长白猪肥胖候选基因socs-3序列及其应用的制作方法

文档序号:3575389阅读:425来源:国知局
专利名称:长白猪肥胖候选基因socs-3序列及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及猪常规杂交育种、分子标记辅助育种、基因定位与作图、单克隆抗体应用的方法与技术,特别涉及猪肥胖候选基因SOCS-3序列的筛选及其应用。
背景技术
中国地方猪种普遍存在脂肪沉积快,瘦肉率偏低的缺点,这些缺点严重制约了我国养猪业的健康、稳定、快速发展。目前,主要通过引进国外优良瘦肉型猪种与我国地方猪种进行杂交,解决我国地方猪种脂肪沉积快,瘦肉率偏低的缺点。但是,该方法导致我国地方猪种养殖数量锐减,其优良的抗病性、抗逆性、高繁殖力等优点得不到发挥。我国地方猪种的遗传资源遭到严重破坏。培育我国特有的、能适应我国气候和环境的优良瘦肉型猪种,一直是猪育种学家关注的问题,本发明主要用于瘦肉型猪种的培育。
大量研究表明瘦素(Leptin)抵抗是肥胖发生的主要原因之一。它可能发生在Leptin转运、与受体结合及Leptin信号传导等环节;Janus激酶-信号转导子和转录激活子(Janus kinase signal transducers and activators oftranscription,JAK-SATA)途径目前被认为是Leptin信号转导的主要途径。目前在人、大鼠和小鼠上众多的研究表明细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS-3)抑制Leptin信号转导,衰减信号转导。SOCS-3作为产生Leptin抵抗的重要信号分子在瘦肉型猪育种中尤为重要。SOCS-3家族分子中保守的SH2结构域和C端特有的SOCS盒结构,以及人、小鼠、大鼠中SOCS-3基因很强的同源性暗示了利用同源序列分析法获得猪SOCS-3eDNA序列的可能性。并且同源序列比较法已经在广泛的应用。在猪上已经有利用该方法获得了ob基因的报道。

发明内容
本发明的目的在于,为利用中国地方猪种培育我国特有的瘦肉型猪提供长白猪肥胖候选基因SOCS-3序列及其应用。
为了实现上述目的,本发明利用大鼠SOCS-3基因序列设计合成一对引物,采用SOCS-3基因同源序列比较技术进行长白猪SOCS-3基因克隆,获得了SOCS-3 cDNA序列。并采用同源序列法,对人、小鼠、大鼠和克隆的猪SOCS-3cDNA序列进行同源性分析。
本发明的长白猪肥胖基因SOCS-3基因片段序列为CCCCTGGACCAGCCTGCGCCTCAAGACCTTCGCTCCAAGAACAAATACCAATTGGTGGTGAAAGCAATGGGCAAGCTGGAAGAAAACGGCTTCCACTGGAACGGCCTAGCCCGAAGCGAGGCGAACCTGCTGCTCAGCGCCTAGCCCGCCAGCACCTTTCTCATCCGCCACAGCTCGAACCAGCGCCACTTCTTACGCGCTCGTCAAGACCCAGTCTGGGATCAAGAACCTGCACGTCCAGTGCGAGGTGGGGGTTTCTTGCTGCAGGGTTACCTCCGGAGCACGCAGCCCGTGCGCGATTCTACTGCTGACTCAAGCCAATGCATCACTATCTGCTCCCCTCCGGCGCCCCCTCTTTCTCCTCGTCTCCTACTAAAGCCTCCTCCTTGGCCTCCTTCTAGGAGGTGGACAACCGCCGGCTCACCCTCTCCCTGGCAGCCCCCTCCCCGCGCCCATCCAATAACCTATTACATCTACTCCAGGGCAGACAACAGCCCTCCGGTGTTGAGCTCACCCCTCTCCAGCATTTTTGTCGAAAGATAGGCAGAAGCCACCTGGACTCCTATGAGAAGGTCTCTCAGCTGCCCGGGCCCATTCCTGAGTTCCTTGGACAAGTTCCTGGACA该基因片段大小为625bp,并分析了该基因序列与人SOCS-3基因序列的同源性为77%,在蛋白质水平上的同源性为37%。以该基因序列为基础,可以进行瘦肉型猪基因标记辅助育种,用作瘦肉型猪育种中的基因探针;鉴于猪有自然肥胖的趋势,并且生理特点与人酷似,进而应用于人类肥胖相关疾病的研究;可根据该基因序列,对长白猪和中国地方猪种SOCS-3基因进行定位,并作图。


图1是本发明的长白猪肥胖基因SOCS-3基因片段序列;图2是PCR扩增鉴定猪SOCS-3基因图;
图3是SOCS-3基因的酶切鉴定图;图2和图3中的M均为MarkerDL2000以下结合附图和发明人给出的实施例。
具体实施例方式
本发明获得的长白猪肥胖候选基因SOCS-3序列具体操作步骤如下A.采用TRIZol法提取4月龄长白猪背部皮下脂肪组织,以随机六聚体为引物反转录合成第一链cDNA。
B.根据大鼠SOCS-3基因序列设计并合成一对引物,上游5’→3’GTCACCCACAGCAAGTTTCC,下游5’→3’GTCCAGGAACTCCCGAAT,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。50μl反应体系中含有30.5μl灭菌的去离子水、5μl 10×PCR buffer(NH)2SO4,5μl 2mM dNTP Mix,1μl25μmol/L Primer I,1μl 25μmol/L Primer II,3μl 25mM MgCl2,2.5μl 0.5U/μlTaq DNA Polymerase,2μl模板DNA。反应条件95℃10min,54.71min,95℃1min,54.71min,72℃1min,30个循环,72℃10min,4℃30min。在PTC-200DNA engine(MJ Research,Inc.)上进行扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳80V,30min,获得了一条长度约为600bp的DNA特异条带(图2)。
C.用DNA胶回收试剂盒将获得的一条约600bp左右的DNA条带回收,连接pMD18-T vector,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含有Amp(100μg·ml-1)的LB琼脂平板上培养,蓝、白斑筛选鉴定挑选白色菌落培养。用H.Q.&.Q质粒微量提取试剂盒提取质粒DNA,用EcoR I和Hind III酶切鉴定有外源DNA片段插入的阳性克隆。将阳性克隆送博亚生物公司测序,经SOCS-3基因的酶切鉴定(图3),测序结果表明,获得猪SOCS-3cDNA序列,大小为625bp(图1)。
本发明的实施例1
利用脂肪沉积快的中国地方猪种八眉猪和内江猪为材料,采用A中的方法,提取上述猪种材料的总RNA,利用长白猪SOCS-3的cDNA序列,设计特异性探针,进行分子杂交,确定其表达量与肥胖基因ob及OB-R的相关性,为猪的常规育种提供依据。
本发明的实施例2获取长白×八眉杂种一代,采用A中方法提取猪脂肪组织总RNA,根据获得的SOCS-3基因序列设计特异引物,进行RT-PCR扩增。根据SOCS-3基因在杂种材料中的表达丰度,同时根据杂种一代的生长表现情况,表明SOCS-3基因可以用于分子标记辅助育种。
本发明的实施例3利用实施例1中所设计的核酸探针,通过PCR技术扩增中国地方猪种、引进的外来猪种和杂种后代猪种的SOCS-3基因序列,利用MAPMAKER软件进行SOCS-3基因基因定位与作图。
本发明的实施例4利用实施例1所设计的探针,通过mRNA末端扩增技术获得SOCS-3基因全长序列。利用该基因序列构建表达载体,获得其相应的SOCS-3蛋白,可用该蛋白制备兔抗猪SOCS-3的抗体,用于Leptin抵抗相关的肥胖研究和治疗。
本发明的实施例5猪是肥胖程度最高的家畜,并且它的许多生理解剖学和生理特点与人酷似,因而猪可作为研究人类肥胖的理想动物模型。SOCS-3参与了肥胖相关基因的表达调控,根据猪SOCS-3基因与人SOCS-3基因的序列异同点,可用于人类肥胖症尤其是Leptin抵抗引起的肥胖症研究和基因治疗。
基因序列长白猪肥胖基因SOCS-3基因片段序列CCCCTGGACCAGCCTGCGCCTCAAGACCTTCGCTCCAAGAACAAATACCAATTGGTGGTGAAAGCAATGGGCAAGCTGGAAGAAAACGGCTTCCACTGGAACGGCCTAGCCCGAAGCGAGGCGAACCTGCTGCTCAGCGCCTAGCCCGCCAGCACCTTTCTCATCCGCCACAGCTCGAACCAGCGCCACTTCTTACGCGCTCGTCAAGACCCAGTCTGGGATCAAGAACCTGCACGTCCAGTGCGAGGTGGGGGTTTCTTGCTGCAGGGTTACCTCCGGAGCACGCAGCCCGTGCGCGATTCTACTGCTGACTCAAGCCAATGCATCACTATCTGCTCCCCTCCGGCGCCCCCTCTTTCTCCTCGTCTCCTACTAAAGCCTCCTCCTTGGCCTCCTTCTAGGAGGTGGACAACCGCCGGCTCACCCTCTCCCTGGCAGCCCCCTCCCCGCGCCCATCCAATAACCTATTACATCTACTCCAGGGCAGACAACAGCCCTCCGGTGTTGAGCTCACCCCTCTCCAGCATTTTTGTCGAAAGATAGGCAGAAGCCACCTGGACTCCTATGAGAAGGTCTCTCAGCTGCCCGGGCCCATTCCTGAGTTCCTTGGACAAGTTCCTGGACA
权利要求
1.长白猪肥胖候选基因SOCS-3序列,其特征在于,该基因序列为CCCCTGGACCAGCCTGCGCCTCAAGACCTTCGCTCCAAGAACAAATACCAATTGGTGGTGAAAGCAATGGGCAAGCTGGAAGAAAACGGCTTCCACTGGAACGGCCTAGCCCGAAGCGAGGCGAACCTGCTGCTCAGCGCCTAGCCCGCCAGCACCTTTCTCATCCGCCACAGCTCGAACCAGCGCCACTTCTTACGCGCTCGTCAAGACCCAGTCTGGGATCAAGAACCTGCACGTCCAGTGCGAGGTGGGGGTTTCTTGCTGCAGGGTTACCTCCGGAGCACGCAGCCCGTGCGCGATTCTACTGCTGACTCAAGCCAATGCATCACTATCTGCTCCCCTCCGGCGCCCCCTCTTTCTCCTCGTCTCCTACTAAAGCCTCCTCCTTGGCCTCCTTCTAGGAGGTGGACAACCGCCGGCTCACCCTCTCCCTGGCAGCCCCCTCCCCGCGCCCATCCAATAACCTATTACATCTACTCCAGGGCAGACAACAGCCCTCCGGTGTTGAGCTCACCCCTCTCCAGCATTTTTGTCGAAAGATAGGCAGAAGCCACCTGGACTCCTATGAGAAGGTCTCTCAGCTGCCCGGGCCCATTCCTGAGTTCCTTGGACAAGTTCCTGGACA。
2.长白猪肥胖候选基因SOCS-3序列的制备方法,其特征在于,采用细胞因子信号转导抑制因子-3基因同源序列法获得猪肥胖候选基因SOCS-3的cDNA序列,具体步骤如下A.采用TRIZol法提取4月龄长白猪背部皮下脂肪组织,以随机六聚体为引物反转录合成第一链cDNA;B.根据大鼠SOCS-3基因序列设计并合成一对引物,上游5’→3’GTCACCCACAGCAAGTTTCC,下游5’→3’GTCCAGGAACTCCCGAAT;50μl反应体系中含有30.5μl灭菌的去离子水、5μl 10×PCR buffer(NH)2SO4,5μl 2mM dNTP Mix,1μl 25μmol/L Primer I,1μl 25μmol/L PrimerII,3μl 25mM MgCl2,2.5μl 0.5U/μl Taq DNA Polymerase,2μl模板DNA;反应条件95℃10min,54.71min,95℃1min,54.71min,72℃1min,30个循环,72℃10min,4℃30min;在PTC-200DNA engine上进行扩增;扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳80V,30min,获得了一条长度约为600bp的DNA特异条带;C.用DNA胶回收试剂盒将获得的600bp左右的DNA条带回收,连接pMD18-T vector,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含有每毫升100μg的Amp的LB琼脂平板上培养,蓝、白斑筛选鉴定挑选白色菌落培养;用H.Q.&.Q质粒微量提取试剂盒提取质粒DNA,用EcoRI和Hind III酶切鉴定有外源DNA片段插入的阳性克隆;将阳性克隆送博亚生物公司测序,经SOCS-3基因的酶切鉴定、测序,获得大小为625bp的猪SOCS-3cDNA序列。
3.长白猪肥胖候选基因SOCS-3序列,用于瘦肉型猪分子标记辅助育种的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于利用SOCS-3基因表达得到其蛋白质,制备高度特异性的单克隆抗体。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于根据该基因在中国地方猪种与引进猪种杂交后代中的分离情况,用于SOCS-3基因定位与作图。
全文摘要
本发明公开了一种猪肥胖候选基因SOCS-3序列的筛选及其应用,采用细胞因子信号转导抑制因子-3(Suppressor of Cytokine Signaling 3,SOCS-3)基因同源序列法(SOCS-3 gene analogus)获得猪肥胖候选基因SOCS-3的cDNA序列,对该序列克隆测序后,其大小为625bp。以此肥胖候选基因SOCS-3序列可制备猪常规杂交育种中检测该基因的特异性探针;可对该基因进行多态性研究,并与猪主要生长性状作相关性分析,从而应用于分子标记辅助育种;利用该基因序列在中国地方猪种和国外猪种中进行基因定位与作图;根据该基因序列可构建表达载体,制备高度特异的单克隆抗体;猪具有肥胖的自然趋势,且它的许多生理解剖学和生理特点与人相似,根据SOCS-3基因序列在人和猪上的异同点,可为人类肥胖相关疾病的研究和治疗提供参考依据。
文档编号C07K14/435GK1737141SQ20051004298
公开日2006年2月22日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者孙超, 杨公社, 吴江维, 高景慧, 张浩卫, 杜宝文, 张冰, 孙红梅 申请人:西北农林科技大学
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