淀反应。综合看来，对比正常或ESRDIgM，HIV-IgM表现出免疫沉淀更多的CD4，但仍需要检测更多个体的样本以确认其真是性。Waldenstrom IgM(用W代表)不能与CD4免疫沉淀。然而IgM不能免疫沉淀IL2-R、HLA-A和HLA-DR受体，即使在被检测的裂解液泳道中存在大量受体蛋白(结果未显示)。
我们随后想知道IgM对细胞增殖的抑制是否仅仅由于IgM可以结合CD3和CD4(从而导致免疫突触形成的不稳定)或是否IgM还可以下调受体，特别是之前有报道指出CD3之间的铰链可以下调CD4。
(ii)研究表明IgM下调CD4、CD2、CD80和CD86但不影响CD8、HLA和其他共激活分子研究中使用MLR分析激活T细胞。在MLR的初期、培养的第3天或在第4天收细胞前的2个小时，加入不同剂量的正常IgM。通过双色流式细胞仪检测4天MLR激活细胞，分析T细胞的共激活分子。我们采用PE或FITC标记的鼠的特异性识别不同受体的单克隆抗体。图8显示了4个涉及个体的不组合的实验的代表数据。我们注意到当正常、HIV和ESRD IgM加入MLR培养基后可以明显的抑制某些共激活分子的密度，如CD4和CD2，但对CD3、CD 28和CD8没有影响(图8)。HIV，ESRD和正常IgM没有明显下调膜受体CD154，CD28，CD3，PDL-1，IL2-R，HLA-A，B，HLA-DR和细胞表面和胞浆受体CD152(结果未显示)。其他实验被设计用以确定IgM是否可以抑制共激活分子的表达，即抗原呈递细胞上的CD80(B7.1)和CD86(B7.2)。在研究中，我们除了检测了MLR起始后24小时的受体密度，还同时检测了在MLR分析中存在的CD14阳性的单核细胞和巨噬细胞中的CD80和CD86的表达水平。IgM可以抑制CD80和CD86在CD14阳性的单核细胞和巨噬细胞中的表达。图9以ESRD IgM为代表，显示了IgM对CD86表达的抑制。
抑制效应并没有伴随细胞调亡或死亡的升高，这可以通过流式细胞仪定量膜联蛋白表达和细胞摄入碘化丙锭的结果而知。无论IgM是在MLR的第0天加入还是在MLR结束的2小时前加入，对CD4和CD2的抑制程度都很类似。其次，正常、HIV或ESRD IgM在10到30μg/ml的浓度范围内，其产生的抑制效果没有明显差异。当浓度低于5μg/ml时，没有抑制效果。
进一步的研究致力于探索对CD4、CD2、CD80和CD86表达抑制的机制。首先，我们想知道在正常或HIV IgM存在的条件下，这种抑制效应是一个激活的过程还是因为封闭的结果，即通过IgM抑制用于检测受体的鼠的抗受体单克隆抗体的结合。在实验的第4天，在MLR结束前的2小时前加入IgM，部分细胞和IgM在4℃共同孵育2小时。在3个独立的试验中，当IgM和细胞在4℃共同孵育时，共激活受体的MCF没有任何降低。因此是一个激活的过程导致了细胞表面共激活受体的密度的降低。那么，问题是在37℃ IgM存在的条件下，是否存在受体内化或受体活性下调的现象。这个问题可以利用流式细胞仪来分析。我们的研究主要关注CD4的表达，作为高表达受体的代表。首先用PE抗CD4对细胞表面的受体染色，冲洗细胞后用BD Pharmigen的试剂盒穿透细胞，然后重新用PE抗CD4对胞浆内的受体染色。数据见图10，结果指出IgM在37℃可以同时下调膜表面和胞浆内的CD4受体的水平。我们进一步想知道IgM对表面和胞浆CD4受体的下调是由于五聚体IgM引起的CD3的间接相互铰链还是IgM直接结合CD4。我们采用了两种方法。首先，选用表达CD4但不表达CD3受体的人单核细胞系(U937)。在正常或HIV IgM存在下，37℃培养细胞2小时，可以导致CD4、CD80和CD86的表达下降50％到55％。结果表明IgM下调CD4和其他共激活受体不依赖与IgM和CD3的结合。现有技术表明，发明人认为由IgM结合CD3、CD4或其他受体所介导的细胞失活会引起CD2、CD4、CD80和CD86的下调(参见WolthersKC，Eur.J.of Immunol.，vol 26p1700，1996)。CD2，CD80和CD86的下调进一步促进了T细胞的失活，因为在抗原呈递细胞和T细胞上的这些共激活分子对优化T细胞的激活起了重要作用。其次，在37℃共同孵育五聚体或单体的IgM和MLR激活的淋巴细胞2小时。同样，单体的HIV IgM也可以下调CD4，表明CD4受体的铰链对表达水平的下调不是本质的。
(iii)IgM-ALA阻碍T细胞激活的主要信号传导通路先前的研究结果表明TcR紊乱或加入佛波酯(佛波醇-12-十四烷酸酯13-乙酸枉费phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)+离子霉素所引起的的T细胞的激活都与Zap 70的汇聚、磷酸化和激活相关。(参见Pullar CE，Scand J ofImmunol，Vol 57，p333-341，2003)因此，我们想确定IgM是否会抑制PMA+离子霉素引起的Zap 70的磷酸化。
研究过程中，在37℃5％CO2条件下，用PMA(1ng/ml)+离子霉素(1μg/ml)预处理新鲜的人外周血淋巴细胞(1×106细胞/ml)12小时，然后通过流式细胞仪检测细胞内Zap 70的磷酸化水平。细胞被固定和穿透，然后与抗磷酸化Zap 70的兔多抗(Upstate，Charlottesville，VA)相互作用，以定量胞浆内的Zap 70磷酸化水平。在加入PMA和离子霉素之前半小时，加入纯化的正常、HIV和ESRD病人的IgM(30μg/ml)。
图11的结果显示，当人T细胞被PMA和离子霉素激活后，Zap 70的磷酸化水平升高。然而，用正常或HIV IgM预先处理T细胞则可以抑制Zap 70的磷酸化。
这些数据进一步证明了IgM-ALA不仅可以抑制T细胞的增殖还能抑制T细胞的激活。
综上所述，正常、HIV和ESRD IgM可与CD3和CD4受体发生免疫沉淀反应。IgM-ALA还可以不依赖于CD3而下调CD4，CD2，CD80和CD86受体表达水平，并且IgM抑制Zap 70的磷酸化和激活。所有这些机制都可能与IgM介导抑制(i)同种异型抗原和抗CD3诱导的T细胞激活和增殖相关，并且(ii)与IgM抑制HIV-1感染细胞相关。
e)IgM-ALA介导抑制趋化反应的机制通过研究我们想确定趋化反应是由于IgM-ALA下调受体(抑制T细胞激活)而引起的后续反应还是由于IgM-ALA直接封闭了趋化因子和受体的结合所致。
(i)免疫沉淀实验显示IgM可以结合CCR5和CXCR4首先我们想确定IgM是否可以结合趋化因子受体。我们将这个问题简化为确定IgM是否可以和Daudi B细胞的全细胞裂解液中含有的CCR5和/或CXCR4免疫沉淀。Daudi B细胞系持续高表达CCR5和CXCR4。图12的实验数据来源于三次独立的实验，每次都使用相同量的IgM和全细胞裂解液。所用IgM的种类包括三个不同的独立正常个体的IgM，收集的正常IgM(6人)，收集了5人的ESRD IgM，和五个独立的HIV个体的IgM。如图12所示，三个来源于正常独立个体的IgM均和CCR5低水平的免疫沉淀，且只有五人中的一个HIV患者的IgM可以免疫沉淀CCR5。这样的结果说明，HIV-IgM，不同于正常人的IgM，其缺乏于CCR5的结合活性。另一方面，对比正常IgM，ESRD IgM表现出免疫沉淀数倍高的IgM抗CCR5活性。CXCR4的免疫沉淀结果完全超出所预期的结果。五分之四的HIV IgM和全部的ESRD IgM都和CXCR4有很高的结合活性。总之，不同个体，无论是正常还是患病，表达的IgM与CCR5或CXCR4的亲和力也不同。有趣的是，在患病过程中IgM抗CCR5或抗CXCR4的性质可能发生改变。通常，HIV-1感染个体IgM抗CCR5活性缺失，而ESRD个体产生高水平的IgM，却可以作用于CCR5和CXCR4。Waldenstrom IgM(用W表示)不能与CCR5或CXCR4免疫沉淀。
图12中可以看到，在仅有细胞裂解也的泳道中Daudi裂解液中含有未糖基化的大小约36-39kDa的另一种形式的CXCR4，这种形式的CXCR4可以被4G10和12G5鼠单克隆抗体识别，证明其在细胞膜上有很高的表达。Daudi细胞裂解液中不存在47kDa的糖基化的CXCR4。而在Daudi细胞裂解液中含有糖基化形式的CCR5(42-43kDa)，其被IgM免疫沉淀。
(ii)IgM抑制MIP-1α和SDF-1α与其受体结合-对MIP-1α有明显的抑制效果但对SDF-1α影响甚微。
我们计划检测是否IgM可以抑制结合完整细胞上的趋化因子受体的趋化作用。主要通过确认正常和HIV IgM是否抑制以下的两种结合(i)生物素标记的SDF-1α结合Sup T-1细胞上持续表达的CXCR4；(ii)生物素标记的MIP-1α结合U937细胞上持续表达的CCR5。虽然选用SupT-1细胞是比较合适的，但我们没法证明SDF-1α和细胞膜上蛋白聚糖的非特异结合，该细胞主要被胰蛋白酶化。在37℃，正常人的收集IgM和HIV病人的收集IgM(但不是人的收集IgG)均可抑制35％到40％SDF-1α和SupT-1细胞结合(图13)。但是IgM对SDF-1α的抑制效应并不能用IgM与SDF-1α相互作用来解释。因为在ELISA和Western印迹试验中我们并没有检测到IgM能够结合SDF-1α。
然而，浓度15.6nM的正常和ESRD IgM可以明显抑制生物素标记的MIP-1α结合U937细胞上存在的CCR5、CCR4和CCR1(见图13)。HIV-1IgM几乎对MIP-1α的结合没有或有很小的抑制效果。结果表明IgM对不同趋化因子受体的抑制效果不同，如对CCR5的抑制效果明显高于CXCR4。
(iii)研究表明IgM下调CCR5但不下调CXCR4的表达进一步的实验为了确认在MLR培养6天的过程中，在IgM始终存在的条件下，细胞趋化因子受体的表达是否改变，通过该机制进而抑制HIV-1的感染。因此，PBL细胞在有或没有IgM的条件下培养6天，利用可以特异性识别CCR5或CXCR4的单克隆抗体通过流式细胞仪定量检测受体的表达水平。图14显示了4个实验中1次的数据。IgM下调了CCR5，但没有下调CXCR4受体的表达水平。正常HIV IgM不仅降低了CCR5的表达水平(对照细胞32％对ESRD IgM处理的细胞12.8％)而且降低了阳性细胞上受体的密度(对照细胞平均194channels对ESRD IgM处理的细胞64.8channels)。HIV IgM对CCR5表达细胞几乎没有抑制效应。正常和ESRD IgM下调CCR5并不是因为受体的内化作用，因为细胞内的CCR5染色结果没有表现出明显的下降，这与对CD4的观察结果类似(结果未显示)。我们没有检测是否CCR5的下调是由于IgM抑制T细胞激活所致，还是由于IgM结合CCR5的直接后果。除此，正常、ESRD，和HIV IgM均可以明显升高PBL细胞上CXCR4受体的密度，对SDF-1α促进趋化反应提供了可能的解释(见图6)。IgM无法抑制SDF-1α诱导的趋化反应是有其生理学意义的，因为CXCR4受体被表达到很多细胞上，包括PBL细胞和内皮细胞，并且CCR4受体很可能在某些基本的细胞功能中起作用，如果其活性被抑制，可能导致细胞的损伤。另一方面，CCR5受体和炎症反应关系密切，可能与阻止过度炎症反应的控制机制有关。
(iv)研究表明IgM阻碍SDF-1α诱导的CXCR4内化IgM下调CCR5而不下调CXCR4，并且降低细胞对RANTES和MIP-1α产生的趋化反应，但不影响SDF-1α产生的趋化反应。这些结果促使我们研究在IgM结合了CXCR4后是否可以抑制SDF-1α引起的CXCR4的内化作用。因为IgM几乎不影响SDF-1α结合受体，也不影响可以被用于检测CXCR4的鼠IgG单克隆抗体(如12G5)结合受体，所以我们的实验是可行的。为了研究这个问题，将表达CXCR4的Jurkat T细胞和ESRD IgM(预先经过鼠IgG吸附处理)在37℃共同孵育30分钟。不要冲洗细胞，然后将细胞和SDF-1α(100ng)在37℃再孵育30分钟。30分钟后洗去细胞培养液，加入FITC标记的12G5和细胞相互作用。图15(B区)清楚的表明了在37℃SDF-1α可以明显降低CXCR4的表达(其次是内化作用)。然而用IgM(15μg每106个细胞)预先处理的细胞可以抵抗SDF-1α诱导的CXCR4的内化(B区)，尽管SDF-1α仍结合在细胞上(C区)。图15的C区显示，细胞和生物素标记的SDF-1α在4℃孵育可以阻止受体内化，并表明IgM并不抑制SDF-1α和受体的结合。采用SupT-1 T细胞系和RAJI B细胞系也可以得到类似的结果。
进一步研究考虑IgM抗CXCR4存在时CXCR4无法内化的功能意义。最初的发现暗示CXCR4内化作用的缺失和趋化反应减弱并不相关，在很多实验中趋化反应反而加强。可能是因为SDF-1α和IgM(和缺失受体内化作用)占据了CXCR4受体的结合位点，对X4HIV-1病毒进入细胞形成了一道阻碍屏障。
综上所述，IgM-ALA(i)下调CCR5受体表达，但不影响CXCR4受体表达；，(ii)有效的抑制RANTES和MIP-1α结合CCR5但极低地影响SDF-1α结合CXCR4；(iii)结合CCR5和CXCR4受体，除非在不同个体及不同病程中IgM抗-CCR5和抗-CXCR4的水平有很大不同，即来自多数病人的HIV-IgM缺失IgM抗-CCR5，但不缺失IgM抗-CXCR4，而ESRD IgM对CCR5和CXCR4都有很高的亲和性。这些结果提供了一种可能的机制以使IgM介导抑制HIV-1感染。
f)综述IgM介导的抑制HIV-1感染的机制描述这些数据支持了某些观察现象(i)IgM-ALA结合CD3、CD4、CCR5和CXCR4。但在IgM-ALA的整体的主要不同，存在明显的个体差异性且在正常期和患病期也有显著差异。例如，多数正常人IgM中含有低水平结合CCR5的抗体并且没有结合CXCR4的抗体，但许多(但非全部)HIV-1感染的个体具有高水平的IgM可以有效的识别CXCR4，但具有低的或不可检测水平的能识别CCR5的IgM。反之，ESRD IgM含有高水平的抗CXCR4和CCR5的抗体。
(ii)IgM-ALA(a)抑制同种异型抗原和抗CD3抗体引起的T细胞的增殖，ESRD IgM表现了最大的抑制活性；(b)显著下调CD4、CD2、CD80、CD86和CCR5受体(但不包括CD8，CD3和CXCR4)，并且ESRD仍表现出最大的下调效果；(iii)生理剂量的IgM-ALA在体内和体外都可以抑制HIV-1感染PBL细胞。IgM对HIV-1的抑制效果是通过抑制病毒进入细胞(见GHOST细胞实验，图3)和抑制T细胞活性而实现的。然而，IgM的抑制效果也根据HIV-1病毒株的不同而不同，且和其中与CD4和趋化因子受体相互作用的IgM-ALA抗体的水平有关。ESRD IgM含有大量可以结合CD4、CCR5和CXCR4的IgM，因此对抗性HIV-1病毒株8397(R5)有最强的抑制效果。
g)IgM抗淋巴细胞自身抗体可以抑制肾移植受者的免疫排斥反应因为正常的IgM可以抑制趋化因子(SDF-1α和RANTES)和其受体的结合，并且在混合淋巴细胞培养中(MLC)ESRD IgM抑制淋巴细胞的活性，所以有必要检测在移植受体体内，这些抗体在体内高水平表达是否和移植肾脏免遭排斥反应有显著的相关性。
因此，在移植受体中利用流式细胞仪检测IgM抗淋巴细胞抗体结合供体T淋巴细胞的活性水平(见图16)。IgM有效结合供体CD3阳性T淋巴细胞表明了IgM也能以相似的水平结合自体白细胞和供体内皮细胞。
表VI移植受体IgM结合CD3阳性供体T淋巴细胞与人肾移植结果的相关性

MCF＝平均通道荧光*这些数据和无IgM或低IgM相比具有统计学意义。(p＜0.02)图16和表IV中的结果清楚的表明具有抗淋巴细胞活性的IgM，无论低水平或高水平(由平均通道荧光MCF定量)，均和降低排斥反应的和减少移植物一年内失败明显相关。参与研究的所有病人都给予相同的免疫抑制药物。
根据最近的研究，IgM抗白细胞抗体通过结合自身白细胞(抑制白细胞的趋化反应和淋巴细胞活性)和结合供体内皮细胞上的受体，从而抑制免疫排斥反应。利用现有技术，研究者们证明了某些肾移植接受者的血清中含有的IgM可以同时结合供体淋巴细胞和肾内皮细胞。这些结果在Lobo et al，Lancet 2879-83，1980中有描述，并且这里引入该材料作为参考。
h)IgM抗淋巴细胞抗体在37℃引起淋巴瘤细胞死亡。
恶性T淋巴细胞，不同于正常IL-2激活的淋巴细胞，在37℃ IgM存在的条件下会出现细胞死亡现象。研究过程中，在0.5ml含2％白蛋白的RPM1培养基中，我们加入5到10μg收集的正常人的IgM到0.5×106的Jurkat或Sup T-1淋巴细胞中。在37℃，5％CO2条件下培养细胞30到45分钟之后用台盼兰染色检测死亡的细胞。任何额外的补体都没有加入。在这样的条件下，有20％到35％的Jurkat或Sup T-1细胞死亡。相同培养条件下，只有小于5％正常人淋巴细胞或IL-2激活的淋巴细胞死亡。


图1A是说明正常IgM、HIV IgM和AIDS IgM结合到T-1细胞的流式细胞仪的直方图。
图1B是表示正常IgM、HIV IgM和AIDS IgM结合到GHOST CXCR4的图表。
图1C是表示按照大小从来自人血细胞所分离的淋巴细胞和嗜中性粒细胞的流式细胞仪散点图。
图1D是表示正常IgM结合到来自外周血细胞的人T淋巴细胞的流式细胞仪直方图。
图1E是表示AIDS IgM结合到来自外周血细胞的人嗜中性粒细胞的流式细胞仪直方图。
图2是表示正常IgM会抑制HIV-1 IIIB，即使当在HIV感染细胞4天后被加入到细胞中时的直方图。
图3是说明正常IgM会抑制(i)HIV-1(R5)8658病毒株免于感染GHOST-CCR5(上图)，和(ii)HIV-1(X4)IIIB病毒株免于感染GHOST-CXCR4(下图)的流式细胞仪散点图。
图4是表示IgM，特别是HIV和ESRD抑制在MLR中激活的T淋巴细胞的增殖的直方图。
图5是表示IgM，特别是HIV和ESRD抑制被抗CD-3激活的T淋巴细胞的增殖的直方图。
图6是表示IgM不会抑制由SDF-1α所诱导的趋化性(下图)，而会抑制RANTES所诱导的趋化性(上图)。
图7是Western印迹，以表示来自Jurkat细胞的全细胞裂解物的正常(标记为N)、HIV(标记为H)和ESRD(标记为E)IgM与CD3e和CD4的免疫沉淀之间的区别。Ly和(Ly+B)是对照带，其只有裂解液(Ly)或者混合了珠的裂解液(Ly+B)而没有IgM。
图8是流式细胞仪直方图，其说明ESRD IgM抑制CD4和CD3的膜表达，而不抑制CD8和CD28的膜表达。阴影的直方图代表在没有IgM的情况下的受体表达(其通过平均通道荧光进行定量-MCF)。
图9表示(i)流式细胞散点图以表示在MLR分析中出现的CD14阳性单细胞和巨噬细胞和(ii)流式细胞直方图以表示ESRD IgM抑制CD86在CD14阳性细胞的表达。
图10表示流式细胞散点图，其表示正常细胞(而不是Waldenstrom)IgM抑制CD4的膜表面表达，以及CD4的细胞质内表达。
图11是两种色彩的流式细胞直方图，其在使用PMA和离子霉素活化细胞之前，当T细胞首先用正常IgM或者HIV IgM进行预处理时，在CD3阳性的T细胞的血细胞计数中存在显著少的磷酸化Zap 70(phospho Zap 70)。
图12是Western印迹，其表示个体正常IgM(标记为N1或2)、所收集的正常IgM(标记为N-P)、所收集的ESRD IgM(标记为E-P)、个体HIV-1 IgM(标记为H1或2等)和Waldenstrom IgM(标记为W)与CXCR4和CCRS的免疫沉淀之间的区别。被标记为Ly或Ly+B的带是与图7中相同的对照。
图13是流式细胞直方图(上图)和图表(下图)，其表示正常IgM抑制MIP-1α结合到U937细胞，以及正常IgM抑制SDF-1α结合到Sup-T1细胞。
图14是流式细胞散点图，其表示正常IgM和ESRD IgM抑制在MLR中被激活的CCR5在PBL的膜表达(上图)，而同样IgM增强CXCR4在MLR激活的PBL的膜表达(下图)。
图15是Jurkat细胞的流式细胞直方图，其表示ESRD IgM不会内在化CXCR4(A图)，但是ESRD IgM将阻止由于SDF-1α所诱导的CXCR4受体的内在化(B图)。C图表示IgM不会抑制被标记SDF-1α的FITC结合到CXCR4。
图16表示流式细胞散点图以表示肾移植受体在他们的血清中具有不同量的IgM结合到他们的供体CD3阳性T淋巴细胞。下面的散点图表示在加入从不同受体得到的血清后，IgM结合到供体T淋巴细胞。某些肾移植受体血清没有IgM抗T淋巴细胞抗体(左图)，而其他的血清则具有非常高的IgM抗T淋巴细胞抗体(右图)，其是通过平均通道荧光进行定量的。
本发明的实施方式在不希望被任何理论限制的前提下，对于尽管在无症状状态存在良好水平的IgM自身抗体比趋化因子受体的比例，但是HIV-1病毒进入细胞和提高的病毒复制，存在多种可能的解释。一种这样的解释是存在可能性，在这些低亲和力结合IgM抗体和病毒负载之间存在精密的平衡。使个体倾向于提高的病毒负载的因子，或者抑制B细胞分泌IgM自身抗体的因子将导致病毒进入细胞以及疾病的发展。也可能，最近所描述的表达CD4、CXCR4和CCRS受体的B细胞亚族可以是分泌IgM自身抗体的相同的亚族。经过几个月或者几年，这种B细胞亚族可能被耗尽，或者可能被HIV-1感染，进而导致抗体产生的减少。另外，人们不能够强调其它寄主因子(例如抗病毒IgG抗体、趋化因子和补体以及细胞毒性T细胞)的重要性，它们降低病毒的负载。在任何寄主抵御机制中的微扰会导致提高的病毒负载。
第二，如这里的某些研究所说明的，可能在某些被HIV-1感染的个体中，IgM抗淋巴细胞抗体可以仅仅部分防止某些HIV-1病毒分离体的进入。该后面的机制可以提供对尽管存在IgM抗趋化因子受体的自身抗体的疾病进展的另一种解释。
IgM自身抗体抑制HIV-1病毒进入细胞和复制，支持这些IgM抗白细胞抗体所介导的保护作用的前提。人类IgM抗白细胞抗体用于降低HIV-1感染性(即通过受体阻断和/或细胞的失活)的应用是消极免疫的可以替换的方法。采用与在淋巴细胞上所出现的宽范围的趋化因子和其它受体有反应性的IgM的受体阻断，在HIV-1病毒切换该受体应用例如从CCR5到CXCR4的情况中是特别有用的。维持这类保护性抗体的提高的水平也能够提高HIV-1感染后的潜伏期。另外，可以设计免疫策略或者疫苗增强体内IgM抗淋巴细胞NAA，其能够抑制HIV-1的感染性。
与组织特异性炎症过程、血管生成和恶性细胞的生长(和扩散)相关的疾病受到趋化因子、细胞因子、趋化因子受体以及其它激活(或抑制)细胞功能的受体的控制。这些受体出现在所有的白细胞、内皮细胞和恶性细胞上。通过结合到趋化因子和其它受体(例如脂筏、CD4和CD3)以及通过下调参与T细胞活化的其他受体例如CD2、CD80和CD86，IgM抗淋巴细胞NAA能够提供在上述紊乱或者过程中的调节作用。IgM抗淋巴细胞NAA，特别是抑制趋化因子受体功能或者抑制细胞激活(即具有造成恶性细胞凋亡的可能)的应用对于炎症过程或者恶性细胞的生长和扩散是特别有益的。在肾移植受体中的研究清楚地说明趋化因子和趋化因子受体在排异过程中有作用。这方面的数据在Hancock，W.W，J.of Am Soc Nephrol 13821-824，2002中被综述，该参考文献中的材料在这里被引入作为参考。因此，对具有低或高水平IgM抗淋巴细胞抗体的肾移植受体没有或者最低的急性排异的发现将支持IgM抗淋巴细胞抗体抑制趋化因子受体功能和淋巴细胞激活的概念。人们可以利用消极免疫技术或者可以替换的设计特异性增强体内产生IgM抗淋巴细胞NAA(其具有对趋化因子受体功能或者细胞激活的抑制作用)的免疫策略以治疗恶性细胞的各种炎症过程和生长(以及扩散)。
IgM抗体的来源可以是异源的、自体同源的或者同种异基因的。使用细胞培养技术，具有对白细胞上的趋化因子和其它受体的特异性的IgM抗体能够在体内(即在小鼠或者其他动物或者在人体内)或体外被提高。
例如，IgM抗体能够在在体内或者体外通过遗传工程而产生，其中对IgM抗淋巴细胞抗体特异性的基因能够被引入到产生抗体的细胞中。接着，这些产生抗体的细胞可以被引入到被感染的人或者免疫缺陷的动物中，在这里这些细胞产生IgM抗体。在可以替换的中，这些产生抗体的细胞可以使用杂交瘤或者其他技术而在体外生长。
具有对趋化因子受体特异性的IgM抗体也可以通过分离对IgM抗淋巴细胞抗体特异性的人类或者动物产生抗体的细胞，并通过使用杂交瘤或者其他技术包括将这些细胞引入到动物或者人类中增强这些细胞的抗体生产。例如，人类淋巴细胞可以被移植入免疫缺陷小鼠中，接着，淋巴细胞可以被能够激活B细胞的药物进行刺激例如脂多糖(″LPS″)。
产生IgM抗体的另一个方法是通过从动物分离能够产生人类IgM的产生人类抗体的细胞，例如XenoMouseTM。接着，由这些细胞的IgM产生可以被通过采用杂交瘤或者其他技术而在体外增强，诸如例如使用LPS或者其他能够激活这些细胞的药物例如EBV病毒刺激所分离的淋巴细胞。
IgM抗体也能够通过从个体分离能够接着用EBV病毒转化并且进行培养的淋巴细胞来产生。这些EBV转化的B淋巴细胞亚族将分泌IgM抗体，以便所得到的培养液含有这些抗体。
另外，病毒、细菌和其它抗原(例如丝裂原)可以用于在体内刺激B细胞以产生针对白细胞的IgM抗体。
在被感染的个体之外产生IgM抗体可以被通过一种或多种给药路线释放给个体，其包括但不限于静脉内或者肌肉内释放。
天然的自身抗体(即NAA)的IgG、IgD、IgE和IgA异型已经在现有技术中被描述。本发明还涉及IgG、IgD、IgE和IgA异型。本发明中的所有的抗体异型(即IgM、IgE、IgG和IgA)包括完整的免疫球蛋白或者这些抗体的片断。同样的，在整个说明书和权利要求中，术语“抗体”或“自身抗体”的使用包括所有异型的天然的抗体，其被用作完整的免疫球蛋白或者这些抗体的片断。
参考某些代表性的实施方式和细节，已经对本发明进行了充分的说明，对于本领域技术人员来说清楚的是，能够对其进行的改变和修饰，而不离开本发明这里所提供的主旨和范围。下面所列的28份参考文献的材料在这本申请中被引入以提供支持权利要求的更详细的信息。
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权利要求
1.一种治疗人类疾病和紊乱的方法，其包括为个体给药分离的天然的抗体(NAA)或其片段、或者细胞生产的NAA、或者增强具有对在淋巴细胞上出现的细胞表面受体的结合特异性的NAA的体内产生。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的受体是趋化因子受体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的趋化因子受体选自由下列所组成的组CCR5、CXCR4、CCR2b、CCR3和其它与天然的抗体具有反应性的趋化因子受体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的细胞表面受体是淋巴细胞上的非趋化因子受体，并且选自激活或者抑制细胞功能(或者过程)或者增强细胞死亡或者抑制病毒感染性的受体的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的细胞表面受体选自由细胞膜上的CD3、CD4、CD2、CD80和CD86受体或者脂筏所组成的组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的多反应性NAA结合到在淋巴细胞上出现的细胞表面受体，和与在非淋巴细胞白细胞或内皮细胞或恶性细胞上出现的表面受体相同或者相似的类别。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的对在白细胞、内皮细胞和恶性细胞上出现的细胞表面受体具有特异性的NAA是选自由人类、动物天然的IgM抗体和具有与IgM NAA相同或相似的表面受体特异性的其他异型的其它天然抗体所组成的组。
8.根据权利要求1和7所述的方法，其中所述的NAA可以选自对在淋巴细胞、非淋巴内皮细胞和恶性细胞白细胞上所出现的细胞表面受体具有特异性的单克隆NAA或多克隆NAA或者合成NAA或重组NAA或者NAA的抗体片段。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的人类疾病或紊乱包括病毒介导的疾病、自身免疫疾病、炎症状态和细胞恶化。
10.根据权利要求2、4和5所述的方法，其中所述的病毒介导的疾病是由HIV-1或者其他感染淋巴细胞或其他细胞的病毒所造成的，其中这些病毒利用出现在淋巴细胞或其他细胞上的趋化因子或非趋化因子受体进入细胞，其中病毒进入细胞和/或复制被T细胞的激活而增强，并且其中病毒进入细胞和/或复制被抑制T细胞增强和/或增殖的NAA所抑制。
11.根据权利要求3、4和5所述的方法，其中所述的自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、I型糖尿病、多发性硬化脉管炎、和其他的自身免疫症状，其中所述自身免疫炎症过程被T细胞激活和趋化因子受体增强或者介导，其中具有与趋化因子和非趋化因子受体结合特异性的NAA会抑制自身免疫炎症过程。
12.根据权利要求3、4和5所述的方法，其中所述的炎症状态选自哮喘、结节病、动脉粥样化形成和动脉硬化症或者同种异体移植物以及异种移植物排异，其中所述炎症过程被T细胞激活和趋化因子受体增强或者介导，其中具有与趋化因子和非趋化因子受体结合特异性的NAA将抑制该炎症过程。
13.根据权利要求3、4和5所述的方法，其中所述的细胞恶化包括淋巴细胞或者非淋巴细胞恶化，其中NAA结合到淋巴细胞上的或其他细胞上的趋化因子受体和非趋化因子受体，其中NAA抑制细胞的激活、抑制细胞增殖、并增强肿瘤细胞的凋亡。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的治疗包括给药NAA，以抑制疾病过程的发展或者阻止疾病过程。
15.根据权利要求10所述的方法，其中NAA结合到细胞表面的受体，重要的是抑制T细胞激活以及抑制病毒感染细胞，其中这类病毒包括HIV-1、EBV、CMV、狂犬病病毒、疱疹病毒6、流感病毒和埃博拉病毒。
16.根据权利要求11～13中任一项所述的方法，其中抗白细胞NAA结合到白细胞、内皮细胞和恶性细胞上出现的趋化因子和非趋化因子受体。
17.根据权利要求1或14所述的方法，其中所述抗淋巴细胞NAA被给药给个体，其通过口服路线、通过皮下路线、经静脉内、经腹腔内或者经肌肉内，或者它们的产生被使用一种或者多种选自由病毒、灭活的细菌、抗原和丝裂原所组成的组的试剂而在体内被增强。
18.根据权利要求1、2和4所述的方法，其中抗白细胞NAA被产生以治疗人类疾病或者紊乱，包括将对抗白细胞NAA特异性的基因导入产生抗体的细胞，并在体外或者体内产生抗白细胞NAA抗体。
19.根据权利要求1、2和4所述的方法，其中动物或者人类抗白细胞NAA被产生以治疗人类疾病或者紊乱，包括分离人类或者动物抗体产生细胞，并由抗体产生细胞在体外增强产生NAA。
20.根据权利要求1、2、4和7所述的方法，其中抗白细胞NAA的产生包括从能够产生人类NAA的动物中分离人类抗体产生细胞，以及在体外或体内通过抗体产生细胞增强产生抗白细胞NAA。
21.根据权利要求18、19或20所述的方法，其中使用杂交瘤或者细胞培养技术，增强通过抗体产生细胞产生抗白细胞NAA。
22.根据权利要求18、19或20所述的方法，其中使用病毒、细菌或者抗原增强产生抗体的细胞所产生的抗白细胞NAA。
23.根据权利要求1、2、4和7所述的方法，其中抗白细胞NAA被在体内产生，其包括为一个或者多个个体注射从由病毒、灭活细菌、病毒和细菌产物、真菌产物、植物抗原和丝裂原所组成组的一种或者多种，其中所述NAA抗体被用于治疗病毒感染、自身免疫疾病、炎症状态和细胞恶化。
24.根据权利要求1、2、4、6、7、8和9所述的方法，其治疗个体中的病毒介导的疾病、人类自身免疫疾病、炎症状态和细胞恶化，其包括为个体给药抗白细胞NAA或者增强抗白细胞NAA的体内产生。
全文摘要
天然的IgM抗淋巴细胞自身抗体结合到T淋巴细胞上的CD4，并下调某些其它的受体，其包括T细胞上的CD2以及巨噬细胞上的CD80和CD86。这些抗体增强抑制HIV－1感染细胞，并且另外抑制T淋巴细胞的激活和增殖。这里所描述的抗体是“天然的”，即在不存在精密的免疫作用时从出生时产生的，第二这些抗体与疾病造成的自身抗体不同在于这些天然的抗体是多反应性的，而且具有低结合亲和力。
文档编号C07K16/28GK101065147SQ200480044260
公开日2007年10月31日 申请日期2004年12月1日 优先权日2004年12月1日
发明者彼得·I.·洛博 申请人:彼得·I.·洛博