专利名称：桃儿七愈伤组织诱导产生鬼臼毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种桃儿七的无菌苗培养、愈伤组织诱导产生鬼臼毒素的方法。
背景技术：
目前，由于化学合成新药的成功机率日益下降，成本增加，周期延长，副作用较大等原因，从天然植物中提取次生代谢产物直接药用，或者作为前体化学半合成新药已成为世界性潮流。全美国的药方中有四分之一含有来源于植物的药品，而且至今仍有50多种重要药物只能依赖于从植物中提取。我国传统中药的80％是野生资源。人类对野生植物资源的大量需求已造成生态环境的严重破坏和许多野生植物的濒危状况。国内外的相关研究已经证明，利用植物细胞培养技术生产药用成份已成为解决药用植物资源问题的有效途径之一，也是生物技术在中药现代化领域的重要应用。国内外在紫草、人参、洋地黄、长春花等植物的愈伤或悬浮细胞培养物中成功获得目的产物，有些已达到工业化生产规模。
桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum)是小檗科多年生草本植物，因其根和根茎中含有木脂素类化合物-鬼臼毒素而受到广泛关注。鬼臼毒素是最具活性的天然胞内毒素，可以抑制细胞内微管的装配，被用作合成抗癌药物鬼臼乙叉苷(etoposide)和鬼臼噻吩苷(teniposide)的前体化合物。这些药物在临床上对肺癌、睾丸癌、淋巴癌、白血病、肝癌及其它肿瘤显示出极好的疗效。此外，它还表现出对一些重要病毒的抗病毒活性，因而具有极大的市场潜力。国内外从化学合成、半合成、原植物提取、组织培养、内生真菌发酵等方面进行了研究。由于鬼臼毒素的化学合成非常复杂且成本较高，目前鬼臼毒素的来源仍是从野生植物中提取，即使化学半合成也需要天然鬼臼毒素为原料。世界范围内产鬼臼毒素的植物有足叶草属(Podophyllum)、八角莲属(Dysosma)、山荷叶属(Diphylleia)和桃儿七属(Sinopodophyllum)。据测定产自我省的桃儿七根茎中鬼臼毒素含量居首，这是因为植物在恶劣的环境中容易积累更多的次生代谢产物。因此桃儿七也是我省一种优势的药用植物资源。但是市场的需求造成对野生资源的掠夺性索取，桃儿七已被列入《中国珍稀濒危植物名录》，是甘肃省三类保护植物。
由于从天然植物中获得鬼臼毒素有一定的局限性，国内外实验已经证明利用生物技术手段，通过细胞培养的方法是获得鬼臼毒素的有效途径之一。国外从美足叶草(Podophyllum peltatum)、印足叶草(Podophyllum hexandrum Royle)的愈伤组织和悬浮培养体系中获得了鬼臼毒素，但含量很低，并且证明含鬼臼毒素植物的愈伤组织培养非常困难；国内仅报道从八角莲属植物的培养品中得到的鬼臼毒素含量是原植物的一半，但无该植物愈伤细胞诱导的报道。国内对桃儿七的分布格局、种子特性、产鬼臼毒素的内生真菌筛选、桃儿七中鬼臼毒素的提取方法及鬼臼毒素的药用等方面有一些报道，但有关桃儿七的组织培养、愈伤诱导及其鬼臼毒素的产生至今未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种桃儿七愈伤组织诱导产生鬼臼毒素的方法。
本发明包括以下步骤1)无菌苗的培养以野生桃儿七种子为试材，在种子处理阶段用浓硫酸浸泡种子1-2分钟，以种皮变黑为度；换用浓度为300mg/L的赤霉素(GA3)浸泡48小时后，常规灭菌，取出其中的胚接种于MS培养基(1/2MS无机成分，无激素)，在光照培养箱中培养获得健壮的无菌苗；2)无菌苗的增殖和生根以MS培养基为基本培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2-3mg/L用于无菌苗的增殖；以MS培养基为基本培养基，添加萘乙酸(NAA)0.2-1mg/L用于无菌苗的生根；3)愈伤组织诱导以无菌苗的胚根、胚轴、子叶和真叶叶柄为外植体，以B5为基本培养基，添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1-5mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)1-3mg/L和萘乙酸(NAA)0.2-1mg/L，诱导愈伤组织；4)愈伤组织继代培养以B5为基本培养基，筛选质地疏松、增殖快的愈伤组织细胞株进行继代培养，胚根、胚轴、子叶来源的愈伤组织在添加2，4-二氯苯氧乙酸0.2-1mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤0.5-1mg/L和萘乙酸0.5-1mg/L的培养基中继代；真叶叶柄来源的愈伤组织在添加2，4-二氯苯氧乙酸0.5-2mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤0.5-1mg/L和萘乙酸0.5-1mg/L的培养基中继代，建立稳定的细胞培养系统，所建立的该细胞培养系统愈伤细胞中含有目标次生代谢产物-鬼臼毒素。
在愈伤组织诱导时所用植物材料为培养30-40天无菌苗的胚根、胚轴、子叶和培养50-60天无菌苗的真叶叶柄。
以无菌苗的胚根、胚轴、子叶为外植体进行愈伤组织诱导添加的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为1mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤浓度为3mg/L，萘乙酸浓度为1mg/L；以真叶叶柄为外植体进行愈伤组织诱导添加的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为5mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤浓度为1mg/L，萘乙酸浓度为0.5mg/L。
本发明的目的是按以下技术方案得以实现以野生桃儿七种子为材料，经过种皮处理、激素浸泡后，培养出无菌苗；对无菌苗进行增殖和生根培养；以无菌苗不同部位为外植体诱导愈伤组织，经多次继代培养和细胞株筛选，建立桃儿七细胞培养体系。
按本发明技术方案可以得到大量桃儿七无菌苗和含鬼臼毒素的愈伤细胞，其不仅可以进行桃儿七的大量繁殖和/或用作直接提取鬼臼毒素，还可以将愈伤细胞进行悬浮培养和/或固定化培养，以解决鬼臼毒素含量低、成本高的问题。
本发明解决了桃儿七种子萌发困难的问题。因为野生桃儿七在自然条件下散落的种子成苗率极低，平均20个10×10平方米的样方中仅有幼苗1-2株。按传统方法温汤浸种后直播大田的种子也要六个月后才能萌发。这是因为桃儿七种子中含有抑制萌发的脱落酸(ABA)，而赤霉素(GA3)具有促进种子萌发的作用。经过对比实验证明，按照本发明处理的种子，其胚在改良MS培养基上3天即可萌动，萌发率可达到80％以上。而不经浓硫酸和GA3处理的种子，约30天左右才可萌动，萌发率只有10％左右。
鬼臼毒素的检测方法采用薄层层析-紫外分光光度法测定。参照徐礼燊等著《中草药有效成分分析法》(下册)，北京人民卫生出版社，1982，P258-259，22-23；陈毓亨“我国鬼臼类植物资源的研究”，《药学学报》，1979，14(2)101-106。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本领域的技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例11.将经过挑选的、饱满的甘肃陇南产桃儿七种子放入烧杯，缓缓加入浓硫酸，用玻璃棒不断搅动分钟，自来水大量冲洗至硫酸完全去除。换用300mg/L的赤霉素溶液浸泡48小时。处理后的种子在无菌条件下用0.1％升汞灭菌5-6分钟，无菌水多次冲洗，无菌滤纸吸干水分。取出其中的胚接种于改良MS培养基(1/2MS无机成分，无激素)，在光照培养箱中培养。其它条件为琼脂0.75％，蔗糖30g/L，pH调为5.8；光照(500μmol.m-2.s-1)10小时，温度25±1℃。3天左右胚开始膨大，6天时两片子叶展开，10天时子叶呈绿色，20天胚根、胚轴明显伸长，30-40天时长成完整、健壮的幼苗。
2.将培养30-40天的无菌幼苗转入MS附加6-BA 3mg/L的增值培养基，培养条件同诱导培养。50-60天后幼苗胚轴部位膨大，发出许多叶丛芽以及具叶柄真叶。分割叶芽转入同培养基，可以繁殖出更多具叶丛芽和真叶的植株。
3.将增殖后的无菌苗转入MS附加NAA0.5mg/L的生根培养基，其它条件同无菌苗培养。20天后有4-5条白色的根出现。
4.由步骤1-3获得的无菌苗可以继续扩大繁殖、炼苗后进行大田栽培；或者直接用于鬼臼毒素的提取。
实施例21.从实施例1中步骤1-3获得的无菌苗选取四种外植体生长40天左右的无菌苗①胚轴②胚根③子叶和60天左右的④真叶叶柄，切成0.3厘米左右的小段或0.3厘米见方的小块，接入B5诱导培养基(外植体①、②和③)选用B5附加2，4-D 1mg/L、6-BA 3mg/L和NAA 1mg/L；④选用B5附加2，4-D 5mg/L、6-BA 1mg/L和NAA 0.5mg/L)。其它条件为琼脂0.75％，蔗糖20g/L，pH调为5.8；光照(500μmol.m-2.s-1)10小时，温度23±1℃。经40-50天左右培养，四种不同外植体均诱导出愈伤组织。
2.筛选质地疏松、增殖快的愈伤组织分别在不同继代培养基上不断继代培养外植体①、②和③)来源的愈伤组织选择B5附加2，4-D 0.2mg/L、6-BA 1mg/L和NAA1mg/L，真叶叶柄来源的愈伤组织选择B5附加2，4-D 2mg/L、6-BA 1mg/L和NAA0.5mg/L。20天为一个周期。如此经4-5代即可建立稳定的桃儿七愈伤组织培养体系。该愈伤组织可以用于直接提取鬼臼毒素，也可以进行悬浮培养和/或固定化培养，以解决鬼臼毒素含量低、成本高的问题。
3.不同来源愈伤组织中鬼臼毒素含量的定性及定量分析经4-5次稳定继代后，取不同来源的愈伤组织为材料，用薄层层析-紫外分光光度法测定了愈伤组织中鬼臼毒素的含量，不同来源愈伤组织中鬼臼毒素含量的差异为胚根＞胚轴≥真叶叶柄＞子叶。
本发明中无菌苗培养、增殖、生根、愈伤组织诱导及继代培养均在光照培养箱中进行。
权利要求
1.一种桃儿七愈伤组织诱导产生鬼臼毒素的方法，其特征在于它包括以下步骤1)无菌苗的培养以野生桃儿七种子为试材，在种子处理阶段用浓硫酸浸泡种子1-2分钟，以种皮变黑为度；换用浓度为300mg/L的赤霉素(GA3)浸泡48小时后，常规灭菌，取出其中的胚接种于MS培养基(1/2MS无机成分，无激素)，在光照培养箱中培养获得健壮的无菌苗；2)无菌苗的增殖和生根以MS培养基为基本培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2-3mg/L用于无菌苗的增殖；以MS培养基为基本培养基，添加萘乙酸(NAA)0.2-1mg/L用于无菌苗的生根；3)愈伤组织诱导以无菌苗的胚根、胚轴、子叶和真叶叶柄为外植体，以B5为基本培养基，添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1-5mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)1-3mg/L和萘乙酸(NAA)0.2-1mg/L，诱导愈伤组织；4)愈伤组织继代培养以B5为基本培养基，筛选质地疏松、增殖快的愈伤组织细胞株进行继代培养，胚根、胚轴、子叶来源的愈伤组织在添加2，4-二氯苯氧乙酸0.2-1mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤0.5-1mg/L和萘乙酸0.5-1mg/L的培养基中继代；真叶叶柄来源的愈伤组织在添加2，4-二氯苯氧乙酸0.5-2mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤0.5-1mg/L和萘乙酸0.5-1mg/L的培养基中继代，建立稳定的细胞培养系统，所建立的该细胞培养系统愈伤细胞中含有目标次生代谢产物-鬼臼毒素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在愈伤组织诱导时所用植物材料为培养30-40天无菌苗的胚根、胚轴、子叶和培养50-60天无菌苗的真叶叶柄。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于以无菌苗的胚根、胚轴、子叶为外植体进行愈伤组织诱导添加的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为1mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤浓度为3mg/L，萘乙酸浓度为1mg/L；以真叶叶柄为外植体进行愈伤组织诱导添加的2，4-二氯苯氧乙酸浓度为5mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤浓度为1mg/L，萘乙酸浓度为0.5mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种桃儿七愈伤组织诱导产生鬼臼毒素的方法，解决了桃儿七种子难以萌发以及含鬼臼毒素的愈伤组织诱导困难的问题。具体步骤包括以野生桃儿七种子为原始材料，获得桃儿七无菌苗，并成功增殖、生根；以该无菌苗不同部位为外植体，进一步诱导愈伤组织。经多代筛选继代培养，建立了适合细胞大规模培养的愈伤组织系统，该培养物中含有目标代谢产物一鬼臼毒素。本发明方法诱导出的愈伤组织中含有鬼臼毒素。
文档编号C07D493/04GK1849882SQ20051004264
公开日2006年10月25日 申请日期2005年4月22日 优先权日2005年4月22日
发明者杨晖, 王治业, 陆栋, 魏甲乾, 龚伟中, 周剑平, 孙智敏, 张文齐 申请人:甘肃省科学院生物研究所