pET15b-PEP-1-Cat质粒及构建、PEP-1-CAT融合蛋白及表达的制作方法

文档序号:3556617阅读:588来源:国知局
专利名称:pET15b-PEP-1-Cat质粒及构建、PEP-1-CAT融合蛋白及表达的制作方法
技术领域
本发明涉及质粒pET15b-PEP-1-Cat的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达。
背景技术
目前已有相当多的证据表明,活性氧(包括.O-2,.OH,H2O2等)介导多种疾病发生的病理生理过程。细胞防御体系利用抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)来对抗活性氧。SOD催化.O-2分解产生H2O2,而CAT和GPX则将H2O2降解为H2O和O2,并避免.OH基团的产生。尽管长期以来人们希望将过氧化氢酶(CAT)应用于防治各种氧化应激损伤,过氧化氢酶(CAT)不能以天然活性形式穿透细胞,由于缺乏有效的把过氧化氢酶(CAT)导入细胞的方法而限制了其生物学效应的发挥。

发明内容
为了解决过氧化氢酶(CAT)不能以天然活性形式穿透细胞,其生物学效应得不到发挥的问题,本发明的目的是提供可以以天然活性形式穿透细胞的pET15b-PEP-1-Cat质粒及构建、PEP-1-CAT融合蛋白及表达方法。
pET15b-PEP-1-Cat质粒,采用pET15b为表达载体,PEP-1-Cat基因见序列表中的核苷酸序列。
PEP-1-CAT融合蛋白,是序列表中的氨基酸序列。
所述pET15b-PEP-1-Cat质粒的构建如下①、PCR扩增目的片段根据人CAT cDNA设计合成Cat的引物,上游引物为5′Sal IGTCGAC ATG GCT GAC AGCCGG GAT CCC GCC 3′,下游引物为5′BglIIAGA TCT TCA CAG ATT TGC CTT CTC CCTTGC3′,在上游引物、下游引物两端分别直接引入Sal I、Bgl II酶切位点;以pZeoSV2(+)-Cat为模板进行PCR扩增;PCR循环参数94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环后72℃延伸10min。取CR产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果得到一条约1600bp的片段,将剩余PCR产物用乙醇沉淀法进行纯化回收。
②、Cat cDNA片段两3’-OH端加“A”在纯化得到的PCR产物沉淀中,加入高压三蒸水、10×buffer、10×MgCl2、2mM dATP、Taq酶,在PCR仪上反应,70℃ 30min后,0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收加“A”后的Cat cDNA片段。
③、pGEM-T-Cat的构建将步骤②中回收所得片段,按pGEM-T Easy Vector说明书进行T载体克隆,经PCR及Sal I-Bgl II双酶切鉴定,阳性重组子命名为“pGEM-T-Cat”,-20℃保存备用。
④、PET15b-PEP-1质粒的构建人工合成编码PEP-1的序列Top strand5’Nde ITAT GAA AGA AAC CTG GTG GGA AACCTG GTG GAC CGA ATG GTC TCA GCC GAA AAA AAA ACG TAA AGT GC 3’,长度为68bp,Bottom strand5’Xho ITCG AGC ACT TTA CGT TTT TTT TTC GGC TGA GAC CAT TCG GTC CACCAG GTT TCC CAC CAG GTT TCT TTC A 3′,长度为70bp;将人工合成的编码PEP-1的两条单链寡核苷酸煮沸变性,逐渐降温复性为双链PEP-1;pET15b作为表达载体,用XhoI-NdeI双酶切pET15b后回收大片段,得pET15b沉淀,然后将双链PEP-1与pET15b沉淀相连,4℃连接过夜,连接产物转化DH5a后,随机挑取单菌落培养,碱裂解法提取质粒DNA,经XhoI-XbaI双酶切电泳,切下含有PEP-1的片段应为167bp,鉴定正确的重组质粒命名为“pET15b-PEP-1”,-20℃保存备用。
⑤、PET15b-PEP-1-Cat质粒的构建首先用XhoI-BamHI对pET15b-PEP-1进行双酶切后回收大片段,再用SalI-BglII消化步骤③中得到的pGEM-T-Cat,回收1600bp的Cat片段,利用同尾酶酶切后能产生相同黏性末端的特性将得到的片段进行连接;将连接产物转化大肠杆菌DH5α后铺板,37℃温箱孵育,挑取单菌落小量培养后,经PCR、XhoI单酶切鉴定,切出一条7365bp的片段,命名为“pET15b-PEP-1-Cat”,经过测序,其序列是序列表中的核苷酸序列。
本发明中PEP-1-CAT融合蛋白的表达纯化方法如下a、PEP-1-CAT融合蛋白的表达用大肠杆菌作为工程菌,用表达质粒pET15b-PEP-1-Cat转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌,然后在培养基中发酵;发酵结束,然后冰浴超声破菌,则融合蛋白以可溶的形式存在于上清液中;b、融合蛋白的纯化收集上步中超离后的上清液,用Ni2+-NTA-琼脂糖柱进行亲和层析纯化融合蛋白,用生物半透膜透析使纯化的融合蛋白充分脱盐,把纯化的融合蛋白用0.45um孔径滤膜过虑过除菌后,用Eppendorf管装,-80℃保存。
本发明通过合成编码PEP-1DNA的片段,用基因工程手段构建出pET15b-PEP-1-Cat质粒,将其在工程菌中表达出PEP-1-CAT融合蛋白,然后通过纯化,从而成功制备了可穿透细胞的PEP-1-CAT融合蛋白,为防治与氧化应激损伤有关的疾病奠定了基础。


图1是PET15b-PEP-1-Cat质粒的构建流程图。
图2是PCR产物的电泳图。
图3是pGEM-T-Cat的SalI-BglII双酶切鉴定图。
图4是pET15b-PEP-1重组质粒用XhoI-XbaI双酶切鉴定图。
图5是pET15b-PEP-1-Cat质粒用XhoI单酶切鉴定图。
图6是PEP-1-CAT融合蛋白的SDS-PAGE及蛋白印迹杂交结果。
具体实施例方式
一、本发明使用的仪器和材料1、仪器PCR仪(Biometra,德国)、透射式紫外分析仪(EF-90A,上海)、凝胶成像系统(Touching955 gel Document System,上海)、台式高速冷冻离心机(Hettich,Universal 32R,德国)、超声波细胞粉碎机(JY-98-3D,宁波)、超速冷冻离心机(HITACHI himac CP 80MX,日本)、核酸蛋白检测仪(HD-2004B,上海)、恒流泵(HL-2,上海)、转移电泳仪(DYY-7,北京)、紫外分光光度计(CE2041,北京)2、材料试剂Taq DNA聚合酶、dNTP、dATP、T4DNA连接酶、IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)购自Promega公司,Pfu酶为New England Biolabs公司产品,限制性内切核酸酶Xho I、BamH I、Nde I、Xba I购自北京赛百盛基因技术有限公司,Sal I、Bgl II购自晶美生物工程有限公司,DNA分子量标准(Marker)为北京华美生物工程有限公司产品,预染蛋白分子量标准(P0066)购自Beyotime Biotechnology公司,Ni2+-NTA-琼脂糖为Qiagen公司产品,His-probe(G-18)购自Santa Cruz Biotechnology公司,Western blot检测试剂盒为KPL公司产品。PCR引物及PEP-1的寡核苷酸链由赛百盛公司合成。
质粒与菌株模板质粒pZeoSV2(+)-Cat由美国西奈山医学院生化/药理学系白景香博士惠赠;质粒pET15b购自Novagen公司;pGEM-T Easy载体系统为Promega公司产品;E.coli.BL21(DF3)购自Novagen公司;大肠杆菌DH5α为本室保存。
二、实施例实施例1pET15b-PEP-1-Cat质粒的构建,结合图1所示的构建流程图描述如下1.1、PCR扩增目的片段根据GeneBank中登录号为“AY028632”的人CAT cDNA设计合成Cat的引物,两端分别直接引入Sal I、Bgl II酶切位点上游引物5′Sal IGTCGAC ATG GCT GAC AGC CGGGAT CCC GCC 3′(30bp)下游引物5′Bgl IIAGA TCT TCA CAG ATT TGC CTT CTC CCTTGC3′(30bp)以pZeoSV2(+)-Cat为模板,PCR扩增两端分别带有SalI和BglII酶切位点的Cat片段。PCR反应体系10×buffer(含MgSO4)10μl、10×dNTP 10μl(2μmol/L)、上下游引物各10μl、Pfu酶4μl、模板2μl,补加去离子水至总体积100μl。循环参数94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环后72℃延伸10min。取10μl PCR产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果得到一条约1600bp的片段。将剩余PCR产物用NH4Ac沉淀法进行纯化回收。
1.2、Cat cDNA片段两3’-OH端加“A”在纯化得到的PCR产物沉淀中,加入高压三蒸水34μl、10×buffer 5μl、10×MgCl25μl、2Mm dATP 5μl、Taq酶1μl,总反应体系50μl。PCR仪上70℃ 30min后,0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收加“A”后的Cat cDNA片段。
1.3、pGEM-T-Cat质粒的构建将上步中回收所得Cat cDNA片段3’-OH末端加“A”后与T载体进行连接。连接体系为将上步所得Cat cDNA沉淀用3μl高压三蒸水溶解,再加2×Rapid ligation buffer5μl,pGEM-T载体1μl,T4DNA连接酶1μl,总体系为10μl,4℃连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,将转化的大肠杆菌液涂布于含X-gal(20ug/ml)、IPTG(24ug/ml)、Ampicillin(100ug/ml)的固体LB培养板上,以蓝白筛选法筛选阳性克隆。经PCR及Sal I-Bgl II双酶切鉴定,阳性重组子命名为“pGEM-T-Cat”,-20℃保存备用。
1.4、pET15b-PEP-1重组质粒的构建人工合成编码PEP-1的序列。Top strand5’Nde ITAT GAA AGA AAC CTG GTG GGA AACCTG GTG GAC CGA ATG GTC TCA GCC GAA AAA AAA ACG TAA AGT GC 3’(68bp),Bottom strand5’Xho ITCG AGC ACT TTA CGT TTT TTT TTC GGC TGA GAC CAT TCG GTC CACCAG GTT TCC CAC CAG GTT TCT TTC A 3′(70bp)。将人工合成的编码PEP-1的两条单链寡核苷酸煮沸变性逐步降温复性为双链PEP-1。pET15b用XhoI-NdeI双酶切后回收大片段,然后将两者相连,反应体系pET15b(沉淀)、PEP-14μl、2×Rapidligation buffer5μl、T4DNA连接酶1μl,总体系为10μl,4℃连接过夜。连接产物转化感受态DH5a后,随机挑取单菌落培养,碱裂解法提取质粒DNA,经XhoI-XbaI双酶切鉴定。因pET15b上带有一个XbaI的酶切位点,因此重组质粒采用XhoI-XbaI双酶切电泳,切下含有PEP-1的片段应为167bp,不含PEP-1的片段为104bp。鉴定正确的重组质粒命名为“pET15b-PEP-1”,-20℃保存备用。
1.5、pET15b-PEP-1-Cat质粒的构建首先用XhoI-BamHI对pET15b-PEP-1进行双酶切后回收大片段,再用SalI-BglII消化pGEM-T-Cat回收1600bp的Cat片段。XhoI与SalI,BamHI与BglII互为两组同尾酶,利用同尾酶酶切后能产生相同黏性末端的特性进行片段的连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a后铺板,37℃温箱孵育。挑取单菌落小量培养后,经PCR、XhoI单酶切鉴定。因为通过同尾酶技术连接后原有酶切位点均被破坏,pET15b上的XhoI位点不存在了,而CatcDNA上有一个XhoI的位点,因此用XhoI单酶切鉴定,如切出一条7365bp的片段则重组正确。命名为“pET15b-PEP-1-Cat”。
1.6、pET15b-PEP-1-Cat序列测定取10μl pET15b-PEP-1-Cat质粒,加10μl高压三蒸水稀释后寄往北京华大中生科技发展有限公司进行核苷酸序列测定,结果见序列表中的核苷酸序列。
实施例2PEP-1-CAT融合蛋白的表达纯化方法2.1、工程菌E.coli.BL21(DE3)的转化和PEP-1-CAT融合蛋白的诱导表达将质粒pET15b-PEP-1-Cat转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌,转化的菌液铺于含Ampicillin(100μg/ml)的LB平板上,37℃温箱培养待长出菌斑,挑单菌落接种于5mlLB液体培养基中37℃振摇培养过夜,然后用新鲜培养基按1∶50比例稀释,扩大培养至OD600≈0.8时加入终浓度为1.0mM的IPTG,30℃培养24h以诱导目的蛋白表达。4℃、5000rpm离心5min收集细菌沉淀,1×PBS漂洗3次,加30ml结合缓冲液(5mM咪唑、500mM NaCl、20mM Tris.HCl,PH7.9)重悬菌体。然后冰浴超声破菌(400W、5s/15s、30min),将菌液置超速冷冻离心机中20000rpm离心10min以除去细胞壁,则融合蛋白以天然、可溶的形式存在于上清中。
2.2、融合蛋白的纯化pET15b作为载体所表达的基因工程重组蛋白在其N端带有一个由6个组氨酸组成的“标签”(His-tag),可用Ni2+-NTA-琼脂糖柱进行亲和层析纯化(1)。收集上步超离后的上清,将其转入装有Ni2+-NTA-琼脂糖的层析柱中,上样完毕后静置2h,以便6个组氨酸标签与填料中Ni2+充分结合。分别用10倍柱体积的结合缓冲液和6倍柱体积的漂洗缓冲液(30mM咪唑、500mM NaCl、20mM Tris.HCl,PH7.9)过柱以洗去未结合的杂蛋白,然后用洗脱缓冲液(500mM咪唑、500mM NaCl、20mM Tris.HCl,PH7.9)将His tag-pep-1-cat融合蛋白洗脱下来。收集峰值洗脱液行SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达水平及纯化效果。洗脱的蛋白加入10%甘油后用生物半透膜透析48h以充分脱盐(透析液为PH7.4的PBS,含10%甘油)。纯化的融合蛋白过0.45μm的滤器除菌后,用1.5ml Eppendorf管分装,-80℃保存。
2.3、12%SDS-PAGE和Western blot检测PEP-1-CAT蛋白的表达量制备12%分离胶、浓缩胶,分别取含有目的蛋白的细菌裂解上清(纯化前)和收集的峰值洗脱液(纯化后)行SDS-PAGE电泳(150V、25mA、2h),凝胶用考马斯亮蓝R-250染色40min后,用含10%冰醋酸的10%甲醇脱色至本底无色为止,经凝胶成像系统扫描,可得出目的蛋白的相对分子质量及占全部菌体蛋白的百分含量。
融合蛋白经SDS-PAGE分离后行Western blot以进一步证实纯化产物。将凝胶电转印至硝酸纤维素膜上,1×TBS/0.2%戊二醛固定40min,加10ml封闭液封闭1h阻断非特异性结合部位,加入经倍比稀释的一抗(兔抗组氨酸多克隆抗体)10μl,室温振摇孵育过夜。Western漂洗液漂洗3次,加10ml封闭液及按1∶1000稀释的羊抗兔二抗10μl,水平摇床孵育1h后漂洗3次,加1mL显色剂显色。
2.4、蛋白浓度测定采用Bradford法(2)(即考马斯亮蓝染色法)进行蛋白浓度定量(以BSA作为标准对照)。
三、结果3.1、编码人CAT cDNA的PCR扩增以pZeoSV2(+)-Cat质粒为模板,经Cat上下游引物PCR后,行1.0%普通琼脂糖凝胶电泳,可见扩增出1600bp的Cat片段。见图2所示。
3.2、pGEM-T-Cat质粒的构建用NH4AC沉淀法对PCR扩增的Cat cDNA进行纯化,利用Taq酶的非模板依赖性末端转移酶活性,在PCR产物的3’末端加单个脱腺苷酸(A),纯化后将其直接克隆入3’末端带T的中间载体pGEM-T-Easy vector上,连接产物转化DH5a,经Amp抗性和蓝白显色筛选,见培养板上长出蓝白斑比例约为1∶2,总菌落数约32个。挑取白色单菌落接种扩增后提取质粒,经Sal I-Bgl II双酶切鉴定,发现有1600bp的条带。见图3,阳性克隆命名为“pGEM-T-Cat”。
3.3、pET15b-PEP-1重组质粒的构建首先将人工合成的编码PEP-1的两条单链寡核苷酸用煮沸法复性为双链DNA,质粒pET15b用XhoI-NdeI双酶切后行0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收线性大片段。然后将带XhoI、NdeI黏性末端的PEP-1双链克隆至pET15b中,连接产物转化DH5a,提取质粒后经XhoI-XbaI双酶切鉴定,见一167bp的片段。见图4,命名为“pET15b-PEP-1”。
3.4、pET15b-PEP-1-Cat质粒的构建质粒pET15b-PEP-1用XhoI-BamHI双酶切后行0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收约5766bp的大片段,pGEM-T-Cat用SalI-BglII双酶切后行1.0%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收约1600bp的片段。利用两组同尾酶(SalI与XhoI、BglII与BamHI)能酶切产生相同黏性末端的特性,进行DNA片段的连接,转化DH5α,提取质粒后经XhoI单酶切鉴定,可见约7365bp的条带。见图5,命名为“pET15b-PEP-1-Cat”。
3.5、pET15b-PEP-1-CAT的核苷酸序列测定将经上述限制性酶切分析、电泳鉴定有目的片段插入的纯化质粒,寄往北京华大中生科技发展有限公司进行核苷酸序列测定。分析证实PEP-1编码区和CAT cDNA编码区均成功地克隆入了pET15b质粒,而且其序列分别与设计合成的PEP-1序列和GeneBank中登录号为“AY028632”的人Cat cDNA序列完全一致。见图6。
3.6、PEP-1-CAT融合蛋白的表达和纯化经IPTG诱导后,用氮基三乙酸(NTA)共价固定的含Ni2+树脂进行金属螯合层析来纯化PEP-1-CAT融合蛋白。分别取含有目的蛋白的细菌裂解上清(纯化前)及收集的峰值洗脱液(纯化后)行SDS-PAGE,65KD附近可见目的蛋白的表达条带,且融合蛋白高水平表达成为E.coli中总蛋白的主要成分,应用Ni2+-NTA-琼脂糖纯化的蛋白纯度达90%左右,见图7中(A)图片所示。用兔抗组氨酸多克隆抗体行Western blot,显示为单一印迹,无降解条带,说明在工程菌BL21中得到了PEP-1-CAT的可溶性表达,且目的蛋白在表达过程中无降解、修饰的发生,见图7中(B)图片所示四、分析讨论过氧化氢酶(Catalase,CAT)是机体抗氧化防御系统的重要组成部分,可通过清除体内的氧自由基而发挥其对抗氧化应激的作用,因此,应用抗氧化酶来防治氧自由基介导的疾病已引起了医学界的广泛关注(3)。目前认为,基因治疗是实现将外源基因导入细胞内表达治疗性蛋白的一种很有前途的方法,但基因治疗存在一些关键问题尚未解决,包括基因导入效率、基因表达的可控性、有效性、安全性等(4)。近年来,细胞穿透肽的发现为这一难题的解决提供了突破口。
细胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides,CPPs),是一种能携带多种大分子物质高效穿透生物膜的结构。CPPs作为一种很有前途的运载工具,已经得到了广泛关注,其中研究最多的是Tat。许多文献报道,Tat-GFP(5)、Tat-GDH(6)、Tat-SOD(7)、Tat-CAT(8)融合蛋白均能被有效转导入哺乳动物细胞,并穿透动物皮肤。进一步研究发现,转导的Tat-SOD、Tat-CAT能增加百草枯(一种可产生超氧阴离子的外源性物质)处理过的哺乳动物细胞的存活力,这就表明这些融合蛋白有对抗氧应激的作用。但Tat等自然界存在的CPPs作为一种运载工具具有很多优点,但同时也存在缺憾,如需要将融合蛋白变性才能使其进入细胞,融合蛋白进入细胞后需要分子伴侣将其重折叠为有活性的天然构像,因此其活性发挥有赖于重折叠效率。此外,关于其是否有细胞毒性和免疫遗传性等问题尚存在争议。因此,为了提高被转导的蛋白在细胞内的生物学活性,就需要设计一种可将目的蛋白以天然活性形式导入细胞内的新型载体。Morris小组(9)设计合成了一个21个氨基酸的肽段载体PEP-1,它由三个结构域构成一个富含色氨酸的疏水区(KETWWETWWTEW);一个连接区(SQP);一个富含赖氨酸的亲水区(KKKRKV)。此载体具有很多自然界存在的CPPs所无法比拟的优势能携带多种肽段和蛋白质以天然活性形式进入多种细胞系,而不需要任何化学的共价结合或变性步骤;在生理缓冲液中具有高度的稳定性;安全无毒性;不受血清影响等。
本研究通过基因工程手段构建出pET15b-PEP-1-Cat重组质粒。常规方法是在目的基因片段的两端引入与载体酶切位点相同的黏性末端来克隆PCR扩增片段,从而通过粘性末端连接的方案将目的片段克隆入载体。我们根据pET15b有NdeI和XhoI的酶切位点,而PEP-1的编码序列中不含这两个位点,因此在其正义链的5’端加入NdeI、反义链的5’端加入XhoI的位点,从而保证了PEP-1的编码序列正向插入到pET15b中。但在将Cat cDNA插入到pET15b-PEP-1时,用同样的策略就遇到了困难,因为pET15b有XhoI和BamHI的位点,而Cat的基因序列中有1个XhoI和3个BamHI的位点,这样就不能保证Cat cDNA在需要的位置被XhoI和BamHI切开。常规的方法是采用部分酶切,通过做预试验、改变酶切时间、温度及酶浓度等反应条件而找到不足以把所有的酶切位点都切断的最适反应体系,然后进行大量酶切,但这一方法繁琐、费时。林澄涛等(10)在疟疾多价重组DNA疫苗的构建中曾应用同尾酶技术,在所有组合片段的两侧分别加上一组同尾酶,将不同的抗原表位加以灵活重组,从而构建了不同组合形式的疟疾多价重组DNA疫苗。因此我们在重组过程中也借鉴了这一思路。我们设计合成Cat的引物,其上游引物5’端引入SalI位点、下游引物3’端引入BglII位点,而SalI与XhoI、BglII与BamHI互为两组同尾酶,利用两组同尾酶切割后能产生相同粘性末端并能通过互补作用彼此连接的特性,将Cat cDNA片段成功地插入到pET15b-PEP-1上。另外,传统的粘性末端克隆法可能会遇到一定的技术困难,原因之一就是许多限制性内切酶不能正确切割位于DNA末端的识别位点,这些酶包括HindIII、SalI、XbaI、XhoI、NotI等,它们已被证明在酶切位于DNA片段末端与次末端的识别效率不高(11),因此不能保证在连接前PCR片段是被完全切开的。丁鹏等(12)采用高保真的pfu DNA聚合酶,然后对PCR产物进行纯化,利用Taq酶在其3’末端加单个不配对“A”的特性,成功的利用TA克隆构建了pET15b-SOD1重组质粒。我们在重组中也采用了这一方案,实现了表达载体的成功构建,然后将其转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达出N端带6个His标签的融合蛋白,而这种含组氨酸尾的融合蛋白可借助NTA共价固定的含Ni2+的树脂来纯化,从而得到了纯度较高的融合蛋白。
序列表TATG AAA GAA ACC TGG TGG GAA ACC TGG TGG ACC GAA TGG TCT CAGK E T W W E T W W T E W S QCCG AAA AAA AAA CGT AAA GTG CTC GAC ATG GCT GAC AGC CGG GAT CCCP K K K R K V L D M A D S R D PGCC AGC GAC CAG ATG CAG CAC TGG AAG GAG CAG CGG GCC GCG CAG AAAA S D Q M Q H W K E Q R A A Q KGCT GAT GTC CTG ACC ACT GGA GCT GGT AAC CCA GTA GGA GAC AAA CTTA D V L T T G A G N P V G D K LAAT GTT ATT ACA GTA GGG CCC CGT GGG CCC CTT CTT GTT CAG AAT GTGN V I T V G P R G P L L V Q N VGTT TTC ACT GAT GAA ATG GCT CAT TTT GAC CGA GAG AGA ATT CCT GAGV F T D E M A H F D R E R I P EAGA GTT GTG CAT GCT AAA GGA GCA GGG GCC TTT GGC TAC TTT GAG GTCR V V H A K G A G A F G Y F E VACA CAT GAC ATT ACC AAA TAC TCC AAG GCA AAG GTA TTT GAG CAT ATTT H D I T K Y S K A K V F E H IGGA AAG AAG ACT CCC ATC GCA GTT CGG TTC TCC ACT GTT GCT GGA GAAG K K T P I A V R F S T V A G ETCG GGT TCA GCT GAC ACA GTT CGG GAC CCT CGT GGG TTT GCA GTG AAAS G S A D T V R D P R G F A V KTTT TAC ACA GAA GAT GGT AAC TGG GAT CTC GTT GGA AAT AAC ACC CCCF Y T E D G N W D L V G N N T P
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权利要求
1.pET15b-PEP-1-Cat质粒,采用pET15b为表达载体,PEP-1-Cat基因见序列表中的核苷酸序列。
2.PEP-1-CAT融合蛋白,是序列表中的氨基酸序列。
3.pET15b-PEP-1-Cat质粒的构建方法,其特征在于步骤如下①、PCR扩增目的片段根据人CAT cDNA设计合成扩增Cat的引物,上游引物为5′Sal IGTCGAC ATG GCT GACAGC CGG GAT CCC GCC 3′,下游引物为5′BglIIAGA TCT TCA CAG ATT TGC CTT CTC CCTTGC3′,在上游引物、下游引物两端分别直接引入Sal I、Bgl II酶切位点;以pZeoSV2(+)-Cat为模板进行PCR扩增;PCR循环参数94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环后72℃延伸10min。取CR产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果得到一条约1600bp的片段,将剩余PCR产物用NH4Ac沉淀法进行纯化回收。②、Cat cDNA片段两3’-OH末端加“A”在纯化得到的PCR产物沉淀中,加入高压三蒸水、10×buffer、10×MgCl2、2Mm dATP、Taq酶,在PCR仪上反应,70℃30min后,0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收加“A”后的Cat cDNA片段。③、pGEM-T-Cat质粒的构建将步骤②中回收所得片段,与T载体连接,经PCR及Sal I-Bgl II双酶切鉴定,阳性重组子命名为“pGEM-T-Cat”,-20℃保存备用。④、pET15b-PEP-1质粒的构建人工合成编码PEP-1的序列Top strand5’Nde ITAT GAA AGA AAC CTG GTG GGA AACCTG GTG GAC CGA ATG GTC TCA GCC GAA AAA AAA ACG TAA AGT GC 3’,长度为68bp,Bottom strand5’Xho ITCG AGC ACT TTA CGT TTT TTT TTC GGC TGA GAC CAT TCG GTC CACCAG GTT TCC CAC CAG GTT TCT TTC A 3′,长度为70bp;将人工合成的编码PEP-1的两条单链寡核苷酸煮沸复性为双链PEP-1;pET15b作为表达载体,用XhoI-NdeI双酶切pET15b后回收大片段,得pET15b沉淀,然后将双链PEP-1与pET15b沉淀相连,4℃连接过夜,连接产物转化DH5a后,随机挑取单菌落培养,碱裂解法提取质粒DNA,经XhoI-XbaI双酶切电泳,切下含有PEP-1的片段应为167bp,鉴定正确的重组质粒命名为“pET15b-PEP-1”,-20℃保存备用。⑤、pET15b-PEP-1-Cat质粒的构建首先用XhoI-BamHI对pET15b-PEP-1进行双酶切后回收大片段,再用SalI-BglII消化步骤③中得pGEM-T-Cat回收1600bp的Cat片段,利用同尾酶酶切后能产生相同黏性末端的特性将得到的片段的连接;将连接产物转化大肠杆菌DH5a后铺板,37℃温箱孵育,挑取单菌落小量培养后,经PCR、XhoI单酶切鉴定,切出一条7365bp的片段,命名为“pET15b-PEP-1-Cat”,经过测序,其序列是序列表中的核苷酸序列。
4.PEP-1-CAT融合蛋白的表达纯化方法,其特征在于步骤如下a、PEP-1-CAT融合蛋白的表达用大肠杆菌作为工程菌,用质粒pET15b-PEP-1-Cat转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌,然后在培养基中发酵;发酵结束,然后冰浴超声破菌,则融合蛋白以可溶的形式存在于上清液中;b、融合蛋白的纯化收集上步中超离后的上清液,用Ni2+-NTA-琼脂糖柱进行亲和层析纯化融合蛋白,用生物半透膜透析使纯化的融合蛋白充分脱盐,把纯化的融合蛋白过除菌后,用Eppendorf管分装,-80℃保存。
全文摘要
本发明提出了可以以天然活性形式穿透细胞的pET15b-PEP-1-Cat质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达纯化方法。具体如下设计并合成两端分别带Sal I和Bgl II酶切位点的Cat引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-Cat质粒为模板,特异性扩增Cat全长cDNA;将扩增的Cat cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶在CAT cDNA的3’末端加“A”并纯化,然后应用TA克隆将Cat cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中得到pGEM-T-Cat;人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,将回收得到的Cat cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出质粒pET15b-PEP-1-Cat。融合蛋白的表达纯化如下用质粒pET15b-PEP-1-Cat转化感受态BL21(DE3)大肠杆菌,然后在培养基中发酵;发酵结束,用冰浴超声破菌,收集超离后的上清液,用Ni
文档编号C07K1/00GK1974774SQ200510019900
公开日2007年6月6日 申请日期2005年11月24日 优先权日2005年11月24日
发明者王家宁 申请人:王家宁
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