一种通过重组前肽实现生物活性肽的基因治疗方法

专利名称：一种通过重组前肽实现生物活性肽的基因治疗方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种通过重组前肽实现生物活性肽的基因治疗方法。
背景技术：
生物活性肽是蛋白质的结构域和功能区片段，它同亲体蛋白质分子比较具有分子量小，结构简单和功能专一的特点，而且一些肽的某种生物功能大于它的亲体蛋白质，因此在预防、诊断和治疗疾病中具有重要使用价值。如何获得生物活性肽是肽研究和使用中的重要课题，从目前的科学和技术水平来看，获得生物活性肽有以下几种方法1、从富含生物活性肽的动植物组织中提取生物活性肽这也是最早获得生物活性肽的方法。但由于动植物的资源限制和组织中的生物活性肽的含量通常很低(每克组织仅含有毫微克的生物活性肽)，提取的方法和步骤繁杂，产量和纯度有限，无法满足肽研究和医学使用中日以增加的需求。
2、使用化学合成方法来生产和制备生物活性肽肽的化学合成技术的进步，使其成为了近来获得生物活性肽的主要方法。它的优点是可以根据研究者和使用者的要求，合成高纯度的生物活性短肽(通常小于60氨基酸残基)。但该技术的缺点是仅能提供毫克级的产量和需要较高的生产成本。从目前的肽类预防和治疗药的市场分析来看，对许多种生物活性肽的年需求量都是公斤级或吨级水平的。使用化学合成方法是无法满足医药市场的需求，而且它也需要高额的生产成本。
3、利用基因工程表达技术生产生物活性肽在生物学原理上看肽和蛋白质都是由核酸编码，编码生物活性肽是cDNA的片段，编码蛋白是一个完整的基因序列。使用蛋白质的表达原理和大肠杆菌或酵母菌表达方法来表达肽已经作了大量的研究探索，研究结果显示使用蛋白质天然表达方式表达生物活肽是不可行的。因为生物活性肽的分子量小，肽链短易被细胞胞浆的肽酶水解。采用蛋白质融合表达/嵌合表达技术来表达生物活性肽是最常使用的方法，获得的表达肽是一种带有标签序列和/或融合序列的表达产物，并非是我们期望的生物活性肽。融合或嵌合表达的标签序列和/或融合序列改变了肽的结构，影响了生物肽的功能。一些融合表达技术也可以在体外使用确定的酶来剪切融合序列，企图纯化生物活性肽，但酶识别序列有严格的特异性，切割后的产物只能说去除了融合序列，但目的肽中还具有附加的非必需的氨基酸残基。使用该方法依然存在费用高，产量低的问题，至今不能工业化生产。
除了生物活性肽的生产成本高和产量低的问题之外，人体的外周血和组织、细胞都存在大量肽水解酶，使输入体内的生物活性肽迅速水解破坏，高价位的生物活性肽在人体内仅能保持很短的有效期，有时仅有几分钟时间。因此大量具有很有前景的预防、治疗用生物活性肽仍然不能在临床医疗中使用。
为了开发肽类药物，许多研究者在寻找修饰生物活性肽的方法，如使用右旋氨基酸取代左旋氨基酸、将肽氨基端乙酰化和同脂类分子偶联等，企图延长肽在体内的有效期，免于体内酶对其降解。仅有极少数的肽修饰成功，开发成肽类药用于临床。但大多数肽修饰后失去生物活性甚至增大了毒副作用。因此寻找新的开发生物活性肽的技术在理论和医药实践中都有重要意义。

发明内容
本发明要克服现有技术存在的无法达到工业化生产要求，成本高昂、无法作为药物进入临床同时表达的产物大多数不能实现生物活性肽的预防和治疗作用问题。
为克服现有技术存在的问题，本发明的技术方案是一种通过重组前肽来实现生物活性肽的基因治疗方法，依次包括下述步骤，(一)确定生物活性肽的序列选定具有特异生物学活性的肽；(二)在目的肽的氨基端加装信号肽酶识别序列根据不同的目的肽进行加装；(三)根据目的肽序列推导cDNA编码根据已经加装了信号肽酶识别点的目的肽序列，依据优势密码子原则推导出编码目的肽的cDNA；(四)编码目的肽的cDNA合成按照真核表达生物活性肽技术的要求，在cDNA的3`—端加终止子和需要的限制性内切酶识别序列；(五)将加装了信号肽酶识别点—目的肽—终止子和内切酶识别点的双链cDNA片段插入表达生物活性肽的载体中制备表达盒；上述载体是一种插入了NT3或NT4长链信号肽/引导肽的真核细胞表达质粒。
还包括步骤(六)，直接使用该表达质粒转导人体和哺乳动物细胞作瞬时表达或将该表达盒插入到各种重组病毒载体，转染细胞作持续表达生物活性肽。
上述步骤(二)中肽的氨基端加装SRR。
上述步骤(二)中肽的氨基端的氨基酸残基是碱性氨基酸、酸性氨基酸或半胱氨酸时，为确保信号肽酶的识别和切割，在肽的氨基端加装SRRG或SRRK。
一种同源串联肽将按上述方法制备的同源肽进行串联而成。
一种异源串联肽将按上述方法制备的异源肽进行串联而成。
一种人工蛋白质按上述方法制备的肽串联达到一定大的分子量并具有高级结构时，即成为人工蛋白质。
一种人工蛋白质的构建设计方法为了达到特定目的，将多个生物活性肽(来自不同生物体)串联组织起来，构建了具有高级结构和特殊生物功能的人工蛋白质。
与现有化学合成方法相比较，本发明的优点是本专利公布了使用重组前肽来实现生物活性肽的基因治疗方法，包括重组表达机理和实施方法。首先在认识到获得生物活性肽的技术困难和成本高之后，采用类似于蛋白质的基因转导技术，将编码生物活性肽的cDNA导入人体或生物体内，通过机体自身的组织细胞来表达具有治疗或预防作用的生物肽，它可以克服体外制备、纯化生物肽的技术困难，来直接用于疾病的预防和治疗。它可以减低生物活性肽的生产费用，同时一次转导可以在体内持续表达生物活性肽(几个星期到数个月，依赖转导方法不同有表达持续时间的不一)，减低了病人的治疗费用。为了达到该目的，本专利在技术上解决了编码生物活性肽在表达细胞内翻译后的细胞内运输、加工和分泌问题，保证了表达生物活性肽的序列和结构的正确性，同时防止了表达细胞的胞浆内肽酶对其降解。哺乳动物和人类细胞在表达分泌蛋白时在成熟蛋白分子的氨基端加装信号肽/引导肽序列，信号肽/引导肽序列指导翻译后蛋白质通过核糖体—内质网—细胞膜在细胞内运输到达细胞内膜，出膜时被细胞膜面的信号肽酶识别酶切点后在此处切开，形成成熟蛋白质和信号肽/引导肽序列。未被酶切割仍带有信号肽/引导肽序列的蛋白质被称之为前蛋白质和/或前原蛋白质(properprotein)，如前胰岛素、凝血酶原等。本专利采用相同机理来表达生物活性肽，因此也称其为前肽(perpeptide)。前蛋白质分子是生理状态下细胞就存在的，前肽是通过体外的重组后通过基因工程方法令细胞来表达的非自然状态的分子，因此称之为重组前肽。为了获得重组蛋白质的分泌表达已经使用了信号肽/引导肽序列建立了分泌表达系统，它在表达重组蛋白质时是有效的。但使用现有的重组蛋白质的分泌表达系统来表达生物活性肽时常常是无效的。原因之一是重组蛋白质分泌表达系统使用的是短链信号肽/引导肽序列(通常仅有20-30氨基酸残基)，生物活性肽通常是小于60氨基酸残基的。重组后细胞表达的前肽序列多小于100氨基酸残基，是易被细胞浆内肽酶水解的，重组的结果是不表达或表达量很低。另一个原因是在构建蛋白质分泌表达时，将编码蛋白的cDNA插入到信号肽酶识别点的下游的多克隆位点处。这样在重组连接时是方便和容易的，但表达的蛋白质分子的氨基端添加了非必需的氨基酸残基。对于分子量大的蛋白质分子添加的2-6个氨基酸残基很少影响它的结构和功能。但如果用来表达仅有几个氨基酸残基的生物活性肽就完全不同，它必然影响了短肽的结构和功能。为了防止表达的生物活性肽和前肽被胞浆的内肽酶降解，使用长链信号肽/引导肽序列(大于90氨基酸残基)就可以解决，但确保表达的前肽在信号肽酶切割后产生序列和结构完全正确的生物活性肽就存在技术困难。由于表达产物的重组是在核酸水平完成的，也就是将编码信号肽/引导肽序列的cDNA和编码生物活性肽的cDNA需要通过适宜的限制性内切酶连接点连接起来。因为信号肽酶的识别点是绝对特异的，并且由切割点的上游序列决定的，切割点的下游是表达的生物活性肽，必需确保序列正确性。也就是说当把限制性内切酶连接点放在信号肽酶切割点下游增加了表达肽的非必需序列，放在信号肽酶切割点上游改变了信号肽酶识别点序列，导致无法识别和有效的切开。本专利在大量筛查了编码人类分泌蛋白质的长信号肽后，发现编码NT4前蛋白的cDNA，在信号肽酶识别点序列编码处具有Nae I酶识别点，使用NT4信号肽/引导肽的cDNA序列通过NaeI酶切点可以连接编码生物活性肽的cDNA，用来表达生物活性肽。同时我们使用无意义突变方法改变了NT3的信号肽酶的识别点序列，在编码氨基酸不变的条件下创建了可以连接生物活性肽cDNA的限制性内切酶连接点。这样即方便了cDNA的重组连接，也保证了表达后被信号肽酶识别和切割，产生序列和结构完全正确的生物活性肽。
本专利通过对编码肽的cDNA和编码NT3或NT4信号肽/引导肽cDNA，经特异的Nae I酶切点连接，构建了具有长链信号肽/引导肽的重组前肽，使其实现在哺乳动物细胞，尤其是人类细胞的正确转录、翻译、翻译后修饰和细胞内运输、达到出胞分泌目的。防止了细胞内肽酶对表达肽的降解，同时保证了信号肽酶的识别和有效切割，产生了序列和结构正确的分泌肽。因此用本专利的方法可彻底解决无法达到工业化生产要求，成本高昂的问题，使其进入临床的经济制约问题得以解决，同时本方法可适用于各种生物活性肽的基因治疗，例如(1)肿瘤是人类健康的大敌，近来的发病率还有不断增高的趋势。近年来研究人员发现了许多可以杀伤肿瘤、诱导肿瘤细胞凋亡、阻断肿瘤血管形成和刺激机体免疫系统来消灭肿瘤的生物肽。其中一些具有特异的杀伤肿瘤作用又不伤害正常组织和细胞。我们使用本专利技术表达了P53的氨基端肽、羧基端肽、Par-4核心区肿瘤特异凋亡肽、鸡贫血病毒的VP3肽和腺病毒的E40RF。它们显示了强大的抗肿瘤作用，可以根治已经建立荷瘤小鼠的肿瘤模型。
(2)HIV、肝炎病毒、SARS和禽流感病毒感染是近年来人类健康，尤其是公共卫生的大敌。病毒受体和辅助受体的阻断肽，如T-20、C-34可以阻断HIV进入靶细胞，一些适配子肽(apitamers peptide)可以阻断病毒的逆转录酶和整合酶，有效抑制病毒感染和复制。而且一些病毒外膜蛋白质上的肽，可以刺激机体免疫系统，产生免疫保护作用。重组前肽可以成为预防病毒感染和治疗病毒感染的新手段。
(3)老年性和老年相关的疾病的是组织和细胞的退性行改变。它可以发生在中枢神经系统，出现老年痴呆、巴金森氏病等，也可以形成心脑血管疾病和骨关节疾病等。一些肽具有抗老化作用，能够营养神经和外周组织、对抗过氧化物、游离基引起的细胞损害。保护细胞线粒体和膜系统，具有抗细胞凋亡作用。使用体内前肽表达系统可以在选定组织和细胞表达某些抗衰老、抗凋亡肽可以预防、治疗和阻止衰老的发生。我们使用重组病毒技术表达具有神经营养作用前肽，在治疗老年动物的中枢退行性疾病和防止外伤和中毒引起的神经损伤获得了理想结果。
与现有技术的差异是(1)本专利的重组前肽表达方法同已经建立的原核和酵母分泌表达系统具有根本的差异，首先本专利的技术目的是实现生物活性肽的真核分泌表达，已经建立的原核和酵母分泌表达系统是实现蛋白质的分泌表达。因此在表达策略上原核和酵母分泌表达系统选用了短链信号肽，如碱性磷酸酶(phoA)、大肠杆菌外膜蛋白A(OmpA)等信号肽，当将目的基因eDNA和信号肽eDNA同表达框(ORF)连接后，表达的蛋白质可以分泌到细菌的膜间腔(外周质)中。甲醇酵母分泌表达载体pMETα使用α因子信号肽，其肽链长度为85aa，因此减低了表达产物的降解，提高了表达产量。但是它仍然不能表达生物活性肽，原因是这些载体为分泌表达蛋白质设计，它的外源基因的插入位点置于了信号肽酶识别下游，使用了多克隆位点插入方法。将外源基因插入后表达产物的氨基端就必然添加了几个氨基酸残基，当表达分子量大的蛋白质时，通常不影响产物的生物功能，如果表达仅有几个和十几个氨基酸残基的生物活性肽时，肽的结构和生物学活性受到严重影响。本专利公布的方法是选用真核细胞分泌表达蛋白质的长链信号肽为前肽的信号肽，在使用氨基酸编码子的无意义突变方法使信号肽酶识别点同时成为限制性内切酶的识别点。这样保证了表达的前肽具有足够的长度，防止了表达产物在细胞内的降解，同时宿主细胞的信号肽酶切割后产生长度和结构完全正确的目的肽。
(2)它同目前使用的蛋白质嵌合表达或融合表达技术不同，融合表达或嵌合表达是使用一种标签序列如GST、TRX或6XHis等，融合一个蛋白质编码序列，在同一表达框(ORF)条件下表达了具有标签序列的融合蛋白，通常使用原核和酵母表达系统在体外获得表达融合蛋白质，可以方便的使用亲和层析技术来纯化表达蛋白，如果需要天然蛋白时，再使用蛋白酶在体外切割，再用分离技术获得天然蛋白质。本专利使用了信号肽和引导肽，同表达肽cDNA同框架(ORF)连接时设计了自身编码了信号肽酶识别点。因此当将该表达盒插入表达载体转导哺乳动物和人类细胞时，宿主细胞的内肽酶可以正确切割重组蛋白，在分泌出胞时获得了表达肽。


附图是通过重组前肽在真核细胞表达生物活性肽的方法示意图。
具体实施例方式本专利公布了使用重组技术构建前肽cDNA方法，长链信号肽/引导肽连接的生物活性肽cDNA在连接点设计了信号肽酶的识别点。这样细胞转录和翻译的前肽，肽链长度达到和超过了100氨基酸残基，防止细胞内的降解，同时信号肽/引导肽序列指导了表达产物在细胞内通过核糖体—内质网—细胞膜运转，在出细胞前被细胞信号肽酶识别剪切，将重组生物活性肽分泌到细胞外间隙。实现了生物活性肽的体内表达。它可以用来预防、诊断和治疗目前棘手的人类疾病。
下面将通过具体实施例对本发明做进一步详细说明。
参见附图实施例1抗肿瘤血管形成肽Anginex的重组前肽构建和它的基因治疗(一)确定生物活性肽的序列图中的XXXXXX表示选定的生物活性肽的氨基酸序列，每个X表示一个氨基酸残基。使用者根据想要达到的生物作用，从已经发表的文献中、或通过自己的前期研究发现，选定了具有特异生物学活性的肽，如促细胞凋亡作用和抑制肿瘤血管形成的抗肿瘤肽、拮抗HIV或HCV侵入靶细胞受体的抗病毒感染肽、截断细胞内信号转导的适配子肽和激活细胞功能具有治疗老年退行性疾病的营养肽等。这些生物活性肽的作用机制和原理是千差万别的，同时它们发挥作用的亚细胞位置也是多样的。如一些阻断肽或称为封闭肽，在细胞间质中同配体结合阻断了配体对细胞的作用，同样也可以和细胞受体结合，阻断或封闭了配体同细胞膜受体结合。另一些肽的作用点是在靶细胞内，在胞浆或细胞核。它们可以同细胞的信号转导酶，如磷酸化酶或去磷酸化酶结合，阻断了细胞的信号转导，甚至是一些肽作用于细胞核，阻断了一些基因的转录和激活，抑制了细胞的增殖和分裂。因此使用重组表达技术来实现肽的基因治疗时，要充分的考虑到肽的作用机制和实现作用的靶细胞位置。它涉及到肽的重组表达时使用单一的生物肽或是嵌合(两种或两种以上的)生物活性肽。
本实施例中给出的Anginex是人工设计的具有β片层结构的抗肿瘤血管形成肽，它的氨基酸序列如下ANIKLSVQMKLFKRHLKWKIIVKLNDGRELSDL实验研究证实Anginex有效地抑制肿瘤血管生长，诱导肿瘤凋亡，具有治疗肿瘤的生物学作用。我们选用anginex作为目的肽设计它的真核重组表达。
(二)目的肽的氨基端加装信号肽酶识别序列信号肽是分泌性蛋白质在细胞表达时其氨基端存在的一段肽序列。细胞表达的带有信号肽的蛋白质常常被称为原(前)蛋白或蛋白原，如凝血酶原、前胰岛素等，此时的蛋白质无生物活性。当信号肽酶切割后，使信号肽和成熟蛋白质分离，成熟蛋白常常被分泌出胞。信号肽的生物学功能除了增加了细胞表达蛋白质的分子量之外，它指导了翻译后蛋白的细胞内运转和加工，最终确定了表达蛋白质的在亚细胞的定位，因此也被称作为表达蛋白质的邮政编码(zipcode)。真核细胞通常表达多种蛋白质，其中的分泌蛋白(无论是外分泌，自分泌或旁分泌)都有自己的信号肽。不同的蛋白质信号肽的长短不同，序列也很少有一致性，但它们的高级结构具有类似性，决定了在信号肽和成熟蛋白质的连接点处存在可以被信号肽酶识别的特异序列—信号肽酶识别点。细胞转录后翻译形成的蛋白质，以前蛋白形式或前蛋白—tRNA复合体方式通过核糖体—内质网—细胞膜系统运输，在内质网和细胞膜被该处的信号肽酶识别，并切割成成熟蛋白质和信号肽两部分，成熟蛋白质常常被分泌出细胞外。我们要获得重组生物活性肽，实现真核细胞的正确表达，也就要模拟分泌蛋白质表达原理，在表达的目的肽氨基端加装信号肽和信号肽酶识别序列。
SRR↓G是神经营养因子4/5(NT4/5)的信号肽酶识别序列，SRR↓K是神经营养因子3(NT3)的信号肽酶识别序列。NT3和NT4/5是哺乳动物细胞表达的自分泌和旁分泌的细胞营养因子蛋白质，↓表示信号肽酶的切割位点。切割点的左侧的氨基酸残基是信号肽的羧基端序列，它的位置紧靠↓的为(-1)、次之为(-2)和(-3)……(-N)。切割点的右侧的氨基酸残基是表达蛋白质或肽的氨基端，紧靠↓的为(+1)、次之为(+2)和(+3)……(+N)。这样SRRG的位置S(-3)R(-2)R(-1)↓G(+1)和SRRK的位置S(-3)R(-2)R(-1)↓K(+1)。近来有关信号肽酶作用底物识别点的切割特异性、有效性和敏感性研究结果表明，-3、-1和+1位置的氨基酸残基是重要的，它确定了底物是否被信号肽酶识别和正确的切开。但有关人类基因信号肽酶对底物的切割要求研究认为-5、-4、-3、-2和-1是重要的，和+1位置的氨基酸残基无关。我们的实验研究表明在+1位置是非极性氨基酸和半光氨酸，信号肽编码的序列(-5--1)决定了信号肽酶识别和正确的切开。当+1位置是极性氨基酸和半光氨酸时保留G或K残基时保证信号肽酶识别和正确的切开条件。为了表达重组的生物活性肽必需在其氨基端加装信号肽酶的识别点，便于在细胞表达时确保正确加工。
本实施例中在anginex的序列氨基端端加装SRR。
SRRANIKLSVQMKLFKRHLKWKIIVKLNDGRELSDL(三)根据目的肽序列推导cDNA编码根据已经加装了信号肽酶识别点的目的肽序列，依据优势密码子原则，使用分子生物软件可以方便的推导出编码目的肽的cDNA。下面是使用DNAsis 2.5软件推导出的加装了信号肽酶识别点的Anginex cDNA。
FileUntitled#1Range 1- 33Codon TableUniuersal10 20Ala Asn Ile Lys Leu Ser Val Gln Met Lys Leu Phe Lys Arg His Leu Lys Trp Lys IleGCN AAY ATH AAR YTN WSN GTN CAR ATG AAR YTN TTY AAR MGN CAY YTN AAR TGG AAR ATH--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---GCT AAT ATT AAA TTA TCT GTT CAA ATG AAA TTA TTT AAA CGT CAT TTA AAA TGG AAA ATTGCC AAC ATC AAG TTG TCC GTC CAG AAG TTG TTC AAG CGC CAC TTG AAG AAG ATCGCA ATA CTT TCA GTA CTT CGA CTT ATAGCG CTC TCG GTG CTC CGG CTCCTA AGT CTA AGA CTACTG AGC CTG AGG CTG30Ile Val Lys Leu Asn Asp Gly Arg Glu Leu Ser Leu AspATH GTN AAR YTN AAY GAY GGN MGN GAR YTN WSN YTN GAY--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---ATT GTT AAA TTA AAT GAT GGT CGT GAA TTA TCT TTA GATATC GTC AAG TTG AAC GAC GGC CGC GAG TTG TCC TTG GACATA GTA CTT GGA CGA CTT TCA CTTGTG CTC GGG CGG CTC TCG CTCCTA AGA CTA AGT CTACTG AGG CTG AGC CTG选择以下序列为Anginex cDNA编码序列GCT AAT ATT AAA TTA TCT GTT CAA ATG AAA TTA TTT AAA CGT CAT TTA AAA TGGAAA ATT ATT GTT AAA TTA AAT GAT GGT CGT GAA TTA TCT TTA GAT当在Anginex的氨基端加装了信号肽酶识别序列后，在该序列的5`-端应当加装编码SRR的cDNA，使用分析软件翻译后，可以有以下几种可能FileUntitled#1Range 1- 3Codon TableUniversalSer Arg ArgWSN MGN MGN--- --- ---TCT CGT CGTTCC CGC CGCTCA CGA CGATCG CGG CGG
AGT AGA AGAAGC AGG AGG在以上编码中，我们选择了AGC CGG CGT作为信号肽酶的识别序列的cDNA编码，其原因是AGC CGG CGT的序列中存在GCC GGC限制性内切酶Nae I的识别位点，这样我们在构建表达重组肽的载体时可以使用该酶切点将目的肽的cDNA和载体中信号肽序列连接。这样我们就获得了加装了信号肽酶识别点的Anginex的cDNA序列AGC CGG CGT GCT AAT ATT AAA TTA TCT GTT CAA ATG AAA TTA TTT AAA CGT CATTTA AAA TGG AAA ATT ATT GTT AAA TTA AAT GAT GGT CGT GAA TTA TCT TTA GATTGA这里的最后一个字符TGA是终止密码子，普通字符是Anginex的cDNA编码子。如果假设Anginex的氨基端第一残基是Arg，它的氨基端加装的信号肽酶识别序列应当是SRRG，它的cDNA序列为AGC CGG CGT GGT CGT AAT ATT AAA TTA TCT GTT CAA ATG AAA TTA TTT AAA CGTCAT TTA AAA TGG AAA ATT ATT GTT AAA TTA AAT GAT GGT CGT GAA TTA TCT TTAGAT TGA从以上两个cDNA序列可以发现，通常肽在氨基端加装的信号肽酶识别序列，在酶切点的上游-3至-1位置，表达后经过信号肽作用产生的目的肽是完整的在氨基端没有附加氨基酸残基，但对于氨基端第一位置是极性氨基酸和半光氨酸的肽，在+1位置加装了Gly残基，表达后经过信号肽作用产生的目的肽是在氨基端加入了Gly残基的肽，它的目的是确保表达肽能够在细胞内正确运输和切割加工，产生分泌肽。在我们表达的多种重组肽，虽然在氨基端多加装了Gly残基，未发现影响肽的生物活性。但对于某一特定肽说，是否影响其生物活性，应当在重组表达前，通过合成肽技术比较氨基端加装了Gly残基的目的肽和不加Gly残基的目的生物活性差异来确定。
(四)编码目的肽的cDNA合成按照真核表达生物活性肽技术的要求，推测出加装了信号肽酶识别点和终止子的cDNA后，为了方向性的将cDNA片段插入到表达载体，在终止子的3`-端需要添加限制性内切酶识别序列，拿anginex为例，合成的cDNA应当是AGC CGG CGT GCT AAT ATT AAA TTA TCT GTT CAA ATG AAA TTA TTT AAA CGTCAT TTA AAA TGG AAA ATT ATT GTT AAA TTA AAT GAT GGT CGT GAA TTA TCT TTAGAT TGA nnn nnn这里的nnn nnn表示限制性内切酶识别序列，如果我们使用BamH I，它的序列应当是GGA TCC。使用DNA合成技术我们能够获得加装了信号肽酶识别点—目的肽—终止子和内切酶识别点的双链cDNA片段。合成的cDNA通常需要连接到线性的pGEM-T载体中，通过序列测定证实它的正确性后，使用Nae I和另一个选定的内切酶，如BamH I双酶切获得具有Nae I和BamH I粘性末端的cDNA片段。
(五)将编码生物活性肽的cDNA插入到具有NT3或NT4/5信号肽/引导肽的生物活性肽表达载体因为在人类和哺乳动物细胞内广泛存在降解小分子肽的内肽酶(PREP)，它含有一个alpha/beta折叠的水解肽酶结构，它的酶活性中心(ser554，his680，asp641)是被beta推进器的中心通道覆盖，保护了大分子肽和蛋白质不被该酶降解。因此我们要表达生物活性肽，确保它在表达细胞内不被内肽酶降解必需选用序列长的信号肽，使用重组技术构建的前蛋白或称为前肽才能够分泌到细胞外，实现它的生物学作用。
本专利使用了神经营养因子NT4/5和NT3的信号肽来表达生物活性肽。
NT4/5的氨基酸序列如下MLPLPSCSLP ILLLFLLPSV PIESQPPPST LPPFLAPEWD LLSPRVVLSRGAPAGPPLLF LLEAGAFRES AGAPANRSRR GVSETAPASR R↓GELAVCDAVSGWVTDRRTA VDLRGREVEV LGEVPAAGGS PLRQYFFETR CKADNAEEGGP
GAGGGGCRGV DRRHWVSECK AKQSYVRALT ADAQGRVGWR WIRIDTACVCTLLSRTGRA″这里的↓是信号肽酶的切割点，红色粗体字符表示NT4/5的信号肽/引导肽序列，黑色普通字符表示NT4/5的成熟蛋白。由此可见当我们将目的肽编码的cDNA和NT4/5信号肽cDNA连接后，表达的前(原)肽的序列长度可以达到100或大于100氨基酸残基。它将防止了细胞浆内肽酶对表达肽的降解作用。下面是使用NT4/5信号肽和Anginex连接后表达的Anginex前(原)肽序列MLPLPSCSLP ILLLFLLPSV PIESQPPPST LPPFLAPEWD LLSPRVVLSRGAPAGPPLLF LLEAGAFRES AGAPANRSRR GVSETAPASR R↓ANIKLSVQMKLFKRHLKWK IIVKLNDGREL SDL这里显示的Anginex前肽在表达细胞的肽链长度达到了123氨基酸残基，可以有效的防止了内肽酶的降解，实现了重组肽的分泌表达。
下面是使用神经营养因子NT3的信号肽来表达生物活性肽。NT3的氨基酸序列如下MSILFYVIFL AYLRGIQGNN MLQRSLPEDS LNSLIIKLIQ ADILKNKLSKQMVDVKENYQ STLPKAEAPR EPERGGPAKS AFQPVIAMDT ELLRQQRRYNSPRVLLSDST PLEPPPLYLM EDYVGSPVVA NRTSRR↓KRYA EHKSHRGEYSVCDSESLWVT DKSSAIDIRG HQVTVLGEIK TGNSPVKQYF YETRCKEARPVKNGCRGIDD KHWNSQCKTS QTYVRALTSE NNKLVGWRWI RIDTSCVCALSRKIGRT这里的↓是信号肽酶的切割点，红色粗体字符表示NT3的信号肽/引导肽序列，黑色普通字符表示NT3的成熟蛋白。从中可见信号肽/引导肽序列长度已经达到136氨基酸残基，同目的肽重组后，前肽的长度将大于140-150氨基酸残基。有效的防止细胞内肽酶的降解作用，保证了重组肽的表达，细胞的运输、信号肽酶的切割和重组肽的分泌出细胞。长信号肽连接的生物肽可以是一种生物活性肽，也可以是多种串连的生物活性肽或自身串连肽。仅表达一种生物活性肽的前肽表达盒的基本结构如下
表达多种生物活性肽的前肽表达盒的基本结构如下 基因组学和蛋白组学的研究目的是发现和寻找新基因和具有新功能的蛋白质，肽的研究是在蛋白质分子中确定和证实它的各种生物机能的片段。本专利公布的前肽重组表达技术是使用了具有不同功能的两个肽，通过重组技术相连结来分泌表达具有生物活性肽。它之所以叫做前肽重组表达，是因为表达产物同蛋白质比较分子量小、缺乏复杂的高级结构。如果我们加大表达肽的分子量和结构，使用串连表达技术同时表达多个生物功能肽，必然会形成具有高级结构和多种生物功能的大分子蛋白质。这种蛋白质和通常所称的表达蛋白质不同，后者是使用生物基因组中的特定基因，表达生物体自然状态下已经存在的蛋白质分子。前者是根据需要完成的生物功能，在多种生物的活性肽中选取，通过重组和转导技术让细胞表达自然界目前还不存在的蛋白质分子，为此我们将前者称作为人工蛋白质(artificiality protein)，后者称为自然蛋白质(Natureprotein)。下面是我们有关人工蛋白质的构建设计和表达实例，抗肿瘤人工蛋白质Par-4 SAC的一级结构如下
该人工蛋白质的序列如下MSILFYVIFL AYLRGIQGNN MDQRSLPEDS LNSLIIKLIQ ADILKNKLSKQMVDVKENYQ STLPKAEAPR EPERGGPAKS AFQPVIAMDT ELLRQQRRYNSPRVLLSDST PLEPPPLYLM EDYVGSPVVA NRTSRR↓GLFG AIAGFIENGWEGMIDGWYG IDgkssgpsa rkgkgqiekr klrekrrstg vvnipaaeclDeyeddeagq kerkredait qqntiqneav nKLLKKWKMR RNQFWVKVQR E氨基端使用了NT3的信号肽(136aa)，接着使用了流感病毒凝血蛋白的氨基端肽(23aa)，Par-4蛋白质的肿瘤特异凋亡肽(55aa)，核定位信号(14aa)和果蝇Ant蛋白的穿膜肽(17aa)，在HA2肽和Par-4 SAC肽之间，NLS(核定位信号肽)和果蝇穿膜肽之间分别加入2和3个氨基酸残基的连接肽，因此该蛋白质的前蛋白分子肽链总长为250aa。表达后分泌肿瘤治疗人工蛋白分子肽链长度为114aa。设计者选择各种生物活性肽理论根据是1.NT3信号肽作为蛋白质细胞内运输编码，使翻译的蛋白质在表达细胞内通过核糖体—内质网—细胞膜系统正常运输。在NT3和HA2氨基端肽的连接处加装了信号肽酶识别位点，在此处切开后HA2羧基端的肽分泌出细胞。出细胞的蛋白分子的羧基端的Ant穿膜肽，可以使表达蛋白通过非受体和能量依赖方式通过细胞膜。进入细胞的人工蛋白分子以巨胞噬体方式存在于细胞浆中，HA2肽可以溶解巨胞噬体膜将人工蛋白分子释放到细胞浆中，在穿膜肽的作用下进入细胞核内，NLS的作用使人工蛋白分子定位到细胞核内。如果该细胞是肿瘤细胞，Par4 SAC肽的生物学作用使肿瘤细胞凋亡。从结构图中可以见到，人工蛋白质分子的各个结构区可以来自不同的生物体，如上述抗肿瘤蛋白，NT3信号肽、Par4 SAC和NLS来自人类不同蛋白质分子，HA2氨基端肽来自流感病毒，Ant穿膜肽来自果蝇。使用重组技术可以将编码这些功能肽的cDNA连接，制备表达载体。我们通过病毒表达载体表达以上抗肿瘤人工蛋白质，治疗荷瘤小鼠收到了理想效果。当然将各个功能肽在一级结构上构建重组人工蛋白仅是人工设计蛋白质分子的开始，设计的蛋白质分子还需要使用三维和多维软件分析它的高级结构和预测功能，尤其要通过生物学实验证实该人工蛋白质的机能。par-4 SAC人工蛋白可以做成二级、三级结构。
本专利公布了一项人工蛋白质的设计和表达技术，它促使我们从利用自然功能蛋白质到设计人工蛋白质的转变。这和人类从使用天然药物(来自动物、植物和矿物质直接药用)到根据化学结构来设计合成化学药物一样，是一场必然的转变过程。设计人工蛋白质和生物大分子技术的突破，必然带来生命科学新的进步，同时为预防、诊断和治疗疾病找到新的有效方法。
实施例2，TAT-VHLβ结构前肽的构建和抗肾癌作用第一步确定生物活性肽的序列肾细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，手术后复发和转移是很多见的，而且该肿瘤对放射和化学抗癌药治疗都不敏感，因此病人预后差。近来肾癌细胞的生物学研究揭示，该细胞的增殖、转移都依赖于胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，ILGF1)受体信号。Yon Hippel-Lindau(VHL)是抑癌基因，它的表达产物通过和protein kinase Cδ结合抑制了ILGF1受体信号使肾癌细胞凋亡，具有治疗肾癌作用。但是使用VHL蛋白质治疗肾癌实体瘤存在技术上的困难，其一是分子量大的蛋白质分子的渗透作用差，不易进入癌细胞内阻断细胞的受体信号。另外是长期使用蛋白质刺激机体产生抗体，大大减低了治疗作用。使用VHL的β结构区的104-123aa的20氨基酸残基的短肽能够同蛋白激酶Cδ结合阻断ILGF1受体信号，诱导肾癌细胞凋亡。由于短肽分子量小渗透作用好，输入机体后不产生抗体，比它的亲体蛋白质有更多的优点，我们选用VHL的β结构区的104-123aa的20氨基酸残基的短肽作为治疗肾癌的生物活性肽。同时我们使用HIV的TAT膜渗透肽作协助肽，使目的肽进入细胞起到治疗作用。根据上述目的我们选择了生物活性肽，根据文献和数据库资料我们确定了肽序列GTGRRIHSYRGHLWLFRDAG
TAT膜渗透肽YGRKKRQRRRD融合后序列YGRKKRQRRRD GTGRRIHSYRGHLWLFRDAG第二步氨基端加装信号肽酶识别序列SRR是信号肽酶识别序列加装到目的肽氨基端SRR YGRKKRQRRRD GTGRRIHSYRGHLWLFRDAG第三步根据目的肽序列推导cDNA编码下表列出了该目的肽的全部编码子，其中信号肽酶识别点SRR的序列是AGCCGG CGT不可改变，因为它同时是内切酶Nae I的识别点，YGRKKRQRRRDGTGRRIHSYRGHLWLFRDAG编码子根据将来在那种生物细胞表达，如人类、哺乳动物、酵母和大肠肝菌等来选择优势密码子。下面是使用人类优势密码子的本例生物活性肽的编码AGC CGG CGT TAC GGC AGG AAG AAG AGG CAG AGG AGG AGG GAT GGC ACC GGTAGG AGG ATC CAC TCC TAT AGG GGC CAC CTG TGG CTG TTC下表显示了目的肽的全部编码子FileUntitled#1Range 1- 34Codon TableUniversal10 20Ser Arg Arg Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Gln Arg Arg Arg Asp Gly Thr Gly Arg Arg IleWSN MGN MGN TAY GGN MGN AAR AAR MGN CAR MGN MGN MGN GAY GGN ACN GGN MGN MGN ATH--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---TCT CGT CGT TAT GGT CGT AAA AAA CGT CAA CGT CGT CGT GAT GGT ACT GGT CGT CGT ATTTCC CGC CGC TAC GGC CGC AAG AAG CGC CAG CGC CGC CGC GAC GGC ACC GGC CGC CGC ATCTCA CGA CGA GGA CGACGA CGA CGA CGA GGA ACA GGA CGA CGA ATATCG CGG CGG GGG CGGCGG CGG CGG CGG GGG ACG GGG CGG CGGAGT AGA AGA AGAAGA AGA AGA AGA AGA AGAAGC AGG AGG AGGAGG AGG AGG AGG AGG AGG30His Ser Tyr Arg Gly His Leu Trp Leu Phe Arg Asp Ala GlyCAY WSN TAY MGN GGN CAY YTN TGG YTN TTY MGN GAY GCN GGN--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---CAT TCT TAT CGT GGT CAT TTA TGG TTA TTT CGT GAT GCT GGTCAC TCC TAC CGC GGC CAC TTG TTG TTC CGC GAC GCC GGCTCA CGA GGA CTT CTT CGA GCA GGATCG CGG GGG CTC CTC CGG GCG GGGAGT AGA CTA CTA AGAAGC AGG CTG CTG AGG
第四步合成编码该目的肽的cDNA片段在合成cDNA时要在3`端加TGA终止子和适宜的内切酶识别点，便于将cDNA片段插入到表达载体。
AGC CGG CGT TAC GGC AGG AAG AAG AGG CAG AGG AGG AGG GAT GGC ACC GGTAGG AGG ATC CAC TCC TAT AGG GGC CAC CTG TGG CTG TTC TGA GGA TCC这里的GGA TCC是内切酶BamH I的识别位点。
第五步将加装了信号肽酶识别点—目的肽—终止子和内切酶识别点的双链cDNA片段插入表达生物活性肽的专用真核细胞表达载体使用Nae I和BamH I联合消化合成目的肽cDNA片段和pcDNA-NT3-peptide载体(见表达生物活性肽的专用载体的专利申请)，常规T4连接酶连接，转化受体菌获得重组克隆。它的表达盒的基本结构如下 表达盒编码的前肽序列如下MSILFYVIFL AYLRGIQGNN MDQRSLPEDS LNSLIIKLIQ ADILKNKLSKQMVDVKENYQ STLPKAEAPR EPERGGPAKS AFQPVIAMDT ELLRQQRRYNSPRVLLSDST PLEPPPLYLM EDYVGSPVVA NRTSRR↓ YGRKKRQRRRDGTGRRIHSYRGHLWLFRDAG注第三行中SRR↓表示信号肽酶识别序列，它前面的字符表示NT3信号肽和引导肽，其后的YGRKKRQRRRD字符表示TAT膜渗透肽，第四行字符代表VHLβ肽。↓表示信号肽酶裂解点。
第六步构建表达TAT-VHLβ结构前肽的重组腺病毒使用EcoR I和BamH I双酶消化插入了TAT-VHLβ结构前肽表达盒的重组载体，获取表达盒。常规插入到重组腺病毒穿梭质粒中，构建重组腺病毒表达TAT-VHLβ结构前肽载体。使用常规重组腺病毒包装系统表达TAT-VHLβ结构前肽的重组腺病毒。该重组病毒转导肾癌细胞后诱导了癌细胞凋亡，注射该重组病毒到荷瘤小鼠，阻断了肿瘤的生长和转移。
实施例3，表达抗老年痴呆的Humanin前肽重组腺伴随病毒的构建和对神经元的保护作用。
老年痴呆(Alzheimer disease，AD)是一种多发常见的老年人中枢神经退行性疾病。目前病因不明，但病理学的特点是神经元减少、老年斑形成和神经纤维缠结。使用分子生物学筛查技术发现了24氨基酸残基的多肽-Humanin，拮抗各种已知的遗传学原因引起的AD病理改变，尤其是神经凋亡。我们使用本专利技术构建了表达Humanin的重组前肽，使用腺伴随病毒载体表达该前肽，转导大鼠皮质神经细胞，成功的防止了淀粉样肽(AD发生中最重要的促神经元凋亡物质)引起的细胞凋亡。
第一步确定生物活性肽的序列Humanin的氨基酸序列如下MAPRGFCLLLLTSEIDLPVKRRA第二步氨基端加装信号肽酶识别序列SRR MAPRGFCLLLLTSEIDLPVKRRA第三步根据目的肽序列推导cDNA编码依据人类优势密码子推导序列AGC CGG CGT ATG GCT CCC AGG GGC TTC TCC TGT CTG CTG CTG CTGACC TCC GAG ATC GAT CTG CCT GTG AAG AGG AGG第四步合成编码该目的肽的cDNA片段3`端加入终止子和酶识别点AGC CGG CGT ATG GCT CCC AGG GGC TTC TCC TGT CTG CTG CTG CTGACC TCC GAG ATC GAT CTG CCT GTG AAG AGG AGG TAG GGA TCC第五步将加装了信号肽酶识别点—目的肽—终止子和内切酶识别点的双链cDNA片段插入表达生物活性肽的专用真核细胞表达载体使用Nae I和BamH I联合消化合成目的肽cDNA片段和pcDNA-NT3-peptide载体(见表达生物活性肽的专用载体的专利申请)常规T4连接酶连接，转化受体菌获得重组克隆。它的表达盒的基本结构如下
表达前肽的表达盒编码序列如下MSILFYVIFL AYLRGIQGNN MDQRSLPEDS LNSLIIKLIQ ADILKNKLSKQMVDVKENYQ STLPKAEAPR EPERGGPAKS AFQPVIAMDT ELLRQQRRYNSPRVLLSDST PLEPPPLYLM EDYVGSPVVA NRTSRR↓MAPRGFCLLLLTSEIDLPVKRRA第六步构建表达Humanin前肽的重组腺伴随病毒使用EcoR I和BamH I双酶消化插入了Humanin前肽表达盒的重组载体，获取表达盒。常规插入到重组腺伴随病毒重组质粒中，构建重组腺伴随病毒表达Humanin前肽载体。使用常规重组腺伴随病毒包装系统表达Humanin前肽的重组腺伴随病毒。该重组病毒转导大鼠皮质神经细胞后，明显增加了抗淀粉样肽对神经细胞的毒性作用，提示具有治疗老年痴呆的重要价值。
实施例4构建表达胰高糖素样-1(Glucagon-like Peptide-1，GlP-1)前肽的重组腺伴随病毒治疗II型糖尿病近来的肠道内分泌学研究表明，肠粘膜的L细胞分泌产生GLP-1生物活性肽，它的7-37或7-36aa的短肽具有增强糖刺激依赖的胰岛素分泌作用，同时减低食欲，促进胰腺微导管的前体细胞转化成分泌胰岛素的β细胞，使β细胞增殖和防止细胞凋亡，因此可以用来治疗糖尿病。但使用化学合成方法合成的GPL-1肽在体内极易被肽酶水解，需要多次反复给药，增加了病人负担。同时使用化学合成方法来生产治疗糖尿病的肽类药物，难达到工业化水平，满足临床需要。为此我们使用本专利技术构建了表达GLP-1前肽的重组腺伴随病毒，口服后可以转化肠道粘膜上皮细胞，使其长期表达GLP-1，仅通过几次口服给药后，治疗作用可以持续一年以上，下面是实施过程第一步确定生物活性肽的序列GLP-1的氨基酸序列如下HAE GTFTSDVSSY LEGQAAKEFI AWLVKGRG第二步氨基端加装信号肽酶识别序列SRR HAE GTFTSDVSSY LEGQAAKEFI AWLVKGRG第三步根据目的肽序列推导cDNA编码依据人类优势密码子推导序列AGC CGG CGT CAC GCT GAG GGC ACC TTC ACC TCC GAT GTG TCC AGT TAT CTGGAG GGC CAA GCT GCC AAG GAG TTT ATC GCT TGG CTG GTG AAG GGC AGG GGC第四步合成编码该目的肽的cDNA片段3`端加入终止子和酶识别点AGC CGG CGT CAC GCT GAG GGC ACC TTC ACC TCC GAT GTG TCC AGT TAT CTGGAG GGC CAA GCT GCC AAG GAG TTT ATC GCT TGG CTG GTG AAG GGC AGG GGC TGAGGA TCC第五步将加装了信号肽酶识别点-目的肽-终止子和内切酶识别点的双链cDNA片段插入表达生物活性肽的专用真核细胞表达载体使用Nae I和BamH I联合消化合成目的肽cDNA片段和pcDNA-NT3-peptide载体(见表达生物活性肽的专用载体的专利申请)常规T4连接酶连接，转化受体菌获得重组克隆。它的表达盒的基本结构如下 表达前肽的表达盒编码序列如下MSILFYVIFL AYLRGIQGNN MDQRSLPEDS LNSLIIKLIQ ADILKNKLSKQMVDVKENYQ STLPKAEAPR EPERGGPAKS AFQPVIAMDT ELLRQQRRYNSPRVLLSDST PLEPPPLYLMEDYVGSPWA NRTSRR↓HAE GTFTSDVSSY LEGQAAKEFIAWLVKGRG第六步构建表达GPL-1前肽的重组腺伴随病毒使用EcoR I和BamH I双酶消化插入了GLP-1前肽表达盒的重组载体，获取表达盒。常规插入到重组腺伴随病毒重组质粒中，构建重组腺伴随病毒表达GLP-1前肽载体。使用常规重组腺伴随病毒包装系统表达GLP-1前肽的重组腺伴随病毒。该重组病毒口服后转导大鼠肠道粘膜上皮细胞，明显增加了糖刺激后实验性糖尿病动物的血清胰岛素和C肽，降低了血糖，提示具有治疗II型糖尿病的重要价值。
权利要求
1.一种通过重组前肽实现生物活性肽的基因治疗方法，依次包括下述步骤，(一)确定生物活性肽的序列选定具有特异生物学活性的肽；(二)在目的肽的氨基端加装信号肽酶识别序列根据不同的目的肽进行加装；(三)根据目的肽序列推导cDNA编码根据已经加装了信号肽酶识别点的目的肽序列，依据优势密码子原则推导出编码目的肽的cDNA；(四)编码目的肽的cDNA合成按照真核表达生物活性肽技术的要求，在cDNA的3`-端加终止子和需要的限制性内切酶识别序列；(五)将加装了信号肽酶识别点-目的肽-终止子和内切酶识别点的双链cDNA片段插入表达生物活性肽的载体中制备表达盒；上述载体是一种插入了NT3或NT4长链信号肽/引导肽的真核细胞表达质粒。
2.如权利要求1所述的一种通过重组前肽实现生物活性肽的基因治疗方法，其特征在于还包括步骤(六)，直接使用该表达质粒转导人体和哺乳动物细胞作瞬时表达或将该表达盒插入到各种重组病毒载体，转染细胞作持续表达生物活性肽。
3.如权利要求1或2所述的一种通过重组前肽实现生物活性肽的基因治疗方法，其特征在于所述步骤(二)中肽的氨基端加装SRR。
4.如权利要求1或2所述的一种通过重组前肽实现生物活性肽的基因治疗方法，其特征在于所述步骤(二)中，在肽的氨基端的氨基酸残基是碱性氨基酸、酸性氨基酸或半胱氨酸时，为确保信号肽酶的识别和切割，在肽的氨基端加装SRRG或SRRK。
5.如权利要求1所述的方法制备的一种同源串联肽，其特征在于将按上述方法制备的同源肽进行串联而成。
6.如权利要求1所述的方法制备的一种异源串联肽，其特征在于将按上述方法制备的异源肽进行串联而成。
7.如权利要求1所述的方法制备的一种人工蛋白质，其特征在于按上述方法制备的肽串联达到一定大的分子量并具有高级结构时，即成为人工蛋白质。
8.如权利要求7所述的一种人工蛋白质的构建设计方法为了达到特定目的，将多个生物活性肽(来自不同生物体)串联组织起来，构建了具有高级结构和特殊生物功能的人工蛋白质。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种通过重组前肽实现生物活性肽的基因治疗方法。本发明要克服现有技术存在的无法达到工业化生产要求，成本高昂、无法作为药物进入临床同时表达的产物大多数不能实现生物活性肽的预防和治疗作用问题。本发明的技术方案是依次包括下述步骤，(一)确定生物活性肽的序列选定具有特异生物学活性的肽；(二)在目的肽的氨基端加装信号肽酶识别序列根据不同的目的肽进行加装；(三)根据目的肽序列推导cDNA编码；(四)编码目的肽的cDNA合成；(五)将加装了信号肽酶识别点一目的肽－终止子和内切酶识别点的双链cDNA片段插入表达生物活性肽的载体中制备表达盒。
文档编号C07K14/00GK1919343SQ200510043139
公开日2007年2月28日 申请日期2005年8月24日 优先权日2005年8月24日
发明者杨广孝 申请人:杨广孝