专利名称：赤霉素ga的制作方法
技术领域：
本发明是一种制备下式(I)表示的赤霉素GA4的方法。
背景技术：
赤霉素类物质(Gibberellins，GA)是四环二萜类化合物，是一类广泛存在于植物中的内源性植物生长调节物质，至今已从植物中分离并鉴定了129种该类物质，赤霉素类物质具有促进植物细胞分裂，使细胞伸长，叶片扩大，茎延长，侧枝生长，抽苔，促进两性花的雄花形成，促进种子发芽和果实生长等功效。其中赤霉酸GA3(中国商品名为920)在我国已有近30年的使用历史，它对植物果实细胞伸长的促进作用活性最强。已经在多种农作物的种植上获得广泛应用，经济效益显著。至今仍是我国杂交稻种植所必须使用的植物生长调节剂。对于水果种植及生产起着至关重要的作用，尤其对于植株的保花保果(倒春寒中如无赤霉素的喷施应用将导致大幅度减产)、水果果实的增大及品质的控制有着重要的作用。在世界范围内，赤霉素类内源性植物生长调控剂已广泛应用于农业生产，而微生物发酵是商业赤霉素的重要生产方法，目前，发酵法生产的赤霉素类植物生长调节剂产品主要有GA3(即920)和GA4+7(GA4和GA7混合物)。由于发酵工艺所限，至今尚不能生产纯品GA4。对于大宗经济作物水果生产而言，GA4是最有效，无副作用的赤霉素类植物生长调控物质之一，而混合物中的GA7则会对第二年的开花造成不良的影响。因而生产纯品GA4对于调节剂产业而言以及其所应用的水果生产领域均具有重要的意义和经济价值。近年来，GA4+7在经济作物方面的应用受到关注，但发酵得到的GA4+7混合物中GA7具有较为明显的副作用，主要表现在对次年开花的影响。要从该混合物中去除GA7是一件困难的事。GA4+GA7已经广泛应用于水果的生产，例如保花保果，提高水果的质量，但GA7会影响到次年的开花，是应该去除的成份。限于发酵工艺及方法目前只能获得GA4+GA7(其中GA7约占30％)的混合物，而GA4和GA7结构差异较小，难以分离纯制。CN1111286A，申请号95102240.7，是一种利用酸水解法在发酵后处理获得赤霉素GA4的方法，但占发酵混合物三分之一强的GA7均被破坏。
发明内容
本发明提出一种赤霉素GA4(3β，10α-二羟基-20-失碳赤霉-16-烯-7，19-双酸-19，10内酯)的简便制备方法，它将发酵得到的GA4+7溶解于醇等有机溶剂中，加入一定比例的三乙胺、吡啶有机碱及催化剂金属镍(Ni)或钯(Pd)等，室温通氢气反应，然后将催化氢化得到的粗产物直接进行卤代内酯化，并将卤代内酯化获得的粗产物用锌及水合氯化镍(Zn/NiCl2·XH2O)脱卤后重结晶得到目标产物GA4；在制备GA4+7中的GA7进一步转化为GA4，提高了发酵产物的利用率。本发明的化学反应流程式如下 式中a催化氢化采用的催化剂为过渡金属铂和钯，催化剂用量按重量计相对于反应底物GA4+7为0.1％～10％；采用的溶剂为有机溶剂与有机胺类化合物按体积比10∶1～1∶10得到的混合溶剂，用量为10～100毫升/克；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚，有机胺类化合物为三乙胺或吡啶。
b卤代内酯化所采用的卤素为溴、碘与卤化钾或卤化钠的混合物，用量按摩尔比相对于反应底物为卤素X2∶GA4+7＝1～10∶1；采用的溶剂为醇、酯、酮、醚或卤代烃与水的混合溶剂，比例为体积比10∶1～1∶10；采用的碱为碳酸盐M2CO3或MHCO3，其中M为钠Na，钾K，锂Li，用量按摩尔比相对于卤代反应底物为3～10∶1。
c脱卤还原反应所采用的试剂按摩尔比为锌粉与含结晶水氯化镍NiCl2·XH2O＝1～30∶1，用量按摩尔比相对于卤代反应底物为5～20∶1；所采用的溶剂是无水乙醇、四氢呋喃、1，4-二氧六环、乙腈。
最终产物GA4以丙酮/石油醚体积比为1～10∶1或乙酸乙酯/石油醚体积比2～15∶1溶剂重结晶
具体实施例方式一、GA4+7的催化氢解。在实施例条件下仅有GA7会发生氢解反应，混合物中的GA4得到保留。
下列实施例是本发明方法的举例说明而不是对其进行限制。对本领域技术人员显而易见的多种条件和参数的其它修改和适应性改变，包含在本发明的权利要求书保护范围内。
实施例1赤霉素GA4+710.0克溶解于25毫升甲醇中，加入50毫升的吡啶及0.1克10％钯碳(Pd-C)，室温搅拌下通氢气(H2)反应数小时至数十小时，硅胶薄层层析(TLC)检测反应完全后，滤除钯碳(Pd-C)并以少许甲醇洗涤滤渣，减压回收甲醇，不挥发残余物溶解于100毫升乙酸乙酯中，盐酸酸化至PH＝1.0，并用饱和盐水洗涤此滤液，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，得到淡黄色固体9.7克(收率97％)(1和GA4的混合物)。混合物的核磁共振谱1H-NMR(300MHz，Acetone)δ5.20(1H，d，J＝1.60Hz)，4.97(1H，s)，4.89(2H，brs)，4.85(1H，s)，4.06(1H，m)，3.73(1H，m)，3.23(1H，d，J＝10.8Hz)，3.10～1.35(26H，m)，1.33～1.15(6H，2xs).
实施例2赤霉素GA4+710.0克溶解于50毫升乙酸乙酯中，加入50毫升的吡啶及0.5克10％钯碳(Pd-C)，室温搅拌下通氢气(H2)反应数十小时，硅胶薄层层析(TLC)检测反应完全后，滤除钯碳(Pd-C)，并以少许乙酸乙酯洗涤滤渣，减压回收乙酸乙酯，不挥发残余物溶解于100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，并用饱和盐水洗涤此滤液，无水硫酸钠干燥，真空浓缩处理得到淡黄色固体9.5克(1和GA4的混合物)(收率95％)。
实施例35.0克赤霉素GA4+7溶解于50毫升甲醇中，加入10毫升三乙胺及0.5克5％钯碳(Pd-C)，室温搅拌下通氢气(H2)反应数小时至数十小时，硅胶薄层层析(TLC)检测，反应完全后，滤除钯碳(Pd-C)，以少许甲醇洗涤滤渣，合并甲醇，减压回收甲醇，残余物溶解于100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，并用饱和盐水洗涤此滤液，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，得到浅黄色固体(1和GA4的混合物)4.6克(收率92％)实施例45.0克赤霉素GA4+7溶解于50毫升乙酸乙酯中，加入10毫升三乙胺及0.5克10％钯碳(Pd-C)，室温搅拌下通氢气(H2)反应数小时至数十小时，硅胶薄层层析(TLC)检测，反应完全后，滤除钯碳(Pd-C)，以少许乙酸乙酯洗涤滤渣，合并乙酸乙酯，减压回收溶剂，残余物溶解于100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，并用饱和盐水洗涤此滤液，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，以丙酮/石油醚结晶，得到浅黄色固体(1和GA4的混合物)4.5克(收率90％)。
实施例510.0克赤霉素GA4+7溶解于10毫升乙醚中，加入100毫升三乙胺及1.5克5％钯碳(Pd-C)，室温搅拌下通氢气(H2)反应数小时至数十小时，硅胶薄层层析(TLC)检测，反应完全后，滤除钯碳(Pd-C)，以少许乙醚洗涤滤渣，合并后减压回收溶剂，残余物溶解于100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，并用饱和盐水洗涤此滤液，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，以乙酸乙酯/石油醚溶剂重结晶，得到得到浅黄色固体(1和GA4的混合物)9.2克(收率92％)。
实施例610.0克赤霉素GA4+7溶解于50毫升乙醇中，加入5毫升吡啶及0.5克5％钯碳(Pd-C)，室温搅拌下通氢气(H2)反应数小时至数十小时，硅胶薄层层析(TLC)检测，反应完全后，滤除钯碳(Pd-C)，以少许乙醚洗涤滤渣，合并后减压回收溶剂，残余物溶解于100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，并用饱和盐水洗涤此滤液，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，以乙酸乙酯/石油醚溶剂重结晶，得到浅黄色固体(1和GA4的混合物)9.0克(收率90％)实施例7赤霉素GA4+710.0克溶解于50毫升乙酸乙酯中，加入50毫升的吡啶及0.5克5％铂碳(Pt-C)，室温搅拌下通氢气(H2)反应数十小时，硅胶薄层层析(TLC)检测反应完全后，滤除5％铂碳(Pt-C)，并以少许乙酸乙酯洗涤滤渣，减压回收乙酸乙酯，不挥发残余物溶解于100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，并用饱和盐水洗涤此滤液，无水硫酸钠干燥，真空浓缩处理得到淡黄色固体9.5克(1和GA4的混合物)(收率95％)。
实施例8
10.0克赤霉素GA4+7溶解于50毫升乙醇中，加入5毫升吡啶及0.5克5％铂碳(Pt-C)，室温搅拌下通氢气(H2)反应数小时至数十小时，硅胶薄层层析(TLC)检测，反应完全后，滤除铂碳(Pt-C)，以少许乙醚洗涤滤渣，合并后减压回收溶剂，残余物溶解于100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，并用饱和盐水洗涤此滤液，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，以乙酸乙酯/石油醚溶剂重结晶，得到浅黄色固体(1和GA4的混合物)9.0克(收率90％)实施例95.0克赤霉素GA4+7溶解于50毫升乙酸乙酯中，加入10毫升三乙胺及0.5克铂碳(Pt-C)，室温搅拌下通氢气(H2)反应数小时至数十小时，硅胶薄层层析(TLC)检测，反应完全后，滤除铂碳(Pt-C)，以少许乙酸乙酯洗涤滤渣，合并乙酸乙酯，减压回收溶剂，残余物溶解于100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，并用饱和盐水洗涤此滤液，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，以丙酮/石油醚结晶，得到浅黄色固体(1和GA4的混合物)4.5克(收率90％)。
二、GA4+7之氢解产物(1和GA4的混合物)的碘代内酯化反应。在实施例条件下仅有1会发生碘代内酯化反应，混合物中的GA4得到保留。
实施例10将GA4+7之氢解产物(1和GA4的混合物)9.7克溶解于100毫升丙酮及20毫升水中，加入碳酸氢钠7.6克，碘6.9克及碘化钾4.5克，室温搅拌反应数十分钟。TLC检测反应结束后，搅拌下缓缓加入饱和硫代硫酸钠溶液至反应溶液颜色消失，然后加入100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，乙酸乙酯相用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干。得到淡黄色固体(2和GA4的混合物)9.5克(收率86％)。
纯化合物2的核磁共振谱如下1H-NMR(300MHz，Acetone)δ5.00(1H，brs)，4.91(1H，brs)，4.62(1H，d，J＝5.8Hz)，4.60(1H，m)，3.98～3.89(2H，m)，2.70～2.40(5H，m)，2.22(1H，d，J＝17.8Hz)，2.18～2.00(2H，m)，1.80～1.20(4H，m)，1.17(3H，s).13C-NMR(300MHz，Acetone)δ177.98，173.37，157.78，107.87，96.05，70.62，55.56，52.52，52.23，51.61，49.06，44.44，39.80，39.21，37.58，32.19，22.08，16.51，15.11.MS m/z458(M+，3％)，440(2)，412(2)，331(3)，315(16)，313(25)，295(10)，285(100)，269(44)，267(76)，254(6)，239(26)，223(75)，195(22)，181(29)，179(23)，169(16)，155(23)，128(22)，115(17)，105(18)，91(38).HRMS(ESI+)m/zFound481.0484[M+Na]+，C19H23O5NaI requires 481.0487。
实施例11将GA4+7之氢解产物(1和GA4的混合物)9.5克溶解于100毫升二氯甲烷及20毫升水中，加入碳酸钠4.8克，碘4.6克及碘化钾3.0克。室温搅拌反应数小时。TLC检测反应结束后，搅拌下缓缓加入饱和硫代硫酸钠溶液至反应溶液颜色消失，然后加入100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，乙酸乙酯相用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，得到淡黄色固体(2和GA4的混合物)9.4克(收率85％)。
实施例12将GA4+7之氢解产物(1和GA4的混合物)4.6克溶解于50毫升四氢呋喃中，加入100毫升水及碳酸氢钾5.0克、溴化钠5.0克，冷却到-20℃，慢慢滴加3毫升液溴。室温搅拌反应数十分钟，薄层层析TLC检测反应结束后，搅拌下缓缓加入饱和硫代硫酸钠溶液至反应溶液颜色消失，然后加入100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，乙酸乙酯相用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干得到淡黄色固体5.3克(收率86％)，进一步乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到淡黄色固体(2和GA4的混合物)3.5克(收率76％)。
实施例13将GA4+7之氢解产物(1和GA4的混合物)4.6克溶解于50毫升甲醇中，加入100毫升水及碳酸氢钠5.0克、溴化锂5.0克，冷却到-20℃，慢慢滴加3毫升液溴。室温搅拌反应数十分钟，薄层层析TLC检测反应结束后，搅拌下缓缓加入饱和硫代硫酸钠溶液至反应溶液颜色消失，然后加入100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，乙酸乙酯相用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干得到淡黄色固体5.3克(收率86％)，进一步乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到淡黄色固体(2和GA4的混合物)4.6克(收率75％)，实施例14GA4+7之氢解产物(1和GA4的混合物)3.1克溶解于30毫升丙酮及5毫升水中，加入碳酸钾2.8克碘6.8克及碘化钾1.7克。室温搅拌反应数十分钟，薄层层析TLC检测反应结束后搅拌下缓缓加入饱和硫代硫酸钠溶液至反应溶液颜色消失，然后加入50毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，乙酸乙酯相用饱和盐水洗涤至中性，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，残余物用乙酸乙酯/石油醚重结晶得到淡黄色固体(2和GA4的混合物)3.0克(收率74％)。
实施例15将GA4+7之氢解产物(1和GA4的混合物)4.6克溶解于50毫升四氢呋喃中，加入100毫升水及碳酸锂5.0克、溴化钠5.0克，冷却到-20℃，慢慢滴加3毫升液溴。室温搅拌反应数十分钟，薄层层析TLC检测反应结束后，搅拌下缓缓加入饱和硫代硫酸钠溶液至反应溶液颜色消失，然后加入100毫升乙酸乙酯，盐酸酸化至PH＝1.0，乙酸乙酯相用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干得到淡黄色固体5.3克(收率86％)，进一步乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到淡黄色固体(2和GA4的混合物)4.6克(收率75％)。
三、碘代内酯化产物2的还原脱碘反应。在实施例条件下仅有2会发生还原脱碘反应，混合物中的GA4得到保留。
实施例16称取Zn粉5.2克及六水合氯化镍(NiCl2·6H2O)1.9克与100毫升四氢呋喃混合，加入少许水，室温搅拌30分钟，然后加入(2和GA4的混合物)9.5克。室温搅拌反应数小时，TLC检测反应完全后，滤除沉淀，滤渣用少许四氢呋喃洗涤，合并滤液，减压回收溶剂。残留物加入乙酸乙酯100毫升，依次用稀盐酸水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，得到8.6克淡黄色固体，乙酸乙酯/石油醚重结晶得到白色晶体7.1克GA4。母液浓缩后重结晶得到另一份GA4白色晶体0.9克(三步总收率80％)。
纯化合物GA4的谱图mp214～215℃1H-NMR(300MHz，Acetone)δ4.97(1H，brs)，4.85(1H，brs)，4.46(1H，brs)，3.72(1H，m)，3.21(1H，d，J＝10.8Hz)，2.64(1H，m)，2.60(1H，d，J＝10.8Hz)，2.20～2.03(3H，m)，2.00～1.47(9H，m)，1.44～1.30(1H，m)，1.12(3H，s，Me).13C-NMR(300MHz，Acetone)δ178.65，173.84，158.27，107.45，94.27，70.34，55.38，54.34，52.54，51.90，51.81，45.10，39.84，37.62，32.28，29.19，28.17，16.79，15.26.MSm/z332(M+，1％)，314(11)，296(5)，286(16)，271(24)，270(100)，268(18)，255(15)，241(19)，227(19)，225(36)，224(33)，213(7)，197(13)，183(14)，169(14)，157(17)，155(16)，143(15)，141(13)，129(18)，128(13)，115(12)，105(19)，91(36).HRMS(ESI+)m/z Found355.1519[M+Na]+，C19H24O5Na requires355.1521.
实施例17硼氢化钠2.6克溶解于100毫升二甘醇二甲醚中，室温搅拌下缓慢加入事先溶解于50毫升二甘醇二甲醚的(2和GA4的混合物)10.8克，加完后于40～50℃反应数小时至数十小时。
薄层层析TLC检测反应完全后，加入少许氢氧化钠冰水溶液，搅拌数十分钟，然后用稀盐酸调PH＝1.0，乙酸乙酯提取(100毫升×3)。合并乙酸乙酯相，饱和盐水洗涤至中性，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，残余物用乙酸乙酯/石油醚重结晶得到白色固体GA45.2克(收率65％)。
实施例18锌(Zn)粉4.8克及六水合氯化镍(NiCl2·6H2O)0.5克与100毫升乙醇混合，加入少许水，室温搅拌30分钟，然后加入(2和GA4的混合物)2.4克。室温搅拌反应数小时，薄层层析TLC检测反应结束后，滤除沉淀，滤渣用少许乙醇洗涤，合并滤液，减压回收溶剂。残留物加入乙酸乙酯50毫升，盐酸调PH＝1.0，饱和食盐水洗至中性，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，残余物用乙酸乙酯/石油醚重结晶得到白色固体GA41.0克(收率60％)。
实施例19锌(Zn)粉10克及六水合氯化镍(NiCl2·6H2O)7.0克与100毫升四氢呋喃混合，室温搅拌15分钟后加入3.5克(2和GA4的混合物)，室温搅拌反应数小时，硅胶薄层层析(TLC)检测反应结束后滤除固体，以少许四氢呋喃洗涤滤渣，合并四氢呋喃，减压回收溶剂，残余物加入100毫升乙酸乙酯溶解，盐酸酸化至PH＝1.0，饱和食盐水洗涤近中性，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，得到浅白色固体GA43.1克(收率90％)。
实施例20锌(Zn)粉10克及六水合氯化镍(NiCl2·6H2O)7.0克与50毫升乙醇混合，室温搅拌15分钟后加入3.5克(2和GA4的混合物)，室温搅拌反应数小时，硅胶薄层层析(TLC)检测反应结束后滤除固体，以少许四氢呋喃洗涤滤渣，合并乙醇，减压回收溶剂，残余物加入50毫升乙酸乙酯溶解，盐酸酸化至PH＝1.0，饱和食盐水洗涤近中性，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，得到浅白色固体GA43.0克(收率85％)。
实施例21锌(Zn)粉10克及六水合氯化镍(NiCl2·6H2O)7.0克与60毫升甲醇混合，室温搅拌15分钟后加入5.5克(2和GA4的混合物)，室温搅拌反应数小时，硅胶薄层层析(TLC)检测反应结束后滤除固体，以少许四氢呋喃洗涤滤渣，合并乙醇，减压回收溶剂，残余物加入50毫升乙酸乙酯溶解，盐酸酸化至PH＝1.0，饱和食盐水洗涤近中性，无水硫酸钠干燥，真空浓缩至干，得到浅白色固体GA44.8克(收率88％)。
权利要求
1.一种制备结构式(I)表示的赤霉素GA4(3β，10α-二羟基-20-失碳赤霉-16-烯-7，19-双酸-19，10内酯)的简便制备方法 其特征是以发酵得到的赤霉酸GA4+7为起始原料，经催化氢化，卤代内酯化以及脱除卤素反应后重结晶得到化合物(I)。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是以发酵得到的赤霉酸GA4+7为起始原料，经催化氢化，将其中的GA7进行后续反应转化成为GA4。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是催化氢化所采用的催化剂为过渡金属铂和钯，催化剂用量按重量计相对于反应底物GA4+7为0.1％～10％。
4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是催化氢化反应所采用的溶剂为有机溶剂与有机胺类化合物按体积比10∶1～1∶10得到的混合溶剂，用量为10～100毫升/克；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚，有机胺类化合物为三乙胺或吡啶。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征是卤代内酯化所采用的卤素为溴、碘与卤化钾或卤化钠的混合物，用量按摩尔比相对于反应底物为卤素X2∶GA4+7＝1～10∶1。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是卤代内酯化所采用的溶剂为醇、酯、酮、醚或卤代烃与水的混合溶剂，比例为体积比10∶1～1∶10；所采用的碱为碳酸盐M2CO3或MHCO3，其中M为钠Na，钾K，锂Li，用量按摩尔比相对于卤代反应底物为3～10∶1。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征是脱卤还原反应所采用的试剂按摩尔比为锌粉与含结晶水氯化镍NiCl2·XH2O＝1～30∶1，用量按摩尔比相对于卤代反应底物为5～20∶1；所采用的溶剂是无水乙醇、四氢呋喃、1，4-二氧六环、乙腈。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征是最终产物GA4以丙酮/石油醚体积比为1～10∶1或乙酸乙酯/石油醚体积比2～15∶1溶剂重结晶。
全文摘要
一种赤霉素GA
文档编号C07D307/00GK1847235SQ20051001086
公开日2006年10月18日 申请日期2005年6月22日 优先权日2005年6月22日
发明者张洪彬, 吴松福, 刘建平, 刘小龙, 李良, 陈静波, 杨万松, 赵静峰, 朱洁 申请人:云南大学, 云大科技股份有限公司